【备考2024】人教生物专题复习课件：第11章 生物技术与工程 课时6 基因工程的基本工具与操作程序(共110张PPT)

(共110张PPT)
第十一章 生物技术与工程
课时6 基因工程的基本工具与操作程序
课标要求 核心考点 五年考情 核心素养对接
1.阐明DNA重组技 术的实现需要利用 限制性内切核酸 酶、DNA连接酶和 载体三种基本工 具； 2.阐明基因工程的 基本操作程序主要 包括目的基因的获 基因工程 的基本工 具 2022：湖北 ； 湖北T7、全国卷乙T38; 2018：全国卷Ⅱ 、北京T5 1.科学思维—
—建立模型:基
因工程的操作
流程。分析与
综合:理解基因
工程的工具；
PCR的原理,推
断PCR反应所
需的条件;根据
基因工程 的操作程 序 2022：江苏T24、全国卷乙T38、辽 宁T12和T24Ⅰ; 山东T25、河北T24、辽宁T2 4、广东T22、湖北T16、全国卷甲T3 8、天津T16、江苏T23、福建T21、 浙江6月T29（二）（2）； 课标要求 核心考点 五年考情 核心素养对接
取、基因表达载体 的构建、目的基因 导入受体细胞和目 的基因及其表达产 物的检测鉴定等步 骤； 的提取和鉴 定； 基因工程 的操作程 序 2020：浙江7月T24和T29（一） （1）（2）、浙江1月T29（二） （2）； 2019：江苏T33、全国卷Ⅰ 、天 津T9； 2018：浙江4月T32（二）（1） （2）、全国卷Ⅰ38 基因表达的过
程,推断目的基
因检测与鉴定
的方式。
续表
课标要求 核心考点 五年考情 核心素养对接
4.利用聚合酶链式反 应（PCR）扩增DN A片段并完成电泳鉴 定，或运用软件进 行虚拟PCR实验 DNA的粗 提取与鉴 定及DNA 片段的扩 增与鉴定 2022：山东T13； 2021：山东T13; 2019：江苏T10 2.科学探究—
—通过DNA的
粗提取与鉴定
及DNA片段的
扩增与鉴定的
实际操作,培
养科学探究能
力
续表
课标要求 核心考点 五年考情 核心素养对接
命题分 析预测 1.基因工程是高考的重点,常以科研或生产实践为情境，考查基因工程的基 本工具及基本操作程序,也常与核酸的结构、遗传的物质基础、细胞工程、 胚胎工程等知识相结合进行综合考查,多以非选择题形式呈现，但也可以选 择题的形式呈现。 2.预计2024年高考试题仍可能延续往年的考查形式及特点,分层设置问题,多 角度考查基因工程的工具、操作程序等相关知识，同时原因分析型试题的 比例将大大增加 续表
考点1 基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
（1）手段：按照人们的愿望，通过 ________等技术，赋予生物新的遗传特性。
（2）目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和 __________。
（3）操作水平： __________。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又
叫作 ______________。
转基因
生物产品
分子水平
重组DNA技术
2.基因工程的基本工具
3.与DNA有关的几种酶的比较
种类 项目 作用底物 作用结果
限制酶 DNA分子 切开磷酸二酯键,形成黏性末端或平末端
DNA连接酶 两个DNA分子片段 通过形成磷酸二酯键,进而形成新的单链
DNA分子
DNA聚合酶 DNA片段、脱氧核苷 酸 通过形成磷酸二酯键,进而形成新的单链
DNA分子
DNA酶 __________ 断开磷酸二酯键,形成脱氧核苷酸
解旋酶 双链DNA分子 断开碱基对间的氢键,形成单链DNA分子
RNA聚合酶 RNA片段、核糖核苷 酸 通过形成磷酸二酯键,进而形成单链RNA
分子
DNA分子
深度思考
1.原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来DNA的入侵。
2.原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA
提示 原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。
3.基因工程中的载体与细胞膜上的载体相同吗？
提示 不同。基因工程中的载体通常是DNA，主要是携带外源基因进入受体细胞并在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA进行同步复制；细胞膜上的载体一般为蛋白质，主要是运载要进入细胞的特定物质。
4.天然质粒一般不能直接用作基因工程载体的原因是什么？
提示 只有具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的质粒才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然质粒一般不完全具备上述条件，其往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
1.重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。( )
×
2.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列。( )
×
3.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )
×
4.DNA聚合酶也可以用作重组DNA技术的工具。( )
×
5.限制酶和DNA连接酶的作用部位一致,但作用相反。( )
√
6.所有DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端。( )
×
7.载体的种类有质粒、噬菌体和动植物病毒等,其中动植物病毒必须是DNA病毒。
( )
√
8.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。( )
×
命题点 基因工程所需的工具酶分析
1.[2022双鸭山检测，多选]图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位
点， 表示氨苄青霉素抗性基因， 表示新霉素抗性基因。下列叙述错误
的是( )
A.在构建重组质粒时，可用 和 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用 处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
[解析] 的切割位点在目的基因上，故用 切割会破坏目的基因，A
错误；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需要保留一个，B正确；
若只用 切割质粒和外源DNA分子片段，会出现目的基因自身环化，或目的基
因和质粒的反向连接，C正确；用 切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏，导入
重组质粒的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
√
√
2.[2021全国卷乙,15分]用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题:
（1）常用的DNA连接酶有 连接酶和 连接酶。图中____________
_______酶切割后的DNA片段可以用 连接酶连接。图中_______________
______________________酶切割后的DNA片段可以用 连接酶连接。
、
、 、 、
[解析] 由图可以直接看出， 、 、 、 切割后分别形成黏
性末端、平末端、黏性末端、平末端； 连接酶可用于连接黏性末端，
连接酶可用于连接黏性末端和平末端。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________
__。
磷酸二酯键
[解析] DNA连接酶催化形成磷酸二酯键。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原
点，可以保证质粒在受体细胞中能______；质粒DNA分子上有__________________，
便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用
抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________。
复制
限制酶的切割位点
用含抗生素的培养基进行培养
[解析] 复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中复制。质粒上有限制酶的切割位点，可被限制酶切开并使目的基因插入其中。采用在含有特定抗生素的选择培养基上进行选择培养的方法可将含质粒载体的细胞筛选出来。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________
__________。
RNA 聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
[解析] 启动子是RNA 聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA 序列。
3.[2023保定模拟,10分]如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。
（1） 和质粒的本质相同，都是______，二者还具有其他共同点，如____________
__（写出一条即可）。
DNA
能够自我复制
[解析] 图中 是拟核DNA，拟核DNA和质粒的本质都是DNA分子，均能够自我复制。
（2）若质粒的切割末端为&2& ，则与之连接的目的基因切割末端应为_ ______；可
使用____________把质粒和目的基因连接在一起。
DNA连接酶
[解析] DNA连接酶可以将具有互补末端的2个DNA片段连接在一起，形成重组DNA分子，若质粒的切割末端为&4& ，则与之连接的目的基因切割末端应为&5& 。
（3）氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上作为__________，其作用是______________
____________。
标记基因
便于重组DNA的鉴定和筛选
[解析] 质粒上常具有标记基因（如抗生素的抗性基因），便于重组DNA的鉴定与筛选。
（4）下列常在基因工程中作为载体的是( )
A.苏云金杆菌抗虫基因 B.农杆菌环状RNA分子
C.大肠杆菌的质粒 D.动物细胞的染色体
C
（5）除质粒外，常用的载体还有________和____________。
噬菌体
动植物病毒
考点2 基因工程的操作程序
1.基因工程的操作程序
&8& [选必3 P77“相关信息”] 抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。
2.利用PCR获取和扩增目的基因
PCR与体内DNA复制的异同
类型 PCR 体内DNA复制
时期 人工控制，随时进行 有丝分裂和减数分裂前的间期
场所 细胞外 细胞内
解旋方式 以上高温条件下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
子链合成方式 从两条引物的 端开始连续合成 一条连续合成，另一条不连续合
成
结果 扩增DNA片段或基因 合成整个DNA分子
相同点 ①都需要DNA模板、引物、能量和一定的温度条件；②都遵循碱基 互补配对原则；③DNA合成方向都是从子链的 端向 端延伸 深度思考
1.构建基因表达载体时，为什么一般选用两种限制酶切割目的基因和载体？
提示 因为用不同的限制酶分别处理目的基因和载体时，可以使目的基因两侧和载体上各自具有两个不同的黏性末端，防止目的基因或载体发生自身环化。
2.农杆菌转化法中的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”的原理是否相同？
提示 相同，都是基因重组。
3.在构建质粒载体时，目的基因的序列中能否含有用到的限制酶的识别序列，为什么？
提示 不能，因为目的基因的序列中若含有用到的限制酶的识别序列，目的基因可能会被切断。
4.在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因
插入 质粒的 上？
提示 质粒的 是可转移的DNA,可转移到受体细胞，并且整合到受体细
胞染色体DNA上。将目的基因插入 质粒的 上，就可以使目的基因进入植
物细胞。
5.复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，但两条解开的DNA模板链结合的概率较低，其原因是什么？
提示 ①模板链一般较长，比引物复杂得多，重新结合的概率低；②加入引物的量足够多，而模板链较少，故引物和模板链结合的机会远大于模板链间的。
1.基因表达载体中含有启动子和密码子。( )
×
2.基因表达载体的构建是基因工程的核心。( )
√
3.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位,是起始密码子。( )
×
4. 质粒上的 可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。( )
√
5.将重组表达载体导入动物受精卵常用基因枪法。( )
×
6.PCR扩增时, 左右,引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合。( )
√
命题点1 PCR的过程和应用分析
1.[2021湖北]某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引
物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少
反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
D
[解析] PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
2.[2021全国卷甲,15分]PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析PCR扩增结果;②从病人组织样本中提取DNA;③利用PCR扩增DNA片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
（1）若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是__________（用数字序号表
示）。
④②③①
[解析] 用PCR技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取DNA，再利用PCR技术扩增DNA片段，分析PCR扩增结果。
（2）操作③中使用的酶是______________________________。PCR反应中的每次循
环可分为变性、复性、______三步,其中复性的结果是__________________________
__________。
耐高温的DNA聚合酶（ 酶）
延伸
两种引物分别与两条单链DNA模板结合
[解析] 利用PCR扩增DNA片段过程中使用的酶是 酶。PCR由变性—复性—延伸
三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链DNA模板结合。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
病原菌DNA
[解析] 要扩增病原菌DNA，设计的引物应该能和病原菌DNA特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指______________________________________
____________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等
方面。
一种在生物体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能在短时间内大量扩增目的基因
[解析] 多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内大量扩增目的基因。
命题点2 基因工程的基本操作程序分析
3.[2023浙江三市联考，多选]自然界中很少出现蓝
色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞
液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家
利用链霉菌的靛蓝合成酶基因 及其激活基
因 构建基因表达载体（如图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基
质中形成稳定显色的靛蓝。下列叙述错误的是( )
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中需要转入能调控液泡 的基因
B.将 基因插入 质粒时宜使用的限制酶是 和
C. 和 基因具有各自的启动子，前者调控后者的表达
D.农杆菌可将 质粒上的 整合到白玫瑰染色体DNA上
[解析] 分析题意，用农杆菌转化法将链霉菌的靛蓝合成酶基因 及其激活基因
导入白玫瑰后，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝，所以不需要转入能调
控 的基因，A错误；分析题图可知，将 基因插入 质粒时可用 和
限制酶，B正确；分析题图可知， 和 基因具有各自的启动子，表达
是相互独立进行的，C错误；将目的基因导入植物细胞可用农杆菌转化法，农杆菌可
将 质粒上的 整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。
√
√
4.[2021福建节选，10分]微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白
是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人
员将枣树的 基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
（1）根据枣树的 的核苷酸序列设计了相应的引物（图中甲），通过PCR
扩增 基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。
选用的引物组合应为______________。
引物1和引物4
[解析] 据题中信息知，A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置，若要通过PCR技术扩增 基因，应选用引物1和引物 。
（2）本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的 基因的末端为平末端。由于载
体 只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体 将 基因接入载体 。载
体 和载体 的酶切位点及相应的酶切序列如图中乙所示。
①选用________酶将载体 切开，再用________（填“ ”或“ ”）连
接酶将 基因与载体 相连，构成重组载体 。


[解析] 通过PCR技术扩增出的 基因的末端为平末端，载体 中有限制酶
、 、 、 的酶切位点，用限制酶 、 切割载
体 得到的均为黏性末端，而用限制酶 和 切割载体 得到的均是平
末端,但不能用限制酶 进行酶切，若用限制酶 进行酶切，无法将目的
基因插入载体 中，因此，应选用 酶将载体 切开，再用能连接平末端的
连接酶将 基因与载体 相连，构成重组载体 。
②载体 不具有表达 基因的________和________。选用_______________酶组合
对载体 和载体 进行酶切，将切下的 基因和载体 用DNA连接酶进行连接，
将得到的混合物导入用____离子处理的大肠杆菌，筛出 工程菌。
启动子
终止子
和
钙
[解析] 载体 不具有表达 基因的启动子和终止子。再选用 和 酶组合对载体 和载体 进行酶切，将切下的 基因和载体 用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入用钙离子处理的大肠杆菌中，筛出 工程菌。
考点3 DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）原理
（2）方法步骤
深度思考
1.能否选择哺乳动物的成熟红细胞作为DNA粗提取的实验材料，为什么？
提示 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体等，不含DNA。
2.DNA的粗提取实验中，过滤时能否用滤纸代替纱布？
提示 不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
1.进行“DNA的粗提取”实验时为获得较好的提取效果,应离心2次,第一次离心后应保
留上清液,第二次离心后应弃去上清液,且两次离心的转速也不相同。( )
√
2.PCR实验中使用的微量离心管、枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。( )
√
3. 聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合
酶。( )
√
4.PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。( )
×
5.电泳鉴定PCR产物时,应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的
混合液。( )
×
命题点1 DNA的粗提取与鉴定
1.[2022山东]关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在 冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B
[解析] 低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在 冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可能不溶于酒精，在体积分数为 的冷酒精中与DNA同时析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
命题点2 DNA片段的扩增与电泳鉴定
2.[2023烟台检测]正常情况下， 基因只在胎盘组织和脑组织中表达，为了探究
基因在肝癌细胞中的表达情况，实验小组分别提取肝癌组织和正常组织细胞的RNA，以
RNA为模板指导合成单链 ，再将获得的 进行电泳，电泳结果如表所示。下列相
关叙述正确的是( )
表达 基因样本 正常肝组织样本 肝癌样本1 肝癌样本2 肝癌样本3
__________ __________ __________ __________
A.以RNA为模板合成 时需要加入RNA聚合酶
B.以RNA为模板合成的 中的嘌呤数目和嘧啶数目相等
C. 基因的表达情况可作为肝细胞是否癌变的检测依据
D.该实验也可以直接提取肝组织细胞中的DNA后再进行电泳
C
[解析] RNA聚合酶的作用是促进RNA的合成，因此合成 时，不需加入RNA聚合酶，A错误；以RNA为模板形成的 为单链DNA，并无碱基互补配对，因此不一定存在嘌呤数目和嘧啶数目相等的现象，B错误；由题意可知，正常肝组织细胞中无 基因的表达，而肝癌组织细胞中有 基因的表达，因此该基因的表达情况可以作为肝细胞是否癌变的检测依据，C正确；直接从肝组织细胞中提取出来的DNA链过长，在电泳过程中移动较慢或者不移动，不易观察，D错误。
1.[2022辽宁]抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管
转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。
下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
[解析] 预变性的温度为 ，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易
和引物结合，不能进行复制，A错误。延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了
延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确。延伸过程需要引物与模板链结合,
在引物的 端加上相应的核苷酸，C错误。转基因品种经检测含有目的基因且已经
表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后
才能上市，D错误。
√
2.[2021山东]粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所
得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出
DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B. 的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 的冷却的酒精
D.加入 调节浓度至 过滤→调节滤液中 浓度至
A
[解析] 木瓜蛋白酶能够分解蛋白质，故在得到的滤液中加入适量的木瓜蛋白酶后容
易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A符合题意。将制备的含有DNA的滤液
放入 的水浴箱中保温10～15分钟，利用DNA和蛋白质对高温的耐受性不
同，使蛋白质变性，从而更好地与DNA分离，B不符合题意。DNA不溶于体积分数
为 的冷却的酒精，因此向含有DNA的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数
为 的冷却的酒精后DNA会析出，不能得到DNA相对含量较高的白色丝状物，C
不符合题意。DNA在 的 溶液中的溶解度最低，因此将含DNA的
溶液调至 ，滤液中几乎不含DNA，D不符合题意。
3.[2022辽宁节选，10分]某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达 蛋白胞
外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对 蛋白胞外段特异性结合的能力。 蛋白
胞外段抗原制备，流程如图。
（1）构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，目的是____
________________________________________________。用脂质体将重组慢病毒质
粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体____________（填“双分子层中”
或“两层磷脂分子之间”）。
筛选出含目的基因（ 蛋白胞外段基因）的病毒包装细胞
双分子层中
[解析] 构建重组慢病毒质粒时，选用氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，将病毒包装细胞在含有氨苄青霉素的培养基上培养，就可以将含有目的基因（ 蛋白胞外段基因）的病毒包装细胞筛选出来。用脂质体将重组慢病毒质粒与辅助质粒导入病毒包装细胞，质粒被包在脂质体的双分子层中。
（2）质粒在包装细胞内组装出由____________________________________________
__________组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化 蛋白胞
外段。
蛋白胞外段基因重组慢病毒质粒、辅助质粒和蛋白质外壳
[解析] 质粒在包装细胞内组装出由 蛋白胞外段基因重组慢病毒质粒、辅助质粒和蛋白质外壳组成的慢病毒，用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化 蛋白胞外段。
4.[2021江苏，11分]某小组为研究真菌基因 的功能，构建了融合表达蛋白 和 标签
的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
（1）目的基因的扩增：
①提取真菌细胞______，经逆转录获得 ,进一步获得基因 片段。
RNA
②为了获得融合 标签的蛋白 ，设计引物P2时，不能包含基因 终止密码子的
编码序列，否则将导致______________________。
蛋白 上不含 标签
[解析] 从构建好的重组质粒来看， 序列位于目的基因下游，若设计的引物P2上
包含基因 终止密码子的编码序列,则获得的蛋白 上不含 标签。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除 聚合酶（ 酶）以外
的各成分混合后，加热到 以上再混入酶，然后直接从 开始PCR扩增。下列
叙述正确的有_____。
A. 酶最适催化温度范围为
B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从 端向 端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了 酶的特异性
BC
[解析] 从构建好的重组质粒来看， 序列位于目的基因下游，若设计的引物P2上
包含基因 终止密码子的编码序列,则获得的蛋白 上不含 标签。③由题中信息
“加热到 以上 扩增”可知， 酶的最适催化温度在 左右，A错
误； 酶不具有特异性，D错误。
（2）重组质粒的构建：
①将 切开的载体A与添加同源序列的 混合，用特定DNA酶处理形成黏性末
端，然后降温以促进__________________，形成 结合体。将 结合体导
入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及__________酶等，完成质粒的环化。
黏性末端碱基配对
DNA连接
②若正确构建的重组质粒 仍能被 切开，则 的酶切位点可能在
_______________________________。
基因 的连接处、基因 的内部
[解析] 由题图可知,载体A上只有一个 的酶切位点，用 将载体A切开，
用特定的DNA酶处理形成黏性末端，则载体A上 的酶切位点不存在了。若正
确构建的重组质粒 仍能被 切开，则 的酶切位点可能在基因
内部，也可能在基因 的连接处。
（3）融合蛋白的表达：
①用含有尿嘧啶的培养基培养 基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒
,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是___________
_________________________________________________________________________。
受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有 基因可以长成菌落
[解析] 筛选获得目的菌株的机理是导入重组质粒 的菌株由于含有 基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而 基因缺失型酵母在无尿嘧啶的培养基上不能存活。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含 标签，说明______________，
后续实验可借助 标签进行蛋白 的分离纯化。
融合基因表达
[解析] 若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含 标签，说明融合基因表达。
一、选择题
1.[2022延安检测]下列关于基因工程的叙述错误的是( )
A.基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，在体外进行的操作技术
B.基因工程是在分子水平上进行设计和施工的
C.基因工程赋予生物新的遗传特性，可以创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
D.基因工程常用的载体质粒中含有两个游离的磷酸基团
D
[解析] 基因工程是按照人们的愿望，进行严格的设计，在体外进行的操作技术，基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，A、B正确；基因工程赋予生物新的遗传特性，可以创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，C正确；质粒为环状的DNA分子，不含有游离的磷酸基团，D错误。
2.[2023湖南模拟]限制性内切核酸酶 的识别序列及切割位点是&14& ，用
完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约
为( )
A. B. C. D.
C
[解析] 据图可知， 的识别序列有6个核苷酸，由于DNA分子的碱基组成为
A、 、 、C，则某一位点出现该序列的概率为 ，即约4 000个
碱基对可能出现一个限制酶 的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长
度（碱基对）约为 ，C符合题意。
3.[2022赣州检测]如图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下列表示限制
酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用图解的正确顺序的是( )
A.①②③④ B.①②④③ C.①④②③ D.①④③②
C
[解析] 图中①表示切割DNA片段，并且形成了黏性末端，需要用限制酶；②表示将两个DNA片段连接起来，需要用DNA连接酶；③表示解旋过程，需要用解旋酶；④表示DNA复制过程，需要用DNA聚合酶。综上分析，C符合题意。
4.[2023孝感检测]PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶
电泳来鉴定，下列有关叙述错误的是( )
A.PCR及电泳过程中用到了多种缓冲液，PCR反应的缓冲液中一般要添加 用于
激活DNA聚合酶，凝胶中的DNA可用紫外灯进行检测
B.用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割前后长度可能不发生变化，此时无法
通过电泳检测质粒是否被切开
C.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
D.采用PCR技术对一个DNA进行扩增，第 次循环共需要引物 个
C
[解析] 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活，因此PCR反应的缓冲液中
一般要添加 ，凝胶中的DNA可用紫外灯进行检测，A正确。用一种限制酶切割
用于构建基因表达载体的质粒后，质粒由环状的DNA分子变为线状的DNA分子，此
时酶切前后质粒长度不发生变化，无法通过电泳检测质粒是否被切开，B正确。PCR
反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，C错误。PCR
技术扩增时，每一轮循环每个DNA分子的每条模板链都需要一个引物，故第 次循环
共需要引物为 个，D正确。
5.研究人员比较了不同储藏条件对棉叶DNA纯度及提取率（提取率越高，获得的
DNA越多）的影响，实验结果如图所示。下列有关叙述错误的是( )
A.提纯DNA时可加入体积分数为 的酒精去除蛋白质等物质
B.从新鲜棉叶中提取的DNA纯度最高，但提取DNA的量不是最多的
C.用二苯胺试剂鉴定，蓝色最深的是冷冻 处理后提取的DNA
D.DNA在 溶液中的溶解度随溶液浓度的不同而不同
A
[解析] DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，所以DNA的粗提取和鉴
定实验中，提纯DNA时，加入冷却的体积分数为 的酒精可以去除部分蛋白质，
形成含杂质较少的DNA丝状物，A错误；由图可知，从新鲜棉叶中提取的DNA纯度
和冷冻 处理后提取的DNA纯度接近，但提取率明显较冷冻 处理后的提取率低，
因此从新鲜棉叶中提取DNA的量不是最多的，B正确；由图可知，从冷冻 的棉叶
中提取的DNA量是最多的，因此用二苯胺试剂鉴定时颜色最深，C正确；DNA在不
同浓度 溶液中的溶解度不同，DNA在 的 溶液中的溶解度最低，
高于或低于该浓度，DNA的溶解度都会增大，D正确。
6.[2022青岛调研，多选]DNA片段有 发生变性时的温度称为熔解温度 。变
性梯度凝胶电泳 是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。
的凝胶中沿电场方向变性剂含量递增，当DNA片段通过这种变性剂递增的凝
胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生改变，可使核苷酸序列不同的DNA
片段分开。下列说法正确的是( )
A. 的大小主要取决于DNA分子中 、 含量的多少
B. 不能用来检测DNA分子中碱基是否发生改变
C.变性剂含量的改变会影响DNA分子中氢键的断裂
D.提高电泳温度有利于DNA分子变性，提高分离效率
AC
[解析] 、C之间有三个氢键，而A、 之间有两个氢键， DNA分子中 、C含量
越高，则DNA分子的热稳定性越高，因此 的大小主要取决于DNA分子中 、C
含量的多少，A正确；据题干信息“变性梯度 片段分开”可知，DNA分子中碱基
发生改变，则进行变性梯度凝胶电泳时，该DNA分子的电泳迁移率在某些区域会发
生改变，即 能用来检测DNA分子中碱基是否发生改变，B错误；由题意可知，
变性剂会使DNA分子的氢键断裂从而熔解DNA片段，故变性剂含量的改变会影响DNA
分子中氢键的断裂，C正确；根据熔解温度的概念和 的原理可知，提高电泳温度
一般对分离效率无影响，D错误。
7.[2023大同检测]为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花细胞中。
下列操作与实验目的不符的是( )
C
A.用限制性内切核酸酶 和DNA连接酶构建重组质粒
B.用含 基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将 基因导入细胞
C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D.用PCR技术检测 基因是否整合到菊花染色体上
[解析] 根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知，用限制性内切核酸酶 和
DNA连接酶构建重组质粒，A正确；将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；图2中显示标记基因是潮霉素抗性基因，因此可在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误；可采用PCR技术检测C基因是否整合到菊花染色体上，D正确。
8.[2022山东质检]杨树被根瘤农杆菌感染后会长出瘤状物，称
为冠瘿瘤，冠瘿瘤内的冠瘿碱是一种含氮有机物，它是根瘤农
杆菌生存所需的碳源和氮源。冠瘿瘤的形成是由于根瘤农杆菌
携带天然的 质粒，该质粒的结构如图所示。下列说法错误
的是( )
C
A. 质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用
B. 质粒上的 区域至少含有一个限制酶的切割位点
C.冠瘿碱合成基因在根瘤农杆菌细胞中表达并分泌到细胞外
D.根瘤农杆菌内 质粒的存在决定了其感染植物的范围
[解析] 质粒上的生长素基因可随 整合到杨树细胞的染色体DNA上，并进行表达，故 质粒上的生长素基因可在杨树生长发育过程中发挥作用，A正确； 质粒上的 区域至少含有一个限制酶的切割位点，以便转入目的基因，B正确；冠瘿碱合成基因会随 整合到杨树细胞的染色体DNA上，并在杨树细胞中表达，C错误；根瘤农杆菌内 质粒的存在决定了其能感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，D正确。
二、非选择题
9.[2023重庆联考，15分]通过咽拭子取样进行 检测是目前临床上诊断新冠
病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸检测的 试剂盒的部分工作原理简
图如下:
（1） 是指以病毒的RNA为模板通过________合成 ，并对 进行
PCR扩增的过程。利用 试剂盒进行核酸检测时，除借助上述 技
术外，还需要有特异性探针，利用该探针进行核酸检测的原理是__________。若用
技术扩增胰岛素基因，应选择_______细胞提取RNA。
逆转录
分子杂交
胰岛B
[解析] 以RNA为模板合成 的过程为逆转录过程。制作特异性探针依据的是新冠病毒的核苷酸序列，利用该探针进行核酸检测的原理是分子杂交。若用 技术扩增胰岛素基因，应选择胰岛B细胞提取RNA。
（2）与体内DNA复制相比，PCR时不需要______酶。利用PCR技术扩增目的基因的
前提是__________________________________。
解旋
要有一段已知目的基因的核苷酸序列
[解析] 利用PCR技术扩增目的基因时，在高温条件下，DNA双链可解旋成单链，因此与体内DNA复制相比，PCR时不需要解旋酶。
（3）若将一个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。

[解析] 利用PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数的计算公
式为 ，因此，若将一个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入
个引物。
（4）PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性是指______
______________________________________。
延伸
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
[解析] PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性是指两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
10.[2023广西检测，15分]某种荧光蛋白 在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧
光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋
白 基因连接在 基因的 末端，获得了 融合基因（简称为甲），
并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，
图中 四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种限制酶是
_________。使用这两种限制酶进行酶切是为了保证__________，也是为了保证____
______________。
和
甲的完整
甲与载体正确连接
[解析] 为了使目的基因在受体细胞中表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有
终止子。甲（ 融合基因）是将某种病毒的外壳蛋白 基因连接在
基因的 末端获得的，再结合图示分析可知，将甲插入质粒P0时，如果用限制酶
或 进行切割，则甲会被破坏，而使用 和 这两种限制酶进行酶切既保证了甲
的完整，也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是 和 。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说
明 基因在牛的皮肤细胞中完成了______和______过程。
转录
翻译
[解析] 构建的真核表达载体P1中含有 基因，而 基因的表达产物是某种荧光蛋白 ，该种荧光蛋白在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明 基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括将能够产生绿色荧光的细胞的
________移入牛的______________中，然后进行体外培养、胚胎移植等。
细胞核
去核卵母细胞
[解析] 若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，再将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，最后进行胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR技术进行鉴定。
在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）
作为PCR模板。
核DNA
[解析] PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的技术。若利用PCR检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
11.[2023昆明质检，15分]如图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所
指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中 基因编码产生的酶可以分解培养
基中的 ，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。
回答下列问题。
（1）过程①选用限制酶的最佳方案是___。
A. 和 B. 和
C. 和 D.只有
B
[解析] 为了酶切目的基因，可以选择 和 、 和 、
和 这些限制酶组合，为了酶切质粒载体，可以选择 和
，不能选择 ，否则会破坏青霉素抗性基因，影响筛选，因此构建重
组质粒时选用限制酶的最佳方案是 和 ,故选B。
（2）构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作
用是______________________________________________________。
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动目的基因转录出mRNA
[解析] 构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动目的基因转录出mRNA。
（3）为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中
额外加入________和________，培养一段时间后挑选出______（填“蓝色”或“白色”）
的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。实验室中通过发酵工程可以对目的菌进
行扩大培养，一般选用______（填“液体”或“固体”）培养基，理由是_____________
_______________________________________________________。
青霉素

白色
液体
大肠杆菌能与液体培养基中的营养物质和氧气充分接触，有利于其大量繁殖
[解析] 转基因成功的大肠杆菌内含有青霉素抗性基因且 基因被破坏，因此需要
在培养基中加入青霉素和 ；无 基因，则菌落呈白色，有青霉素抗性基
因，则在含青霉素的培养基中能存活，因此若出现白色菌落，则说明基因表达载体
成功转入大肠杆菌。实验室中通过发酵工程可以对目的菌进行扩大培养，一般选用
液体培养基，这样大肠杆菌能与液体培养基中的营养物质和氧气充分接触，有利于
其大量繁殖。
（4）目的基因导入受体细胞后，常用________________技术检测目的基因是否翻译
出乙肝病毒外壳蛋白。
抗原—抗体杂交
[解析] 目的基因导入受体细胞后，检测目的基因是否翻译出蛋白质可用抗原—抗体杂交技术。
一、选择题
12.[2023南京六校调研]大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构
改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应
即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮P
CR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
D
A.两轮PCR过程中复性时的温度一样
B.单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C.第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR的产物——DNA的两条链
D.利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
[解析] 单核苷酸的定点诱变需进行两轮PCR反应，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，为了使引物与模板链准确配对，第二轮PCR的复性温度应比第一轮的高，A错误；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；由图可知，第二轮
PCR需加入另一种侧翼引物，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
13.[多选]用 和 两种限制酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产
物分离结果如图1和图2所示。以下叙述错误的是( )
BC
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中泳道②的酶切产物说明该限制酶断开了6个磷酸二
酯键
C.若用两种限制酶同时切割该DNA，电泳后泳道中将出现
7条条带
D.图2泳道①中是用 处理得到的酶切产物
[解析] 不同的限制酶识别并切割的核苷酸序列不同，图1中两种酶识别的核苷酸序列
不同，A正确。分析图1和图2可知，泳道②是限制酶 的酶切结果，该DNA片
段共有2个该限制酶酶切位点，所以断开了4个磷酸二酯键，B错误。由题图可知，若
用两种限制酶同时切割该DNA，该DNA的每个酶切位点都会被切开，则将被切成6
个片段，如果6个片段分子大小不同则在泳道中出现6条条带；如果其中有片段分子
大小相同，则条带数目小于6条，C错误。根据图2分析泳道①中是用 处理（其
有3处切割位点，切割后产生4个DNA片段）得到的酶切产物，D正确。
14.[2023南通检测，多选] 细胞疗法是通过设计 基因，导入癌症患者的
细胞中，使其转化为 细胞， 细胞膜上的 蛋白与癌细胞表面
抗原特异结合后，激活 细胞使其增殖、分化，从而实现对癌细胞的特异性
杀伤和记忆，主要过程如图。肿瘤浸润淋巴细胞是对肿瘤起识别、抵抗和攻击作用
的细胞群体。下列说法正确的是( )
A.胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞
B. 基因缺少启动子，无法在 细胞中复制，故过程②在导入 细胞前完成
C.重组分子导入 细胞后，应当用PCR技术检验指导 合成的基因是否表达成功
D. 细胞疗法具有持久性是因为 细胞能够在体内形成记忆细胞
√
√
[解析] 由题意可知， 细胞膜上的 蛋白可与癌细胞表面抗原特异结合，因此 蛋白的胞外结合区DNA序列可来自患者自身的肿瘤浸润淋巴细胞，A正确；启动子能启动目的基因的转录， 基因缺少启动子，无法在 细胞中转录，故过程②在导入 细胞前完成，B错误；通过PCR技术可以检测目的基因是否成功插入或转录出mRNA，不能检验指导 合成的基因是否表达成功，C错误；由图可知， 细胞能够在体内形成记忆细胞，因此 细胞疗法具有持久性，D正确。
二、非选择题
15.[2023河南模拟，13分]科研人员通过转基因技术培育出超量表达 蛋白的转基因
甜玉米。在超量表达 基因载体的构建中，含 基因的DNA片段以及 质粒的酶切
位点如图所示，其中强启动子能驱动基因的持续转录。请回答下列问题。
限制酶 识别序列






（1）以RNA为模板，通过 技术可获取 基因。进行 时需加入的
酶有______________________________。为了特异性扩增 基因序列，需根据_____
_________________设计特异性引物。
逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
基因两端的碱基序列
[解析] 以RNA为模板获取 基因需要用到逆转录酶，进行PCR时需要用到耐高温的DNA聚合酶。为了特异性扩增 基因序列，需根据 基因两端的碱基序列设计特异性引物。
（2）在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是_________和_______，这样操
作不仅使 基因在玉米植株中超量表达，还可利用 的________特性，最终
使 基因____________________________。


可转移
整合到玉米细胞染色体DNA上
[解析] 在构建基因表达载体时，要想使 基因在玉米植株中超量表达，需要把强启
动子和 基因一起切割下来，再结合含 基因的DNA片段以及 质粒的酶切位点可
知，基因上游需要用限制酶 切割，基因下游含限制酶 和 的酶
切位点，在质粒中， 的酶切位点在 的酶切位点的左侧，终止子在右
侧，如果用 、 切割，目的基因和质粒连接后， 基因不在启动子和
终止子之间，因此在构建基因表达载体时，应优先选用的限制酶是 和
。 是 质粒上的一个可转移的DNA片段。如果将目的基因插入 质
粒的 上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将
其插到植物细胞中染色体的DNA上。
（3）对转基因再生玉米植株进行鉴定时发现，有些植株虽有 基因，但几乎没有
蛋白，出现该现象的原因可能有_____________________________________________
_______________________________________________________________________。
基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是 基因保持沉默，不能有效表达（合理即可）
[解析] 有些植株虽有 基因，但几乎没有 蛋白，出现该现象的原因可能有基因转化过程中强启动子可能丢失或断裂，未能真正转化成功；虽然转化成功，但是 基因保持沉默，不能有效表达等。
16.[2023成都市七中零诊，15分]人乳铁蛋白
对细菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人员
开展人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体构建及
转染研究，主要流程如图。 过程需先进
行逆转录合成 ，然后再进行PCR。图中
、 、 、 代表相关限制
酶酶切位点， 为新霉素抗性基因， 基因为B乳铁蛋白基因， 基因为绿
色荧光蛋白基因。请回答：
（1）过程①不能从人肌肉细胞中提取RNA用于 ，是因为_______________
_______________。在 过程中，加入的引物需在___端添加______________
__两种限制酶的识别序列，以便 基因插入 质粒中。
基因在人肌肉细胞中不表达

和
[解析] 由于 基因在人肌肉细胞中不表达，因此过程①不能从人肌肉细胞中提取RNA用于 。根据质粒的复制方向和过程②构建的重组质粒中目的基因两侧限制酶的识别序列可知，在 过程中，加入的引物需在 端添加 和 两种限制酶的识别序列，以便 基因插入 质粒中。
（2）过程②中， 基因插入 基因之后的目的是_________________________
_______________________________。
使 基因在山羊乳腺上皮细胞中表达（或使目的基因表达）
[解析] 过程②中， 基因在复制原点之后、终止子之前，故 基因插入 基
因之后的目的是使人乳铁蛋白基因在山羊的乳腺细胞中表达。
（3）过程③中利用磷脂分子构成脂质体介导的机理是__________________________
________________________________________________________。
我们还学过利用__________法将基因表达载体导入动物受体细胞。
利用生物膜的流动性使脂质体与山羊乳腺上皮细胞融合，从而将（重组）质粒导入受体细胞
显微注射
[解析] 利用生物膜的流动性使脂质体与山羊乳腺上皮细胞融合，将重组质粒导入受体细胞。显微注射法也可将基因表达载体导入动物受体细胞。
（4）将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的细
胞应该是导入_____________________的细胞，再利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮
细胞中________________，以筛选出转染成功的细胞。
质粒、 质粒
是否有绿色荧光
[解析] 质粒上有新霉素抗性基因，可使导入质粒的细胞在含新霉素的培养基中
生存，将转染后的山羊乳腺上皮细胞先置于含新霉素的培养液中培养，能够存活的
细胞应该是导入 质粒或 质粒的细胞； 质粒上有绿色荧光蛋白基因，
可使细胞产生绿色荧光，利用荧光显微镜观察山羊乳腺上皮细胞中是否有绿色荧光，
以筛选出转染成功的细胞。
（5）科研过程中，也可以用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取
转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩
增产物中除目的基因外，还有其他不同大小的非目的基因片段，可能的原因一般有
______。
①模板受到污染 ②复性温度过高
③引物太短 ④延伸温度偏低
①③
[解析] 模板受到污染和引物太短可能会使扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小的非目的基因片段，故提取转染后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他片段，故可能的原因一般有①③。