2017-2018学年高中生物人教版 选修3 专题1 基因工程 1.2基因工程的基本操作程序
一、单选题
1．下列关于基因表达载体构建的相关叙述中，不正确的是（ ）
A．需要限制酶和DNA连接酶
B．抗生素抗性基因可作为标记基因
C．在细胞外进行
D．启动子位于目的基因的首端，是启动翻译的一段DNA
【答案】D
【知识点】基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】A、构建基因表达载体过程中需要用限制酶切割目的基因和载体，最后用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，A不符合题意；
B、抗生素抗性基因可以用作标记基因，B不符合题意；
C、基因表达载体的构建过程一般在体外进行，C不符合题意；
D、启动子位于目的基因的首端，是启动转录的一段DNA，D符合题意。
故答案为：D
【分析】理清基因表达载体中启动子、终止子的来源：
①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子，
②如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
2．关于基因工程下列说法正确的有（ ）
①重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工
③限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列
④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上
⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体
A．2项 B．3项 C．4项 D．5项
【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具简介
【解析】【解答】基因工程中常用的工具酶有DNA连接酶、限制性核酸内切酶，载体不属于工具酶，①不符合题意；基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②符合题意；一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，③⑤不符合题意；目的基因进入受体细胞需要检测和鉴定，不一定能成功实现表达，④不符合题意；基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上，⑥符合题意；可以做载体的有质粒、动植物病毒、噬菌体，⑦不符合题意。
故答案为：A
【分析】理清DNA重组技术的基本工具：
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
(3)载体
种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
3．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法不正确的是（ ）
A．X是能合成胰岛素的细菌细胞
B．质粒是细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA
C．目的基因与质粒的重组只需要DNA连接酶
D．该细菌的性状被定向改造
【答案】C
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、根据题意和图示分析可知：重组质粒导入的是细菌细胞，所以X是能合成胰岛素的细菌细胞，A不符合题意；
B、质粒作为载体需要有多个限制酶切点以便转运多种目的基因，同时具有标记基因以便于检测目的基因是否导入到受体细胞内，B不符合题意；
C、基因与载体的重组需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C符合题意；
D、基因工程的特点是能够定向改造生物的性状，D不符合题意。
故答案为：C
【分析】在对基因表达载体构建时，要注意用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。
4．（2016高二下·定州期末）下列有关基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶能将碱基对之间的氢键连接起来
B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变
C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大
D．Taq酶是PCR过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶
【答案】C
【知识点】基因工程的概述
【解析】【解答】解：A、DNA连接酶将DNA分子之间的磷酸二酯键连接起来，A不符合题意；
B、目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因重组，B不符合题意；
C、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，所以识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大，C符合题意；
D、Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶，D不符合题意．
故选：C．
【分析】a、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体，其中限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；DNA连接酶的作用是连接具有相同黏性末端的DNA片段以形成重组DNA分子；运载体的作用将目的基因导入受体细胞．
b、PCR技术扩增DNA的条件：模板（已知序列的DNA）、原料（四种脱氧核苷酸）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
5．（2015高二下·东莞期中）基因工程是在DNA分子水平进行设计施工的，在基因操作的以下步骤中，不进行碱基互补配对的是（ ）
①人工合成目的基因
②E．coliDNA连接酶结合目的基因与运载体
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测和表达
⑤个体生物学水平的鉴定
A．①③ B．①⑤ C．③⑤ D．②③④
【答案】C
【知识点】基因工程的概述
【解析】【解答】解：①人工合成目的基因的方法是逆转录法，需要进行碱基互补配对，正确；
②目的基因与运载体结合时，进行碱基互补配对，正确；
③将目的基因导入受体细胞，不进行碱基互补配对，错误；
④检测目的基因时需要用到基因探针，进行碱基互补配对；基因表达包括转录和翻译过程，都要进行碱基互补培养，正确；
⑤个体生物学水平的鉴定不需要碱基互不配对原则，错误．
故选：C．
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定．其中人工合成目的基因、基因表达载体的构建、目的基因的检测都进行碱基互补配对原则．
6．（2015高二下·邹平期中）在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）
A．540个 B．8100个 C．17280个 D．7560个
【答案】B
【知识点】DNA分子的结构；DNA分子的复制
【解析】【解答】解；由题意知，目的基因含有1000个碱基对，即2000个脱氧核糖核苷酸，其中腺嘌呤脱氧核糖核苷酸为460个，那么该DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸=（2000﹣460×2）÷2=540个，DNA扩增仪中扩增4代，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（24﹣1）×540=8100个．
故选：B．
【分析】计算DNA分子复制过程中需要的某种游离的脱氧核糖核苷酸数量，先根据DNA分子的碱基互补配对原则计算出DNA分子中该脱氧核糖核苷酸的数量，然后用DNA该脱氧核糖核苷酸的数量乘以增加的DNA分子数．
7．若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ（A↓GATCT）、EcoRⅠ（G↓AATTC）和Sau3AⅠ（↓GATC）。下列分析合理的是（ ）
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，A不符合题意；
B、用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连接，B不符合题意；
C、用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，也能产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，C不符合题意；
D、只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，防止发生反向连接，这样目的基因插入载体后，RNA聚合酶的移动方向肯定与图丙相同，D符合题意。
故答案为：D
【分析】与DNA相关的五种酶的比较:
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
8．（2017高二下·福州期中）下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，正确的是（ ）
A．同一物种的cDNA文库只有1种
B．某真核生物的cDNA文库中的某基因一定比基因组文库中的该基因短
C．可以利用反转录法获取cDNA文库和基因组文库
D．只有cDNA文库的基因可实现物种间的基因交流
【答案】B
【知识点】基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】解：A、cDNA文库只包含该物种部分基因，因此同一物种的cDNA文库不只1种，A错误；
B、真核生物的基因组文库中的基因含有内含子、启动子、终止子等，而真核生物的cDNA文库的基因中不含有这些，因此某真核生物的cDNA文库中的某基因一定比基因组文库中的该基因短，B正确；
C、可以利用反转录法获取cDNA文库，但不能获得基因组文库，C错误；
D、cDNA文库的基因都可实现物种间的基因交流，基因组文库的部分基因也可实现物种间的基因交流，D错误．
故选：B．
【分析】cDNA文库和基因文库的比较表：
文库类型 cDNA 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流 可以 部分基因可以
9．下表是外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
A．①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
【答案】A
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】第①组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。说明了外源基因插入位置是c；第②组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏。说明了外源基因插入位置是b；③细胞不能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。说明了外源基因插入位置是a。
故答案为：A
【分析】根据质粒的特点确定限制酶的种类：
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
10．（2017高二下·汉中期中）下列属于PCR技术的条件的是（ ）
①单链的脱氧核苷酸序列引物
②目的基因所在的DNA片段
③脱氧核苷酸
④核糖核苷酸
⑤DNA连接酶
⑥DNA聚合酶
⑦DNA限制性内切酶
A．①②③⑤ B．①②③⑥ C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦
【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】解：①PCR需要一对引物，即一对单链的脱氧核苷酸序列引物，①正确；
②PCR需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；
③需要脱氧核苷酸作为原料，③正确；
④核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；
⑤采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，⑤错误；
⑥体外合成DNA时，需要DNA聚合酶，⑥正确；
⑦体外合成DNA时，不需要限制性内切酶，⑦错误．
故选：B．
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术．PCR技术的原理是DNA复制，需要的条件有：模板DNA（目的基因所在的DNA片段）、原料（四种脱氧核苷酸）、一对引物（单链的脱氧核苷酸序列）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
11．下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是
（ ）
A．这三种方法都用到酶，都是在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．图示a、b、c三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶（方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶、方法b需要限制酶、方法c需要DNA聚合酶），A符合题意；
BC、图示方法a为逆转录法，得到的目的基因①不含有内含子，方法b为直接分离目的基因，方法c为人工合成法，得到的目的基因③的碱基序列可能有多种，由于密码子的简并性，三种方法得到的目的基因中碱基对排列顺序不一定相同，故B、C不符合题意；
D、方法a逆转录法属于中心法则的内容，D不符合题意。
故答案为：A
【分析】理清目的基因获取的方法：
①从基因文库中获取
基因文库包括：基因组文库和部分基因文库(其中的cDNA文库是利用反转录法获取的)。
②利用PCR技术扩增
a．变性(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链。
b．复性(55～60℃)：引物与DNA模板结合，形成局部双链。
c．延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的子链。
d．循环重复上述过程， n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。
③利用化学方法人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知时，选择该方法。
12．（2016高二下·黑龙江开学考）以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图．据图分析，下列说法正确的是（ ）
A．催化①过程的酶是DNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都必须能耐高温
D．过程③需要解旋酶
【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】解：A、①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，A错误；
B、④为复性过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，B正确；
C、图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶不耐高温，C错误；
D、过程③为高温解链，该过程不需要解旋酶，D错误．
故选：B．
【分析】分析题图：图示为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图，其中①是由RNA形成单链DNA的过程，为逆转录过程；②是以单链DNA合成双链DNA的过程，是DNA分子复制过程；③④⑤是多聚酶链式反应扩增DNA片段，其中③是变性、④是复性、⑤是延伸阶段．
二、非选择题
13．据图回答有关基因工程的问题：
（1）图中正在构建基因表达载体，构建时所需的工具酶有 和 。
（2）一个完整的基因表达载体包括四部分，分别是启动子、 、 、 。
（3）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是 识别与结合的位点，促进转录的开始。
（4）如果要将此表达载体导入大肠杆菌细胞中，通常要用 对大肠杆菌处理，使之变成 细胞。该细胞的特性是 。
【答案】（1）同种限制酶；DNA连接酶
（2）终止子；标记基因；目的基因
（3）RNA聚合酶
（4）CaCl2或Ca2+；感受态；能主动吸收周围环境中游离的DNA分子
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，在构建时所需的工具酶是同种限制酶和DNA连接酶．（2）一个完整的基因表达载体包括四部分，分别是启动子、终止子、标记基因和目的基因．（3）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别与结合的位点，促进转录的开始．（4）如果要将此表达载体导入大肠杆菌细胞中，通常要用CaCl2对大肠杆菌处理，使之变成感受态细胞，从而能主动吸收周围环境中游离的DNA分子。
故答案为：（1）同种限制酶和DNA连接酶（2）终止子 标记基因 目的基因（3）RNA聚合酶（4）CaCl2或Ca2+感受态 能主动吸收周围环境中游离的DNA分子
【分析】基因表达载体的构建：
①通常用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。
②组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点。
14．荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针,与染色体上对应的DNA片段结合,从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题:
（1）DNA荧光探针的制备过程如图1所示,DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的 键从而产生切口,随后在DNA聚合酶Ⅰ作用下,以荧光标记的 为原料,合成荧光标记的DNA探针。
（2）图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸,使DNA双链中 键断裂,形成单链。随后在降温复性过程中,探针的碱基按照 原则,与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有 条荧光标记的DNA片段。
（3）A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组,已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲（AABB）与植物乙（AACC）杂交,则其F1有丝分裂中期的细胞中可观察到 个荧光点;在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到 个荧光点。
【答案】（1）磷酸二酯；脱氧核苷酸
（2）氢；碱基互补配对；4
（3）6；2和4
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）两个核苷酸分子之间以磷酸二酯键连接。合成标记的DNA探针时,需要的原料是脱氧核苷酸。（2）高温可使DNA双链碱基之间的氢键断裂,形成单链。在降温复性的过程中,按照碱基互补配对原则,探针的碱基与染色体上特定的基因序列形成杂交分子。1个DNA分子的两条链可分别与探针的单链结合,出现2个荧光点,两条姐妹染色单体中含2个DNA分子,故最多可有4条荧光标记的DNA片段。（3）植物甲（AABB）与植物乙（AACC）杂交,则F1为AABC,即含2个A染色体组、1个B染色体组和1个C染色体组。其中的2个A染色体组、1个B染色体组中各有1条染色体（共3条染色体）被荧光探针标记,则其在有丝分裂中期时,有6条染色单体上出现荧光点,即可观察到6个荧光点。减数第一次分裂形成的两个子细胞中含染色体组有AB和AC两种情况,含A、B两个染色体组的子细胞中可观察到有4个荧光点,含A、C两个染色体组的子细胞中可观察到有2个荧光点。
【分析】理清目的基因的检测与鉴定的方法：
①分子水平的检测
a．利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。
b．利用分子杂交技术检测目的基因的转录。
c．利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。
②个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。
15．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 （基团）连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有 种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。
（5）有关质粒描述错误的是（ ）
A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子
B、质粒是唯一的载体
C、质粒上有多个酶切位点
D、质粒可在宿主外单独复制
【答案】（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖
（2）平；537bp、790bp、661bp
（3）4
（4）BamH I；抗生素B；同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
（5）B、D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖连接。（2）限制酶SmaⅠ的酶切位点是CCC↓GGG，其切割产生的是平末端。图1中DNA片段含有两个SmaⅠ酶切位点，被SmaⅠ酶完全切割后出现三个长度的片段，分别是537bp、790bp、661bp．（3）杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537bp、790bp、661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后会形成四种不同的DNA片段。（4）基因表达载体构建的过程中需要利用限制酶和DNA连接酶。限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和载体。用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养。由于同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接，这样会导致部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达。（5）质粒是能够自我复制的环状DNA分子，质粒上有多个酶切位点，病毒也可以作为载体，质粒必须在宿主细胞内复制。
【分析】与DNA相关的五种酶的比较：
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
1 / 12017-2018学年高中生物人教版 选修3 专题1 基因工程 1.2基因工程的基本操作程序
一、单选题
1．下列关于基因表达载体构建的相关叙述中，不正确的是（ ）
A．需要限制酶和DNA连接酶
B．抗生素抗性基因可作为标记基因
C．在细胞外进行
D．启动子位于目的基因的首端，是启动翻译的一段DNA
2．关于基因工程下列说法正确的有（ ）
①重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工
③限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列
④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达
⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上
⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的载体
A．2项 B．3项 C．4项 D．5项
3．下图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。下列有关说法不正确的是（ ）
A．X是能合成胰岛素的细菌细胞
B．质粒是细胞核或拟核外能自主复制的小型环状DNA
C．目的基因与质粒的重组只需要DNA连接酶
D．该细菌的性状被定向改造
4．（2016高二下·定州期末）下列有关基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．DNA连接酶能将碱基对之间的氢键连接起来
B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变
C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大
D．Taq酶是PCR过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶
5．（2015高二下·东莞期中）基因工程是在DNA分子水平进行设计施工的，在基因操作的以下步骤中，不进行碱基互补配对的是（ ）
①人工合成目的基因
②E．coliDNA连接酶结合目的基因与运载体
③将目的基因导入受体细胞
④目的基因的检测和表达
⑤个体生物学水平的鉴定
A．①③ B．①⑤ C．③⑤ D．②③④
6．（2015高二下·邹平期中）在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）
A．540个 B．8100个 C．17280个 D．7560个
7．若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ（A↓GATCT）、EcoRⅠ（G↓AATTC）和Sau3AⅠ（↓GATC）。下列分析合理的是（ ）
A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
8．（2017高二下·福州期中）下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，正确的是（ ）
A．同一物种的cDNA文库只有1种
B．某真核生物的cDNA文库中的某基因一定比基因组文库中的该基因短
C．可以利用反转录法获取cDNA文库和基因组文库
D．只有cDNA文库的基因可实现物种间的基因交流
9．下表是外源基因插入位置（插入点有a、b、c），请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
A．①是c；②是b；③是a B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a D．①是c；②是a；③是b
10．（2017高二下·汉中期中）下列属于PCR技术的条件的是（ ）
①单链的脱氧核苷酸序列引物
②目的基因所在的DNA片段
③脱氧核苷酸
④核糖核苷酸
⑤DNA连接酶
⑥DNA聚合酶
⑦DNA限制性内切酶
A．①②③⑤ B．①②③⑥ C．①②③⑤⑦ D．①②④⑤⑦
11．下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是
（ ）
A．这三种方法都用到酶，都是在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．图示a、b、c三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
12．（2016高二下·黑龙江开学考）以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图．据图分析，下列说法正确的是（ ）
A．催化①过程的酶是DNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都必须能耐高温
D．过程③需要解旋酶
二、非选择题
13．据图回答有关基因工程的问题：
（1）图中正在构建基因表达载体，构建时所需的工具酶有 和 。
（2）一个完整的基因表达载体包括四部分，分别是启动子、 、 、 。
（3）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是 识别与结合的位点，促进转录的开始。
（4）如果要将此表达载体导入大肠杆菌细胞中，通常要用 对大肠杆菌处理，使之变成 细胞。该细胞的特性是 。
14．荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针,与染色体上对应的DNA片段结合,从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题:
（1）DNA荧光探针的制备过程如图1所示,DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的 键从而产生切口,随后在DNA聚合酶Ⅰ作用下,以荧光标记的 为原料,合成荧光标记的DNA探针。
（2）图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸,使DNA双链中 键断裂,形成单链。随后在降温复性过程中,探针的碱基按照 原则,与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有 条荧光标记的DNA片段。
（3）A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组,已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲（AABB）与植物乙（AACC）杂交,则其F1有丝分裂中期的细胞中可观察到 个荧光点;在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到 个荧光点。
15．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由 （基团）连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有 种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是 。
（5）有关质粒描述错误的是（ ）
A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子
B、质粒是唯一的载体
C、质粒上有多个酶切位点
D、质粒可在宿主外单独复制
答案解析部分
1．【答案】D
【知识点】基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】A、构建基因表达载体过程中需要用限制酶切割目的基因和载体，最后用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，A不符合题意；
B、抗生素抗性基因可以用作标记基因，B不符合题意；
C、基因表达载体的构建过程一般在体外进行，C不符合题意；
D、启动子位于目的基因的首端，是启动转录的一段DNA，D符合题意。
故答案为：D
【分析】理清基因表达载体中启动子、终止子的来源：
①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子，
②如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
2．【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具简介
【解析】【解答】基因工程中常用的工具酶有DNA连接酶、限制性核酸内切酶，载体不属于工具酶，①不符合题意；基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②符合题意；一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，③⑤不符合题意；目的基因进入受体细胞需要检测和鉴定，不一定能成功实现表达，④不符合题意；基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上，⑥符合题意；可以做载体的有质粒、动植物病毒、噬菌体，⑦不符合题意。
故答案为：A
【分析】理清DNA重组技术的基本工具：
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
(3)载体
种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
3．【答案】C
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、根据题意和图示分析可知：重组质粒导入的是细菌细胞，所以X是能合成胰岛素的细菌细胞，A不符合题意；
B、质粒作为载体需要有多个限制酶切点以便转运多种目的基因，同时具有标记基因以便于检测目的基因是否导入到受体细胞内，B不符合题意；
C、基因与载体的重组需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C符合题意；
D、基因工程的特点是能够定向改造生物的性状，D不符合题意。
故答案为：C
【分析】在对基因表达载体构建时，要注意用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。
4．【答案】C
【知识点】基因工程的概述
【解析】【解答】解：A、DNA连接酶将DNA分子之间的磷酸二酯键连接起来，A不符合题意；
B、目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因重组，B不符合题意；
C、限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，所以识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大，C符合题意；
D、Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶，D不符合题意．
故选：C．
【分析】a、基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体，其中限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；DNA连接酶的作用是连接具有相同黏性末端的DNA片段以形成重组DNA分子；运载体的作用将目的基因导入受体细胞．
b、PCR技术扩增DNA的条件：模板（已知序列的DNA）、原料（四种脱氧核苷酸）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
5．【答案】C
【知识点】基因工程的概述
【解析】【解答】解：①人工合成目的基因的方法是逆转录法，需要进行碱基互补配对，正确；
②目的基因与运载体结合时，进行碱基互补配对，正确；
③将目的基因导入受体细胞，不进行碱基互补配对，错误；
④检测目的基因时需要用到基因探针，进行碱基互补配对；基因表达包括转录和翻译过程，都要进行碱基互补培养，正确；
⑤个体生物学水平的鉴定不需要碱基互不配对原则，错误．
故选：C．
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定．其中人工合成目的基因、基因表达载体的构建、目的基因的检测都进行碱基互补配对原则．
6．【答案】B
【知识点】DNA分子的结构；DNA分子的复制
【解析】【解答】解；由题意知，目的基因含有1000个碱基对，即2000个脱氧核糖核苷酸，其中腺嘌呤脱氧核糖核苷酸为460个，那么该DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸=（2000﹣460×2）÷2=540个，DNA扩增仪中扩增4代，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（24﹣1）×540=8100个．
故选：B．
【分析】计算DNA分子复制过程中需要的某种游离的脱氧核糖核苷酸数量，先根据DNA分子的碱基互补配对原则计算出DNA分子中该脱氧核糖核苷酸的数量，然后用DNA该脱氧核糖核苷酸的数量乘以增加的DNA分子数．
7．【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末端，用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接，A不符合题意；
B、用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连接，B不符合题意；
C、用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，也能产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，C不符合题意；
D、只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，防止发生反向连接，这样目的基因插入载体后，RNA聚合酶的移动方向肯定与图丙相同，D符合题意。
故答案为：D
【分析】与DNA相关的五种酶的比较:
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
8．【答案】B
【知识点】基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】解：A、cDNA文库只包含该物种部分基因，因此同一物种的cDNA文库不只1种，A错误；
B、真核生物的基因组文库中的基因含有内含子、启动子、终止子等，而真核生物的cDNA文库的基因中不含有这些，因此某真核生物的cDNA文库中的某基因一定比基因组文库中的该基因短，B正确；
C、可以利用反转录法获取cDNA文库，但不能获得基因组文库，C错误；
D、cDNA文库的基因都可实现物种间的基因交流，基因组文库的部分基因也可实现物种间的基因交流，D错误．
故选：B．
【分析】cDNA文库和基因文库的比较表：
文库类型 cDNA 基因组文库
文库大小 小 大
基因中启动子 无 有
基因中内含子 无 有
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间的基因交流 可以 部分基因可以
9．【答案】A
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】第①组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。说明了外源基因插入位置是c；第②组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏。说明了外源基因插入位置是b；③细胞不能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。说明了外源基因插入位置是a。
故答案为：A
【分析】根据质粒的特点确定限制酶的种类：
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
10．【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】解：①PCR需要一对引物，即一对单链的脱氧核苷酸序列引物，①正确；
②PCR需要模板，即目的基因所在的DNA片段，②正确；
③需要脱氧核苷酸作为原料，③正确；
④核糖核苷酸是合成RNA的原料，而PCR合成的是DNA，④错误；
⑤采用PCR合成DNA时，不需要DNA连接酶，⑤错误；
⑥体外合成DNA时，需要DNA聚合酶，⑥正确；
⑦体外合成DNA时，不需要限制性内切酶，⑦错误．
故选：B．
【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术．PCR技术的原理是DNA复制，需要的条件有：模板DNA（目的基因所在的DNA片段）、原料（四种脱氧核苷酸）、一对引物（单链的脱氧核苷酸序列）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）．
11．【答案】A
【知识点】基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶（方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶、方法b需要限制酶、方法c需要DNA聚合酶），A符合题意；
BC、图示方法a为逆转录法，得到的目的基因①不含有内含子，方法b为直接分离目的基因，方法c为人工合成法，得到的目的基因③的碱基序列可能有多种，由于密码子的简并性，三种方法得到的目的基因中碱基对排列顺序不一定相同，故B、C不符合题意；
D、方法a逆转录法属于中心法则的内容，D不符合题意。
故答案为：A
【分析】理清目的基因获取的方法：
①从基因文库中获取
基因文库包括：基因组文库和部分基因文库(其中的cDNA文库是利用反转录法获取的)。
②利用PCR技术扩增
a．变性(90～95℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链。
b．复性(55～60℃)：引物与DNA模板结合，形成局部双链。
c．延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的子链。
d．循环重复上述过程， n次循环后，目的基因的量将被扩增2n倍。
③利用化学方法人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知时，选择该方法。
12．【答案】B
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】解：A、①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，A错误；
B、④为复性过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，B正确；
C、图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶不耐高温，C错误；
D、过程③为高温解链，该过程不需要解旋酶，D错误．
故选：B．
【分析】分析题图：图示为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图，其中①是由RNA形成单链DNA的过程，为逆转录过程；②是以单链DNA合成双链DNA的过程，是DNA分子复制过程；③④⑤是多聚酶链式反应扩增DNA片段，其中③是变性、④是复性、⑤是延伸阶段．
13．【答案】（1）同种限制酶；DNA连接酶
（2）终止子；标记基因；目的基因
（3）RNA聚合酶
（4）CaCl2或Ca2+；感受态；能主动吸收周围环境中游离的DNA分子
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，在构建时所需的工具酶是同种限制酶和DNA连接酶．（2）一个完整的基因表达载体包括四部分，分别是启动子、终止子、标记基因和目的基因．（3）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别与结合的位点，促进转录的开始．（4）如果要将此表达载体导入大肠杆菌细胞中，通常要用CaCl2对大肠杆菌处理，使之变成感受态细胞，从而能主动吸收周围环境中游离的DNA分子。
故答案为：（1）同种限制酶和DNA连接酶（2）终止子 标记基因 目的基因（3）RNA聚合酶（4）CaCl2或Ca2+感受态 能主动吸收周围环境中游离的DNA分子
【分析】基因表达载体的构建：
①通常用同一种限制酶切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将二者连接，改造后成为基因表达载体。
②组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点。
14．【答案】（1）磷酸二酯；脱氧核苷酸
（2）氢；碱基互补配对；4
（3）6；2和4
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）两个核苷酸分子之间以磷酸二酯键连接。合成标记的DNA探针时,需要的原料是脱氧核苷酸。（2）高温可使DNA双链碱基之间的氢键断裂,形成单链。在降温复性的过程中,按照碱基互补配对原则,探针的碱基与染色体上特定的基因序列形成杂交分子。1个DNA分子的两条链可分别与探针的单链结合,出现2个荧光点,两条姐妹染色单体中含2个DNA分子,故最多可有4条荧光标记的DNA片段。（3）植物甲（AABB）与植物乙（AACC）杂交,则F1为AABC,即含2个A染色体组、1个B染色体组和1个C染色体组。其中的2个A染色体组、1个B染色体组中各有1条染色体（共3条染色体）被荧光探针标记,则其在有丝分裂中期时,有6条染色单体上出现荧光点,即可观察到6个荧光点。减数第一次分裂形成的两个子细胞中含染色体组有AB和AC两种情况,含A、B两个染色体组的子细胞中可观察到有4个荧光点,含A、C两个染色体组的子细胞中可观察到有2个荧光点。
【分析】理清目的基因的检测与鉴定的方法：
①分子水平的检测
a．利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。
b．利用分子杂交技术检测目的基因的转录。
c．利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。
②个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。
15．【答案】（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖
（2）平；537bp、790bp、661bp
（3）4
（4）BamH I；抗生素B；同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接
（5）B、D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖连接。（2）限制酶SmaⅠ的酶切位点是CCC↓GGG，其切割产生的是平末端。图1中DNA片段含有两个SmaⅠ酶切位点，被SmaⅠ酶完全切割后出现三个长度的片段，分别是537bp、790bp、661bp．（3）杂合子的基因型为Dd，其中D基因片段有两个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现三个片段长度分别是537bp、790bp、661bp，发生基因突变后的d基因片段只有一个SmaⅠ酶切位点，完全切割后出现两个片段长度分别是1327bp、661bp，所以从杂合子中分离的DNA片段被限制酶SmaⅠ完全切割后会形成四种不同的DNA片段。（4）基因表达载体构建的过程中需要利用限制酶和DNA连接酶。限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和载体。用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养。由于同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接，这样会导致部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达。（5）质粒是能够自我复制的环状DNA分子，质粒上有多个酶切位点，病毒也可以作为载体，质粒必须在宿主细胞内复制。
【分析】与DNA相关的五种酶的比较：
名称 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段
DNA连接酶 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA (水解)酶 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶 碱基对之间的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
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