整合训练（十七）
1．解析：启动子是一段特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，故构建表达载体时需将EPO基因（目的基因）插入乳腺蛋白基因的启动子的下游，A错误；结合题干“某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO”可知该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达，到合适时期收集羊的乳汁进行相关产物的检测与鉴定，B正确；将目的基因导入动物受精卵最常用的方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵（全能性高）中，整个受精卵发育成为具有新性状的动物，C正确；用PCR扩增人EPO基因，前提是需要一段已知的EPO基因核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，D正确。
答案：A
2．解析：基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T（不含Cre酶），其肌肉组织细胞呈无色，B正确；1oxP1、1oxP2位置如图2黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，将含Cre酶的病毒注入小鼠体内，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色（同不含Cre酶时），也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，也有可能敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C错误；小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T（含Cre酶），Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而细胞的颜色由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D正确。
答案：C
3．解析：PCR体系中需要的是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，A错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测，C正确；PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到90～95 ℃的目的是使双链DNA解聚为单链，然后冷却到55～60 ℃使引物与互补DNA链结合，继续加热到70～75 ℃，目的是在DNA聚合酶作用下进行延伸。所以PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，D错误。
答案：C
4．解析：DNA在冷酒精中溶解度很低，提取DNA时可加入酒精，是为了让DNA析出，蛋白质等物质溶解，A正确；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水浴条件下进行鉴定，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，B正确；DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理，C正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，D错误。
答案：D
5．解析：②过程需要两种引物，引物中C、G碱基的含量一般不相同，A错误；为了使目的基因与质粒正确连接，③过程利用pvul和sspl双酶切目的基因与运载体，B错误；精子介导法是利用精子将重组目的基因直接导入卵细胞的过程，C错误；重组质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，所以筛选导入PBR322—Fst的大肠杆菌可在培养基中添加氨苄青霉素，D正确。
答案：D
6．解析：（1）科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板，经过逆（反）转录过程合成cDNA。DNA分子是双链，PCR时以每一条为模板，合成子代DNA，因此需要两种引物。据图可知，如果融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成，那么该基因长度为239 bp，能以F1和R1引物进行PCR扩增，因此如果提取该病人的DNA，使用图中F1和R1引物进行PCR扩增，若出现239 bp扩增片段，该融合基因的融合方式是基因组水平融合。（2）PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，①位置前面为ATG，是翻译的起始位置，若FLAG标签基因序列插入①位置，UBA2—WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，不能得到带有FLAG肽链的蛋白质，因此一般不能插入①位置。标签基因序列本身含有启动子和终止子序列，不需要插在目的基因中的启动子和终止子之间，因此若在下游引物R2②③处插入FLAG标签基因序列和EcoR Ⅰ酶切位点，引物中TCA对应终止密码，则③位置为FLAG标签基因序列，FLAG标签基因编码链序列（5′GATTACAAGGATGACGACGATAAG3′），
③处序列与此互补，为5′CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC3′。
（3）检测相关蛋白质是否表达的方法是抗原—抗体杂交。据图2结果可知，与转染空质粒的对照细胞相比，转录WTIP基因的KG－la细胞增殖较少，转录UBA2—WTIP融合基因的KG－la细胞增殖较多，据此可知，UBA2—WTIP融合基因能在体外促进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖。
答案：（1）逆（反）转录 两 提取该病人的DNA，使用图中F1和R1引物进行PCR扩增，若出现239bp扩增片段，该融合基因的融合方式是基因组水平融合
（2）蛋白质前端的信号肽一般会在蛋白质成熟时被切割掉，所以不能得到带有FLAG肽链的蛋白质
CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC
（3）抗原—抗体杂交 UBA2—WTIP融合基因能在体外促进白血病细胞增殖，WTIP基因能抑制白血病细胞的增殖
7．解析：分析题干可知，原位PCR技术是通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法，故推测原位PCR技术可用于人类β－地中海贫血致病基因的检测，A正确；因为组织细胞间的物质会吸附Mg2＋，故原位PCR反应体系中使用的Mg2＋浓度要比常规PCR高，B错误；在一定范围内，反应体系中引物的G、C碱基含量越高，其结合的特异性越强，但G、C过高，不利于退火，从而阻碍目标DNA的扩增，C错误；dNTP作为扩增的原料会依次连接到子链的3′端，D错误。
答案：A
8．解析：④为对照组，把含CYP3A基因启动子及LUC基因的表达载体导入细胞，A错误；T 2毒素是无关变量，每组加入的含量要相同，因此与④组相比，①组中加入T 2毒素的含量相同，B错误；实验的因变量是荧光素酶的活性，可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值，荧光素酶的活性越大，启动子活性相对值就越大，C正确；由图可知，②③④这三组的启动子活性相对值都大于0，说明调控序列的缺失使T 2毒素可以诱导CYP3A基因表达，D错误。
答案：C
9．解析：（1）流感病毒包膜来源于宿主细胞的细胞膜，主要由蛋白质和磷脂组成，病毒没有细胞结构，包膜上血凝素的合成场所在宿主细胞的核糖体。（2）由图可知，引物b、c可与HA1两端的碱基序列结合，故PCR扩增目的基因时应选择图中引物b和c。若设计引物时含有HA1的终止密码子的编码序列，则IL 2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体转录后形成mRNA，核糖体读到终止密码子时就停止翻译，导致HA1基因之后的IgGFc基因的mRNA序列不能正常翻译，产生的HA1上不含IgGFc标签，因此设计引物时，不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列。（3）由图可知，限制酶EcoRⅤ切割可产生平末端，其识别切割位点恰巧处于IL 2SS和IgGFc中间，可选择该酶对质粒进行切割，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入T4 DNA连接酶（将DNA片段连接起来），使得目的基因与质粒A相连。由图可知HA1基因片段长度为1 038－51＝987 bp，重组质粒长度为5 554＋1 038－51＝6 541 bp，IgGFc基因片段长度为717 bp，二者正向相连时BamHⅠ作用于HA1中，SacⅠ酶作用于IgGFc末端，完全酶切后的产物的长度约为717＋1 038－694＝1 061 bp、5 554＋1 038－51－1 061＝5 480 bp。（4）载体中人工构建诱导型启动子可激活或者抑制目的基因的表达。（5）大肠杆菌本身DNA分子不具备该酶的识别序列（或识别序列已经发生了甲基化），所以限制酶不能切割大肠杆菌本身的DNA分子。
答案：（1）蛋白质和磷脂 宿主细胞的核糖体
（2）bc 防止产生的HA1上不含IgGFc标签（或防止IgGFc基因不表达）
（3）EcoRⅤ T4 1 061
（4）激活或者抑制目的基因的表达
（5）本身不具备该酶的识别序列（或识别序列已经发生了甲基化）
10．解析：（1）据图可知，目的基因应该插入启动子和终止子之间，图中BamHⅠ会破坏标记基因，HindⅢ会破坏启动子，PstⅠ会破坏终止子，KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，会将终止子切割掉，而Pvit2和EcoRⅠ位于启动子和终止子之间，因此切割目的基因和质粒时用Pvit2和EcoRⅠ，在引物的5′端需要加入的是Pvit2和EcoRⅠ限制酶识别序列。Pvit2切割后形成的是平末端，EcoRⅠ切割后形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端，因此本题中在目的基因和载体连接时，可选用T4 DNA连接酶。（2）启动子是RNA聚合酶识别、结合的位点，是驱动转录的位点，在构建基因表达载体时添加大肠杆菌蛋白基因的启动子tac，有利于目的基因在大肠杆菌细胞内表达。图中的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，筛选时可将受体菌置于含有氨苄青霉素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达基因产物的细菌。（3）PCR属于体外DNA复制，利用高温解旋，故需要耐高温的DNA聚合酶。由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到一个不含突变位点的DNA，一个有一条链含有突变位点的DNA，进行第二轮循环，即可得到三个不含突变位点的DNA和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物。从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。与X射线诱变相比，该突变技术目的性强、突变率更高。
答案：（1）Pvit2和EcoRⅠ T4 DNA连接酶
（2）tac有利于目的基因在大肠杆菌细胞内表达 氨苄青霉素
（3）耐高温的DNA聚合 2 ② 目的性强、突变率高整合训练(十七) 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
全员必做题
1.[2023·广东湛江统考二模]红细胞生成素(EPO)是人体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，某科研团队采用基因工程培育转基因羊作为乳腺生物反应器，使其能合成EPO。下列有关叙述错误的是( )
A．构建表达载体时需将EPO基因插入乳腺蛋白基因的启动子的上游
B．一般情况下，该转基因羊中的EPO基因只在羊的乳腺细胞中表达
C．可用显微注射技术将含有EPO基因的表达载体导入羊的受精卵中
D．用PCR扩增人EPO基因，需要一段已知的EPO基因核苷酸序列
2．[2023·山东聊城统考三模]Cre loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是( )
A．构建表达载体T时用到的工具酶包括限制酶、DNA连接酶
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色
C.若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞只能呈红色或黄色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能出现两种颜色
3．[2023·山东青岛统考一模]新型冠状病毒(2019 nCoV)的检测可以采用实时荧光RT PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT PCR的具体过程如图，下列叙述正确的是( )
A．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
B．过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n个引物B
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
4．[2023·山东青岛统考一模]大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述不正确的是( )
A．提取DNA时可加入酒精，使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
B．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定
C．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着与它所带电荷相反的电极移动的原理
D．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶Ⅰ和Ⅱ的切割位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
5．[2023·辽宁校联考三模]Fst基因可以表达卵泡抑素，降低皮脂率，提高瘦肉率。研究人员为得到转Fst基因瘦肉型猪，从鸭的卵泡中提取RNA，通过RT—PCR扩增获得Fst基因，将其与运载体PBR322结合，通过精子介导法将重组目的基因导入受体细胞并成功获得转基因瘦肉型猪(如图所示，AmpR为氨苄青霉素抗性基因)。下列叙述正确的是( )
A．②过程需要两种引物，且引物中C、G碱基的含量基本相同
B．③过程利用pvul和sspl双酶切不利于目的基因与运载体准确连接
C．精子介导法是利用精子将重组目的基因直接导入受精卵的过程
D．欲筛选导入PBR322—Fst的大肠杆菌可在培养基中添加氨苄青霉素
6．[2023·山东济南统考一模]研究发现，大部分白血病患者细胞中存在异常的融合基因UBA2—WTIP，可作为检测白血病的特异性分子标志物。科研人员通过RT—PCR方法克隆得到融合基因UBA2—WTIP，为了研究该基因的作用和致病机制，需要构建重组载体并把目的基因和FLAG标签基因序列连接起来，分别获得带有FLAG肽链的UBA2—WTIP融合蛋白和WTIP蛋白。FLAG肽链由8个氨基酸残基组成，可作为基因工程中蛋白质是否表达的标记。
(1)科研人员以提取的某白血病人外周血细胞总RNA为模板，经过____________过程合成cDNA，设计________种引物，经RT—PCR扩增出融合基因UBA2—WTIP。对测序结果进行数据分析，推测融合基因UBA2—WTIP是在UBA2基因的第16外显子与WTIP基因的第2外显子处拼接而成，如图1所示。为了验证该融合基因的产生是基因组DNA融合而不是不同的RNA剪接后逆转录所产生的，可通过PCR验证，其实验思路和预期结果为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)为了构建重组载体，科研人员设计了以下2种引物，如图2所示：
上游引物F2为：5′TATGGTACCATG①GCACTGTCGCGGGGG3′，GGTACC为KpnⅠ酶切位点；
下游引物R2为：
5′TAT②TCA③GAGCTCAGTGACGTG3′；
FLAG标签基因编码链序列
可以插入目的基因编码区的首端或者末端。已知引物中ATG对应起始密码，若UBA2—WTIP融合基因编码的蛋白质前端有一段信号肽，则FLAG标签基因序列一般不能插入①位置，原因是____________________________________________________________；若在下游引物R2②③处插入FLAG标签基因序列和EcoRⅠ酶切位点，已知引物中TCA对应终止密码，位置③处序列为5′__________________3′。
(3)制备的重组载体体外转染人类白血病细胞株KG—la细胞，提取各细胞总蛋白，用FLAG单克隆抗体检测蛋白表达情况，并分别测定转染空质粒的对照细胞、转录UBA2—WTIP融合基因及转录WTIP基因的KG－la细胞增殖情况，结果分别如图3所示。
检测相关蛋白质是否表达的方法是______________________________；上述生长曲线结果说明________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
重点选做题
7.[2023·山东青岛统考一模]原位PCR技术是利用原位PCR仪，在组织或细胞中靶DNA所在的位置上进行的PCR循环扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。进行扩增时，反应体系中的反应成分需渗透到组织或细胞的靶DNA处才能进行扩增。PCR反应体系中需要添加一定浓度的Mg2＋，而组织细胞间的物质会吸附Mg2＋，使进入细胞的Mg2＋减少。下列说法正确的是( )
A．原位PCR技术可用于人类β—地中海贫血致病基因的检测
B．原位PCR反应体系中使用的Mg2＋浓度要比常规PCR低
C．反应体系中引物的G、C碱基含量越高，其结合的特异性越强
D．反应体系中NTP作为扩增的原料，会依次连接到子链的5′端
8．[2023·广东统考二模]T 2毒素是一种常见的霉菌毒素，可通过污染饲料引起畜禽中毒。CYP3A是猪体内降解T 2毒素的关键酶，T 2毒素可诱导其表达水平升高。CCAATbox和GCbox是CYP3A基因启动子的两个调控序列。研究者将不同调控序列分别和CYP3A基因启动子及LUC基因(荧光素酶基因)连接构建表达载体，导入猪肝细胞，在培养基中加入T 2毒素，24 h后计算启动子活性相对值，结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．④为对照组，把仅含LUC基因的表达载体导入细胞
B．与④组相比，①组中加入T 2毒素的含量大大增加
C．可通过检测荧光素酶的活性来计算启动子活性相对值
D．调控序列的缺失使T 2毒素不能诱导CYP3A基因表达
9．[2023·辽宁校联考三模]血凝素基因(HA)编码的血凝素是构成流感病毒包膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位，其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签，由IgGFc基因的片段(长度为717bp)编码。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL－2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL 2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌表达和分泌。请回答下列问题：
(1)流感病毒包膜主要由__________组成，包膜上血凝素的合成场所在________________。
(2)本实验用信号肽IL 2SS代替HA自身信号肽有利于融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物________。设计引物时，不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列，原因是__________________________________。
(3)应选择限制酶________来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入________DNA连接酶，使得目的基因与质粒A相连。若目的基因与质粒A正向连接，用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒，完全酶切后的产物中短片段的长度约为________bp。
(4)有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以______________________________。
(5)图示中的限制酶有的来自于大肠杆菌，但限制酶不能切割大肠杆菌本身的DNA分子，原因是__________________________。
10．[2023·河南校联考三模]研究者将某基因改造并插入质粒中，然后导入大肠杆菌中获得表达产物。将获得的突变基因导入普通大肠杆菌之前，先构建基因表达载体。下图1为所用载体示意图，表为限制酶的识别序列及切割位点。下图2为通过PCR定点诱变改造基因的流程图。请回答下列问题：
(1)构建基因表达载体时，为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5′端分别引入____________两种不同限制酶的识别序列。在目的基因和载体连接时，可选用____________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
(2)构建的基因表达载体中需要使用大肠杆菌蛋白基因的启动子tac，原因是____________________________。将受体菌置于含有____________的培养基中进行筛选培养，以获得能表达基因产物的细菌。
(3)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR，PCR过程中需要____________________酶。在第一次PCR中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。利用所获得的大引物模板和其他引物进行第二次PCR过程，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。与X射线诱变相比，该突变技术的优点是__________________。第3讲 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
聚焦新课标：5.1基因工程是一种重组DNA技术；5.2蛋白质工程是基因工程的延伸；6.1转基因产品的安全性引发社会的广泛关注；6.2中国禁止生殖性克隆人；6.3世界范围内应全面禁止生物武器。
基础自查·明晰考位
纵引横连——建网络
提醒：特设长句作答题，训练文字表达能力
边角扫描——全面清
提醒：判断正误并找到课本原话
1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(选择性必修3 P71)( )
2．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(选择性必修3 P72“旁栏思考”)( )
3．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(选择性必修3 P72正文)( )
4．目的基因就是指编码蛋白质的基因。(选择性必修3 P76正文)( )
5．人畜食用Bt抗虫蛋白会中毒。(选择性必修3 P77“相关信息”)( )
6．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(选择性必修3 P77“相关信息”)( )
7．基因表达载体中含有启动子和密码子。(选择性必修3 P80正文和图36)( )
8．干扰素是我国批准生产的第一个基因工程药物。(选择性必修3 P90“资料卡”)( )
9．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的。(选择性必修3 P93正文)( )
10．转基因作为一项技术本身是中性的。(选择性必修3 P103正文)( )
11．治疗性克隆是指利用克隆技术获得胚胎，并将胚胎孕育成为个体的克隆性技术。(选择性必修3 P106正文)( )
考点梳理·整合突破
整合考点22 “功能强大”的基因工程
任务驱动
任务1 理解基因工程的理论基础
任务2 理清基因工程的3种操作工具
任务3 掌握基因工程的操作步骤
任务4 图解记忆蛋白质工程
任务5 完善PCR技术原理与条件
任务6 完善PCR技术的过程
任务7 DNA的粗提取与鉴定
任务8 DNA片段的扩增及电泳鉴定
过程评价
评价1 依托真题归类比较再体验，明考向
1.[2023·浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2.[2023·新课标卷]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
3．[2023·湖北卷]用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
4．[2023·广东卷]“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
评价2 依托教材专练长句表述，提考能
5.(选择性必修3 P71“旁栏思考”)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
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6．(选择性必修3 P72正文拓展)天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？
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7．(选择性必修3 P77“相关信息”改编)PCR的引物实质是什么？
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8．(选择性必修3 P80正文)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？
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9．(选择性必修3 P81正文)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？
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10．(选择性必修3 P94正文)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
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评价3 依托真题归类比较再探究，强素养
11.[2023·天津卷]基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是_________(填“细胞内”和“细胞外”)
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A.B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物_________对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
(ⅰ)导入目的基因的酵母菌应在_________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C′序列，以便对UGA基因进行切除。C.C′的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式_________进行连接。
(ⅱ)切去UGA基因的酵母菌应在_____________的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图__________。
12．[2023·山东卷]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是_____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有___________________________ (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_______________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_________，条带2所检出的蛋白_________ (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
13．[2023·广东卷]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__________________。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________ (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
模拟预测·题组集训
题组预测一 聚焦基因工程
1．[2023·山东青岛统考三模]免疫PCR是一种微量抗原检测系统，利用该技术可检测牛乳中微量抗生素。大致检测步骤是，将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，PCR扩增及产物检测。下列叙述错误的是( )
A．图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合
B．第三次冲洗的目的是除去游离的抗体2以避免出现假阳性
C．在PCR扩增过程中，子链的合成均是从5′端向3′端延伸的
D．可用牛乳蛋白基因的DNA片段作为标记DNA与抗体2相连
2．[2023·广东省揭阳市高三质量测试]斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。据此分析，下列说法正确的是( )
A．放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置
B．p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同
C．p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成
D．斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达
3．[2023·山东青岛统考三模] 20世纪70年代，Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中错误的是( )
A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶
B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C．测得未知DNA的序列为5′—GATTCGAGCTGA—3′
D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端
4．[2023·山东青岛统考一模]科研人员克隆了猪白细胞抗原基因(SLA-2基因)，构建了该基因的真核表达载体，进行了猪肾上皮细胞表达研究。实验的主要流程如下，请回答：
(1)过程①中，PCR扩增SLA-2的原理是_________，下列4种引物中应选择的是_________。
a 5′－GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
b 5′－GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
c 5′－GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
d 5′－GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
(2)过程②将重组质粒导入大肠杆菌的目的是___________________________，该过程需要用_________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。然后将大肠杆菌涂布在含有_________ (抗生素)的培养基上培养。
(3)科研中常用嘌呤霉素对真核细胞进行筛选，一般选择最低致死浓度的前一个浓度作为筛选浓度的原因是：既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让____________________________。实验结果如图，根据实验结果最佳的嘌呤霉素筛选浓度为_________。
(4)过程⑦研究人员用小鼠抗SLA抗原肽单克隆抗体检测肾上皮细胞生产的抗原肽，其原理是__________________，单克隆抗体能检测其是否具有正确的_________，从而是否具有生物活性。
题组预测二 聚焦蛋白质工程
5．[2023·北京市四中高三期中]快速、准确地确定蛋白质的三维空间结构，一直是生命科学领域的研究热点和难点。人工智能程序AlphaFold 2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，达到了人类利用冷冻电镜等复杂仪器观察预测的水平。下列相关叙述不正确的是( )
A．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础
B．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程
C.结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制
D．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
6．[2023·四川南充统考三模]胰岛素是治疗糖尿病的特效药，但天然胰岛素在人体内的寿命只有几个小时。重症患者每天需要注射多次药物，增加了痛苦。通过蛋白质工程改变蛋白质的空间结构，以延长蛋白质的半衰期，可得到长效胰岛素，还可以增强其稳定性。下图是通过蛋白质工程获得长效胰岛素的过程。请分析回答：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新蛋白质模型的主要依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)通过人工合成DNA形成的新基因应与_________结合后，转移到__________________中，才能准确表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产上述长效胰岛素，需要用到的生物工程有__________________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
专题拓展·素养落地22 PCR技术中的引物的设计
知识拓展
1.设计引物的原则
引物是根据目的基因特有的一段已知的核苷酸序列设计合成的，能与目的基因的模板链通过碱基互补配对特异性地结合。设计引物的主要原则为①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合；②引物与靶序列间的T不应过低；③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基；⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。⑥引物5′端可以修饰，3′端不可修饰。a.引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。b.引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。c.在引物的5′端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
引物5′端链接限制酶的识别序列(两种引物两种限制酶)
双酶切优点：防止自连
2．引物的处理由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。在2种引物的5′端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。
3．引物具有以下几个特点：引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合；2种引物之间不能互补配对；某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；引物不能太短。
专项提升
1.请回答基因工程方面的有关问题
(1)通过PCR技术可在DNA分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)请回答基因工程方面的有关问题：设计引物是PCR技术关键步骤之一某同学设计的2组引物都不合理，请分别说明理由。
第1组：_________________________________________________________________
第2组：_________________________________________________________________
(3)科研过程中，可用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转化后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有_________。
①模板受到污染；②退火温度过高；③引物太短；④延伸温度偏低。
2．[2023·山东淄博统考一模]重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
(1)上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是__________________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为__________________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是_________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的_________端分别添加限制酶____________的酶切位点。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内_________ (填“一定”或“不一定”)含有目的基因，理由是_____________________________________________。
考点梳理·整合突破
整合考点23 生物技术的安全性与伦理问题
任务驱动
任务1 理清治疗性克隆与生殖性克隆的关系
类型 项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 从胚胎中获取_________用于医学研究和治疗 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞水平 水平
联系 都属于_________生殖；产生的新个体或新组织，_________相同
任务2 比较试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
(1)试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(2)两者都是体外受精，并进行体外__________________________________________，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
过程评价
评价1 依托真题归类比较再体验，明考向
1.[2023·浙江1月]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
评价2 依托教材专练长句表述，提考能
2.(选择性必修3 P102“相关信息”)在转基因研究工作中，我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，其原因是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
3．(选择性必修3 P107“思考·讨论”拓展)治疗性克隆与生殖性克隆的主要区别是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
4．(选择性必修3 P113“思考·讨论”节选)在战争中，为预防敌方使用生物武器，你认为参战部队采取的最有效措施是什么？请简述这一措施的原理。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
评价3 依托真题归类比较再探究，强素养
5.[2021·河北卷]采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为_____________。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是_________________。
构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是________________________________________________________________________。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是__________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的
______________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的______________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是_________________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于_____________________________________________(写出两点即可)。
模拟预测·题组集训
题组预测一 聚焦生物技术的安全性和伦理问题
1．[2023·北京朝阳统考一模]生物武器作为一种大规模杀伤性武器，在人类历史上造成了严重的威胁与伤害，全人类需要严格禁止生物武器。以下做法错误的是( )
A．遵守不发展、不生产、不储存生物武器公约
B．发展生物安全前瞻科技、储备生物防御技术
C．设立相关法律条例保护人类遗传资源信息
D．改变致病微生物的表面抗原使其难以检测
2．[2022·湖北省武汉市高三模拟]下列关于“克隆羊”“试管羊”“转基因羊”的说法，合理的是( )
A．这三种羊都是无性繁殖的产物
B．在培育过程中都需要使用二氧化碳培养箱
C．在培育过程中都需要用到核移植技术
D．在培育过程中都需要采集良种公羊的精子
3．[2023·江苏省镇江市高三调研]下列关于生物工程和技术的说法正确的是( )
A．从某生物cDNA文库中获取的目的基因不含启动子
B．PCR反应中温度的周期性改变是为了TaqDNA聚合酶催化不同的反应
C．蛋白质工程实施过程中可对关键氨基酸直接置换或增删
D．外源基因不会通过花粉扩散到转基因植物的近缘生物中
4．[2023·北京市朝阳区高三期中]表中关于转基因作物的观点和理由，合理的是( )
选项 观点 理由
A 与传统作物的味道、色彩不同的不一定是转基因作物 杂交育种、诱变育种也能培育出来
B 应避免摄入转基因食品 没有或很少有害虫吃转基因作物，说明它们抗虫，同时也威胁人体健康
C 只吃应季水果 反季水果都来自转基因作物
D 用转基因作物替代现有全部农作物 转基因农作物性状优良，没有任何风险
题组预测二 综合考查生物技术的安全性与伦理问题
5．[2023·广东韶关统考二模]不同动物细胞膜表面的分子标签(MHC，主要组织相容性抗原)具有特异性，使得即使在相同抗原的刺激下，与人类相比，所产生的免疫反应也有很大的差异性，为此，构建人MHC转基因小鼠模型并应用于疫苗研发，具有重要的价值。如图是人MHC转基因小鼠模型的构建过程。
(1)过程①用___________处理可以获取更多的卵(母)细胞，过程③所用的技术是________________________________________________________________________。
将早期胚胎植入代孕母鼠前，需对受体进行
________________________________________________________________________。
(2)图中X表示_________过程。从基因组数据库中查询人MHC的mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成_________用于PCR扩增，PCR扩增过程第一轮循环的模板是_______________________________。
(3)通过上述途径和杂交选育虽然可获得含有人源MHC基因的纯合子代小鼠，但该模型小鼠还不是理想的模型动物，理由是_________________________________________________，表达的产物会干扰疫苗的筛选或评价。欲获得理想的模型动物，后续的实验设想是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
专题拓展·素养落地23 基因组编辑技术
知识拓展
1.基因组编辑的含义：对基因进行定点“修改”，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
2．应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9
3．CRISPR/Cas9组分及功能：
短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂
4.CRISPR/Cas9技术的主要应用：
(1)基因敲除。
(2)特异突变引入。
(3)定点转基因。
5．CRISPR/Cas9技术的风险：
(1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
(2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。
专项提升
1.基因组编辑技术是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部特定片段，是一种对生物体基因组特定目标基因进行修饰的技术。如图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中用sgRNA指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的靶位点。下列相关叙述错误的是( )
A．sgRNA的全部碱基序列与靶基因序列完全互补
B．限制性内切核酸酶Cas9可断裂核苷酸之间的磷酸二酯键
C．根据上述处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能
D．使用该项基因组编辑技术来预防人的某些疾病时需要审批
2．人体移植器官短缺是一个世界性难题。目前，科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造，再结合克隆技术，培养出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。下图为科学家借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术剔除猪抗原决定簇基因的示意图(不同的sgRNA可以识别不同的DNA序列)，请回答下列问题：
(1)DNA重组技术主要用到的工具酶包括DNA连接酶和______________________。图中充当该酶的物质是________________________。
(2)Cas9-sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是________________________________________________________。
(3)培育转基因猪时，应使用_________技术将剔除了猪抗原决定簇基因的基因表达载体导入猪成纤维细胞中，再将该细胞的细胞核注入______________________的去核卵母细胞中，构建重构胚。
第3讲 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
纵引横连——建网络
①理性 ②生殖性克隆人 ③致病菌类、病毒类、生化毒剂类等 ④限制性内切核酸酶和DNA连接酶 ⑤PCR ⑥目的基因、启动子、终止子、标记基因等 ⑦花粉管通道法、农杆菌转化法 ⑧PCR技术、抗原—抗体杂交 ⑨植物的品质 ⑩改造或合成基因
边角扫描——全面清
1．× 2.× 3.× 4.× 5.× 6.√ 7.× 8.√ 9.× 10.√ 11.×
整合考点22
任务驱动
任务1 基因 中心法则 遗传密码 载体 RNA 脱氧核苷酸 双螺旋结构
任务2 ①磷酸二酯键 ②黏性末端或平末端 ③磷酸二酯键 ④黏性末端 ⑤平末端 ⑥质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等 ⑦能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因
任务3 ①基因文库 ②识别和结合 ③转录 ④农杆菌转化法 ⑤显微注射技术
任务4 ①合成基因 ②新的蛋白质 ③蛋白质结构 ④脱氧核苷酸序列
过程评价
1．解析：分析题图可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
答案：B
2．解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
答案：C
3．解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
答案：D
4．解析：裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，沸水浴5 min，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
答案：D
5．答案：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
6．答案：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
7．答案：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
8．答案：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
9．答案：Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
10．应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
11．解析：(1)由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
(2)根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
(3)(ⅰ)选择了尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式1，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式2，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
(ⅱ)由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
(4)根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
答案：(1)细胞外
(2)P1和P6
(3)缺乏尿嘧啶 2 含有5-氟乳清酸
(4)3
12．解析：(1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
答案：RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2)F2和R1或F1与R2 a链
(3)J-V5融合蛋白 不是
13．解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DA1基因和运载体(Ti质粒)进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中继续培养幼苗。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制性核酸内切酶X的切割位点，而突变型的基因有限制性核酸内切酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
答案：(1)野生型
(2)运载体(Ti质粒) 启动子和终止子
(3)DA1基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
模拟预测·题组集训
1．解析：图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合，形成抗体1—抗生素—抗体2复合物，A正确；如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确；DNA的合成方向都是由5′端向3′端延伸的，C正确；若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，D错误。
答案：D
2．解析：斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以检测出整合有目的基因的受体细胞。所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置，A正确；p和q杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，B错误；在杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，C错误；斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中表达，目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原—抗体杂交法，D错误。
答案：A
3．解析：PCR测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，A正确；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤(G)结尾，B正确；由图可知测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′，C错误；ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D正确。
答案：C
4．解析：(1)PCR是在体外进行DNA复制，原理是DNA复制；引物需与经限制酶剪切过的黏性末端互补配对，经分析表格中相关限制酶的切割位点和引物序列，只有c能和Sau3AⅠ切割的黏性末端配对。
(2)将重组质粒导入大肠杆菌的目的是扩增重组DNA分子，用于下一步的抗性检测；大肠杆菌通常在低温条件下，用Ca2＋处理，使其转化为感受态细胞；据图分析，在含氨苄青霉素的培养基中培养可达到筛选的目的。
(3)最低致死浓度既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让具有抗性的细胞死亡；根据实验结果分析，最佳的嘌霉素筛选浓度为80 μg/mL；
(4)检测抗原肽的原理是抗原—抗体杂交；利用单克隆抗体能检测其抗原基因是否正确表达从而产生正确的抗原肽。
答案：(1)DNA复制 c
(2)扩增重组DNA分子 Ca2＋ 氨苄青霉素
(3)具有抗性的细胞死亡 80 μg/mL
(4)抗原—抗体杂交 抗原肽
5．解析：蛋白质多样性与组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序及肽链盘曲折叠形成的蛋白质的空间结构不同有关，因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，B正确；结构与功能相适应，结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，C正确；一个氨基酸的密码子可能有多个，因此依据新蛋白质的氨基酸序列推出多个基因序列不止一种，D错误。
答案：D
6．解析：(1)分析图可知，图中改造胰岛素用到的主要生物工程是蛋白质工程，该技术是根据蛋白质的预期功能对蛋白质结构进行分子设计，图中构建新蛋白质模型的主要依据是胰岛素的预期功能。
(2)人工合成形成的新的胰岛素基因必须与相应的载体结合，并导入大肠杆菌等受体细胞内，通过新的胰岛素基因在工程菌体内正确表达以获得目的蛋白质(新的胰岛素)。
(3)若要利用大肠杆菌生产长效胰岛素，需先根据新的胰岛素的功能设计其结构，然后人工合成新的胰岛素基因，并将新的胰岛素基因导入受体细胞，然后通过培养受体细胞获得新的胰岛素，因此该过程涉及的生物工程包括基因工程、蛋白质工程和发酵工程。
(4)图中由新的胰岛素模型到新的胰岛素基因，其基本设计思路是：根据新的胰岛素模型的结构特点(即其中氨基酸的序列)，推测出控制其合成的新的胰岛素基因的结构(即新基因中的脱氧核苷酸序列)，然后利用DNA合成仪合成新的胰岛素基因。
答案：(1)蛋白质(胰岛素)的预期功能
(2)载体 大肠杆菌等受体细胞
(3)蛋白质工程、基因工程
(4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成新的胰岛素基因
专题拓展·素养落地
专项提升
1．答案：(1)引物是根据目的基因的一段已知核苷酸序列设计合成的(或引物能与目的基因通过碱基互补配对结合)
(2)第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；
第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(3)①③
2．解析：(1)由于DNA合成的方向是从子链的5′端到3′端延伸的，根据PCR1的产物，可知引物是引物A、引物C。根据PCR2的产物，PCR2的引物为引物B、引物C，将DNA分子②④混合后退火可得到③⑤，PCR3获得DNA⑥，DNA⑥分子的3′端与引物D互补配对，5′端与引物C互补配对，所以PCR4的引物为引物C、引物D；PCR3为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′→3′，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶，因为5′端对扩增特异性影响不大，引物的延伸是从5′端开始的，不能进行任何修饰。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于pstⅠ靠近终止子，所以应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ。
(3)目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目的基因连接，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四环素的平板上长出菌落，所以这些菌落不一定含有目的基因。
答案：(1)引物A、引物C 引物C、引物D 子链的延伸方向只能从5′→3′，以DNA分子③作模板时子链不能延伸
(2)5′ KpnⅠ、EcoRⅠ
(3)不一定 含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养上生长
整合考点23
任务驱动
任务1 干细胞 个体 无性 遗传信息
任务2 (2)早期胚胎培养
过程评价
1．解析：我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，A错误，D正确；我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误；生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误。
答案：D
2．答案：由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
3．答案：在治疗性克隆中获得的早期胚胎用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的细胞、组织和器官；在生殖性克隆中获得的胚胎则通过胚胎移植移植到母体的子宫内，由母体孕育出婴儿。
4．答案：最有效的措施是接种常见病原体的疫苗，目的是使参战人员体内产生相应的抗体。
5．解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
答案：(1)基因组文库
(2)限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定
(3)农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散
(4)耐性 茎叶
(5)YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
模拟预测·题组集训
1．解析：生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的一类武器，为了维护世界和平，中国在《禁止生物武器公约》中重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，A正确；为防止生物武器的危害，要发展生物安全前瞻科技、储备生物防御技术，B正确；设立相关法律条例保护人类遗传资源信息，可以防止生物武器的危害，C正确；改变致病微生物的表面抗原使其难以检测，不利于防止生物武器的危害，D错误。
答案：D
2．解析：克隆羊属于无性繁殖，试管羊、转基因羊属于有性生殖，A错误；在培育过程中都需要使用二氧化碳培养箱，B正确；克隆羊在培育过程中需要用到核移植技术，试管羊和转基因羊不需要，C错误；克隆羊在培育过程中不需要采集良种公羊的精子，D错误。
答案：B
3．解析：cDNA是逆转录形成的，因此从某生物cDNA文库中获取的目的基因不含基因中的启动子，A正确；PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，B错误；蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，C错误；外源基因可通过花粉扩散到转基因植物的近缘生物中，D错误。
答案：A
4．解析：通过杂交育种、诱变育种也能培育出来与传统作物的味道、色彩不同的作物品种，不一定是转基因作物，A正确；没有或很少有害虫吃转基因作物，说明它们抗虫，但未必威胁人体健康，因为人体结构与害虫的生理结构差异很大，我们可以适当减少转基因食品，B错误；反季水果不都来自转基因作物，也可能是利用温室大棚通过改变环境条件培育的，因此，我们未必只吃应季水果，C错误；转基因农作物性状优良，可能存在潜在的风险，因此，我们需要有选择性地转基因作物，不必用转基因作物替代现有全部农作物，D错误。
答案：A
5．解析：(1)过程①为获取卵母细胞，为了获取更多的卵(母)细胞，可以用促性腺激素处理供体雌鼠使之超数排卵。过程③为体外受精，获得受精卵。胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，为了提高胚胎移植的成功率，将早期胚胎植入代孕母鼠前，需对受体进行同期发情处理使之处于与供体母鼠相同的生理状态。
(2)图中X的过程以mRNA为模板，产物是cDNA，故X过程为反(逆)转录。PCR过程需要模板、原料、酶，以及引物，设计引物时需要有一段已知的目的基因序列。PCR的原理是DNA半保留复制，扩增过程第一轮循环的模板是人MHC基因的cDNA。
(3)不同动物细胞膜表面具有不同的分子标签，即MHC，通过上述途径和杂交选育虽然可获得含有人源MHC基因的纯合子代小鼠，但该模型小鼠含有鼠源MHC基因，表达的产物会干扰疫苗的筛选或评价，故该模型小鼠还不是理想的模型动物。欲获得理想的模型动物，则需要想方设法除去鼠源的MHC基因，方法为运用基因编辑技术将鼠源的MHC基因敲除，得到仅含人MHC基因的小鼠。
答案：(1)促性腺激素 体外受精 同期发情处理
(2)反转录(逆转录) 引物 人MHC基因的cDNA
(3)该模型小鼠含有鼠源MHC基因 运用基因编辑技术将鼠源的MHC基因敲除，得到仅含人MHC基因的小鼠
专题拓展·素养落地
专项提升
1．解析：据图观察sgRNA的部分碱基序列与靶基因序列互补，A错误；由图看出限制性内切核酸酶Cas9能剪切下DNA片段，故可断裂核苷酸之间的磷酸二酯键，B正确；通过破坏B基因后生物体的功能变化，可推测B基因的功能，C正确；基因组编辑技术用于人类疾病研究时，有可能涉及伦理道德问题，故使用该项基因组编辑技术来预防人的某些疾病时需要审批，D正确。
答案：A
2．解析：(1)DNA重组技术即基因工程，主要用到的工具酶是DNA连接酶和限制酶；由分析可知，Cas9-sgRNA复合体充当限制性内切核酸酶。(2)使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列根据碱基互补配对原则结合在一起，从而能够精准识别该核苷酸序列(sgRNA是单链，可与特定核苷酸序列即靶核苷酸序列碱基互补配对)。(3)将目的基因(基因表达载体)注入动物细胞的最有效方法是显微注射技术；将该转基因猪的细胞核注入减数分裂Ⅱ期(MⅡ期)的去核卵母细胞中，构建重构胚。
答案：(1)限制性内切核酸酶(限制酶)
Cas9-sgRNA复合体
(2)sgRNA是单链，可与特定核苷酸序列即靶核苷酸序列碱基互补配对
(3)显微注射 减数分裂Ⅱ期(MⅡ期)(共100张PPT)
第3讲 基因工程和生物技术的
安全性与伦理问题
纵引横连——建网络
提醒：特设长句作答题，训练文字表达能力
①理性 ②生殖性克隆人 ③致病菌类、病毒类、生化毒剂类等 ④限制性内切核酸酶和DNA连接酶 ⑤PCR ⑥目的基因、启动子、终止子、标记基因等 ⑦花粉管通道法、农杆菌转化法 ⑧PCR技术、抗原—抗体杂交 ⑨植物的品质 ⑩改造或合成基因
边角扫描——全面清
提醒：判断正误并找到课本原话
1．切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(选择性必修3 P71)( )
2．DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事。(选择性必修3 P72“旁栏思考”)( )
3．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(选择性必修3 P72正文)( )
4．目的基因就是指编码蛋白质的基因。(选择性必修3 P76正文)( )
5．人畜食用Bt抗虫蛋白会中毒。(选择性必修3 P77“相关信息”)( )
6．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(选择性必修3 P77“相关信息”)( )
×
×
×
×
×
√
7．基因表达载体中含有启动子和密码子。(选择性必修3 P80正文和图36)( )
8．干扰素是我国批准生产的第一个基因工程药物。(选择性必修3 P90“资料卡”)( )
9．对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的。(选择性必修3 P93正文)( )
10．转基因作为一项技术本身是中性的。(选择性必修3 P103正文)( )
11．治疗性克隆是指利用克隆技术获得胚胎，并将胚胎孕育成为个体的克隆性技术。(选择性必修3 P106正文)( )
×
√
×
√
×
考点梳理·整合突破
整合考点22 “功能强大”的基因工程
任务驱动
任务1 理解基因工程的理论基础
基因
中心法则
遗传密码
载体
RNA
脱氧核苷酸
双螺旋结构
任务2 理清基因工程的3种操作工具
磷酸二酯键
黏性末端或平末端
磷酸二酯键
黏性末端
平末端
质粒、动植物病毒、λ噬菌体的衍生物等
能自我复制、有一个至多个限制酶切割位点、有标记基因
任务3 掌握基因工程的操作步骤
基因文库
识别和结合
转录
农杆菌转化法
显微注射技术
任务4 图解记忆蛋白质工程
合成基因
新的蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
任务5 完善PCR技术原理与条件
任务6 完善PCR技术的过程
任务7 DNA的粗提取与鉴定
任务8 DNA片段的扩增及电泳鉴定
过程评价
评价1 依托真题归类比较再体验，明考向
1.[2023·浙江6月]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
答案：B
解析：分析题图可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
2.[2023·新课标卷]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
答案：C
解析：只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。
3．[2023·湖北卷]用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。
下列叙述错误的是( )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案：D
解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确； 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
4．[2023·广东卷]“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案：D
解析：裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，沸水浴5 min，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
评价2 依托教材专练长句表述，提考能
5.(选择性必修3 P71“旁栏思考”)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
6．(选择性必修3 P72正文拓展)天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体？为什么？
答案：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
答案：不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
7．(选择性必修3 P77“相关信息”改编)PCR的引物实质是什么？
8．(选择性必修3 P80正文)为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？
答案：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
答案：选用同一种限制酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
9．(选择性必修3 P81正文)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？
10．(选择性必修3 P94正文)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
答案：Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
答案：应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
评价3 依托真题归类比较再探究，强素养
11.[2023·天津卷]基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是_________(填“细胞内”和“细胞外”)
细胞外
解析：由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A.B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物_________对目的基因进行PCR。
P1和P6
解析：根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
(ⅰ)导入目的基因的酵母菌应在_________的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C′序列，以便对UGA基因进行切除。C.C′的序列方向
将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定
DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，
则应选择方式_________进行连接。
(ⅱ)切去UGA基因的酵母菌应在_____________
的培养基上筛选培养。
缺乏尿嘧啶
2
含有5-氟乳清酸
解析：(ⅰ)选择了尿嘧啶合成基因(UGA)常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式1，C和C′方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式2，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
(ⅱ)由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图__________。
解析：根据前面分析，C和C′的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
3
12．[2023·山东卷]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是___________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有__________________________________ (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_______________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_______ (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白_________ (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
RNA聚合酶
限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
F2和R1或F1与R2
a链
J-V5融合蛋白
不是
解析：(1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；
考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′，所以引物结合的单链其方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
13．[2023·广东卷]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_____________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备______________。
野生型
运载体(Ti质粒)
启动子和终止子
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DA1基因和运载体(Ti质粒)进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________________________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________ (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
DA1基因和卡那霉素抗性基因
75
自交
100
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中继续培养幼苗。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制性核酸内切酶X的切割位点，而突变型的基因有限制性核酸内切酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
模拟预测·题组集训
题组预测一 聚焦基因工程
1．[2023·山东青岛统考三模]免疫PCR是一种微量抗原检测系统，利用该技术可检测牛乳中微量抗生素。大致检测步骤是，将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，PCR扩增及产物检测。
下列叙述错误的是( )
A．图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合
B．第三次冲洗的目的是除去游离的抗体2以避免出现假阳性
C．在PCR扩增过程中，子链的合成均是从5′端向3′端延伸的
D．可用牛乳蛋白基因的DNA片段作为标记DNA与抗体2相连
答案：D
解析：图中的抗体1和抗体2均需要与抗生素特异性结合，形成抗体1—抗生素—抗体2复合物，A正确；如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确；DNA的合成方向都是由5′端向3′端延伸的，C正确；若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，D错误。
2．[2023·广东省揭阳市高三质量测试]斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，其技术流程如图。
据此分析，下列说法正确的是( )
A．放射性自显影技术可显示原培养皿中含目的基因的菌落位置
B．p和q片段能够杂交的主要原因是两单链的碱基排列顺序相同
C．p和q片段的杂交双链区域形成过程中有氢键和磷酸二酯键生成
D．斑点印迹杂交技术可用于检测目的基因是否在受体细胞中成功表达
答案：A
解析：斑点印迹杂交技术是将目的基因片段用放射性同位素或荧光进行标记，与受体细胞的基因组DNA进行杂交，如果目的基因整合到受体细胞上，那么标记基因就会与其结合，通过放射性自显影就可以检测出整合有目的基因的受体细胞。所以该技术可以显示原培养基中含目的基因的菌落位置，A正确；p和q杂交是因为两单链的碱基可以互补配对，B错误；在杂交过程中，双链区域会有氢键形成，但不会形成磷酸二酯键，C错误；斑点印迹杂交是一种简单的DNA分子杂交技术，该技术可以检测目的基因的导入和转录，但无法用于检测目的基因是否在受体细胞中表达，目的基因是否在受体细胞中表达常用抗原—抗体杂交法，D错误。
3．[2023·山东青岛统考三模] 20世纪70年代，Fredsanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4支试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4支试管中DNA链将会分别在A、G、C及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。
下列说法中错误的是( )
A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶
B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾
C．测得未知DNA的序列为5′—GATTCGAGCTGA—3′
D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端
答案：C
解析：PCR测序方法需要引物和耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，A正确；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤(G)结尾，B正确；由图可知测得未知DNA的序列为5′—TCAGCTCGAATC—3′，C错误；ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D正确。
4．[2023·山东青岛统考一模]科研人员克隆了猪白细胞抗原基因(SLA-2基因)，构建了该基因的真核表达载体，进行了猪肾上皮细胞表达研究。实验的主要流程如下，请回答：
(1)过程①中，PCR扩增SLA-2的原理是_________，下列4种引物中应选择的是_________。
a 5′－GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
b 5′－GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
c 5′－GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
d 5′－GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
(2)过程②将重组质粒导入大肠杆菌的目的是________________，该过程需要用_________处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。然后将大肠杆菌涂布在含有_________ (抗生素)的培养基上培养。
DNA复制
c
扩增重组DNA分子
Ca2＋
氨苄青霉素
解析：(1)PCR是在体外进行DNA复制，原理是DNA复制；引物需与经限制酶剪切过的黏性末端互补配对，经分析表格中相关限制酶的切割位点和引物序列，只有c能和Sau3AⅠ切割的黏性末端配对。
(2)将重组质粒导入大肠杆菌的目的是扩增重组DNA分子，用于下一步的抗性检测；大肠杆菌通常在低温条件下，用Ca2＋处理，使其转化为感受态细胞；据图分析，在含氨苄青霉素的培养基中培养可达到筛选的目的。
(3)科研中常用嘌呤霉素对真核细胞进行筛选，一般选择最低致死浓度的前一个浓度作为筛选浓度的原因是：既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让__________________。实验结果如图，根据实验结果最佳的嘌呤霉素筛选浓度为_________。
具有抗性的细胞死亡
80 μg/mL
解析：最低致死浓度既可以让大部分没有抗性的细胞死亡又不会让具有抗性的细胞死亡；根据实验结果分析，最佳的嘌霉素筛选浓度为80 μg/mL；
(4)过程⑦研究人员用小鼠抗SLA抗原肽单克隆抗体检测肾上皮细胞生产的抗原肽，其原理是______________，单克隆抗体能检测其是否具有正确的_________，从而是否具有生物活性。
抗原—抗体杂交
抗原肽
解析：检测抗原肽的原理是抗原—抗体杂交；利用单克隆抗体能检测其抗原基因是否正确表达从而产生正确的抗原肽。
题组预测二 聚焦蛋白质工程
5．[2023·北京市四中高三期中]快速、准确地确定蛋白质的三维空间结构，一直是生命科学领域的研究热点和难点。人工智能程序AlphaFold 2对大部分蛋白质结构的预测极为精准，接近真实的蛋白质结构，达到了人类利用冷冻电镜等复杂仪器观察预测的水平。下列相关叙述不正确的是( )
A．蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础
B．预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程
C.结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制
D．依据新蛋白质的氨基酸序列能推出唯一的基因序列
答案：D
解析：蛋白质多样性与组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序及肽链盘曲折叠形成的蛋白质的空间结构不同有关，因此蛋白质的氨基酸序列是预测其空间结构的重要基础，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求，因此预测、设计并制造新蛋白质的技术属于蛋白质工程，B正确；结构与功能相适应，结构预测能帮助揭示蛋白质分子间相互作用的机制，C正确；一个氨基酸的密码子可能有多个，因此依据新蛋白质的氨基酸序列推出多个基因序列不止一种，D错误。
6．[2023·四川南充统考三模]胰岛素是治疗糖尿病的特效药，但天然胰岛素在人体内的寿命只有几个小时。重症患者每天需要注射多次药物，增加了痛苦。通过蛋白质工程改变蛋白质的空间结构，以延长蛋白质的半衰期，可得到长效胰岛素，还可以增强其稳定性。下图是通过蛋白质工程获得长效胰岛素的过程。请分析回答：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新蛋白质模型的主要依据是______________________。
(2)通过人工合成DNA形成的新基因应与_________结合后，转移到__________________中，才能准确表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产上述长效胰岛素，需要用到的生物工程有__________________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是
_________________________________________________________。
蛋白质(胰岛素)的预期功能
载体
大肠杆菌等受体细胞
蛋白质工程、基因工程
根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成新的胰岛素基因
解析：(1)分析图可知，图中改造胰岛素用到的主要生物工程是蛋白质工程，该技术是根据蛋白质的预期功能对蛋白质结构进行分子设计，图中构建新蛋白质模型的主要依据是胰岛素的预期功能。
(2)人工合成形成的新的胰岛素基因必须与相应的载体结合，并导入大肠杆菌等受体细胞内，通过新的胰岛素基因在工程菌体内正确表达以获得目的蛋白质(新的胰岛素)。
(3)若要利用大肠杆菌生产长效胰岛素，需先根据新的胰岛素的功能设计其结构，然后人工合成新的胰岛素基因，并将新的胰岛素基因导入受体细胞，然后通过培养受体细胞获得新的胰岛素，因此该过程涉及的生物工程包括基因工程、蛋白质工程和发酵工程。
(4)图中由新的胰岛素模型到新的胰岛素基因，其基本设计思路是：根据新的胰岛素模型的结构特点(即其中氨基酸的序列)，推测出控制其合成的新的胰岛素基因的结构(即新基因中的脱氧核苷酸序列)，然后利用DNA合成仪合成新的胰岛素基因。
知识拓展
1.设计引物的原则
引物是根据目的基因特有的一段已知的核苷酸序列设计合成的，能与目的基因的模板链通过碱基互补配对特异性地结合。设计引物的主要原则为①引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合；②引物与靶序列间的T不应过低；③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补的碱基；⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。⑥引物5′端可以修饰，3′端不可修饰。a.引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
b.引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。c.在引物的5′端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
引物5′端链接限制酶的识别序列(两种引物两种限制酶)
双酶切优点：防止自连
2．引物的处理由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。在2种引物的5′端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。
3．引物具有以下几个特点：引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合；2种引物之间不能互补配对；某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；引物不能太短。
专项提升
1.请回答基因工程方面的有关问题
(1)通过PCR技术可在DNA分子中专一性扩增出某目的基因，其原因是
_______________________________________________________。
引物是根据目的基因的一段已知核苷酸序列设计合成的(或引物能与目的基因通过碱基互补配对结合)
(2)请回答基因工程方面的有关问题：设计引物是PCR技术关键步骤之一某同学设计的2组引物都不合理，请分别说明理由。
第1组：____________________________________________________
第2组：____________________________________________________
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；
引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(3)科研过程中，可用PCR技术检测受体细胞是否成功转入了目的基因。提取转化后的细胞的全部DNA分子，用目的基因的引物扩增。扩增完毕后，检测发现扩增产物中除目的基因外，还有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有_________。
①模板受到污染；②退火温度过高；③引物太短；④延伸温度偏低。
①③
2．[2023·山东淄博统考一模]重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
(1)上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是_____________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为_____________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是____________________________________________________。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的_________端分别添加限制酶_____________的酶切位点。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内_________ (填“一定”或“不一定”)含有目的基因，理由是____________________________________。
引物A、引物C
引物C、引物D
子链的延伸方向只能从5′→3′，以DNA分子③作模板时子链不能延伸
5′
KpnⅠ、EcoRⅠ
不一定
含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养上生长
解析：(1)由于DNA合成的方向是从子链的5′端到3′端延伸的，根据PCR1的产物，可知引物是引物A、引物C。根据PCR2的产物，PCR2的引物为引物B、引物C，将DNA分子②④混合后退火可得到③⑤，PCR3获得DNA⑥，DNA⑥分子的3′端与引物D互补配对，5′端与引物C互补配对，所以PCR4的引物为引物C、引物D；PCR3为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5′→3′，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶，因为5′端对扩增特异性影响不大，引物的延伸是从5′端开始的，不能进行任何修饰。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于pstⅠ靠近终止子，所以应在基因上、下游引物的5′端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ。
(3)目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目的基因连接，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四环素的平板上长出菌落，所以这些菌落不一定含有目的基因。
考点梳理·整合突破
整合考点23 生物技术的安全性与伦理问题
任务驱动
任务1 理清治疗性克隆与生殖性克隆的关系
类型
项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 从胚胎中获取_________用于医学研究和治疗 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞水平 水平
联系 都属于______生殖；产生的新个体或新组织，_______相同
干细胞
个体
无性
遗传信息
任务2 比较试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
(1)试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿用于白血病、贫血症等疾病的治疗。
(2)两者都是体外受精，并进行体外____________，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
早期胚胎培养
过程评价
评价1 依托真题归类比较再体验，明考向
1.[2023·浙江1月]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
答案：D
解析：我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，A错误，D正确；我国政府同样重视治疗性克隆所涉及的伦理问题，主张对治疗性克隆进行有效监控和严格审查，B错误；生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误。
评价2 依托教材专练长句表述，提考能
2.(选择性必修3 P102“相关信息”)在转基因研究工作中，我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中，其原因是什么？
3．(选择性必修3 P107“思考·讨论”拓展)治疗性克隆与生殖性克隆的主要区别是什么？
答案：由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性，因而可以防止转基因花粉的传播。
答案：在治疗性克隆中获得的早期胚胎用于获得胚胎干细胞，然后诱导胚胎干细胞分化出所需的特定的细胞、组织和器官；在生殖性克隆中获得的胚胎则通过胚胎移植移植到母体的子宫内，由母体孕育出婴儿。
4．(选择性必修3 P113“思考·讨论”节选)在战争中，为预防敌方使用生物武器，你认为参战部队采取的最有效措施是什么？请简述这一措施的原理。
答案：最有效的措施是接种常见病原体的疫苗，目的是使参战人员体内产生相应的抗体。
评价3 依托真题归类比较再探究，强素养
5.[2021·河北卷]采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为_____________。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是_________________。
构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是______________________。
(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是____________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是__________________________。
基因组文库
限制酶和DNA连接酶
便于目的基因的筛选和鉴定
农杆菌转化法
避免目的基因在自然界中的扩散
解析：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。
(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的
_______(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的_______进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
耐性
茎叶
解析：根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是____________________________________________________________ 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于
__________________________________________________(写出两点即可)。
YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水
杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
解析：YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
模拟预测·题组集训
题组预测一 聚焦生物技术的安全性和伦理问题
1．[2023·北京朝阳统考一模]生物武器作为一种大规模杀伤性武器，在人类历史上造成了严重的威胁与伤害，全人类需要严格禁止生物武器。以下做法错误的是( )
A．遵守不发展、不生产、不储存生物武器公约
B．发展生物安全前瞻科技、储备生物防御技术
C．设立相关法律条例保护人类遗传资源信息
D．改变致病微生物的表面抗原使其难以检测
答案：D
解析：生物武器是指有意识的利用微生物、毒素、昆虫侵袭敌人的军队、人口、农作物或者牲畜等目标，以达到战争目的一类武器，为了维护世界和平，中国在《禁止生物武器公约》中重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，A正确；为防止生物武器的危害，要发展生物安全前瞻科技、储备生物防御技术，B正确；设立相关法律条例保护人类遗传资源信息，可以防止生物武器的危害，C正确；改变致病微生物的表面抗原使其难以检测，不利于防止生物武器的危害，D错误。
2．[2022·湖北省武汉市高三模拟]下列关于“克隆羊”“试管羊”“转基因羊”的说法，合理的是( )
A．这三种羊都是无性繁殖的产物
B．在培育过程中都需要使用二氧化碳培养箱
C．在培育过程中都需要用到核移植技术
D．在培育过程中都需要采集良种公羊的精子
答案：B
解析：克隆羊属于无性繁殖，试管羊、转基因羊属于有性生殖，A错误；在培育过程中都需要使用二氧化碳培养箱，B正确；克隆羊在培育过程中需要用到核移植技术，试管羊和转基因羊不需要，C错误；克隆羊在培育过程中不需要采集良种公羊的精子，D错误。
3．[2023·江苏省镇江市高三调研] 下列关于生物工程和技术的说法正确的是( )
A．从某生物cDNA文库中获取的目的基因不含启动子
B．PCR反应中温度的周期性改变是为了TaqDNA聚合酶催化不同的反应
C．蛋白质工程实施过程中可对关键氨基酸直接置换或增删
D．外源基因不会通过花粉扩散到转基因植物的近缘生物中
答案：A
解析：cDNA是逆转录形成的，因此从某生物cDNA文库中获取的目的基因不含基因中的启动子，A正确；PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，B错误；蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状，合成新的蛋白质，C错误；外源基因可通过花粉扩散到转基因植物的近缘生物中，D错误。
4．[2023·北京市朝阳区高三期中]表中关于转基因作物的观点和理由，合理的是( )
选项 观点 理由
A 与传统作物的味道、色彩不同的不一定是转基因作物 杂交育种、诱变育种也能培育出来
B 应避免摄入转基因食品 没有或很少有害虫吃转基因作物，说明它们抗虫，同时也威胁人体健康
C 只吃应季水果 反季水果都来自转基因作物
D 用转基因作物替代现有全部农作物 转基因农作物性状优良，没有任何风险
答案：A
解析：通过杂交育种、诱变育种也能培育出来与传统作物的味道、色彩不同的作物品种，不一定是转基因作物，A正确；没有或很少有害虫吃转基因作物，说明它们抗虫，但未必威胁人体健康，因为人体结构与害虫的生理结构差异很大，我们可以适当减少转基因食品，B错误；反季水果不都来自转基因作物，也可能是利用温室大棚通过改变环境条件培育的，因此，我们未必只吃应季水果，C错误；转基因农作物性状优良，可能存在潜在的风险，因此，我们需要有选择性地转基因作物，不必用转基因作物替代现有全部农作物，D错误。
题组预测二 综合考查生物技术的安全性与伦理问题
5．[2023·广东韶关统考二模]不同动物细胞膜表面的分子标签(MHC，主要组织相容性抗原)具有特异性，使得即使在相同抗原的刺激下，与人类相比，所产生的免疫反应也有很大的差异性，为此，构建人MHC转基因小鼠模型并应用于疫苗研发，具有重要的价值。如图是人MHC转基因小鼠模型的构建过程。
(1)过程①用___________处理可以获取更多的卵(母)细胞，过程③所用的技术是_________。
将早期胚胎植入代孕母鼠前，需对受体进行____________。
(2)图中X表示_____________过程。从基因组数据库中查询人MHC的mRNA的核苷酸序列，以便根据这一序列设计合成_________用于PCR扩增，PCR扩增过程第一轮循环的模板是_________________。
(3)通过上述途径和杂交选育虽然可获得含有人源MHC基因的纯合子代小鼠，但该模型小鼠还不是理想的模型动物，理由是________________________，表达的产物会干扰疫苗的筛选或评价。欲获得理想的模型动物，后续的实验设想是________________________________________________________。
促性腺激素
体外受精
同期发情处理
反转录(逆转录)
引物
人MHC基因的cDNA
该模型小鼠含有鼠源MHC基因
运用基因编辑技术将鼠源的MHC基因敲除，得到仅含人MHC基因的小鼠
解析：(1)过程①为获取卵母细胞，为了获取更多的卵(母)细胞，可以用促性腺激素处理供体雌鼠使之超数排卵。过程③为体外受精，获得受精卵。胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，为了提高胚胎移植的成功率，将早期胚胎植入代孕母鼠前，需对受体进行同期发情处理使之处于与供体母鼠相同的生理状态。
(2)图中X的过程以mRNA为模板，产物是cDNA，故X过程为反(逆)转录。PCR过程需要模板、原料、酶，以及引物，设计引物时需要有一段已知的目的基因序列。PCR的原理是DNA半保留复制，扩增过程第一轮循环的模板是人MHC基因的cDNA。
(3)不同动物细胞膜表面具有不同的分子标签，即MHC，通过上述途径和杂交选育虽然可获得含有人源MHC基因的纯合子代小鼠，但该模型小鼠含有鼠源MHC基因，表达的产物会干扰疫苗的筛选或评价，故该模型小鼠还不是理想的模型动物。欲获得理想的模型动物，则需要想方设法除去鼠源的MHC基因，方法为运用基因编辑技术将鼠源的MHC基因敲除，得到仅含人MHC基因的小鼠。
知识拓展
1.基因组编辑的含义：对基因进行定点“修改”，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
2．应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9
3．CRISPR/Cas9组分及功能：
短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂
4.CRISPR/Cas9技术的主要应用：
(1)基因敲除。
(2)特异突变引入。
(3)定点转基因。
5．CRISPR/Cas9技术的风险：
(1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
(2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。
专项提升
1.基因组编辑技术是指将外源DNA片段导入染色体DNA特定位点或删除基因内部特定片段，是一种对生物体基因组特定目标基因进行修饰的技术。如图是对某生物B基因进行基因编辑的过程，该过程中用sgRNA指引限制性内切核酸酶Cas9结合到特定的靶位点。
下列相关叙述错误的是( )
A．sgRNA的全部碱基序列与靶基因序列完全互补
B．限制性内切核酸酶Cas9可断裂核苷酸之间的磷酸二酯键
C．根据上述处理前后生物体的功能变化，可推测B基因的功能
D．使用该项基因组编辑技术来预防人的某些疾病时需要审批
答案：A
解析：据图观察sgRNA的部分碱基序列与靶基因序列互补，A错误；由图看出限制性内切核酸酶Cas9能剪切下DNA片段，故可断裂核苷酸之间的磷酸二酯键，B正确；通过破坏B基因后生物体的功能变化，可推测B基因的功能，C正确；基因组编辑技术用于人类疾病研究时，有可能涉及伦理道德问题，故使用该项基因组编辑技术来预防人的某些疾病时需要审批，D正确。
2．人体移植器官短缺是一个世界性难题。目前，科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造，再结合克隆技术，培养出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。下图为科学家借助CRISPR/Cas9基因组编辑技术剔除猪抗原决定簇基因的示意图(不同的sgRNA可以识别不同的DNA序列)，请回答下列问题：
(1)DNA重组技术主要用到的工具酶包括DNA连接酶和_____________________。图中充当该酶的物质是________________。
(2)Cas9-sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是____________________________________________________。
(3)培育转基因猪时，应使用_________技术将剔除了猪抗原决定簇基因的基因表达载体导入猪成纤维细胞中，再将该细胞的细胞核注入__________________的去核卵母细胞中，构建重构胚。
限制性内切核酸酶(限制酶)
Cas9-sgRNA复合体
sgRNA是单链，可与特定核苷酸序列即靶核苷酸序列碱基互补配对
显微注射
减数分裂Ⅱ期(MⅡ期)
解析：(1)DNA重组技术即基因工程，主要用到的工具酶是DNA连接酶和限制酶；由分析可知，Cas9-sgRNA复合体充当限制性内切核酸酶。(2)使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列根据碱基互补配对原则结合在一起，从而能够精准识别该核苷酸序列(sgRNA是单链，可与特定核苷酸序列即靶核苷酸序列碱基互补配对)。(3)将目的基因(基因表达载体)注入动物细胞的最有效方法是显微注射技术；将该转基因猪的细胞核注入减数分裂Ⅱ期(MⅡ期)的去核卵母细胞中，构建重构胚。
