课件50张PPT。1．2 基因工程的基本操作程序专题1 基因工程学习导航专题1 基因工程一、基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
↓
__________________的构建
↓
将____________导入受体细胞
↓
目的基因的____________基因表达载体目的基因检测与鉴定二、目的基因的获取
1．目的基因：主要是指______________的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2．目的基因的获取方法
(1)从基因文库中获取
①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入_____________中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。编码蛋白质受体菌的群体③提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物____________，以及基因的表达产物蛋白质等特性。
(2)利用PCR技术扩增目的基因
①PCR的含义：是一项在生物____________复制特定DNA片段的核酸合成技术。
②目的：短时间内大量扩增目的基因。
③原理：___________________。基因组mRNA体外DNA双链复制④过程：
第一步：加热至90～95 ℃，____________；
第二步：冷却至____________℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
⑤特点：指数形式扩增。
(3)人工合成
如果目的基因较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA合成仪用____________人工合成。DNA解旋55～60 化学方法三、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的：
(1)使目的基因在_____________中稳定存在，并且可以_____给下一代。
(2)使目的基因能够_______和____________。受体细胞遗传表达发挥作用2．基因表达载体组成：3．基因表达载体的功能：通过基因表达载体将____________导入受体细胞。
巧记
两子启动和终止；
目的基因在中间；
标记基因来筛选。目的基因四、将目的基因导入受体细胞
1．转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内______________________的过程。
2．将目的基因导入植物细胞
(1)____________法:将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。
(2)基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
(3)____________法：我国科学家独创的一种方法。维持稳定和表达农杆菌转化花粉管通道3．将目的基因导入动物细胞
(1)方法：____________。
(2)常用受体细胞：受精卵。显微注射法4．将目的基因导入微生物细胞
(1)方法：
①用__________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为____________)。
②感受态细胞吸收________________________。
(2)受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。
(3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。Ca2＋感受态细胞重组表达载体DNA分子五、目的基因的检测与鉴定
1．分子水平检测
(1)检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因。
方法：_______________技术。
(2)检测目的基因是否转录出mRNA。
方法：____________杂交技术。
(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：____________杂交技术。
2．个体生物学水平鉴定：抗虫、抗病、抗逆性状的有无及程度。DNA分子杂交分子抗原—抗体1．判一判
(1)所有的目的基因都可从基因文库中直接获得。( )
(2)标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。( )
(3)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( )
(4)基因工程常用的受体细胞都是动植物的体细胞。( )
(5)基因工程是否成功需进行个体生物学水平上的鉴定。( )√××√√2．连一连
将下列方法技术与其对应内容连线目的基因的获取1．基因文库：基因组文库和cDNA文库
(1)基因文库的含义(如图所示)(2)cDNA文库与基因组文库的主要区别：小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以2．提取目的基因方法的比较操作简单专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强,可产生自然界中不存在的新基因工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度、技术要求高适用范围小3．PCR技术与生物体内DNA复制的比较DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶温度条件需控制温度，在较高温度下进行细胞内温和条件结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等特别提醒 获取目的基因需在受体细胞中表达
(1)真核细胞的基因编码区含有不能表达的区域，因此不能直接用于基因的扩增和表达。获得真核细胞中的目的基因时，一般用人工合成的方法。
(2)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。
(3)通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。 下列获取目的基因的方法中需要模板的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③反转录法 ④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
[解析] PCR技术利用的是DNA双链复制原理。即将DNA双链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在反转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④则均不需要模板。D(2014·甘肃兰州一中高二检测)获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是( )
A．从基因组文库中获取
B．从cDNA文库中获取
C．直接从受体细胞中获取目的基因
D．利用PCR技术获取
解析：应该直接从供体细胞中获取目的基因。C基因表达载体的构建2．构建方法：特别提醒 启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别
启动子≠起始密码(子)；终止子≠终止密码(子)。
(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。
(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。 (2014·聊城高二检测)下列关于基因表达载体的构建描述错误的是( )
A．基因表达载体的构建是基因工程的核心
B．基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分
C．目的基因主要是指编码蛋白质的基因
D．构建的基因表达载体都是相同的
[解析] 基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的基因；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别，不可能都是相同的。D由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，加上目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别，不可能千篇一律。(2014·安徽屯溪一中高二质检)人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因，该抗性基因的主要作用是
( )
A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B．有利于对目的基因是否导入进行检测
C．增加质粒分子的分子量
D．便于与外源基因连接
解析：抗生素抗性基因为标记基因，便于对目的基因是否导入进行检测。B1．目的基因导入受体细胞的过程：目的基因导入受体细胞2．不同受体细胞的常用导入方法显微注射法Ca2＋处理法体细胞受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵
(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子特别提醒 目的基因能否稳定遗传的判断
目的基因能否在受体细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体上的DNA分子中。图中过程b与过程a相比，b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，而a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。 (2014·山东济南高二检测)农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到____________________(部位)即可。单子叶植物目的基因导入植物细胞染色体的DNAT-DNA片段(内部)(2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制________________________(酶)合成的基因。
(3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是________类化合物。
(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取________________________。(至少写出两种)DNA连接酶、限制酶酚基因枪法、花粉管通道法[解析] (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。(1)能促进含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中的常用方法是什么？
(2)怎样操作可促进单子叶植物受农杆菌的感染？
提示：(1)用Ca2＋(或CaCl2溶液)处理可增加农杆菌细胞壁的通透性而达到促进含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌中的目的。
(2)可在单子叶植物受损处加涂酚类物质来吸引更多的农杆菌感染。下列关于目的基因导入受体细胞的描述不正确的是( )
A．基因枪法导入植物体细胞的方法比较经济有效
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C.大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
解析：不同生物目的基因导入的方法不同，每种方法都有利有弊。目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济有效，基因枪法成本较高；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；大肠杆菌细胞最常用的转化方法就是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变,完成转化过程。A目的基因的检测与鉴定目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术(DNA和mRNA之间)目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术是否成功显示出杂交带包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同特别提醒 在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，所用的探针都是用放射性同位素等标记的含有目的基因的单链DNA片段。 回答有关基因工程的问题：
(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。平相同(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_____________________________。在用表达载体转化大肠杆菌时,常用____________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入;为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交,该杂交技术称为
_______________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成____________,常用抗原—抗体杂交技术。RNA聚合酶识别和结合的部位Ca2＋分子杂交技术蛋白质[解析] (1)限制酶切割产生两种末端；黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。
(2)基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术;检测是否形成蛋白质，使用抗原—抗体杂交技术。(2014·陕西西安高二检测)下列哪项表述说明了目的基因表达成功( )
A．用DNA探针检测目的基因出现杂交带
B．用DNA探针检测mRNA出现杂交带
C．用抗原—抗体杂交检测蛋白质出现杂交带
D．以上都不能说明
解析：由于基因工程产生与天然产品的功能不一定相同，往往需要进行活性的比较，才能确定功能程度，最终说明目的基因是否表达成功。D本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放
1．基因工程的基本操作程序有：①使目的基因与运载体相结合；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求；④提取目的基因。正确的操作顺序是( )
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
解析：选C。平常要熟记基因工程的“四步曲”：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。
2. 如图为表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是( )
A．氨苄青霉素抗性基因
B．启动子
C．限制酶
D．DNA连接酶
解析：选B。启动子是该表达载体所必需的，功能是启动插入基因的转录过程。氨苄青霉素抗性基因可以作为标记基因，但不是必须用它作标记基因。限制酶和DNA连接酶都不是表达载体所需要的。
3．下列关于图中P、Q、R、S、G的描述，正确的是( )
A．P代表的是质粒RNA，S代表的是外源DNA
B．Q表示限制酶的作用，R表示RNA聚合酶的作用
C．G是RNA与DNA形成的重组质粒
D．G是重组质粒DNA
解析：选D。质粒是小型环状DNA分子，因此P是质粒DNA，S是外源DNA，G是质粒和外源DNA通过DNA连接酶连接而成的重组质粒；质粒和外源DNA需经过同一种限制酶切割出相同的黏性末端。
4．(2014·高考广东卷)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是(双选)( )
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
解析：选AD。A项，过程①是通过逆转录获取DNA，逆转录过程需要用到逆转录酶。B项，过程②指的是从cDNA文库中获取目的基因，不需要利用PCR技术，也用不到解旋酶。C项，过程③中使用的感受态细胞要用CaCl2溶液制备，而不是用NaCl溶液制备。D项，过程④鉴定目的基因是否已经导入受体细胞，可以用标记的目的基因为探针来检测受体细胞中是否存在目的基因，即利用DNA分子杂交鉴定。
5．(2014·湖南长沙高二检测)DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时，形成标记DNA—DNA(或标记DNA—RNA)的双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是( )
①该人胰岛A细胞中的DNA ②该人胰岛B细胞中的mRNA ③该人胰岛A细胞中的mRNA ④该人肝细胞中的DNA
A．①③④ B．①②③
C．①②④ D．②③④
解析：选C。DNA单链能与其互补链及其转录产生的mRNA分子互补配对而形成杂交分子；人体细胞中都有胰岛素基因，但此基因只有在胰岛B细胞中才能得到表达。
6．(2014·高考新课标全国卷Ⅱ)植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的______________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了________________________________________________________________________
(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。
解析：(1)基本组文库含有生物的全部基因，而cDNA文库中含有生物的部分基因。(2)植物甲具有极强的耐旱
性，其耐旱性与某个基因有关，若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，包含该生物的所有基因，然后再从中筛选出所需的耐旱基因。(3)若从植物甲中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，通常采用的方法是农杆菌转化法。将耐旱基因导入植物乙的体细胞后，经过植物组织培养得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测该耐旱基因是否合成了相应的蛋白质，即检测此再生植株中该基因的表达产物，如果检测结果呈阳性，说明已经合成了相应的蛋白质，这时再进行个体生物学检测，即在田间试验中检测植株的耐旱性是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱和不耐旱植株的数量比为3∶1，符合基因的分离定律，说明得到的二倍体转基因耐旱植株为杂合子，因此可推测该耐旱基因只整合到了同源染色体的一条上。
答案：(1)全部 部分 (2)筛选 (3)乙 表达产物
耐旱性 (4)同源染色体的一条上
1．获取目的基因的常用方法有：从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子及标记基因。
3．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。
4．培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方法常用显微注射技术。
5．检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测目的基因是否翻译，常用抗原—抗体杂交技术；有的还需个体生物学水平的接种实验检测其活性。
1．(2014·江西南昌高二检测)下列属于获取目的基因的方法的是( )
①利用mRNA反转录形成 ②从基因文库中提取 ③利用PCR技术合成 ④利用DNA转录形成 ⑤人工合成
A．①②③⑤ B．①③④⑤
C．①②③④ D．①②④⑤
解析：选A。目的基因的获取可以从基因文库中提取；也可以用mRNA反转录形成DNA分子的一条链，然后合成DNA分子；对于一些已知一段核苷酸序列的目的基因，可用PCR技术扩增合成；对于一些短小而无模板且已知核苷酸序列的目的基因可用人工合成法；DNA转录出的是RNA，不能得到目的基因。
2．(2014·北京海淀区高二检测)PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似。下列关于两者共同点的叙述，不正确的是( )
①边解旋边复制 ②遵循碱基互补配对原则 ③需要引物 ④过程可分为变性、复性、延伸等步骤
A．①② B．②③
C．③④ D．①④
解析：选D。PCR技术不具①、但具④。
3．(2014·高考江苏卷)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是(多选)( )
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
解析：选ABC。A项，限制性核酸内切酶大多特异性地识别6个核苷酸序列，但也有少数限制性核酸内切酶能识别4个、5个或8个核苷酸序列。B项，PCR反应中温度周期性变化是为变性、复性和延伸创造条件。另外，耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用，变性和复性过程不需要酶的催化。C项，载体质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因。D项，目的基因导入受体细胞后不一定能正常表达。
4．在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( )
①一个表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在相应地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的
A．②③ B．①④
C．①② D．③④
解析：选B。一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。标记基因用于鉴别受体细胞中是否含目的基因。由于受体细胞的种类不同，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建不可能完全相同。
5．农杆菌中含有一个大型的Ti质粒(如图所示)，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程并通过农杆菌向某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是( )
A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏
B．将重组Ti质粒导入农杆菌中时，可以用Ca2＋处理细菌
C．转基因抗旱植物培育是否成功的最简单检测方法是看该植物是否具有抗旱性状
D．若能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，则说明该基因工程项目获得成功
解析：选D。若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点、终止点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏，否则不会成功；将重组Ti质粒导入农杆菌中时，可以用Ca2＋处理细菌，便于完成转化；转基因抗旱植物培育是否成功的最简单检测方法是看该植物是否具有抗旱性状；能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，并能成功表达出抗旱性状，才说明基因工程项目获得成功。
6．将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，应分别采用的方法是( )
A．显微注射法 农杆菌转化法
B．基因枪法 花粉管通道法
C．农杆菌转化法 显微注射法
D．基因枪法 显微注射法
解析：选D。玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射法。
7．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是( )
A．结构简单，操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少、简单
D．性状稳定，变异少
解析：选B。目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，故在很短时间内就能获得大量目的基因表达的产物。
8．(2014·福建福州高二检测)下列有关基因工程操作的叙述正确的是( )
A．用同种限制性核酸内切酶切割载体与目的基因可获得相同的末端
B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同
C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功
D．用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接
解析：选A。一种氨基酸可对应多个密码子，以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列可能不同。只有目的基因在受体细胞中成功表达才标志着基因工程操作的成功。用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为抗性基因作为标记基因可检测表达载体是否导入到受体细胞中。
9．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性内切酶。下列说法错误的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶Sma Ⅰ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：选B。图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
10．(2012·高考浙江卷改编)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是( )
A．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩增基因B
B．利用限制酶从开蓝色花的矮牵牛的基因文库中获取基因B
C．利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞
D．将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞
解析：选A。由题意知：控制蓝色色素合成的基因B是目的基因，提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩增基因B，然后导入天然的玫瑰细胞中，经培育该受体细胞即能获得蓝玫瑰，故选项A正确。限制酶用于切割目的基因而不是获取目的基因；将目的基因B与质粒连接需用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；基因B需与质粒连接形成基因表达载体再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，而不能将基因B直接导入大肠杆菌。
11．为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。如图是获取植酸酶基因的流程。
据图回答：
(1)图中基因组文库________(填“小于”“等于”或“大于”)cDNA文库。
(2)B过程需要的酶是________________。
(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中________和________为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是________。
解析：分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA文库。B过程需要的酶应该是反转录酶；目的基因Ⅰ和Ⅱ除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中DNA和cDNA为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。
答案：(1)大于
(2)反转录酶
(3)DNA cDNA 耐高温
12．如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、Bam HⅠ的酶切位点，ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR Ⅰ、Bam HⅠ在内的多种酶的酶切位点。
据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________、________________、________________三种。
(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是________________________。
解析：(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物；目的基因—目的基因、目的基因—载体、载体—载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有载体—载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
答案：(1)目的基因—载体连接物 载体—载体连接物 目的基因—目的基因连接物
(2)载体—载体连接物 目的基因—载体连接物、载体—载体连接物
(3)启动子 mRNA (4)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ
13．如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、Sma Ⅰ直线所示为三种限制酶的酶切位点。
据图回答下面的问题。
(1)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________________限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含________的培养基上进行。
(2)能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是________(填字母代号)。
A．启动子 B．tetR
C．复制原点 D．ampR
(3)过程①可采用的操作方法是________(填字母代号)。
A．农杆菌转化 B．大肠杆菌转化
C．显微注射 D．基因枪法
(4)为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用________(填字母代号)技术。
A．核酸分子杂交 B．基因序列分析
C．抗原—抗体杂交 D．PCR
解析：(1)由图示可知：需用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因，因酶切后tetR四环素抗性基因结构被破坏而ampR结构完好，故用含氨苄青霉素的选择培养基可筛选含有重组载体的大肠杆菌。(2)启动子是一段特殊的DNA序列，是RNA聚合酶识别和结合的位点，可调控基因的特异性表达。(3)过程①表示把重组载体导入受体细胞的过程，当受体细胞为动物细胞时，常采用显微注射法。(4)人乳铁蛋白基因是否成功表达，关键看是否有其表达产物即人乳铁蛋白，可用抗原—抗体杂交法检测该蛋白是否存在。
答案：(1)Hind Ⅲ和BamH Ⅰ 氨苄青霉素 (2)A (3)C (4)C
14．(2014·潍坊高二检测)如图为培育转基因抗虫棉的技术流程，请据图回答：
(1)质粒上标记基因的作用是________________________________________________________________________。
(2)过程①是________________________，这是基因工程的核心步骤。其目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)过程②采用最多的方法是____________，检测抗虫基因是否整合到棉花细胞DNA分子上的方法是________________________。
(4)经检测抗虫棉细胞染色体上含有一个抗虫基因，该植株自交得到F1，其中全部的抗虫植株再自交一次，后代中抗虫植株占总数的________________________________________________________________________。
解析：(1)质粒上标记基因具有鉴别目的基因是否导入受体细胞的作用。(2)图中分析①是质粒与抗虫基因重组为重组质粒的过程，即基因表达载体的构建过程。(3)棉花为双子叶植物，常用农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞，并用DNA分子杂交技术检测目的基因(抗虫基因)是否整合到棉花细胞DNA分子上。(4)抗虫基因整合到染色体上后，该植株为杂合子，自交2次后代中抗虫植株为5/6。
答案：(1)鉴别受体细胞中是否含有目的基因
(2)基因表达载体的构建 使目的基因在受体细胞中能够稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用
(3)农杆菌转化法 DNA分子杂交
(4)5/6
