人教生物二轮专题复习微专题课件：专题9 生物技术与工程 (1)PCR技术的原理与应用(共44张PPT)

(共44张PPT)
真题测评·试能力
1．(2023·浙江6月选考)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3 GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
专题9 生物技术与工程
(一)　PCR技术的原理与应用
下列叙述正确的是(　 )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
答案：B　
解析：由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；
由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；
利用引物1和引物2进行PCR扩增，大片段包含GFP基因编码区和非编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，只有非编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；
若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩增出条带，仅有Gata3基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
2．(2023·浙江1月选考，节选)甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。
用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的________。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，______为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的________个条带，则可初步确定再生植株来自杂种细胞。
解析：提取纯化再生植株的总DNA，可作为PCR扩增的模板。扩增序列a时所用的特异性引物是M1和M2。PCR的扩增产物常用凝胶电泳进行鉴定。若在2个PCR扩增体系中能分别扩增出a序列和b序列，则将2个PCR扩增体系扩增的产物进行凝胶电泳后，可观察到1个凝胶中含a序列对应的1个条带，1个凝胶中含b序列对应的1个条带。
答案：Ⅰ.模板　Ⅱ.M1、M2　Ⅲ.电泳　1
3．(2022·山东高考)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是____________________________________________________________。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_______________________________________。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是____________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是____________________________。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是___________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此设计扩增P基因的引物需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对，并且是短单链核酸。DNA聚合酶使子链延伸时，是将脱氧核苷酸依次添加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图甲可以看出，P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基共同编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。解决该问题的方案是在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基，使EcoRⅠ识别序列不影响P基因的正常翻译。
(3)按照图乙中各组样品经题中所述处理后，图丙中①组没出现杂交带，②③组出现杂交带，③组杂交带更加明显，说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组含有FLAG-P，出现杂交带，④⑤组含有FLAG-P△，没出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列的作用是参与P与UBC的结合。
(4)根据(3)的分析推测，药物A通过增强P与UBC结合促进P降解，达到治疗该病的目的。
答案：(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基共同编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加一个碱基　(3)增强FLAG-P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
深化学习·提素养
1．常规PCR的原理流程及应用
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2．PCR中设计引物的意义及一般原则
意 义 ①DNA分子体外扩增时必须设计两种引物。
②设计引物的首要目标是其特异性，只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定结构时才能达到这个目标(如图)
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一 般 原 则 ①引物长度一般以20～30个核苷酸为宜，过短降低特异性，过长会引起复性时结合的模板数减少，降低反应效率。
②要避免两个引物间碱基序列互补以及同一引物自身碱基序列互补。
③引物5′末端碱基可添加与模板无关的序列(如限制酶的识别序列、启动子序列等)，便于克隆和表达。
④引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物与核酸序列数据库的其他序列均应无明显同源性，以免造成不必要的非特异性扩增
3．引物的特殊应用
添加 酶位点 在PCR引物的5′端加上根据需要而设计的限制酶酶切位点，PCR产物内部无该切点
反向 PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段即对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增(见下图)
　 [典例]　(2023·南通模拟)递减PCR是常规PCR技术的发展，如图表示递减PCR各阶段温度及时间控制。下列相关叙述错误的是(　 )
A．PCR反应体系中应加入Taq DNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物、缓冲液等物质
B．第 1 阶段的目的是使模板DNA充分解旋，减少DNA复杂结构对扩增的影响
C．第 2 阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板
D．第 4 阶段72 ℃下维持10 min ，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
[答案]　D
[解析]　PCR 反应体系中应加入Taq DNA聚合酶(催化DNA子链的形成)、模板 DNA 、dNTP(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；
据图可知，第1阶段是在96 ℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少 DNA 复杂结构对扩增的影响，B正确；
复性温度越低，能与引物中部分碱基序列发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，故第2阶段中复性温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第3阶段提供更多正确的模板，C正确；
72 ℃下维持10 min ，主要目的是使引物链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。
　[易错提醒]　PCR过程的两点提醒
(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合。
(2)PCR反应的产物并不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。　　
考法训练·融会通
考法(一)　PCR原理及过程
1．(2023·台州二模)某校学习小组进行PCR实验，甲、乙、丙三名同学分别以酵母菌的DNA为材料，进行PCR扩增，各取20 μL产物进行凝胶电泳，得到的结果如下图。下列叙述错误的是(　 )
A．凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱
B．甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多
C．丙同学所用的引物可能与甲、乙同学的不一样
D．丙同学扩增得到的片段比甲、乙同学的要大
答案：D　
解析：凝胶a端靠近电泳槽的负极接线柱，A正确；
甲同学的电泳条带比乙同学条带宽，说明甲同学扩增的DNA产物多于乙同学，故甲同学设置的PCR循环次数可能比乙同学多，B正确；
丙同学扩增产物的电泳条带比甲、乙条带位置距离点样孔更远，说明丙同学扩增得到的DNA片段相对分子质量小，移动速率快，产生这一结果的原因可能是丙同学所用的引物与甲、乙同学的不一样，C正确，D错误。
2．下列关于PCR技术的说法，正确的是(　 )
A.PCR每个循环均包括变性、复性和延伸3个步骤，变性需用解旋酶
B.用于诊断流感病毒的PCR技术，与扩增Bt毒蛋白基因的过程完全相同
C.PCR技术中的引物有两种，与DNA分子由两条反向平行互补链组成的结构有关
D.PCR扩增仪中获得的产物，常采用抗原—抗体杂交的方法进行鉴定
答案：C　
解析： PCR每个循环均包括变性、复性和延伸3个步骤，变性需用高温，不需要解旋酶，A错误；
流感病毒的遗传物质为RNA，若进行诊断流感病毒的PCR技术，需先加入逆转录酶获得DNA，再进行PCR技术，与扩增Bt毒蛋白基因的过程不完全相同，B错误；
由于DNA分子由两条反向平行的互补链组成，因此设计引物时，对应互补的两条链应为两种引物，C正确；
PCR扩增仪中获得的产物为DNA，不能用抗原—抗体杂交的方法进行鉴定，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物，D错误。
3．(2023·梅州二模)二十碳五烯酸(EPA)能促进体内饱和脂肪酸代谢，是人体自身不能直接合成但又不可缺少的营养物质。获取EPA产品的主要途径是从鱼油等海洋渔业资源中提取。研究人员利用转基因技术从海洋细菌中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA，相关过程如图所示，请回答下列问题：
(1)利用PCR扩增pfaB基因前，需设计引物______(填序号)，在第______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(pfaB基因)。
(2)利用PCR扩增pfaB基因时，需将温度上升到90 ℃以上后再降温至50 ℃左右，其目的是________________________。将pfaB基因连接在pPIC9质粒上时所用的酶是____________。
(3)将pfaB-pPIC9表达载体导入酵母菌前，需先将表达载体导入大肠杆菌并进行筛选，筛选时培养基中应加入____________，再将含有表达载体的大肠杆菌与酵母菌置于电转杯中，通过电激将大肠杆菌导入酵母菌，该表达载体在酵母菌中不会随着酵母菌繁殖而丢失的原因是________________________________________。
解析：(1)PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，因此利用PCR扩增pfaB基因前，需设计引物①④。根据半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链。
(2)PCR过程包括高温变性、低温复性、中温延伸。利用PCR扩增pfaB基因时，需将温度上升到90 ℃以上后再降温至50 ℃左右，可以使pfaB基因双链解旋为单链后，便于引物与模板链通过碱基互补配对原则结合。在构建基因表达载体时，必须使用限制酶切割pPIC9质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将pfaB基因连接在pPIC9质粒上。
(3)将pfaB-pPIC9表达载体导入大肠杆菌并进行筛选，由于质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，筛选时培养基中应加入氨苄青霉素。该表达载体上含有真核生物复制原点，能在酵母菌中复制，因此该表达载体在酵母菌中不会随着酵母菌繁殖而丢失。
答案：(1)①④　三　(2)使pfaB基因双链解旋为单链后，便于引物与模板链通过碱基互补配对原则结合　DNA连接酶和限制酶　(3)氨苄青霉素　表达载体上含有真核生物复制原点，能在酵母菌中复制
考法(二)　PCR技术的应用
4．(2023·大连二模)通过引物设计，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变，如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　 )
A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3′端
B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等
C.第2轮PCR中，引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因
D.在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
答案：D
解析： DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸的，据此可知，图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端，A错误；
PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2＋)等物质，B错误；
由图可知，第3轮PCR中引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因，C错误；
在第3轮PCR结束后，会产生23＝8(个)DNA分子，其中含突变碱基对且两条链等长的DNA分子有2个，其他的DNA分子的两条链均是不等长的，故含突变碱基对且两条链等长的DNA分子所占的比例为1/4，D正确。
5．基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图。图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请据图回答下列问题：
(1)图甲所示的基因定点突变技术需要多次PCR，并对PCR的中间产物A、B进行纯化，据图甲分析，为得到中间产物A、B需要的引物对分别是______________________________________，研究人员利用图甲中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图甲中基因敲除片段的长度为________，基因M1的长度为__________。
基因M A B
长度/kb 3.24、2.8、0.15、0.13 2.8、0.09 3.24、0.05
(2)研究人员将基因M1与Ti质粒重构前需要在基因M1的C、D两端分别加上的黏性末端序列为_____________________。构建重组质粒过程所需要的酶有____________________。
解析：(1)DNA复制时子链的合成方向为5′端→3′端，故引物需要与模板的3′端结合，据图甲可知，使用引物1和3可得到包含片段A的产物，使用引物2和4可得到包含片段B的产物；基因M上有三个酶切位点(箭头处)，完全酶切产生4个片段，长度分别为3.24 kb、2.8 kb、0.15 kb、0.13 kb，产物A酶切后产生2个片段，长度分别为2.8 kb、0.09 kb，产物B酶切后产生2个片段，长度分别为3.24 kb、0.05 kb，图中产物A和产物B的特定序列“……”是相同的，
因此“……”长度为0.05 kb，则基因M1的长度为2.8＋0.05＋3.24＝6.09(kb)，因此基因敲除片段的长度为(3.24＋2.8＋0.15＋0.13)－6.09＝0.23(kb)。
(2)由图乙可知， 重组质粒中基因M1的C端为Hind Ⅲ的酶切位点、基因M1的D端为Pst Ⅰ的酶切位点，因此需要在基因M1的 C、D 两端分别加上HindⅢ、Pst Ⅰ的识别序列，结合两种酶的酶切位点可知，需在基因M1的C、D两端分别加上的黏性末端序列为—TCGA、ACGT—；此外，构建重组质粒过程所需要的酶还有DNA连接酶。
答案：(1)引物1和引物3、引物2和引物4　0.23 kb　6.09 kb　(2)—TCGA、ACGT—　HindⅢ、PstⅠ、DNA连接酶