2024届高考生物复习：基因工程非选择题专练（有解析）
文档属性
| 名称 | 2024届高考生物复习：基因工程非选择题专练（有解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.9MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-03-04 16:06:22 | ||
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文档简介
2024届高考生物复习非选择题专练-基因工程
1．近年来，生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏DGATI基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的产油微藻并利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。
限制酶及其识别序列
限制酶 识别序列
BamH I
Hind III
EcoR I
Xba I
注：LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则呈白色。
(1)提取紫苏细胞的总RNA经过 得到的cDNA，经 技术扩增得到DGAT1基因，与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经CaC12处理后的大肠杆菌细胞，并接种到添加 的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为 的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。
(2)用限制酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到 ，并导入到四尾栅藻。若DGAT1基因序列两端没有限制酶识别序列需要人工添加黏性末端，请根据表中信息写出DGAT1基因两端所添加脱氧核苷酸的碱基顺序 ，使得目的基因左右侧分别与质粒上的BamH I、Xba I酶切末端相连。
(3)转DGATI基因四尾栅藻成功的标志是 。
2．Gas6蛋白的LG部分可识别吞噬细胞表面的TAM蛋白，Gal部分可识别凋亡细胞表面的P物质，Gas6蛋白通过上述两个功能区介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞（如图1），该过程会引发炎症反应。研究者欲通过将Aβ的抗体与Gas6蛋白融合，介导吞噬细胞吞噬阿尔兹海默（AD）患者脑内堆积的Aβ蛋白，以治疗AD。回答下列问题：
(1)αAβ基因编码Aβ的抗体，可通过相关技术在细胞中表达αAβ基因从而获得Aβ抗体。
①通过上述方法获得Aβ抗体 （填“是”或“不是”）单克隆抗体，理由是 。
②上述获得Aβ的抗体方法，与课本中单克隆抗体的制作方法相比，有何异同 （异同点各写出1点）
(2)为减轻炎症反应，应选择图2中的引物 ，通过PCR技术扩增获得Gas6基因，该扩增体系内除加入四种脱氧核苷酸外，还需要加入 等物质。（写出两种）
(3)写出通过酶切、连接的方法构建αAβ Gas6融合基因的方法： 。
(4)将相关基因转入吞噬细胞后，检测吞噬细胞对Aβ的吞噬情况，结果如图3所示。
图3结果说明，融合蛋白能 。
(5)若要将上述方法用于AD患者的治疗，还需进行的研究有 。（写出 条）
3．p53基因是一种重要的抑癌基因。研究人员按图示流程构建双拷贝p53目的基因片段，再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttle连接，构建重组质粒pShuttle-du-p53并对其进行酶切，将酶切产物与复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy-1一起，经电穿孔法共转染大肠杆菌，以进行同源重组，然后筛选并提取双拷贝人p53基因重组腺病毒载体（prAd5-du-p53)，用PacI对其进行酶切使其线性化，转化真核细胞HEK293并获得病毒颗粒（rAd5-du-p53)。该病毒颗粒可为各类肿瘤的治疗提供可能的新途径。回答下列问题：
(1)图示人cDNA由人体白细胞中mRNA经逆转录获得，该过程需使用 酶；该过程所需原料是 。
(2)Pcmv是一种强启动子。对Pcmv进行PCR的过程中，需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是 ；该过程中所选择的引物序列不能太短，且两种引物间不能发生 。构建双拷贝p53目的基因片段时，两个p53基因分别连接Pcmv的优点有 （答出一点即可）。
(3)实验时，使用T4DNA连接酶相较于E.coli DNA连接酶的优势是 。复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy—1是经过一定处理的，包括去除编码病毒复制蛋白的区段和编码对抗宿主的抗病毒防御蛋白的区段，进行上述加工的理由是 。
(4)PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段 会被去除。若以肝癌细胞株为材料，以细胞生长抑制率为指标，比较双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒对癌细胞的抑制效果，简要写出实验思路： 。
4．丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病，其包膜蛋白中包含6个保守序列Bp蛋白和抗原表位R9蛋白。免疫佐剂热敏肠毒素B单位（LTB）是一种免疫增强剂。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组拟先构建针对该病毒的多表位疫苗基因的重组质粒，操作流程如图1、图2所示。请回答以下问题：
(1)图1为利用融合PCR技术获得LTB-R9-Bp融合基因的过程，反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及 。引物P2与P3设计时要求除了考虑引物的碱基数量、与模板链的特异性结合之外，还需要 。请在下图中标出②过程两条模板链的5’端和3’端 。
(2)获得LTB-R9-Bp融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。利用电泳技术对扩增结果进行检测，发现除目标条带外还有其他非特异性扩增条带，原因可能有 。
A．模板DNA被污染 B．引物特异性不强 C．加入原料过多
(3)图2构建融合基因表达载体时，质粒上除了复制起点、标记基因和多个限制酶的识别序列外，还需要有 。将得到的重组质粒导入低温、低浓度的 处理的大肠杆菌，完成转化实验。
5．宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒（HPV）感染有关，其中HPV16、18、31、45型是宫颈癌的高危型，E7蛋白是HPV16型重要的抗原标志蛋白。我国研究人员以酿酒酵母菌为表达载体，成功构建表达HPV16型E7蛋白的转基因重组全酿酒酵母疫苗。图1表示拟转入的质粒上某片段及其上的酶切位点分布，图2表示各限制酶识别序列和切割位点。
(1)研究人员首先需要利用PCR技术从HPV16型的基因组中获取E7蛋白基因的DNA序列，以 为原料合成子链，扩增6次需要引物B 个。
(2)为了将获得的E7蛋白基因准确连接至图1中的质粒上，需要在引物A和引物B的 （填“5′”或“3'”）端分别添加 限制酶的识别序列。若决定E7蛋白的mRNA的碱基序列为5'-AUGAGCUAC…（中间序列）…CAACGTAGA—3',理论上应设计引物A的前12个碱基序列为5' -3'。
(3)控制表达载体大量扩增的组成元件是 ,该结构发挥作用时通常需要的酶是 。
(4)HPV16型E7蛋白疫苗注入人体后作为抗原，可以刺激机体的B淋巴细胞增殖分化成为 。在预防接种疫苗时通常需要多次注射，但是相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期，原因是 。
6．利用转基因的工程菌生产药用蛋白，近些年在我国制药行业中异军突起，我国科学家采用基因工程技术生产干扰素已实现量产。图中质粒是基因工程常用的一种质粒pBR322，目的基因干扰素基因所在的DNA片段酶切位点如图所示。
(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—— 和平末端。在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：分别是 和 ，这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 。
(2)据图示分析，在基因工程操作中，构建重组DNA分子时，可以选用 两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，目的是既能保证目的基因和质粒正向连接，又能防止质粒与目的基因自身环化，除此之外，还可防止 。
(3)质粒作为基因工程的载体，具备的基本条件有 (答出两点即可)。
7．经过基因工程改造的、能生产人胰岛素的大肠杆菌是一种特殊的“工程菌”。所用载体（普通质粒）结构如图1所示，目的基因如图2所示。
(1)该过程中最重要的环节是基因表达载体的构建，方法是选用 （填“X”或“Y”）限制酶同时处理质粒和目的基因，再用 处理使之成为重组质粒。
(2)基因工程的四个基本步骤是 ， ， ， 。
(3)将目的基因导入受体菌时，常出现三种情况未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。如图3是含人胰岛素基因的重组质粒的“工程菌”的筛选示意图：
图3中的 和 （填图3中字母）菌落为含有目的基因的“工程菌”。
8．基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作物性状。通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分。多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR技术。请回答下列问题：
(1)我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得 、 、延熟的转基因作物。
(2)每种基因扩增需要一对引物的原因是 。下表是AB、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要体现在 。
A基因 引物1 5′－GCTCCTACAAATGCCATCATTGC－3′
引物2 5′－GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC－3′
B基因 引物1 5′－TGAATCCTGTTGCCGGTCTT－3′
引物2 5′－AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC－3′
C基因 引物1 5′－CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG－3′
引物2 5′－GCGTCATGATCGGCTCGATG－3′
(3)PCR过程中温度从90 ℃以上降到55 ℃左右的目的是 。
(4)检测人员通过多重PCR技术确定农作物中是否含有A、B、C三种转基因。将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图。
1为已知A、B、C三种基因对照，2、3、4为待测农作物样品，据图分析：含有三种转基因的农作物是 ，判断依据是 。
(5)与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是 。
9．下列几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切割位点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题：
(1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有 。
(2)采用PCR扩增目的基因的原理是 ，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有 两种引物(DNA复制方向由5′→3′)。
(3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是 。
a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成
b．该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定
c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开
d．若该片段复制6次，则需要碱基A的数量至少是252个
(4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生 ，从图2切割下目的基因需要消耗 个水分子。不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是 。
10．目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。探究下列问题：
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为 和 酶。
(2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。
(3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用 和 两种限制酶。
(4)建好的基因表达载体在目的基因前要加上 ，其是 识别和结合的部位。
(5)请简要描述基因表达载体的构建过程 。
11．甜玉米与普通玉米相比，甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢含可溶性糖量高，汁多质脆，富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值，科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。TDNA在该实验中的作用是 。
(2)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 进行筛选，筛选出的愈伤组织 形成丛芽，最终获得多个玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对a1、a2、a3、a4四株甜玉米株系的蛋白质表达量进行测定结果如图2，其中a4株系P蛋白表达量较低的原因可能是 。
(3)为了进一步提高甜玉米中淀粉的含量，科研人员提出通过降低淀粉酶合成有关基因的表达实现生产目标。研究人员研究发现吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，将其注入植物细胞内会使基因表达受阻，科研人员将吗啉反义寡核苷酸导入玉米的受精卵中起到明显效果。针对它的具体作用，科研人员提出以下假说：
假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪。
假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。
为了验证上述假说，分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取 ，逆转录形成 。
(4)在PCR反应体系中，需加入引物、模板基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入 等。PCR的反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，30个循环。在循环之前的94℃ 3min处理为预变性；循环中72℃处理的目的是 。
12．腺病毒是可侵染人体内分泌腺的DNA病毒，具有一定的传染性，其E1基因控制合成的E1蛋白能启动基因组的复制。重组新冠病毒疫苗以5型腺病毒为载体，制备该疫苗的基本流程如图1所示。请回答下列问题：
注：新冠病毒表面抗原主要为S蛋白，由S基因控制合成。
(1)S蛋白基因表达载体构建过程中，要以S蛋白的RNA为模板，在 酶的作用下获取S蛋白基因；科研人员对腺病毒DNA进行人工改造，删除了E1基因，主要目的是 。
(2)图2、3中EcoRI、SmaI、BamHI和HindⅢ为限制酶，箭头所指位点为相应的酶切位点。科研人员欲用图3中载体构建S蛋白基因表达载体，应选择的限制酶是 以提高S蛋白基因和载体连接的正确率，其原因是 。
(3)在利用PCR技术扩增S基因时，应选择的引物为 。对含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒进行扩大培养的操作是 。
(4)若在接种该种疫苗前机体曾感染过腺病毒，则疫苗效果会明显下降，原因是 。
13．猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是通过猪细胞膜上的受体CD163 进行感染的。为实时监控受体CD163的表达和转运过程，科研人员将红色荧光蛋白 RFP 基因与CD163 基因拼接在一起，如图1所示，使其表达为一条多肽。 图2 表示用PCR 扩增后的CD163 基因的部分碱基序列。回答下列问题：
(1)为了完整的扩增CD163 基因序列，科研人员设计了一对碱基序列相等的引物，其中一个引物序列为 另一个引物序列为 。在PCR 扩增过程中引物与两条单链DNA结合时的温度一般要控制在 ℃左右。
(2)为了扩增后的 CD163 基因能够与 RFP 基因拼接在一起，科研人员从图3的三种限制酶中选择了两种，然后对CD163 基因进行切割，切割结果如图3 所示。科研人员选择的限制酶是 ，判断的依据是 。
(3)根据图1分析，为了使拼接后的重组基因能够表达成一条多肽，需要除去 CD163 基因中编码 （填“起始密码子”或“终止密码子”）的序列。
(4)将图1所示表达载体导入猪的细胞，该表达载体转录时以 （填“a”或“b”）链为模板；翻译时，RFP蛋白与CD163蛋白合成的顺序是 。
14．目前，临床上开始采用重组人血清白蛋白（rHSA）替代人血清白蛋白（HSA）。图1为工业化生产rHSA的过程示意图。回答下列问题：
(1)依据图1和下表所示分析，在获取目的基因时，最好选择限制酶 和 共同切割质粒，双酶切法的优点有 （答出2点）。除图示中的启动子之外，构建的表达载体还需要具有的结构有 （答出2点）。
限制酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
识别序列及切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GTAC CATG↑ A↓AGCTT TTCGA↑A
(2)PCR扩增时，要设计一对引物（引物1和引物2），根据图2中HSA基因的两端序列，需要设计的引物序列分别是 和 。如PCR过程完成四次循环，则所需引物的总数为 。
(3)可采用 将重组基因表达载体导入酵母菌。然后在含四环素和氨苄青霉素的两种培养基上分别筛选，筛选出具有 特点的是含HSA基因表达载体的目标菌。
(4)AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，生产中常以其作为HSA基因的启动子，在以 为碳源的培养基中进行培养发酵。该方法的优点是 。
15．红豆杉被称作“植物界的大熊猫”，紫杉醇是红豆杉合成的一种次生代谢物，具有高抗癌活性。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，这种方法不利于对它们的保护。根据材料回答下列问题：
(1)相比于传统方法，利用植物组织（细胞）培养技术获得紫杉醇的方法的优点有 （答出2点）。
(2)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下：
①Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，需要的引物有 （从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段产生2个双链等长的子代Bapt基因片段至少要经过 次循环。
②构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞：在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。强启动子能被 识别并结合，驱动基因持续转录。Ti质粒中的T-DNA在培育转基因红豆杉中的作用是 。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。
③Bapt基因的检测和鉴定。
试卷第1页，共3页
参考答案：
1．(1) 逆转录 PCR 氨苄青霉素和X-gal 白色
(2) 基因表达载体 5′-GGATCC-3′和5′-TCTAGA-3′
(3)四尾栅藻可以生成油脂
【分析】分析题图：图中首先提取紫苏细胞的总RNA经逆转录得到的cDNA，再获得DGAT1基因，接着将DGAT1基因与克隆质粒pMD19结合，形成重组质粒；然后将其导入到经CaCl2处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞，并接种到添加氨苄青霉素和X-gal的培养基培养、筛选。
【详解】（1）RNA到DNA的过程属于逆转录，由RNA得到的cDNA需经过逆转录，经PCR技术扩增得到DGAT1基因，与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经CaCl2处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞。分析题图可知，目的基因插入LacZ基因中，使该基因被破坏，又由题中信息可知：“LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X﹣gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则成白色。”且由于质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故应接种到添加氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为白色的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。
（2）分析题图可知：用限制酶酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到重组基因表达载体，并导入到四尾栅藻。DGAT1基因序列两端无限制酶酶切位点，由表中信息可知DGAT1基因的两端各有限制酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ的识别位点，故可推测扩增DGAT1基因时所用一对引物的一端分别加上的限制酶识别序列是5’-GGATCC-3’和5’-TCTAGA-3’。
（3）题干信息可知，DGATI基因与油脂产生有关，故转DGATI基因四尾栅藻成功的标志是四尾栅藻可以生成油脂。
2．(1) 是 转入细胞的αAβ基因只能表达 Aβ的抗体 相同为均须用到动物细胞培养技术，均可从细胞培养液中获得抗体；不同为上述方法需转入基因，课本方法需诱导细胞融合
(2) F3和 R3 耐高温的 DNA 聚合酶、Gas6 基因
(3)在引物R3和引物F4（或引物R4和引物F3）的5’端加上相同的酶切位点，将扩增产物用该酶切割，用DNA连接酶连接切割产物
(4)介导吞噬细胞识别并吞噬 Aβ
(5)上述方法是否会引起炎症反应
【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】（1）①αAβ基因编码 Aβ的抗体，可通过转基因技术将αAβ基因导入受体细胞，在受体细胞中只能表达 αAβ基因从而获得 Aβ抗体属于单克隆抗体。
②上述获得Aβ的抗体方法，与课本中单克隆抗体的制作方法相比，相同点为均须用到动物细胞培养技术，均可从细胞培养液中获得抗体，不同点为上述方法需转入基因，课本方法需诱导细胞融合。
（2）由题干信息可知，将Aβ的抗体与Gas6蛋白融合，介导吞噬细胞吞噬阿尔兹海默（AD）患者脑内堆积的Aβ蛋白，以治疗AD，且不发生炎症反应，只需扩增Gas6蛋白基因的LG段，无需扩增Gal段，因此引物应选择F3和R3，PCR扩增体系内需加入四种脱氧核苷酸、 耐高温的 DNA聚合酶、Gas6基因、引物等。
（3）在引物R3和引物F4（或引物R4和引物F3）的5’端加上相同的酶切位点，将扩增产物用该酶切割，用DNA连接酶连接切割产物即可构建出构建αAβ-Gas6融合基因。
（4）αAβ-Gas6融合基因表达αAβ-Gas6蛋白，将相关基因转入吞噬细胞后，检测吞噬细胞对Aβ的吞噬情况，结果为导入融合基因的吞噬细胞中Aβ的吞噬程度明显高于未转入基因的组或转入全长Gas6基因的组，说明融合蛋白介导吞噬细胞识别并吞噬Aβ。
（5）要将上述方法用于AD患者的治疗，还需进行的研究是否会引起炎症反应。
3．(1) 逆转录（或反转录） （4种）脱氧核苷酸
(2) 激活耐高温DNA聚合酶（或激活Taq酶） 碱基互补配对（形成二聚物） 增加p53基因的表达量
(3) 既能连接黏性末端又能连接平末端 使病毒失去在细胞内复制的能力，降低宿主针对该腺病毒的免疫反应
(4) Ori和Kan 将生理状况相同的肝癌细胞株均分为两组，一组注射双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒，另一组注射复制缺陷型腺病毒空载体颗粒，在相同且适宜的条件下培养一段时间，期间分别测定细胞活性多次，计算细胞生长抑制率的平均值并比较分析
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）逆转录过程需要逆转录酶的催化。逆转录过程所需原料是4种脱氧核苷酸。
（2）进行PCR的过程中，在缓冲溶液中添加的Mg2+的作用是激活耐高温DNA聚合酶（或激活Taq酶）；进行PCR的过程中，所选择的引物序列不能太短，且两种引物间不能发生碱基互补配对形成二聚物。构建双拷贝p53目的基因片段时，两个p53基因分别连接Pemv可以增加p53基因的表达量。
（3）T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，而E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端。去除E1区（编码病毒复制蛋白）是为了使病毒失去在细胞内复制的能力，而去除E3区（编码对抗宿主的抗病毒防御蛋白）是为了降低宿主针对该腺病毒的免疫反应。
（4）PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段Ori和Kan会因此被去除。以肝癌细胞株为材料，以细胞生长抑制率为指标，比较双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒对癌细胞的抑制效果，简要的实验思路是：将生理状况相同的肝癌细胞株均分为两组，一组注射双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒，另一组注射复制缺陷型腺病毒空载体颗粒，在相同且适宜的条件下培养一段时间，期间测定细胞活性多次，计算细胞生长抑制率的平均值并比较分析。
4．(1) 耐高温的DNA聚合酶 具有部分互补序列
(2) 引物P1和引物P4 AB
(3) 启动子和终止子 Ca2+
【分析】基因工程的操作步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质:抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）应用PCR技术可以对目的基因进行体外大量扩增，反应体系中应提供模板、引物、4种的NTP、耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度实现DNA的解聚，使DNA复制在体外反复进行。引物P2与P3设计时要求除了考虑引物的碱基数量、与模板链的特异性结合之外，还需要具有部分互补序列。由图中颜色可判断，上面一条链为引物P1延伸的链，下面一条链为引物P4延伸的链，子链延伸方向为5'-3'端，标记如下：
（2）根据目的基因的颜色可知，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR。
PCR扩增产物的电泳结果显示，除目的基因条带外，还有非特异性条带，从引物的角度考虑，可能的原因是引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性，也可能是模板DNA被污染 AB正确，C错误。
故选AB。
（3）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因、复制起点、多个限制酶的识别序列等。将表达载体导入微生物细胞需要采用钙离子转化法，即导入之前需在低温、低浓度的Ca2+溶液中处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
5．(1) 四种游离的脱氧核苷酸（或dNTP） 63
(2) 5' MfeI和KpnI CAATTGATGAGC
(3) 复制原点 解旋酶和DNA聚合酶
(4) 记忆B细胞和浆细胞 若间隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的记忆细胞数量少，免疫效果下降
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA是以4种脱氧核苷酸为原料合成，利用PCR技术（原理DNA复制）从HPV16型的基因组中获取E7蛋白基因的DNA序列，以4种脱氧核苷酸为原料合成子链。若一个该目的基因循环扩增6次，PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物B个数计算公式为2n-1，因此扩增6次需要引物B有2n-1=26-1=63个。
（2）引物是从子链的5'端往3'方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与表达载体正确连接，则需要在引物的5'端分别添加相应限制酶的识别序列。由于限制酶EcoRⅠ会切割启动子，限制酶BamHⅠ会切割终止子，因此选择的限制酶是MfeI和KpnI。设计引物A时其左边需要添加MfeI识别序列5'-CAATTG-3'，且引物需要与E7蛋白的DNA碱基序列5'-TACTCG-3'互补配对，故设计引物A的前12个碱基序列为5'-CAATTGATGAGC-3'。
（3）复制原点可以保证表达载体（质粒）在受体细胞中能自我复制，因此，控制表达载体大量扩增的组成元件是复制原点，复制原点的作用是进行目的基因的复制，DNA复制时需要解旋酶和DNA聚合酶。
（4）HPV16型E7蛋白疫苗作为抗原，可以刺激机体的B淋巴细胞增殖分化成为记忆B细胞和浆细胞。若间隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的记忆细胞数量少，免疫效果下降，因此相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期。
6．(1) 黏性末端 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 磷酸二酯键
(2) 酶B、酶C 同时破坏质粒中的两个标记基因
(3)具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；对受体细胞无害（2分，每点1分，答出两点即可）
【分析】1、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
2、由于不同限制酶识别的碱基序列不同，所以在切割质粒和目的基因时常用双酶切，可防止目的基因反向粘连和质粒自行环化。
【详解】（1）DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——平末端和黏性末端。将质粒载体和目的基因进行双酶切，用DNA连接酶连接重新形成磷酸二酯键，DNA连接酶主要有两类：分别是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中后者既能连接平末端，也能连接黏性末端。
（2）标记基因可用于鉴定目的基因是否导入受体细胞，所以重组质粒上至少要保留一个标记基因，由于两个标记基因上均含有酶A的切点，所以不能用酶A切割，防止同时破坏质粒中的两个标记基因。为了保证目的基因和质粒正向连接，防止连接时质粒与目的基因自身环化，故在构建重组载体DNA分子时，可以选用酶B和酶C两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切。
（3）质粒被选用为基因工程的载体是因为：质粒DNA分子上具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；对受体细胞无害。
7．(1) X DNA连接酶
(2) 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
(3) B D
【分析】分析题图：图1为载体，含有抗四环素基因，另还含有X限制酶切位点，位于抗青霉素基因内部；图2为含有人胰岛素基因的片段，含有X和Y限制酶切位点，其中Y限制酶切位点位于胰岛素基因内部。
【详解】（1） 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，该过程需要选用X限制酶同时处理质粒和目的基因，保证目的基因结构的完整性。再用DNA连接酶处理质粒和目的基因，将其连接为重组质粒。
（2）①目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；②基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；③将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；④目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（3）据分析可知，X限制酶切位点，位于抗青霉素基因内部，故重组质粒只含有抗四环素基因，不含有抗青霉素基因，故含人胰岛素目的基因的重组质粒的“工程菌”，可以在含有四环素的培养基上生长，不能在含青霉素的培养基生长，故可以选择B和D菌落为含有目的基因的“工程菌”。
8．(1) 抗虫 抗冻
(2) DNA在加热后得到的两条单链均作为PCR扩增的模板，其序列不同，每一单链对应一条引物 核苷酸的数目不同，序列不同且每对引物之间不能互补配对
(3)使引物与模板链（或“单链”）相应序列互补结合
(4) 样品4 样品4的PCR扩增后的结果与已知三种基因的电泳结果一致
(5)一次检测效率高（可同时检测多种基因）
【分析】关于PCR技术的相关知识：1、概念：PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；2、原理：DNA复制；3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1） Bt毒蛋白基因的抗虫基因，可以表达出毒蛋白，鱼的抗冻蛋白基因可以表达出抗冻蛋白，控制果实成熟的基因可以表达出控制早熟的相关的蛋白，因此将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得抗虫、抗冻、延熟的转基因作物；
（2）引物是根据已知目的基因的一段核苷酸序列合成的，DNA在加热后得到的两条单链作为PCR扩增的模板，序列不同，每一单链对应一条引物，因此每种基因扩增需要一对引物。据表中A、B、C三种基因的引物核苷酸序列分析，引物特异性是引物中特定的碱基序列、核苷酸的数目不同以及每对引物之间不能互补配对。一对引物的序列是不互补的，否则会形成引物二聚体，进而影响目的基因的扩增；
（3）PCR过程中温度加热至90～95℃利于DNA解链，冷却到55～60℃，使引物与模板链（或“单链”）相应序列互补结合；
（4）PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，1组为已知A、B、C三种基因的对照，其中样品4含有A基因、B基因和C基因，但样品2只含有A基因和C基因，样品3不含有这三种基因；
（5）多重PCR技术在一个反应体系中使用两对以上的引物，每对引物都可扩增一种目的基因，多对引物可同时扩增多种目的基因，因此与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是一次检测效率高（可同时检测多种基因）。
9．(1)从基因文库中获取、人工合成
(2) DNA半保留复制 B、C
(3)a
(4) 目的基因与载体反向连接 4/四 会破坏标记基因
【分析】1、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】（1）获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。
（2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。
（3）a．DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；
b．其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；
c．PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；
d．由图3可知，该片段碱基A有2个，复制6次至少需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。
故选a。
（4）在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。
10．(1) 限制酶 DNA连接
(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
(3) BamHⅠ（或EcoRⅠ） HindⅢ
(4) 启动子 RNA聚合酶
(5)用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶（切割目的基因和载体，产生相应的黏性末端）和DNA连接（连接DNA片段，将目的基因与载体连接）。
（2）由图可知，SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因，所以用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割。
（3）使用单酶切会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，所以常选用双酶切，结合图示可知，SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因，所以可选用BamHⅠ（或EcoRⅠ）和HindⅢ切割目的基因和质粒。
（4）表达载体通常包括启动子、目的基因、标记基因、终止子等，其中启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点。
（5）构建基因表达载体时，用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
11．(1) RNA聚合酶 BamHⅠ和SacⅠ 将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上
(2) 潮霉素 再分化 a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达
(3) 总RNA cDNA
(4) Taq酶/耐高温DNA聚合酶/热稳定DNA聚合酶/4种脱氧核苷酸（dNTP） Taq酶从引物的3’端起始进行子链合成
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，需要将P基因导入到玉米细胞中，因此需要首先构建基因表达载体，则P基因和Ti质粒需要相同的限制酶切位点，结合图示可知，BamHⅠ后面有强启动子不能丢弃，EcoRⅠ和NotI限制酶会破坏目的基因，因此选择BamHⅠ和SacⅠ限制酶的组合。T-DNA是可转移的DNA，T-DNA可将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上，随着玉米染色体DNA的复制而复制，从而使目的基因在受体细胞中稳定的保存。
（2）农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，重组质粒中有潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，但植物细胞能表现出对潮霉素的抗性，因此，培养基中需加入潮霉素进行筛选，并以此为特性进行筛选，将筛选出的愈伤组织经过再分化（细胞分化）形成丛芽，从而获得多个转基因玉米株系。a4株与野生型的P蛋白表达量基本相同，可能原因是a4株系玉米中导入目的基因或目的基因未表达。
（3）针对吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，提出假说1和假说2，为验证上述假说，可分别从受精后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成cDNA。若假说1成立，即实验组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，对照组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去。
（4）PCR技术指的是体外扩增DNA的技术，其需要的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；据此可推测，在PCR反应体系中，需加入引物、模板基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入Taq酶/耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。PCR的反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，30个循环。在循环之前的94℃ 3min处理为预变性；循环中72℃处理的目的让子链延伸，即使Taq酶从引物的3’端起始进行子链的延伸。
12．(1) 逆转录 限制腺病毒DNA的复制，提高安全性；增大对目的基因的载量
(2) BamHI和HindⅢ 避免载体和S蛋白基因自身连接或反向连接
(3) 引物4、引物5 先在体外大量培养HEK细胞，然后接种含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，继续培养一段时间
(4)机体存在针对腺病毒的抗体和记忆细胞，会迅速消灭接种的疫苗，致使腺病毒载体重组疫苗不能表达并释放S蛋白
【分析】制备疫苗的目的是希望在人体内产生特异性抗体或记忆细胞，由于S蛋白为抗原的主要部分，所以无论是哪条途径都需要在人体内形成S蛋白才可。灭活的病毒肯定含有S蛋白，但可能存在灭活不充分的情况，安全性较差。重组病毒疫苗需要以S蛋白基因为目的基因，构建重组病毒。腺病毒复制缺陷病毒为载体，具有不能在人体细胞中复制的特点，伤害较小，同时将S蛋白基因导入，使得其可以产生S蛋白，引起人体的特异性免疫。
【详解】（1）由于新冠病毒的遗传物质是RNA,S蛋白基因表达载体构建过程中，要以S蛋白的RNA为模板，通过逆转录酶的作用获取S蛋白基因；由于E1基因控制合成的E1蛋白能启动基因组的复制，科研人员对腺病毒DNA进行人工改造，删除了E1基因，删除E1基因的主要目的是限制腺病毒DNA的复制，提高安全性；增大对目的基因的载量。
（2）科研人员欲用图3中载体构建S蛋白基因表达载体，应选择的限制酶是BamHI和HindⅢ，原因是使用限制酶BamHI和HindⅢ切割，能获得完整的S蛋白基因，而且载体上存在这两种酶的切割位点。BamHI和HindⅢ双酶切可以提高S蛋白基因和载体连接的正确率，避免载体和S蛋白基因自身连接或反向连接。
（3）任何一条子链都是从5'端到3'端合成的，另外考虑基因的完整性，在利用PCR技术扩增S基因时，应选择的引物为引物4、引物5。对含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒进行扩大培养的操作是先在体外大量培养HEK细胞，然后接种含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，继续培养一段时间。
（4）若在接种该种疫苗前机体曾感染过腺病毒，则机体存在针对腺病毒的抗体和记忆细胞，会迅速消灭接种的疫苗，致使腺病毒载体重组疫苗不能表达并释放S蛋白，疫苗效果会明显下降。
13．(1) 5'-AGCTAGCA-3' 50
(2) Nhe Ⅰ、Cfo Ⅰ 酶切后的序列有Nhe Ⅰ的黏性末端序列GTAGC，有Cfo Ⅰ的黏性末端序列GCG
(3)终止密码子
(4) b 先合成CD163蛋白，再合成RFP蛋白
【分析】基因工程操作的步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。获取目的基因的方法有多种，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR产物的鉴定方法：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
【详解】（1）为了完整的扩增CD163 基因序列，科研人员设计了一对碱基序列相等的引物，其中一个引物序列为 5' TGCGCAGT 3'，另一个引物序列为5'-AGCTAGCA-3'。在PCR 扩增过程中引物与两条单链DNA结合时的温度一般要控制在50℃左右。
（2）为了扩增后的 CD163 基因能够与 RFP 基因拼接在一起，科研人员从图3的三种限制酶中选择了两种，然后对CD163 基因进行切割，切割结果如图3 所示。科研人员选择的限制酶是Nhe Ⅰ、Cfo Ⅰ，判断的依据是酶切后的序列有Nhe Ⅰ的黏性末端序列GTAGC，有Cfo Ⅰ的黏性末端序列GCG。
（3）根据图1分析，为了使拼接后的重组基因能够表达成一条多肽，形成融合蛋白，所以需要除去 CD163 基因中编码终止密码子的序列。
（4）将图1所示表达载体导入猪的细胞，该表达载体转录时以b链为模板；翻译时，RFP蛋白与CD163蛋白合成的顺序是先合成CD163蛋白，再合成RFP蛋白。
14．(1) Ⅱ Ⅳ 使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接；避免目的基因和质粒自连 目的基因、标记基因、终止子
(2) 5'-AATGGATCCTTC-3' 3'-GTAAGTTAAGAG-5' 30
(3) 显微注射法 抗四环素不抗氨苄青霉素
(4) 甲醇 可以通过控制培养液中甲醇的有无来控制HSA 基因的表达
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）由于质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点，故不能选用限制酶Ⅲ；由于氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因均含有限制酶Ⅰ的识别位点，故不能使用限制酶Ⅰ，所以选用Ⅱ和Ⅳ切割目的基因和质粒，选用双酶切法，可有效避免基因的反向链接和自身环化。构建基因表达载体是需要有启动子（起始转录）、目的基因、标记基因（便于筛选）、终止子（终止转录）等。
（2）PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因碱基互补配对，子链延伸时从引物的 5'向 3'端延伸，所以两个引物分别为：5'-AATGGATCCTTC-3'，3'-GTAAGTTAAGAG-5'。PCR过程完成一次循环产生两个DNA分子，所需引物为2个，完成第二次循环产生四个DNA分子，所需引物为4个，以此类推，完成第四次循环产生16个DNA 分子，所需引物为16个，所以PCR过程完成四次循环所需引物的总数为：2+4+8+16=30。
（3）将重组基因表达载体导入酵母菌可用显微注射法或基因枪法。根据图1所示，HSA基因插入质粒时破坏了抗氨苄青霉素基因，其标记基因为四环素抗性基因，所以导入重组基因表达载体的酵母菌抗四环素不抗氨苄青霉素。
（4）AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，生产中常以其作为HSA基因的启动子，则在以甲醇为唯一碳源的培养基中HSA基因正常表达，无甲醇时该基因不表达，故而选用AOX1作为rHSA基因的启动子时可以通过控制培养液中甲醇的有无来控制HSA基因的表达。
15．(1)不占用耕地，不受季节、天气等限制，利于保护濒危植物，产量高，不破坏环境等
(2) BC 3 RNA聚合酶 将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上 NotI和SacI
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）植物组织（细胞）培养技术优点有：不占用耕地，不受季节、天气等限制，利于保护濒危植物，产量高，不破坏环境等。
（2）①由于DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，由图1可知，5'端对应的引物分别是B和C；
设计的引物决定了扩增产物的长度，第一个循环，引物与模板互补，此时变成两个模板，但因为模板很长，没有什么终止扩增，所以第一个循环扩增出来的新片段很长，第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因，第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，所以当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因，所以至少要3个循环才能产生双链等长子代Bapt基因；
②RNA聚合酶识别并与启动子结合，启动转录。
Ti质粒中的T-DNA将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上。
分析目的基因可知，不可以使用EcoRI、BamHI以及HindIII，所以Ti质粒使用SacI和NotI，为使DNA片段能定向插入T-DNA中，启动子在前，所以在DNA片段的M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotI和SacI
1．近年来，生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一。研究人员利用基因工程的方法将油料作物紫苏DGATI基因导入四尾栅藻（操作过程如图），获得转基因的产油微藻并利用地热废水培养，不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。
限制酶及其识别序列
限制酶 识别序列
BamH I
Hind III
EcoR I
Xba I
注：LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X-gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则呈白色。
(1)提取紫苏细胞的总RNA经过 得到的cDNA，经 技术扩增得到DGAT1基因，与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经CaC12处理后的大肠杆菌细胞，并接种到添加 的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为 的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。
(2)用限制酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到 ，并导入到四尾栅藻。若DGAT1基因序列两端没有限制酶识别序列需要人工添加黏性末端，请根据表中信息写出DGAT1基因两端所添加脱氧核苷酸的碱基顺序 ，使得目的基因左右侧分别与质粒上的BamH I、Xba I酶切末端相连。
(3)转DGATI基因四尾栅藻成功的标志是 。
2．Gas6蛋白的LG部分可识别吞噬细胞表面的TAM蛋白，Gal部分可识别凋亡细胞表面的P物质，Gas6蛋白通过上述两个功能区介导吞噬细胞吞噬凋亡细胞（如图1），该过程会引发炎症反应。研究者欲通过将Aβ的抗体与Gas6蛋白融合，介导吞噬细胞吞噬阿尔兹海默（AD）患者脑内堆积的Aβ蛋白，以治疗AD。回答下列问题：
(1)αAβ基因编码Aβ的抗体，可通过相关技术在细胞中表达αAβ基因从而获得Aβ抗体。
①通过上述方法获得Aβ抗体 （填“是”或“不是”）单克隆抗体，理由是 。
②上述获得Aβ的抗体方法，与课本中单克隆抗体的制作方法相比，有何异同 （异同点各写出1点）
(2)为减轻炎症反应，应选择图2中的引物 ，通过PCR技术扩增获得Gas6基因，该扩增体系内除加入四种脱氧核苷酸外，还需要加入 等物质。（写出两种）
(3)写出通过酶切、连接的方法构建αAβ Gas6融合基因的方法： 。
(4)将相关基因转入吞噬细胞后，检测吞噬细胞对Aβ的吞噬情况，结果如图3所示。
图3结果说明，融合蛋白能 。
(5)若要将上述方法用于AD患者的治疗，还需进行的研究有 。（写出 条）
3．p53基因是一种重要的抑癌基因。研究人员按图示流程构建双拷贝p53目的基因片段，再将其与腺病毒穿梭质粒pShuttle连接，构建重组质粒pShuttle-du-p53并对其进行酶切，将酶切产物与复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy-1一起，经电穿孔法共转染大肠杆菌，以进行同源重组，然后筛选并提取双拷贝人p53基因重组腺病毒载体（prAd5-du-p53)，用PacI对其进行酶切使其线性化，转化真核细胞HEK293并获得病毒颗粒（rAd5-du-p53)。该病毒颗粒可为各类肿瘤的治疗提供可能的新途径。回答下列问题：
(1)图示人cDNA由人体白细胞中mRNA经逆转录获得，该过程需使用 酶；该过程所需原料是 。
(2)Pcmv是一种强启动子。对Pcmv进行PCR的过程中，需要在缓冲溶液中添加Mg2+，其作用是 ；该过程中所选择的引物序列不能太短，且两种引物间不能发生 。构建双拷贝p53目的基因片段时，两个p53基因分别连接Pcmv的优点有 （答出一点即可）。
(3)实验时，使用T4DNA连接酶相较于E.coli DNA连接酶的优势是 。复制缺陷型腺病毒载体pAdEasy—1是经过一定处理的，包括去除编码病毒复制蛋白的区段和编码对抗宿主的抗病毒防御蛋白的区段，进行上述加工的理由是 。
(4)PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段 会被去除。若以肝癌细胞株为材料，以细胞生长抑制率为指标，比较双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒对癌细胞的抑制效果，简要写出实验思路： 。
4．丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病，其包膜蛋白中包含6个保守序列Bp蛋白和抗原表位R9蛋白。免疫佐剂热敏肠毒素B单位（LTB）是一种免疫增强剂。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组拟先构建针对该病毒的多表位疫苗基因的重组质粒，操作流程如图1、图2所示。请回答以下问题：
(1)图1为利用融合PCR技术获得LTB-R9-Bp融合基因的过程，反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及 。引物P2与P3设计时要求除了考虑引物的碱基数量、与模板链的特异性结合之外，还需要 。请在下图中标出②过程两条模板链的5’端和3’端 。
(2)获得LTB-R9-Bp融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物 继续进行PCR。利用电泳技术对扩增结果进行检测，发现除目标条带外还有其他非特异性扩增条带，原因可能有 。
A．模板DNA被污染 B．引物特异性不强 C．加入原料过多
(3)图2构建融合基因表达载体时，质粒上除了复制起点、标记基因和多个限制酶的识别序列外，还需要有 。将得到的重组质粒导入低温、低浓度的 处理的大肠杆菌，完成转化实验。
5．宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒（HPV）感染有关，其中HPV16、18、31、45型是宫颈癌的高危型，E7蛋白是HPV16型重要的抗原标志蛋白。我国研究人员以酿酒酵母菌为表达载体，成功构建表达HPV16型E7蛋白的转基因重组全酿酒酵母疫苗。图1表示拟转入的质粒上某片段及其上的酶切位点分布，图2表示各限制酶识别序列和切割位点。
(1)研究人员首先需要利用PCR技术从HPV16型的基因组中获取E7蛋白基因的DNA序列，以 为原料合成子链，扩增6次需要引物B 个。
(2)为了将获得的E7蛋白基因准确连接至图1中的质粒上，需要在引物A和引物B的 （填“5′”或“3'”）端分别添加 限制酶的识别序列。若决定E7蛋白的mRNA的碱基序列为5'-AUGAGCUAC…（中间序列）…CAACGTAGA—3',理论上应设计引物A的前12个碱基序列为5' -3'。
(3)控制表达载体大量扩增的组成元件是 ,该结构发挥作用时通常需要的酶是 。
(4)HPV16型E7蛋白疫苗注入人体后作为抗原，可以刺激机体的B淋巴细胞增殖分化成为 。在预防接种疫苗时通常需要多次注射，但是相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期，原因是 。
6．利用转基因的工程菌生产药用蛋白，近些年在我国制药行业中异军突起，我国科学家采用基因工程技术生产干扰素已实现量产。图中质粒是基因工程常用的一种质粒pBR322，目的基因干扰素基因所在的DNA片段酶切位点如图所示。
(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式—— 和平末端。在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：分别是 和 ，这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的 。
(2)据图示分析，在基因工程操作中，构建重组DNA分子时，可以选用 两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切，目的是既能保证目的基因和质粒正向连接，又能防止质粒与目的基因自身环化，除此之外，还可防止 。
(3)质粒作为基因工程的载体，具备的基本条件有 (答出两点即可)。
7．经过基因工程改造的、能生产人胰岛素的大肠杆菌是一种特殊的“工程菌”。所用载体（普通质粒）结构如图1所示，目的基因如图2所示。
(1)该过程中最重要的环节是基因表达载体的构建，方法是选用 （填“X”或“Y”）限制酶同时处理质粒和目的基因，再用 处理使之成为重组质粒。
(2)基因工程的四个基本步骤是 ， ， ， 。
(3)将目的基因导入受体菌时，常出现三种情况未转化的细菌、含空载体（普通质粒）的细菌、含重组质粒的细菌。如图3是含人胰岛素基因的重组质粒的“工程菌”的筛选示意图：
图3中的 和 （填图3中字母）菌落为含有目的基因的“工程菌”。
8．基因工程在农业中的应用发展迅速，基因可导入农作物中，用于改良该农作物性状。通过多重PCR技术可扩增并检测转基因农作物的外源基因成分。多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域，扩增多个目的基因的PCR技术。请回答下列问题：
(1)我国科学家将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得 、 、延熟的转基因作物。
(2)每种基因扩增需要一对引物的原因是 。下表是AB、C三种基因的引物，据表分析，引物特异性主要体现在 。
A基因 引物1 5′－GCTCCTACAAATGCCATCATTGC－3′
引物2 5′－GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC－3′
B基因 引物1 5′－TGAATCCTGTTGCCGGTCTT－3′
引物2 5′－AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC－3′
C基因 引物1 5′－CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG－3′
引物2 5′－GCGTCATGATCGGCTCGATG－3′
(3)PCR过程中温度从90 ℃以上降到55 ℃左右的目的是 。
(4)检测人员通过多重PCR技术确定农作物中是否含有A、B、C三种转基因。将A、B、C三种基因和待测的农作物基因样品进行PCR，扩增后的产物再进行电泳，结果如图。
1为已知A、B、C三种基因对照，2、3、4为待测农作物样品，据图分析：含有三种转基因的农作物是 ，判断依据是 。
(5)与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是 。
9．下列几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoRⅠ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切割位点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题：
(1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有 。
(2)采用PCR扩增目的基因的原理是 ，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有 两种引物(DNA复制方向由5′→3′)。
(3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是 。
a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成
b．该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定
c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开
d．若该片段复制6次，则需要碱基A的数量至少是252个
(4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生 ，从图2切割下目的基因需要消耗 个水分子。不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是 。
10．目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。探究下列问题：
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为 和 酶。
(2)用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。
(3)构建基因表达载体时，可用EcoRⅠ同时切割质粒和DNA，但会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用 和 两种限制酶。
(4)建好的基因表达载体在目的基因前要加上 ，其是 识别和结合的部位。
(5)请简要描述基因表达载体的构建过程 。
11．甜玉米与普通玉米相比，甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢含可溶性糖量高，汁多质脆，富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值，科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。回答下列问题：
(1)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被 识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用 酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。TDNA在该实验中的作用是 。
(2)将农杆菌液浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 进行筛选，筛选出的愈伤组织 形成丛芽，最终获得多个玉米株系a1、a2、a3、a4。通过对a1、a2、a3、a4四株甜玉米株系的蛋白质表达量进行测定结果如图2，其中a4株系P蛋白表达量较低的原因可能是 。
(3)为了进一步提高甜玉米中淀粉的含量，科研人员提出通过降低淀粉酶合成有关基因的表达实现生产目标。研究人员研究发现吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，将其注入植物细胞内会使基因表达受阻，科研人员将吗啉反义寡核苷酸导入玉米的受精卵中起到明显效果。针对它的具体作用，科研人员提出以下假说：
假说1：导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪。
假说2：导致RNA前体上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。
为了验证上述假说，分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取 ，逆转录形成 。
(4)在PCR反应体系中，需加入引物、模板基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入 等。PCR的反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，30个循环。在循环之前的94℃ 3min处理为预变性；循环中72℃处理的目的是 。
12．腺病毒是可侵染人体内分泌腺的DNA病毒，具有一定的传染性，其E1基因控制合成的E1蛋白能启动基因组的复制。重组新冠病毒疫苗以5型腺病毒为载体，制备该疫苗的基本流程如图1所示。请回答下列问题：
注：新冠病毒表面抗原主要为S蛋白，由S基因控制合成。
(1)S蛋白基因表达载体构建过程中，要以S蛋白的RNA为模板，在 酶的作用下获取S蛋白基因；科研人员对腺病毒DNA进行人工改造，删除了E1基因，主要目的是 。
(2)图2、3中EcoRI、SmaI、BamHI和HindⅢ为限制酶，箭头所指位点为相应的酶切位点。科研人员欲用图3中载体构建S蛋白基因表达载体，应选择的限制酶是 以提高S蛋白基因和载体连接的正确率，其原因是 。
(3)在利用PCR技术扩增S基因时，应选择的引物为 。对含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒进行扩大培养的操作是 。
(4)若在接种该种疫苗前机体曾感染过腺病毒，则疫苗效果会明显下降，原因是 。
13．猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是通过猪细胞膜上的受体CD163 进行感染的。为实时监控受体CD163的表达和转运过程，科研人员将红色荧光蛋白 RFP 基因与CD163 基因拼接在一起，如图1所示，使其表达为一条多肽。 图2 表示用PCR 扩增后的CD163 基因的部分碱基序列。回答下列问题：
(1)为了完整的扩增CD163 基因序列，科研人员设计了一对碱基序列相等的引物，其中一个引物序列为 另一个引物序列为 。在PCR 扩增过程中引物与两条单链DNA结合时的温度一般要控制在 ℃左右。
(2)为了扩增后的 CD163 基因能够与 RFP 基因拼接在一起，科研人员从图3的三种限制酶中选择了两种，然后对CD163 基因进行切割，切割结果如图3 所示。科研人员选择的限制酶是 ，判断的依据是 。
(3)根据图1分析，为了使拼接后的重组基因能够表达成一条多肽，需要除去 CD163 基因中编码 （填“起始密码子”或“终止密码子”）的序列。
(4)将图1所示表达载体导入猪的细胞，该表达载体转录时以 （填“a”或“b”）链为模板；翻译时，RFP蛋白与CD163蛋白合成的顺序是 。
14．目前，临床上开始采用重组人血清白蛋白（rHSA）替代人血清白蛋白（HSA）。图1为工业化生产rHSA的过程示意图。回答下列问题：
(1)依据图1和下表所示分析，在获取目的基因时，最好选择限制酶 和 共同切割质粒，双酶切法的优点有 （答出2点）。除图示中的启动子之外，构建的表达载体还需要具有的结构有 （答出2点）。
限制酶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
识别序列及切割位点 G↓GATCC CCTAG↑G T↓GATCA ACTAG↑T ↓GTAC CATG↑ A↓AGCTT TTCGA↑A
(2)PCR扩增时，要设计一对引物（引物1和引物2），根据图2中HSA基因的两端序列，需要设计的引物序列分别是 和 。如PCR过程完成四次循环，则所需引物的总数为 。
(3)可采用 将重组基因表达载体导入酵母菌。然后在含四环素和氨苄青霉素的两种培养基上分别筛选，筛选出具有 特点的是含HSA基因表达载体的目标菌。
(4)AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，生产中常以其作为HSA基因的启动子，在以 为碳源的培养基中进行培养发酵。该方法的优点是 。
15．红豆杉被称作“植物界的大熊猫”，紫杉醇是红豆杉合成的一种次生代谢物，具有高抗癌活性。生产紫杉醇的传统方法是从红豆杉的树皮和树叶中提取，但野生红豆杉是濒危植物，这种方法不利于对它们的保护。根据材料回答下列问题：
(1)相比于传统方法，利用植物组织（细胞）培养技术获得紫杉醇的方法的优点有 （答出2点）。
(2)为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因（Bapt基因）的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，其具体流程如下：
①Bapt基因的获取：提取红豆杉的mRNA，并通过逆转录得到其cDNA，利用PCR技术以图1中的cDNA片段为模板扩增Bapt基因，需要的引物有 （从A、B、C、D四种引物中选择）。上述过程中，用1个图1所示片段产生2个双链等长的子代Bapt基因片段至少要经过 次循环。
②构建Bapt基因的超表达载体并将其导入受体细胞：在超量表达Bapt基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点（注：图中所示限制酶切割后形成的黏性末端各不相同）如图2所示。强启动子能被 识别并结合，驱动基因持续转录。Ti质粒中的T-DNA在培育转基因红豆杉中的作用是 。为使DNA片段能定向插入T-DNA中，可用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列，M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是 。
③Bapt基因的检测和鉴定。
试卷第1页，共3页
参考答案：
1．(1) 逆转录 PCR 氨苄青霉素和X-gal 白色
(2) 基因表达载体 5′-GGATCC-3′和5′-TCTAGA-3′
(3)四尾栅藻可以生成油脂
【分析】分析题图：图中首先提取紫苏细胞的总RNA经逆转录得到的cDNA，再获得DGAT1基因，接着将DGAT1基因与克隆质粒pMD19结合，形成重组质粒；然后将其导入到经CaCl2处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞，并接种到添加氨苄青霉素和X-gal的培养基培养、筛选。
【详解】（1）RNA到DNA的过程属于逆转录，由RNA得到的cDNA需经过逆转录，经PCR技术扩增得到DGAT1基因，与克隆质粒pMD19连接，将连接产物导入到经CaCl2处理后的处于感受态的大肠杆菌细胞。分析题图可知，目的基因插入LacZ基因中，使该基因被破坏，又由题中信息可知：“LacZ基因可使细菌利用加入培养基的物质X﹣gal，从而使菌落显现出蓝色。若无该基因或该基因被破坏，则菌落则成白色。”且由于质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故应接种到添加氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，一段时间后，挑选颜色为白色的菌落用液体培养基培养，提取质粒pMD19-DGAT1。
（2）分析题图可知：用限制酶酶切pMD19-DGAT1获得DGAT1基因，并与酶切后的载体pBI121连接得到重组基因表达载体，并导入到四尾栅藻。DGAT1基因序列两端无限制酶酶切位点，由表中信息可知DGAT1基因的两端各有限制酶BamH Ⅰ和Xba Ⅰ的识别位点，故可推测扩增DGAT1基因时所用一对引物的一端分别加上的限制酶识别序列是5’-GGATCC-3’和5’-TCTAGA-3’。
（3）题干信息可知，DGATI基因与油脂产生有关，故转DGATI基因四尾栅藻成功的标志是四尾栅藻可以生成油脂。
2．(1) 是 转入细胞的αAβ基因只能表达 Aβ的抗体 相同为均须用到动物细胞培养技术，均可从细胞培养液中获得抗体；不同为上述方法需转入基因，课本方法需诱导细胞融合
(2) F3和 R3 耐高温的 DNA 聚合酶、Gas6 基因
(3)在引物R3和引物F4（或引物R4和引物F3）的5’端加上相同的酶切位点，将扩增产物用该酶切割，用DNA连接酶连接切割产物
(4)介导吞噬细胞识别并吞噬 Aβ
(5)上述方法是否会引起炎症反应
【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】（1）①αAβ基因编码 Aβ的抗体，可通过转基因技术将αAβ基因导入受体细胞，在受体细胞中只能表达 αAβ基因从而获得 Aβ抗体属于单克隆抗体。
②上述获得Aβ的抗体方法，与课本中单克隆抗体的制作方法相比，相同点为均须用到动物细胞培养技术，均可从细胞培养液中获得抗体，不同点为上述方法需转入基因，课本方法需诱导细胞融合。
（2）由题干信息可知，将Aβ的抗体与Gas6蛋白融合，介导吞噬细胞吞噬阿尔兹海默（AD）患者脑内堆积的Aβ蛋白，以治疗AD，且不发生炎症反应，只需扩增Gas6蛋白基因的LG段，无需扩增Gal段，因此引物应选择F3和R3，PCR扩增体系内需加入四种脱氧核苷酸、 耐高温的 DNA聚合酶、Gas6基因、引物等。
（3）在引物R3和引物F4（或引物R4和引物F3）的5’端加上相同的酶切位点，将扩增产物用该酶切割，用DNA连接酶连接切割产物即可构建出构建αAβ-Gas6融合基因。
（4）αAβ-Gas6融合基因表达αAβ-Gas6蛋白，将相关基因转入吞噬细胞后，检测吞噬细胞对Aβ的吞噬情况，结果为导入融合基因的吞噬细胞中Aβ的吞噬程度明显高于未转入基因的组或转入全长Gas6基因的组，说明融合蛋白介导吞噬细胞识别并吞噬Aβ。
（5）要将上述方法用于AD患者的治疗，还需进行的研究是否会引起炎症反应。
3．(1) 逆转录（或反转录） （4种）脱氧核苷酸
(2) 激活耐高温DNA聚合酶（或激活Taq酶） 碱基互补配对（形成二聚物） 增加p53基因的表达量
(3) 既能连接黏性末端又能连接平末端 使病毒失去在细胞内复制的能力，降低宿主针对该腺病毒的免疫反应
(4) Ori和Kan 将生理状况相同的肝癌细胞株均分为两组，一组注射双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒，另一组注射复制缺陷型腺病毒空载体颗粒，在相同且适宜的条件下培养一段时间，期间分别测定细胞活性多次，计算细胞生长抑制率的平均值并比较分析
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）逆转录过程需要逆转录酶的催化。逆转录过程所需原料是4种脱氧核苷酸。
（2）进行PCR的过程中，在缓冲溶液中添加的Mg2+的作用是激活耐高温DNA聚合酶（或激活Taq酶）；进行PCR的过程中，所选择的引物序列不能太短，且两种引物间不能发生碱基互补配对形成二聚物。构建双拷贝p53目的基因片段时，两个p53基因分别连接Pemv可以增加p53基因的表达量。
（3）T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端，而E．coliDNA连接酶只能连接黏性末端。去除E1区（编码病毒复制蛋白）是为了使病毒失去在细胞内复制的能力，而去除E3区（编码对抗宿主的抗病毒防御蛋白）是为了降低宿主针对该腺病毒的免疫反应。
（4）PacI酶切使prAd5-du-p53线性化的过程中，片段Ori和Kan会因此被去除。以肝癌细胞株为材料，以细胞生长抑制率为指标，比较双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒对癌细胞的抑制效果，简要的实验思路是：将生理状况相同的肝癌细胞株均分为两组，一组注射双拷贝人p53基因重组腺病毒颗粒，另一组注射复制缺陷型腺病毒空载体颗粒，在相同且适宜的条件下培养一段时间，期间测定细胞活性多次，计算细胞生长抑制率的平均值并比较分析。
4．(1) 耐高温的DNA聚合酶 具有部分互补序列
(2) 引物P1和引物P4 AB
(3) 启动子和终止子 Ca2+
【分析】基因工程的操作步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质:抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）应用PCR技术可以对目的基因进行体外大量扩增，反应体系中应提供模板、引物、4种的NTP、耐高温的DNA聚合酶，同时通过控制温度实现DNA的解聚，使DNA复制在体外反复进行。引物P2与P3设计时要求除了考虑引物的碱基数量、与模板链的特异性结合之外，还需要具有部分互补序列。由图中颜色可判断，上面一条链为引物P1延伸的链，下面一条链为引物P4延伸的链，子链延伸方向为5'-3'端，标记如下：
（2）根据目的基因的颜色可知，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR。
PCR扩增产物的电泳结果显示，除目的基因条带外，还有非特异性条带，从引物的角度考虑，可能的原因是引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性，也可能是模板DNA被污染 AB正确，C错误。
故选AB。
（3）基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因、复制起点、多个限制酶的识别序列等。将表达载体导入微生物细胞需要采用钙离子转化法，即导入之前需在低温、低浓度的Ca2+溶液中处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
5．(1) 四种游离的脱氧核苷酸（或dNTP） 63
(2) 5' MfeI和KpnI CAATTGATGAGC
(3) 复制原点 解旋酶和DNA聚合酶
(4) 记忆B细胞和浆细胞 若间隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的记忆细胞数量少，免疫效果下降
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）DNA是以4种脱氧核苷酸为原料合成，利用PCR技术（原理DNA复制）从HPV16型的基因组中获取E7蛋白基因的DNA序列，以4种脱氧核苷酸为原料合成子链。若一个该目的基因循环扩增6次，PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物B个数计算公式为2n-1，因此扩增6次需要引物B有2n-1=26-1=63个。
（2）引物是从子链的5'端往3'方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与表达载体正确连接，则需要在引物的5'端分别添加相应限制酶的识别序列。由于限制酶EcoRⅠ会切割启动子，限制酶BamHⅠ会切割终止子，因此选择的限制酶是MfeI和KpnI。设计引物A时其左边需要添加MfeI识别序列5'-CAATTG-3'，且引物需要与E7蛋白的DNA碱基序列5'-TACTCG-3'互补配对，故设计引物A的前12个碱基序列为5'-CAATTGATGAGC-3'。
（3）复制原点可以保证表达载体（质粒）在受体细胞中能自我复制，因此，控制表达载体大量扩增的组成元件是复制原点，复制原点的作用是进行目的基因的复制，DNA复制时需要解旋酶和DNA聚合酶。
（4）HPV16型E7蛋白疫苗作为抗原，可以刺激机体的B淋巴细胞增殖分化成为记忆B细胞和浆细胞。若间隔时间太短，上次免疫产生的抗体会与疫苗结合，导致刺激产生的记忆细胞数量少，免疫效果下降，因此相邻的两次注射之间需要间隔一定的时期。
6．(1) 黏性末端 E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 磷酸二酯键
(2) 酶B、酶C 同时破坏质粒中的两个标记基因
(3)具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；对受体细胞无害（2分，每点1分，答出两点即可）
【分析】1、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
2、由于不同限制酶识别的碱基序列不同，所以在切割质粒和目的基因时常用双酶切，可防止目的基因反向粘连和质粒自行环化。
【详解】（1）DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——平末端和黏性末端。将质粒载体和目的基因进行双酶切，用DNA连接酶连接重新形成磷酸二酯键，DNA连接酶主要有两类：分别是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中后者既能连接平末端，也能连接黏性末端。
（2）标记基因可用于鉴定目的基因是否导入受体细胞，所以重组质粒上至少要保留一个标记基因，由于两个标记基因上均含有酶A的切点，所以不能用酶A切割，防止同时破坏质粒中的两个标记基因。为了保证目的基因和质粒正向连接，防止连接时质粒与目的基因自身环化，故在构建重组载体DNA分子时，可以选用酶B和酶C两种限制酶对质粒pBR322和干扰素基因进行双酶切。
（3）质粒被选用为基因工程的载体是因为：质粒DNA分子上具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选；对受体细胞无害。
7．(1) X DNA连接酶
(2) 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
(3) B D
【分析】分析题图：图1为载体，含有抗四环素基因，另还含有X限制酶切位点，位于抗青霉素基因内部；图2为含有人胰岛素基因的片段，含有X和Y限制酶切位点，其中Y限制酶切位点位于胰岛素基因内部。
【详解】（1） 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，该过程需要选用X限制酶同时处理质粒和目的基因，保证目的基因结构的完整性。再用DNA连接酶处理质粒和目的基因，将其连接为重组质粒。
（2）①目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；②基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；③将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；④目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质-抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
（3）据分析可知，X限制酶切位点，位于抗青霉素基因内部，故重组质粒只含有抗四环素基因，不含有抗青霉素基因，故含人胰岛素目的基因的重组质粒的“工程菌”，可以在含有四环素的培养基上生长，不能在含青霉素的培养基生长，故可以选择B和D菌落为含有目的基因的“工程菌”。
8．(1) 抗虫 抗冻
(2) DNA在加热后得到的两条单链均作为PCR扩增的模板，其序列不同，每一单链对应一条引物 核苷酸的数目不同，序列不同且每对引物之间不能互补配对
(3)使引物与模板链（或“单链”）相应序列互补结合
(4) 样品4 样品4的PCR扩增后的结果与已知三种基因的电泳结果一致
(5)一次检测效率高（可同时检测多种基因）
【分析】关于PCR技术的相关知识：1、概念：PCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；2、原理：DNA复制；3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物；4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】（1） Bt毒蛋白基因的抗虫基因，可以表达出毒蛋白，鱼的抗冻蛋白基因可以表达出抗冻蛋白，控制果实成熟的基因可以表达出控制早熟的相关的蛋白，因此将Bt毒蛋白基因、鱼的抗冻蛋白基因、控制果实成熟的基因导入农作物，可获得抗虫、抗冻、延熟的转基因作物；
（2）引物是根据已知目的基因的一段核苷酸序列合成的，DNA在加热后得到的两条单链作为PCR扩增的模板，序列不同，每一单链对应一条引物，因此每种基因扩增需要一对引物。据表中A、B、C三种基因的引物核苷酸序列分析，引物特异性是引物中特定的碱基序列、核苷酸的数目不同以及每对引物之间不能互补配对。一对引物的序列是不互补的，否则会形成引物二聚体，进而影响目的基因的扩增；
（3）PCR过程中温度加热至90～95℃利于DNA解链，冷却到55～60℃，使引物与模板链（或“单链”）相应序列互补结合；
（4）PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，1组为已知A、B、C三种基因的对照，其中样品4含有A基因、B基因和C基因，但样品2只含有A基因和C基因，样品3不含有这三种基因；
（5）多重PCR技术在一个反应体系中使用两对以上的引物，每对引物都可扩增一种目的基因，多对引物可同时扩增多种目的基因，因此与PCR技术相比，多重PCR技术的优势是一次检测效率高（可同时检测多种基因）。
9．(1)从基因文库中获取、人工合成
(2) DNA半保留复制 B、C
(3)a
(4) 目的基因与载体反向连接 4/四 会破坏标记基因
【分析】1、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】（1）获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。
（2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。
（3）a．DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；
b．其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；
c．PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；
d．由图3可知，该片段碱基A有2个，复制6次至少需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。
故选a。
（4）在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。
10．(1) 限制酶 DNA连接
(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因
(3) BamHⅠ（或EcoRⅠ） HindⅢ
(4) 启动子 RNA聚合酶
(5)用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）构建基因表达载体时需要使用的工具酶为限制酶（切割目的基因和载体，产生相应的黏性末端）和DNA连接（连接DNA片段，将目的基因与载体连接）。
（2）由图可知，SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因，所以用图中质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割。
（3）使用单酶切会导致目的基因和质粒的自身环化、目的基因不能定向连接等问题，所以常选用双酶切，结合图示可知，SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因，所以可选用BamHⅠ（或EcoRⅠ）和HindⅢ切割目的基因和质粒。
（4）表达载体通常包括启动子、目的基因、标记基因、终止子等，其中启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的位点。
（5）构建基因表达载体时，用相同的限制酶分别切割载体和含目的基因的DNA片段，产生末端相同的切口，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
11．(1) RNA聚合酶 BamHⅠ和SacⅠ 将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上
(2) 潮霉素 再分化 a4株系玉米中可能没有导入目的基因或目的基因未表达
(3) 总RNA cDNA
(4) Taq酶/耐高温DNA聚合酶/热稳定DNA聚合酶/4种脱氧核苷酸（dNTP） Taq酶从引物的3’端起始进行子链合成
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，需要将P基因导入到玉米细胞中，因此需要首先构建基因表达载体，则P基因和Ti质粒需要相同的限制酶切位点，结合图示可知，BamHⅠ后面有强启动子不能丢弃，EcoRⅠ和NotI限制酶会破坏目的基因，因此选择BamHⅠ和SacⅠ限制酶的组合。T-DNA是可转移的DNA，T-DNA可将强启动子和P基因带入玉米细胞并整合到玉米细胞染色体DNA上，随着玉米染色体DNA的复制而复制，从而使目的基因在受体细胞中稳定的保存。
（2）农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，重组质粒中有潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，但植物细胞能表现出对潮霉素的抗性，因此，培养基中需加入潮霉素进行筛选，并以此为特性进行筛选，将筛选出的愈伤组织经过再分化（细胞分化）形成丛芽，从而获得多个转基因玉米株系。a4株与野生型的P蛋白表达量基本相同，可能原因是a4株系玉米中导入目的基因或目的基因未表达。
（3）针对吗啉反义寡核苷酸是一种RNA剪接抑制剂，提出假说1和假说2，为验证上述假说，可分别从受精后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，逆转录形成cDNA。若假说1成立，即实验组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去，对照组RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切下去。
（4）PCR技术指的是体外扩增DNA的技术，其需要的条件有模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；据此可推测，在PCR反应体系中，需加入引物、模板基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入Taq酶/耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。PCR的反应程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，30个循环。在循环之前的94℃ 3min处理为预变性；循环中72℃处理的目的让子链延伸，即使Taq酶从引物的3’端起始进行子链的延伸。
12．(1) 逆转录 限制腺病毒DNA的复制，提高安全性；增大对目的基因的载量
(2) BamHI和HindⅢ 避免载体和S蛋白基因自身连接或反向连接
(3) 引物4、引物5 先在体外大量培养HEK细胞，然后接种含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，继续培养一段时间
(4)机体存在针对腺病毒的抗体和记忆细胞，会迅速消灭接种的疫苗，致使腺病毒载体重组疫苗不能表达并释放S蛋白
【分析】制备疫苗的目的是希望在人体内产生特异性抗体或记忆细胞，由于S蛋白为抗原的主要部分，所以无论是哪条途径都需要在人体内形成S蛋白才可。灭活的病毒肯定含有S蛋白，但可能存在灭活不充分的情况，安全性较差。重组病毒疫苗需要以S蛋白基因为目的基因，构建重组病毒。腺病毒复制缺陷病毒为载体，具有不能在人体细胞中复制的特点，伤害较小，同时将S蛋白基因导入，使得其可以产生S蛋白，引起人体的特异性免疫。
【详解】（1）由于新冠病毒的遗传物质是RNA,S蛋白基因表达载体构建过程中，要以S蛋白的RNA为模板，通过逆转录酶的作用获取S蛋白基因；由于E1基因控制合成的E1蛋白能启动基因组的复制，科研人员对腺病毒DNA进行人工改造，删除了E1基因，删除E1基因的主要目的是限制腺病毒DNA的复制，提高安全性；增大对目的基因的载量。
（2）科研人员欲用图3中载体构建S蛋白基因表达载体，应选择的限制酶是BamHI和HindⅢ，原因是使用限制酶BamHI和HindⅢ切割，能获得完整的S蛋白基因，而且载体上存在这两种酶的切割位点。BamHI和HindⅢ双酶切可以提高S蛋白基因和载体连接的正确率，避免载体和S蛋白基因自身连接或反向连接。
（3）任何一条子链都是从5'端到3'端合成的，另外考虑基因的完整性，在利用PCR技术扩增S基因时，应选择的引物为引物4、引物5。对含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒进行扩大培养的操作是先在体外大量培养HEK细胞，然后接种含S蛋白基因的复制缺陷重组腺病毒，继续培养一段时间。
（4）若在接种该种疫苗前机体曾感染过腺病毒，则机体存在针对腺病毒的抗体和记忆细胞，会迅速消灭接种的疫苗，致使腺病毒载体重组疫苗不能表达并释放S蛋白，疫苗效果会明显下降。
13．(1) 5'-AGCTAGCA-3' 50
(2) Nhe Ⅰ、Cfo Ⅰ 酶切后的序列有Nhe Ⅰ的黏性末端序列GTAGC，有Cfo Ⅰ的黏性末端序列GCG
(3)终止密码子
(4) b 先合成CD163蛋白，再合成RFP蛋白
【分析】基因工程操作的步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。获取目的基因的方法有多种，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR产物的鉴定方法：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
【详解】（1）为了完整的扩增CD163 基因序列，科研人员设计了一对碱基序列相等的引物，其中一个引物序列为 5' TGCGCAGT 3'，另一个引物序列为5'-AGCTAGCA-3'。在PCR 扩增过程中引物与两条单链DNA结合时的温度一般要控制在50℃左右。
（2）为了扩增后的 CD163 基因能够与 RFP 基因拼接在一起，科研人员从图3的三种限制酶中选择了两种，然后对CD163 基因进行切割，切割结果如图3 所示。科研人员选择的限制酶是Nhe Ⅰ、Cfo Ⅰ，判断的依据是酶切后的序列有Nhe Ⅰ的黏性末端序列GTAGC，有Cfo Ⅰ的黏性末端序列GCG。
（3）根据图1分析，为了使拼接后的重组基因能够表达成一条多肽，形成融合蛋白，所以需要除去 CD163 基因中编码终止密码子的序列。
（4）将图1所示表达载体导入猪的细胞，该表达载体转录时以b链为模板；翻译时，RFP蛋白与CD163蛋白合成的顺序是先合成CD163蛋白，再合成RFP蛋白。
14．(1) Ⅱ Ⅳ 使用两种不同的限制酶可以避免目的基因和质粒反向连接；避免目的基因和质粒自连 目的基因、标记基因、终止子
(2) 5'-AATGGATCCTTC-3' 3'-GTAAGTTAAGAG-5' 30
(3) 显微注射法 抗四环素不抗氨苄青霉素
(4) 甲醇 可以通过控制培养液中甲醇的有无来控制HSA 基因的表达
【分析】1、基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）由于质粒上没有限制酶Ⅲ的识别位点，故不能选用限制酶Ⅲ；由于氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因均含有限制酶Ⅰ的识别位点，故不能使用限制酶Ⅰ，所以选用Ⅱ和Ⅳ切割目的基因和质粒，选用双酶切法，可有效避免基因的反向链接和自身环化。构建基因表达载体是需要有启动子（起始转录）、目的基因、标记基因（便于筛选）、终止子（终止转录）等。
（2）PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因碱基互补配对，子链延伸时从引物的 5'向 3'端延伸，所以两个引物分别为：5'-AATGGATCCTTC-3'，3'-GTAAGTTAAGAG-5'。PCR过程完成一次循环产生两个DNA分子，所需引物为2个，完成第二次循环产生四个DNA分子，所需引物为4个，以此类推，完成第四次循环产生16个DNA 分子，所需引物为16个，所以PCR过程完成四次循环所需引物的总数为：2+4+8+16=30。
（3）将重组基因表达载体导入酵母菌可用显微注射法或基因枪法。根据图1所示，HSA基因插入质粒时破坏了抗氨苄青霉素基因，其标记基因为四环素抗性基因，所以导入重组基因表达载体的酵母菌抗四环素不抗氨苄青霉素。
（4）AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，生产中常以其作为HSA基因的启动子，则在以甲醇为唯一碳源的培养基中HSA基因正常表达，无甲醇时该基因不表达，故而选用AOX1作为rHSA基因的启动子时可以通过控制培养液中甲醇的有无来控制HSA基因的表达。
15．(1)不占用耕地，不受季节、天气等限制，利于保护濒危植物，产量高，不破坏环境等
(2) BC 3 RNA聚合酶 将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上 NotI和SacI
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）植物组织（细胞）培养技术优点有：不占用耕地，不受季节、天气等限制，利于保护濒危植物，产量高，不破坏环境等。
（2）①由于DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，由图1可知，5'端对应的引物分别是B和C；
设计的引物决定了扩增产物的长度，第一个循环，引物与模板互补，此时变成两个模板，但因为模板很长，没有什么终止扩增，所以第一个循环扩增出来的新片段很长，第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因，第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩增的长度，所以当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因，所以至少要3个循环才能产生双链等长子代Bapt基因；
②RNA聚合酶识别并与启动子结合，启动转录。
Ti质粒中的T-DNA将强启动子和Bapt基因带入红豆杉细胞并整合到红豆杉细胞染色体的DNA上。
分析目的基因可知，不可以使用EcoRI、BamHI以及HindIII，所以Ti质粒使用SacI和NotI，为使DNA片段能定向插入T-DNA中，启动子在前，所以在DNA片段的M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotI和SacI
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