人教生物重难强化训练：专题9 生物技术与工程（1） PCR技术的原理与应用（含解析）

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专题9 生物技术与工程
（一） PCR技术的原理与应用
1．(2023·济南二模)循环阈值(Ct值)是通过一定的技术手段，使病毒的扩增产物达到可检测水平所需的循环次数。某诊疗方案把感染者出院标准规定为两次核酸检测Ct值均>35。下列说法错误的是(　 )
A．Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等
B．Ct值越高，则表示病毒浓度越高，检测所需的时间越长
C．一般来说，确诊者出现症状时，Ct值较低，体内病毒浓度较高
D．体积分数75%的酒精可使某病毒的蛋白质变性从而达到消杀的目的
解析：选B　Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等，A正确；Ct值(循环阈值)的含义为每个反应体系内病毒的扩增产物到达设定阈值时所经历的循环次数，所以Ct值越高，则表示病毒浓度越低，检测所需的时间越长，因此Ct值越低，体内病毒浓度越高，B错误，C正确；病毒的组成成分是蛋白质和核酸，体积分数75%的酒精可使某病毒的蛋白质变性，从而达到消杀的目的，D正确。
2．(2023·菏泽二模)为研究CaPAO(脱镁叶绿酸a氧化酶)基因在辣椒衰老过程中调控作用的大小，研究者通过提取正常辣椒植株不同组织细胞中的RNA，以RNA为模板合成cDNA，再通过PCR技术扩增后比较CaPAO基因相对表达量，推测其表达情况，结果如下图所示。下列有关叙述错误的是(　 )
A．CaPAO基因在不同组织中表达情况不同可能与表观遗传有关
B．由图2可知CaPAO基因可能参与调控辣椒叶片的衰老过程
C．正常辣椒植株不同组织细胞中CaPAO基因的数量是不同的
D．用PCR技术扩增时耐高温的DNA聚合酶能将脱氧核苷酸连接到引物的3′端
解析：选C　DNA甲基化和构成染色体的组蛋白发生甲基化、乙酰化等修饰均属于表观遗传，会影响基因的表达，因此CaPAO基因在不同组织中表达情况不同可能与表观遗传有关，A正确；由图2可知，黄化老叶的CaPAO基因表达量明显高于其他两种叶片，因此可以推测CaPAO基因可能参与调控辣椒叶片的衰老过程，B正确；绝大部分体细胞都是由一个受精卵经有丝分裂而来，所以正常辣椒植株不同组织细胞中所含的CaPAO基因数量一般是相同的，C错误；耐高温的DNA聚合酶能够催化脱氧核苷酸从引物的3′端开始连接，D正确。
3．(2023·海口模拟)我国研发出一种可高效特异性地扩增超长DNA的抑制热交错PCR(STIPCR)技术。STIPCR通过在正/反向引物的5′端引入一段相同的短序列，抑制了较短产物链的扩增，增强了超长DNA的特异性扩增，在延伸阶段使用不同幅度(60～72 ℃)变温的嵌套热交错方法，解决了某一温度下，因超长DNA不同区域G—C碱基对含量不同而难以高效延伸的问题。回答下列问题：
(1)利用STIPCR从复杂基因组中特异性地扩增超长DNA需要根据__________________来合成引物，并对引物加工处理，STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处有____________________________________________(答出3点)。
(2)在正/反向引物的5′端引入一段相同的短序列，容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构，原因是____________________________________________________________，该结构不能与引物结合，从而使较短产物链停留在PCR过程的______阶段，抑制了非特异性产物的扩增。
(3)为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率，可适当______(填“降低”或“升高”)温度，依据是______________________________________________。
(4)为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同，需用限制酶处理所得DNA，其目的是去除________________________，若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达，需要______________________才能将超长DNA导入细胞。
解析：(1)PCR扩增DNA需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列来合成引物。由题干可知，STIPCR是一种PCR技术，因此STIPCR扩增过程与DNA在细胞中复制过程的相同之处有以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合酶、复制方式为半保留复制等。(2)在正/反向引物的5′端引入一段相同的短序列，则DNA片段的两个末端形成反向互补序列且较短的DNA片段两末端容易相互配对，进而容易使较短的产物链首尾连接形成茎环结构，该结构不能与引物结合，从而使较短产物链停留在PCR过程的复性阶段。(3)碱基对间以氢键相连，其中A—T碱基对间有2个氢键，G—C碱基对间有3个氢键。G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键数目相对较少，热稳定性较差，因此为提高超长DNA中G—C碱基对含量低的区域链的延伸效率，可适当降低温度。(4)由题干可知，经STIPCR获得的某超长DNA比细胞内的该DNA多了一段插入在引物5′端的短序列，为保证经STIPCR获得的某超长DNA与细胞内的该DNA遗传信息相同，需要用限制酶去除插入在引物5′端的短序列。若要使获得的超长DNA在大肠杆菌中表达，不能直接将该DNA导入大肠杆菌中，需要将超长DNA与载体结合构建基因表达载体才能将超长DNA导入细胞。
答案：(1)一段已知目的基因的核苷酸序列　以DNA双链为模板、以脱氧核糖核苷酸为原料、需要DNA聚合酶、复制方式为半保留复制等(答出3点)　(2)DNA片段的两个末端形成反向互补序列且较短的DNA片段两末端容易相互配对　复性　(3)降低　G—C碱基对间有3个氢键，G—C碱基对含量低的DNA片段中氢键数目相对较少，热稳定性较差　(4)插入在引物5′端的短序列　将超长DNA与载体结合构建基因表达载体
4．In Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为①质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。请据图回答下列问题。
(1)过程①中需要用到的酶有______________。另外，利用________处理也可以直接得到线性化质粒。
(2)据图分析，为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据________________序列进行设计。过程②经过______轮循环即可初步得到符合要求的目的基因片段。
(3)过程③中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是__________________________。图示In Fusion技术可作为模型使用，一般来说只需要改变图中的__________________________，即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。
(4)若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞时，过程④需要用______处理大肠杆菌。
解析：(1)据图可知，过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要Taq DNA聚合酶；此外，也可利用限制酶切割相应的磷酸二酯键直接得到线性化质粒。(2)据图分析，目的基因经引物A和引物B扩增后需要与线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A或引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计；根据DNA的半保留复制的特点，可知PCR前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，因此，至少经过3轮循环可初步得到符合要求的目的基因片段。(3)过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基排序不同，这样设计的好处是防止目的基因反向连接，以保证目的基因能够正确连接并表达；引物是一段能与已知目的基因进行碱基互补配对的短单链核酸，故一般来说只需要改变图中的引物A和引物B，即可快速构建出另一种目的基因的重组质粒。(4)将目的基因导入受体细胞时，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于易吸收周围环境中DNA分子的感受态。
答案：(1)Taq DNA聚合酶　限制酶　(2)目的基因和质粒　3　(3)防止目的基因反向连接　引物A和引物B　(4)Ca2＋
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