人教生物重难强化训练：专题9 生物技术与工程（2） 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建（含解析）

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专题9 生物技术与工程
（二） 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
一、选择题
1．如图为目的基因结构示意图及几种限制酶的酶切位点，下列相关叙述正确的是(　 )
A．图中所示目的基因可能来源于真核生物，也可能来源于原核生物
B．噬菌体可以作为载体将重组DNA导入动物细胞获得转基因动物
C．PCR技术扩增该基因时，形成磷酸二酯键所需要的能量可由dNTP提供
D．用图中目的基因和质粒构建重组质粒时，只能用SmaⅠ酶切割
解析：选C　图中所示目的基因的编码区存在能指导蛋白质合成的外显子和不能指导蛋白质合成的内含子，因此该目的基因来源于真核生物，A错误；噬菌体是细菌病毒，不能侵入动物细胞，B错误；dNTP含有高能特殊化学键，在用PCR技术扩增该基因时，可以为形成磷酸二酯键提供能量，C正确；限制酶SmaⅠ的酶切位点在编码区，会破坏目的基因，所以不能用限制酶SmaⅠ切割目的基因，D错误。
2．(2023·沈阳三模)下表为5种限制酶的识别序列及切割位点，图1为某种质粒，图中标出了限制酶的酶切位点，图2为某种目的基因及限制酶的酶切位点。现要将图中的目的基因定向插入到质粒中。下列有关叙述错误的是(　 )
限制酶识别序列和切割位点
BamH Ⅰ：—G↓GATCC— EcoR Ⅰ：—G↓AATTC—
Hind Ⅲ：—A↓AGCTT— Nhe Ⅰ：—G↓CTAGC—
Mun Ⅰ：—C↓AATTG—
A．目的基因必须插入启动子和终止子之间
B．构建基因表达载体时一定要用到DNA连接酶
C．切割图中目的基因和质粒时必须选用相同的限制酶
D．切割目的基因和质粒时一定用到的限制酶是Hind Ⅲ
解析：选C　目的基因必须插入启动子和终止子之间才能进行转录，A正确；构建基因表达载体时，目的基因和质粒的连接用DNA连接酶，B正确；切割目的基因和质粒时只要形成的对应黏性末端相同，就可以将二者连接，不一定要选用相同的限制酶，为保证将目的基因定向插入到质粒中，目的基因被切割后应形成两个不同序列的黏性末端，C错误；结合题图和表格可知，图中限制酶BamH Ⅰ切点位于标记基因(四环素抗性基因)内，限制酶EcoR Ⅰ切点位于目的基因内，Nhe Ⅰ在质粒上无相应识别序列，且其他酶与它产生的黏性末端不同，为保证目的基因与质粒定向连接，切割目的基因应选Mun Ⅰ和Hind Ⅲ，质粒上无Mun Ⅰ的酶切位点，但可选择能与Mun Ⅰ切割出相同末端的EcoR Ⅰ共同与Hind Ⅲ切割质粒，因此切割目的基因和质粒时一定用到的限制酶是Hind Ⅲ，D正确。
3．如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如乙所示。下列说法正确的是(　 )
A．过程①中应使用限制酶Hind Ⅲ切割质粒
B．应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程②可用Ca2＋处理来促进大肠杆菌的转化
D．若将该基因片段扩增6次，则消耗128个引物分子
解析：选C　①是基因表达载体的构建过程，使用限制酶Hind Ⅲ切割质粒将破坏标记基因(氨苄青霉素抗性基因)，不利于目的基因的鉴定和筛选，A错误；由于DNA聚合酶只能从5′端→3′端延伸子链，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，B错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，所以过程②可用Ca2＋处理使大肠杆菌处于易吸收周围环境中DNA分子的感受态，从而促进大肠杆菌的转化，C正确；PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此PCR过程完成6轮循环，理论上至少需加入引物26＋1－2＝126(个)，D错误。
4．为提高红豆杉细胞培养物中紫杉醇的产量，研究人员构建紫杉醇合成关键酶基因(Bapt)的超表达载体，并将其导入红豆杉细胞，具体流程如下图。下列相关说法不正确的是(　 )
A．p1301载体上应含有增强Bapt表达的序列
B．超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因
C．可使用Bapt制成的探针检测过程⑤是否成功
D．工厂化生产紫杉醇需将改造后的红豆杉细胞培养至愈伤组织
解析：选C　根据题干和题图可知，Bapt与p1301载体结合可构建出Bapt的超表达载体，可见p1301载体上可能含有增强子序列，作用是促进Bapt的表达，A正确；超表达载体中应含有潮霉素抗性基因作为标记基因，在含有潮霉素的培养基上，含有超表达载体的细胞能够存活，从而起到筛选作用，B正确；由于红豆杉细胞中本身存在Bapt，无论超表达载体是否成功导入，都能与Bapt探针形成杂交分子，因此不能使用Bapt制成的探针来检测步骤⑤是否成功，C错误；工厂化生产紫杉醇属于细胞产物的获得，只需要将改造后的红豆杉细胞培养到愈伤组织阶段即可，D正确。
5．噬菌体DNA可以和大肠杆菌DNA的特定位点发生互换，在此基础上发展起来的Gateway克隆技术是一种快速、高效构建基因表达载体的方法。该技术依靠载体上存在的特定重组位点和克隆酶，通过BP反应将目的基因连接到质粒1上，获得克隆质粒2，再通过LR反应将目的基因连接到载体质粒3上，获得表达载体，如图所示。下列有关叙述正确的是(　 )
A．利用PCR技术扩增目的基因时需在引物的3′ 端添加attB1和attB2序列
B．目的基因的获取是基因工程的核心工作，图中未标出的结构有启动子、终止子等
C．为了从反应体系中筛选出质粒2，应在培养基上添加青霉素和卡那霉素
D．可用Ca2＋处理大肠杆菌以促进其对环境中质粒4的吸收
解析：选D　子链的延伸方向是从5′端到3′端，因此利用PCR技术扩增目的基因时应在引物的5′ 端添加attB1和attB2序列，A错误；基因工程的核心工作是基因表达载体的构建，B错误；质粒2上存在青霉素抗性基因，含有质粒2的大肠杆菌可在含青霉素的培养基上生存，质粒2上无卡那霉素抗性基因，含有质粒2的大肠杆菌无法在含卡那霉素的培养基上生存，故无法起到筛选作用，C错误；用Ca2＋处理大肠杆菌会使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，故用Ca2＋处理大肠杆菌可促进其对环境中质粒4的吸收，D正确。
二、非选择题
6．人乳头瘤病毒(HPV)可诱发宫颈癌等恶性肿瘤，人乳头瘤病毒疫苗可以预防由HPV引起的多种宫颈癌。图a是利用大肠杆菌制备HPV疫苗所需的L1基因片段，图b是某种质粒载体。回答下列问题。
(1)为构建重组HPV疫苗，科研人员将L1基因插入质粒中，最好选择限制酶______________进行共同切割，原因是_______________________________(答出2点即可)。
(2)图中启动子为RNA聚合酶结合位点，该处序列应根据________(填“人宫颈细胞”“乳头瘤病毒”或“大肠杆菌”)的RNA聚合酶识别序列来设计。
(3)若将工具酶处理目的基因和质粒载体得到的混合物经过连接后转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的含有质粒载体，有的含带有目的基因的重组质粒。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述三种大肠杆菌中，能够正常生长的有__________________________________，这些大肠杆菌能正常生长的原因是____________________________________；若将上述筛选出来的大肠杆菌，培养在含有卡那霉素的固体培养基上，其生长情况可能是_____________________________________。
(4)导入重组质粒的大肠杆菌表达产物衣壳蛋白L1经纯化，可被免疫系统识别，引起免疫反应。与传统灭活疫苗相比，这样的重组疫苗更安全又有效。从疫苗的组成成分分析，其主要原因是______________________________________________。
解析：(1)限制酶BdⅠ在质粒上的酶切位点不唯一，导致结果不可控，所以将L1基因插入质粒中，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ进行共同切割，用限制酶BamHⅠ、HindⅢ共同切割的原因：不会导致标记基因都被破坏；避免目的基因自身环化；避免载体自身环化；避免目的基因反向连接到载体上。(2)大肠杆菌中的启动子序列有利于L1基因在大肠杆菌细胞内表达，所以应该根据大肠杆菌中RNA聚合酶识别序列来设计。(3)含有质粒载体和含带有目的基因的重组质粒的大肠杆菌都具有氨苄青霉素抗性基因，可抗氨苄青霉素，所以含有质粒载体和含带有目的基因的重组质粒的大肠杆菌都可以在含有氨苄青霉素的培养基中生长。由于重组质粒中的卡那霉素抗性基因被破坏，不能抗卡那霉素则含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有卡那霉素的培养基中生长。(4)衣壳蛋白L1无核酸成分，无增殖能力(或侵染能力)，但有抗原特性可刺激机体产生相应的抗体和记忆细胞，而传统灭活疫苗含有病毒核酸，可能存在侵染能力，所以与传统灭活疫苗相比，这样的重组疫苗更安全又有效。
答案：(1)BamHⅠ、Hind Ⅲ　不会导致标记基因都被破坏；避免目的基因自身环化；避免载体自身环化；避免目的基因反向连接到载体上等　(2)大肠杆菌　(3)含有质粒载体和含带有目的基因的重组质粒的大肠杆菌　二者都含有氨苄青霉素抗性基因，可抗氨苄青霉素　含有质粒载体的大肠杆菌能正常生长，而含带有目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能生长　(4)衣壳蛋白L1无核酸成分，无增殖能力(或侵染能力)，但有抗原特性可刺激机体产生相应的抗体和记忆细胞，而传统灭活疫苗含有病毒核酸，可能存在侵染能力
7．(2023·南通二模)通常真核细胞翻译的起始必须依赖于mRNA的5′端帽子结构，而内部核糖体进入的位点(IRES)则是位于mRNA内部的核糖体识别、结合序列，IRES使翻译可以从mRNA内部开始。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人员构建人溶菌酶基因(hLYZ)和人乳铁蛋白基因(hLTF)双基因表达载体，并获得转基因牛胚胎。下图表示双基因表达载体的主要构建过程，请回答下列问题。
(1)IRES的基本单位是______________，翻译时核糖体在mRNA上的移动方向是________(填“5′端→3′端”或“3′端→5′端”)。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是___________________________________。
(2)为实现hLTF与IRES序列的连接，在PCR扩增基因片段时通常在引物的5′端添加特定的限制酶识别序列，而不在3′端添加的原因是______________________________。
(3)过程①中，用限制酶______________切割质粒a、b后，再用______________(方法)分离，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。
(4)过程②中，用BamHⅠ分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种，这是因为______________________________________________________。用BamHⅠ对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为______________。
(5)科研人员用包含重组质粒2的脂质体转染牛乳腺上皮细胞后，在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素的主要目的是____________________。选择牛乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测________________。
(6)研究人员试图以转hLYZ与hLTF双基因的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基因克隆胚胎，在此过程中主要涉及的现代生物技术有_________________________(答出2点即可)。
解析：(1)IRES是mRNA上的位点，则IRES的基本单位是核糖核苷酸，mRNA的翻译方向是5′端→3′端，则核糖体在mRNA上的移动方向也是5′端→3′端。IRES是核糖体的识别位点，则两个基因之间插入IRES序列便于得到两种具有功能的蛋白质(一种mRNA可翻译形成两种蛋白质)。(2)DNA的两条链是反向平行的，使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸，则在PCR扩增基因片段时通常只在引物的5′端添加特定的限制酶识别序列。(3)酶切位点不能破坏标记基因，还要保留IRES序列和启动子序列，则过程①中，应用限制酶XbaⅠ和NheⅠ切割质粒a、b，由于不同长度的片段在电场中的移动速度不同，所以可用琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。(4)由于目的基因与质粒c可能存在正反连接、多个目的基因与质粒c连接等，所以过程②中，用BamHⅠ分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种。重组质粒1的大小为5.9 kb，质粒c的大小为8.2 kb，过程②只能用限制酶BamHⅠ酶切重组质粒1和质粒c然后再连接，得到重组质粒2是由质粒c和IRES序列与hLIF组成的片段相互连接形成的，其大小为11.4 kb，则用BamHⅠ对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段为IRES序列与hLTF组成的片段(3.2 kb)和质粒c的片段(8.2 kb)。(5)重组质粒2上面有新霉素抗性基因，则用含重组质粒2的脂质体转染牛乳腺上皮细胞后，在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素可筛选出导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞。牛乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测hLYZ和hLTF(目的基因)能否在转基因牛中表达。(6)以转hLYZ与hLTF双基因的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基因克隆胚胎，首先用到卵母细胞采集与培养技术获得受体细胞，需要用到体细胞核移植技术构建重组细胞，还要用到动物细胞的培养技术培养重组细胞，然后通过早期胚胎培养技术进行体外胚胎培养。
答案：(1)核糖核苷酸　5′端→3′端　便于得到两种具有功能的蛋白质(一种mRNA可翻译形成两种蛋白质)　(2)使引物的3′端与模板链严格互补配对，保证子链的延伸　(3)XbaⅠ和NheⅠ　琼脂糖凝胶电泳　(4)目的基因与质粒c存在正反连接、多个目的基因与质粒c连接等　3.2 kb和8.2 kb　(5)筛选出导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞　hLYZ和hLTF(目的基因)能否在转基因牛中表达　(6)体细胞核移植技术、早期胚胎培养技术、动物细胞培养技术、卵母细胞采集与培养技术
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