2024年高考生物学二轮复习16：微生物的培养及发酵工程
一、选择题
1．（2023高三上·茂名月考）某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 如图为某同学接种后培养得到的结果，推测该同学的接种方法及操作失误是（ ）
A．稀释涂布平板法，菌液浓度过高
B．平板划线法，接种环未灼烧灭菌
C．稀释涂布平板法，菌液未涂布均匀
D．平板划线法，菌液未涂布均匀
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】据图可知，该同学使用的接种方法是稀释涂布平板法，菌落均匀分布，但只出现在培养基的一边，推测可能是在使用涂布器的时候未将菌液涂布均匀。ABD不符合题意，C符合题意。
故答案为：C。
【分析】(1)欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其它碳源，不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。
(2)分离纯化菌种时，需采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，使聚集在一起的细菌细胞分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便纯化菌种。
2．（2024高三下·月考） 酸笋是螺蛳粉的灵魂，腌酸笋季节在春季。当竹子出笋后，长出约30cm高时便可砍下，剥去笋壳，切成块或是切成笋丝、笋片，放于陶罐中，清水过面，撒上适量食盐，置于阴凉处一个月左右，酸味即出，便可随食随取。下列相关叙述错误的是（ ）
A．制作酸笋所需菌种的代谢类型为异养厌氧型
B．为防止杂菌污染，需对鲜笋进行灭菌处理
C．“清水过面”的目的是为了创造无氧环境
D．在制作酸笋时若加入上一批次的发酵液可加快发酵进程
【答案】B
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、腌制过程中产酸的细菌主要是乳酸菌，利用的是乳酸菌的无氧呼吸，需要厌氧环境，其代谢类型为异养厌氧型，A正确；
BC、“清水过面”可以创造无氧环境，利于乳酸菌生存繁殖，同时减少杂菌污染，无需对鲜笋进行灭菌处理，B错误，C正确；
D、上一批次的发酵液含有乳酸菌，在制作酸笋时若加入上一批次的发酵液可加速发酵进程，D正确。
故答案为：B。
【分析】酸笋的制作使用的微生物是乳酸菌，代谢类型是异养厌氧型，在无氧条件下乳酸菌能够将蔬菜中的葡萄糖氧化为乳酸。
3．（2023高三上·福田月考）益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。市售的益生菌产品质量参差不齐，某益生菌品牌宣传其产品中活菌数不少于107个/g。研究小组尝试检测该品牌益生菌中的活菌含量是否与宣传一致，实验步骤为：制备培养基→调节pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是（ ）
A．经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
B．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
C．培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
D．对该品牌益生菌进行计数时，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；灭菌技术
【解析】【解答】A、经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置，防止冷凝水对培养基造成污染，A不符合题意；
B、若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养，如果出现了菌落，则说明培养基制作不合格，被污染，B不符合题意；
C、根据题意“益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌”，看推测其代谢类型是厌氧型，因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢，C不符合题意；
D、对益生菌计数时，可能会有两个或多个细菌形成一个菌落，所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】（1）稀释涂布平板法：除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（2）显微镜进行直接计数：该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
4．（2024高三上·汕头期末） 尿酸氧化酶能分解尿酸（C5H4N4O3）。为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从某泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到10-6，然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活力（用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示），结果如表所示。下列最适合作为实验目的菌落的是（ ）
菌落 1 2 3 4
酶活力 100 50 14 20
A．菌落1 B．菌落2 C．菌落3 D．菌落4
【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】分析题意，酶活力用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示，故所需酶量越少，说明酶活力越大，可知菌落3的酶活力最高，可作为实验所需的目的菌，C正确，ABD错误。
故答案为：C。
【分析】微生物分离时，利用该分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使该微生物大量增殖，这些物质主要是一些特殊的碳源、氮源，如纤维素可用来富集纤维素分解微生物，尿素可用来富集尿素分解微生物。
（2024高三上·期末）阅读下面材料回答以下问题
某技术人员设计了青霉素生产菌——产黄青霉菌的诱变育种方案，具体包括：①配制中性偏酸的培养基，准备相关的培养皿，稀释用水；②进行菌种的紫外线诱变；③用接种环蘸取诱变后的产黄青霉菌孢子悬液在固体培养基上划线；④放在恒温培养箱中培养到长出单菌落；⑤挑取单菌落，接种至均匀分布野生型金黄色葡萄球菌（葡萄糖为主要碳源的培养基上）进行生产青霉素性能的测定。
5．下列对该方案不合理之处的叙述正确的是（ ）
A．①中应配置中性偏碱的培养基
B．③中分离菌种应用稀释涂布平板法
C．步骤②、③的顺序应该调换
D．⑤中应将单菌落接种至含酚红的培养基上
6．下列关于该方案中无菌操作的叙述正确的是（ ）
A．①中调节pH值需在灭菌之后进行
B．实验结束时可用紫外线照射的方法对④中残余的培养基彻底灭菌
C．⑤过程培养基中添加的葡萄糖可用G6玻璃砂漏斗过滤除菌
D．青霉素具有杀菌作用，此发酵罐不需严格灭菌
【答案】5．B
6．C
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】1、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
2、实验室常用的灭菌方法：
（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min。
5．A、培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性， ①中应配置酸性的培养基，A错误；
B、 分离青霉菌突变菌种应该用稀释涂布平板法，即③中分离菌种应用稀释涂布平板法，B正确；
C、先进行诱变育种，再进行分离、纯化处理， 故步骤②、③的顺序不应该调换，C错误；
D、 青霉素生产菌不需要用酚红的培养基进行鉴定，D错误。
故答案为：B。
6．A、为了避免杂菌污染， ①中调节pH值需在灭菌之前进行，A错误；
B、实验结束时可用高温蒸汽的方法对④中残余的培养基彻底灭菌，B错误；
C、 G6玻璃砂漏斗的孔径最小，细菌不能滤过，⑤过程培养基中添加葡萄糖可用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，C正确；
D、 由于杂菌能分泌青霉素酶，从而分解青霉素，为防止杂菌生长，故发酵罐需要严格灭菌，D错误。
故答案为：C。
7．（2024高三上·海淀期末）嗜盐单胞菌可利用海水合成聚羟基脂肪酸酯(PHA，一种新型生物塑料)，在细胞内形成由膜包裹的不溶性颗粒。科研人员从海水中分离得到一株嗜盐单胞菌，在非灭菌、高盐、高pH的发酵液中连续发酵生产PHA，其流程如下图所示。下列相关叙述不正确的是（ ）
A．利用含PHA的选择培养基筛选嗜盐单胞菌
B．高盐、高pH的发酵液抑制了杂菌生长
C．培养液上清循环利用，有利于节约物质和能量
D．发酵完成后收集沉淀的菌体以得到PHA
【答案】A
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、嗜盐单胞菌可利用海水合成PHA，不能用含PHA的选择培养基筛选嗜盐单胞菌，A错误；
B、高盐、高pH的发酵液使杂菌因失水过多或蛋白质变性而死亡，故可抑制杂菌生长，B正确；
C、培养液上清可以循环利用，可避免物质和能量的浪费，有利于节约物质和能量，C正确；
D、嗜盐单胞菌可利用海水合成PHA，在细胞内形成由膜包裹的不溶性颗粒，因此发酵完成后收集沉淀的菌体以得到PHA，D正确。
故答案为：A。
【分析】发酵工程的基本操作过程为： （1）菌种的选育：从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。 （2）扩大培养：发酵之前需对菌种进行扩大培养。 （3）培养基的配制：在菌种确定后，要选择原料制备培养基，培养基的配方须经反复试验才能确定。 （4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。 （5）接种：对发酵过程进行监控和控制，还可以进行反馈控制。 （6）发酵过程：这是发酵工程的中心环节，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加需要的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。 （7）产品的分离提纯：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。若产品是代谢物，可采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
8．（2024·河南模拟） 黄豆酱是人们喜爱的传统美食，早在春秋时期就有制作方法的相关记载。它以黄豆为主要原料，经米曲霉（好氧菌）、酵母菌、乳酸菌等微生物发酵而成。劳动人民在制作过程中不断改进发酵技术，总结出以下经验。下列叙述错误的是（ ）
①选用具有高蛋白酶活性的米曲霉
②用蒸煮后的大豆与米曲霉混合堆积
③将初步发酵后含米曲霉等微生物的曲料摊薄，并适当通风
④在装坛时，添加适量食盐
⑤发酵过程中，需保持发酵坛密封
⑥发酵过程中，需定期搅拌
A．①和④对黄豆酱风味的形成起重要作用，利于提升品质
B．②和⑥可以促使微生物和物料充分混合，提高发酵效率
C．③有利于米曲霉和酵母菌进行有氧呼吸并快速大量增殖
D．⑤中乳酸菌主要集中于发酵坛上部而米曲霉集中于下部
【答案】D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、米曲霉能够分泌蛋白酶，能够将黄豆酱中的蛋白质分解成氨基酸，而食盐一方面可以抑制杂菌生长，避免黄豆酱腐败变质，另一方面可以调味，故①和④对黄豆酱风味的形成起重要作用，利于提升品质，A不符合题意；
B、米曲霉是好氧菌，且能够分泌蛋白酶将黄豆酱中的蛋白质分解，故②和⑥可以促使微生物和物料充分混合，提高发酵效率，B不符合题意；
C、米曲霉是好氧菌，而酵母菌也可以进行有氧呼吸，故③有利于米曲霉和酵母菌进行有氧呼吸并快速大量增殖，C不符合题意；
D、乳酸菌属于厌氧菌，米曲霉是好氧菌，故⑤中米曲霉主要集中于发酵坛上部，而乳酸菌集中于下部，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】米曲霉是真菌的一种，米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶(如蛋白酶和脂肪酶)中能将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分。
9．（2024·黑龙江模拟） 鸡蛋表面污染的细菌会逐渐侵入蛋内，缩短鸡蛋保质期。对某地不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样，按每克鸡蛋用1mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面，收集清洗液，培养计数结果如下表。下列叙述错误的是（ ）
季节 菌落数（个·g-1）
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A．表中数据是对清洗液稀释1×10 倍后涂板获得的
B．稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少
C．比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D．冬季鸡舍更需要消毒以减少鸡蛋表面的细菌污染
【答案】A
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、题中信息没有提到对清洗液如何进行稀释，只给了培养后的菌落数，因此无法推测出稀释倍数，A符合题意；
B、稀释涂布平板法得到的稀释菌落中会存在两个或者多个细菌粘合在一起的情况，在读数时往往产生误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，B不符合题意；
C、表格中，半封闭式养殖模式下的菌落数明显多于全封闭式养殖模式，可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境，C不符合题意；
D、表格中，在两种模式下，冬季的菌落数均高于夏季，故冬季鸡舍更需要消毒来减少鸡蛋表面的细菌污染，D不符合题意。
故答案为：A。
【分析】稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散敏肢开，但实际操作中往往会出现菌落粘合在一起的情况，菌落数比实际数略少。
二、非选择题
10．（2024高三上·罗湖期末）苹果富含矿物质和维生素，真菌X可引起苹果树腐烂病，对苹果树威胁很大，目前该病仍以化学防治为主。研究人员欲从土壤中分离筛选出能抑制真菌X的芽孢杆菌进行生物防治。分离筛选芽孢杆菌的实验流程如下图所示，分析回答以下问题：
（1）生物防治较化学防治的优势是 。
（2）上图所示分离筛选细菌的方法是 。所取5g土壤中加入 mL无菌水，可得到10倍的土壤悬液；经过梯度稀释后即可接种到培养基上，再根据培养基上的 特征鉴别出芽孢杆菌并进一步纯化，即可获得若干种纯化的芽孢杆菌。
（3）若10 稀释倍数下的三个平板菌落数分别为165、179、166，则每克土壤中含相关微生物数目为 个。
（4）目的菌株筛选时，需在上图中多个实验组和对照组的A处接种等量真菌X，并在不同实验组的B处接种一系列不同含量的同种芽孢杆菌，然后在相同且适宜的条件下培养合适的时间。判断目的菌株抑菌效果最佳的依据是 。
（5）为进一步检测芽孢杆菌的抑菌效果，某同学选用健康果树枝条进行测定，请为该同学设计简要的实验思路。
【答案】（1）防治效果持久，且对环境无污染（答出“不污染环境”即可得分）
（2）稀释涂布平板法；45；菌落
（3）1.7×106
（4）实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小）
（5）选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）生物防治与化学防治相比，生物物防治具有防治效果持久，且对环境无污染等的优势。
故填： 防治效果持久，且对环境无污染 。
（2） 上图所示分离筛选细菌的方法是稀释涂布平板法，取土样5g应加入45mL的无菌水， 可得到10倍的土壤悬液。不同种类的细菌形成的菌落不同，根据培养基上的菌落特征鉴别出芽孢杆菌并进一步纯化，即可获得若干种纯化的芽孢杆菌。
故填：稀释涂布平板法；45；菌落。
（3）若10 稀释倍数下的三个平板菌落数分别为165、179、166，则每克土壤中含相关微生物数目为=（C÷V）×M=（165+179+166）÷3÷0.1×103=1.7×106。
故填：1.7×106。
（4）土壤中分离筛选出的芽孢杆菌能抑制真菌X，在上图A处均接种等量真菌X，如果实验组A菌落直径最小，说明目的菌株抑菌效果最佳，因此判断目的菌株抑菌效果最佳的依据是实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小） 。
故填： 实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小） 。
（5）为进一步检测芽孢杆菌的抑菌效果，某同学选用健康果树枝条进行测定， 选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况 。
故填： 选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况 。
【分析】间接计数法（活菌计数法）：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作：a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
11．（2024·江西模拟） 蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题。研究人员成功地从环境样品中分高得到能降解蒽的菌株A和B．回答下列问题：
（1）用于分离菌株A和B的固体培养基含有（NH4）3SO4、MgSO4、CaCl2、NaH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、H2O、琼脂、蒽等成分。其中为细菌生长提供碳源的成分是 ；该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）为鉴定菌株A和B，研究人员提取了菌株A和B的基因组DNA，并用PCR扩增16S rRNA基因。为了验证提取基因组DNA是否成功，采用二苯胺试剂鉴定，其原理是 。在PCR扩增16SrRNA基因过程中，反应体系中引物的作用是 。在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是 。
（3）菌株A和B降解蒽的过程相同，均由按严格顺序排列的一系列静催化反应组成。为探究菌株A和B对蒽的降解能力，研究人员采用单独、混合接种（菌株AB接种量之比为1：1）方式开展实验（所有实验组接种总量一致）结果如表，由表可以看出菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，其原因可能是 。
接种方式 单独接种 混合接种
菌株A 菌株B
降解率（%） 41.7 20.9 65.2
【答案】（1）蒽；蛋白质、核酸
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色；界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸；变性
（3）菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；DNA的粗提取和鉴定；培养基概述及其分类
【解析】【解答】 （1）蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，菌株A和B能够降解蒽，因此蒽为细菌生长提供碳源，生物大分子蛋白质、核酸的组成元素中含有N，因此该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成蛋白质、核酸等生物大分子。
故填：蒽、 蛋白质、核酸。
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色，所以DNA可以采用二苯胺试剂鉴定。在PCR中，引物能为DNA聚合酶提供结合位点，能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，即在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是变性。
故填：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 、 界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 、变性。
（3）由表格内容可知：菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，有可能是因为菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
故填：菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
【分析】PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
12．（2024高三上·龙岗期末）有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能 被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株通常需要经过选择培养和划线纯化 等操作。回答下列问题：
（1）微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、 四类，该实验所用的选 择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是 。
（2）某同学在划线操作时，接种环灼烧后未冷却，这样操作的后果是 。
（3）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做下图所示实验。 该实验的假设是 ，该实验设计是否合理？为什么？ 。
（4）将目的菌种用于环境保护实践时，还有需要解决的问题有 （举出一列）。
【答案】（1）氮源和无机盐；只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖
（2）接种环灼烧以后未冷却进行划线的区域没有菌落
（3）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质；不合理，缺少空白对照
（4）目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株 是否可以大量繁殖等（只要写出一条）
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，选择培养基只允许特定种类的微生物生长，又要抑制或阻止其他种类微生物生长，因此为筛选出分离降解苯磺隆的菌株，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖。
故填：氮源和无机盐、只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖。
（2）在用平板划线法进行接种时，接种环灼烧后未冷却会烫死上次划线末端菌株，造成划线上没有菌株。
故填：接种环灼烧以后未冷却进行划线的区域没有菌落。
（3）由图可知，上清液中加入蛋白酶溶液是用于水解上清液中的某蛋白质的，由此可判定实验假设是目的菌株通过分泌某种蛋白质来降解苯磺隆，但由于没有设置不加入蛋白酶的对照组实验，因此该实验设计没有说服力，不合理。
故填：目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 、不合理，缺少空白对照。
（4）将目的菌种用于环境保护实践时，需要考虑目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株是否可以大量繁殖等。
故填：目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株 是否可以大量繁殖等 。
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。
13．（2023高三上·松江月考）在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，其凝乳及蛋白水解功能可使奶制品形成特殊风味和质地，被广泛应用于奶酪和酸奶生产。图10为利用生物工程技术生产凝乳酶的过程，①-④为具体操作步骤。
（1）根据题干信息及所学知识，步骤①中提取的质粒中应含有（ ）。（多选）
A．目的基因 B．启动子和终止子
C．标记基因 D．起始密码子和终止密码子
（2）图11是从小牛胃中分离得到的含凝乳酶基因的DNA，其两端的序列已知。限制性内切核酸酶的酶切位点如图所示。
可以采用 扩增该DNA。（编号选填）
①化学合成法 ②聚合酶链式反应 ③大规模筛选法
（3）要成功扩增出凝乳酶基因，所设计的引物应结合在图11中的 位置。（用图11中的编号选填）
（4）切割目的基因选用的限制性内切核酸酶是 。（编号选填）
①HindⅢ ②EcoRⅠ ③Bam HⅠ
（5）图12是研究人员利用平板划线法，分离纯化得到的含重组质粒的大肠杆菌。由菌落分布规律可知，划线顺序应为 。（用编号和箭头表示）
（6）挑取图12中的菌落转接至图13所示培养基，用于扩大培养。下列步骤可能涉及图13培养基的配制过程，请选择正确的编号并排序 。（用编号和箭头表示）
①倒平板 ②调整pH ③溶解 ④灭菌 ⑤称量 ⑥分装
（7）研究发现，通过图10过程获得的凝乳酶活性较低，请分析可能的原因。
（8）已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序 。（用编号和箭头表示）
①重组DNA分子导入大肠杆菌 ②随机改变凝乳酶基因的序列
③对突变蛋白进行结构和功能分析 ④改变凝乳酶基因的特定序列
⑤培养细胞后提纯突变蛋白 ⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组
【答案】（1）B；C
（2）②
（3）②③
（4）②③
（5）③→①→②
（6）⑤→③→②→⑥→④
（7）凝乳酶是真核细胞合成的蛋白质，有内质网和高尔基体的加工过程（或其他真核细胞对蛋白质合成、加工的机制），而图10所用的受体细胞是大肠杆菌，未经过内质网和高尔基体的加工，所合成的凝乳酶空间结构可能不同，影响了酶的功能，导致活性减弱
（8）④→⑥→①→⑤→③
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；蛋白质工程；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)将目的基因插入载体质粒后，要想目的基因得到成功表达，还需要在目的基因前插入启动子，在目的基因后插入终止子，此外为了便于筛选出含有目的基因的受体细胞，还要求运载体上有标记基因。因此，作为载体应具备的结构有启动子、终止子、标记基因等。故选BC。
(2)PCR(聚合酶链式反应)技术是一项体外扩增DNA的技术，故若两端的序列已知，可用聚合酶链式反应扩增DNA。故选②。
（3）引物需要与模板的3'端结合，故要成功扩增出凝乳酶基因，所设计的引物应结合在图中的②③位置。
（4）据图可知，HindIII会破坏目的基因，故不能选择，且为避免反向连接和自身环化，通常需要选择两种限制酶进行切割，故可选择EcoRI和BamHI。故选②③。
(5)采用划线接种时，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后，就可以得到单菌落，据此分析图示可知：划线的顺序依次是③→①→②。
(6)培养基的配置过程为：⑤称量 →③溶解 →②调整pH→⑥分装→④倒平板。
(7)分析题意可知，通过图A过程获得的凝乳酶活性较低，原因是：凝乳酶是真核细胞合成的蛋白质，有内质网和高尔基体的加工过程(或其他真核细胞对蛋白质合成、加工的机制)，而图所用的受体细胞是大肠杆菌，未经过内质网和高尔基体的加工，所合成的凝乳酶空间结构可能不同，影响了酶的功能，导致活性减弱。
(8)蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)，其前提是基因工程，故运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝乳酶，具体过程为：④改变凝乳酶基因的特定序列→⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组→①重组DNA分子导入大肠杆菌→⑤培养细胞后提纯突变蛋白→③对突变蛋白进行结构和功能分析。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、分泌蛋白合成与分泌过程：核糖体合成蛋白质→内质网进行粗加工→内质网“出芽“形成囊泡→高尔基体进行再加工形成成熟的蛋白质→高尔基体“出芽“形成囊泡→细胞膜，整个过程还需要线粒体提供能量。
4、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
5、 蛋白质工程的实质是：改造基因。蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列；进行基因修饰或基因合成；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成问题。因此，蛋白质工程生产合成的蛋白质是自然界中不存在的新型蛋白质分子。
14．（2023高二下·桂林期末） 生物柴油是以动植物油脂以及餐饮垃圾油等为原料，通过化学反应制成的可供内燃机使用的燃料，是一种绿色能源。微生物脂肪酶在催化生产生物柴油中起者重要作用，为筛选产脂肪酶的微生物，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
（1）产脂肪酶的微生物主要从油污土壤或水体中寻找，原因是 。
（2）为确保能够分离得到产脂肪酶的微生物，配置的培养基时应选择以 为唯一碳源。
（3）需要对分解脂肪的微生物进行分离和计数，可采用 法接种，从而得到分布均匀的单菌落。为了提高实验结果的可信度，研究人员设置了对照实验
对照组 作用 应出现的现象
接种的牛肉膏蛋白胨培养基 对照组培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数
判断选择培养基是否被污染
【答案】（1）油污土壤或水体中分解脂肪的微生物数量较多
（2）脂肪
（3）稀释涂布平板；判断选择培养基是否具有选择作用；未接种的选择培养基；对照组培养基中未出现菌落
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）微生物生活需要一定的环境条件，产脂肪酶的微生物大多生活在富含油脂的环境中，由于油污土壤或水体中产脂肪酶的微生物数量较多，故筛选产脂肪酶的微生物，应主要从油污土壤或水体中寻找。
（2）欲筛选某种微生物，需要人为提供有利于目的菌的生长条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。为确保能够分离得到产脂肪酶的微生物，配制培养基时应选择以脂肪(油脂)为唯一碳源。
（3）纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法；平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。可见，需要对分解脂肪的微生物进行分离和计数，可采用稀释涂布平板法接种。由接种的牛肉膏蛋白胨培养基上应出现的现象(对照组培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数)可推知，接种的牛肉膏蛋白胨培养基所起的作用是：判断选择培养基是否具有选择作用。若要判断选择培养基是否被污染，则需要将未接种的选择培养基培养一段时间，观察菌落的有无，若对照组培养基中未出现菌落，则说明培养培养基没有被杂菌污染。
【分析】（1）培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。选择培养基作用的原理是在培养基中加入某一化学物质或改变某一理化性质，使某种微生物正常生长，而其他微生物则被杀灭或生长受到抑制，从而选出所需要的微生物。
（2）微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
15．（2023高一下·大同期末） 碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类抗生素。为了探究抗生素对细菌的选择作用，某兴趣小组的同学利用碳青霉烯类抗生素进行了如下实验：
步骤一：取大肠杆菌菌液均匀涂布在已灭菌的培养基平板上，并将平板划分为四个大小一致的区域，分别标记①—④。①区域放一张不含碳青霉烯类抗生素的圆形滤纸片，②—④区域各放入一个含碳青霉烯类抗生素的相同圆形滤纸片，将培养皿倒置于适宜条件下培养12~16h，结果如下图。
步骤二：挑取该平板上位于抑菌圈边缘菌落上的细菌配制成菌液，重复上述实验操作，培养至第3代，观察、测量并记录每一代的实验结果。
请回答下列问题。
（1）大肠杆菌耐药性变异一般来源于 ，该变异产生于碳青霉烯类抗生素广泛使用 （填“前”或“后”）。
（2）本实验可以根据 判定碳青霉烯类抗生素的选择作用。步骤二中从抑菌圈边缘菌落挑取细菌，原因是该处的细菌可能具有 。
（3）该小组同学通过实验得到如下表数据。
抑菌圈直径/cm
区域 第一代 第二代 第三代
② 2.26 1.89 1.62
③ 2.41 191 1.67
④ 2.42 1.87 1.69
平均值 2.36 1.89 1.66
实验数据表明，随着培养代数的增加， ，说明细菌的耐药性 。从进化的角度解释细菌耐药性变化的原因是 。
（4）该小组同学将含碳青霉烯类抗生素的圆形滤纸片替换为含有卡那霉素的相同圆形滤纸片，从第3代抑菌圈边缘挑取细菌接种，重复培养3代；又在抑菌圈边缘重新挑取细菌培养，恢复使用含有碳青霉烯类抗生素的滤纸片，测得抑菌圈直径平均值大于第三代的平均值1.66cm。这一结果为我们防止“超级细菌”的出现提供的思路是：建立细菌耐药预警机制，当细菌耐药率超过一定值时， 。
【答案】（1）基因突变；前
（2）抑菌圈的直径（或抑菌圈的大小）；耐药性
（3）抑菌圈直径逐渐变小；（随着细菌培养代数的增加）逐渐增强；碳青霉烯类抗生素对大肠杆菌起到（定向）选择的作用（或“碳青霉烯类抗生素的使用，使耐药菌生存和繁殖的机会增加，耐药性基因频率升高”）
（4）及时更换抗生素类药物（将细菌耐药率控制在较低水平）
【知识点】基因突变的类型；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】(1)大肠杆菌是原核生物，耐药性变异一般来源于基因突变，无基因重组和染色体变异。变异在前，抗生素的选择作用在后。
(2)本实验目的是探究抗生素对细菌的选择作用，抗生素能抑制细菌的生长，可根据抑菌圈的大小判定碳青霉烯类抗生素的选择作用，抑菌圈越大，说明选择作用越强。在抑菌圈边缘可能有突变后产生耐药性的菌株，所以从抑菌圈边缘菌落挑取细菌，可能获得目的菌株。
(3)由表可知，随着实验代数的增加，抑菌圈逐渐减小，说明细胞的耐药性逐渐增强。由于碳青霉烯类抗生素对大肠杆菌起到选择的作用，所以随着培养代数的增加，耐药性会逐渐增强。
(4)由题意可知，换其他抗生素后，细菌的耐药性降低，说明及时更换抗生素类药物有利于防止超级细菌的出现，可将细菌的耐药性控制在较低水平。
【分析】1、基因突变：
（1）概念：指基因中碱基对的增添、缺失或替换。
（2）时间：突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期。
（3）基因突变的类型：自发突变和人工诱变。
（4）基因突变的特点：①基因突变具有普遍性：生物界中普遍存在；②低频性：自然情况下突变频率很低；③随机性：个体发育的任何时期和部位；④不定向性：突变是不定向的；⑤多害少利性：多数对生物有害。
（5）基因突变是点突变，在光学显微镜下观察不到，在染色体变异在显微镜下可以观察到。
（6）基因突变的意义：基因突变是新基因产生的途径；基因突变能为生物进化提供原材料；基因突变是生物变异的根本来源。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
16．（2024高三上·哈尔滨期末）油菜素内酯被认为是第六类植物激素，广泛分布于植物体内，其能促进细胞生长、细胞分裂和农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因（如 P450基因和红霉素抗性基因）的表达和酶活性都得到了提高，在这些基因指导下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。根据以上信息，研究人员进行了如下实验操作，请回答下列问题：
（1）用 PCR扩增获取目的基因，首先要制备2种引物，为 提供结合位点，并从引物 端（填“5”或“3”）开始拼接单个的脱氧核苷酸。
（2）在构建重组质粒1时，最好用两种不同的限制酶进行切割，这样可以有效防止酶切产物 。将构建的重组质粒2与用 处理的受体细菌混合，从而将目的基因导入受体细菌，且在受体细菌内 该过程称为转化。
（3）培养菌落的实验过程中，应向培养基中加入 可将含有目的基因的细菌筛选出来，图中将受体细菌的菌液接种到培养基上的方法是 。
【答案】（1）TaqDNA聚合酶或耐高温的DNA聚合酶或DNA聚合酶；3’
（2）自身环化或反向连接；Ca2+；维持稳定存在并表达
（3）红霉素；稀释涂布平板法
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）用PCR扩增DNA，首先要制备2种引物，以便为热稳定DNA聚合（或Taq）酶提供结合位点，并从引物的3’端开始拼接单个的脱氧核苷酸。
（2）同种限制酶切割目的基因，目的基因两端的产生的黏性末端是相同的，可能出现自身环化现象以及目的基因和质粒反向连接，因此研究者使用不同的限制酶切割目的基因能有效防止酶切产物自身环化或反向连接。转化是将构建的重组质粒2与用Ca2+处理的受体细菌混合，从而将目的基因导入受体细菌，且在受体细菌内维持稳定与表达。
（3）重组质粒抗性基因是红霉素基因，故在培养基中加入红霉素可将含有目的基因的细胞筛选出来。图中将受体细菌的菌液接种到平板上用稀释涂布平板法。
【分析】1、基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、微生物常见的接种的方法： （1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。 （2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
17．（2023高二下·运城期末） 稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养)。蓝细菌中B基因表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收的载体蛋白，科学家利用基因工程和细胞工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1、2分别是农杆菌的T质粒和蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题：
（1）为获得可用于进一步研究的固氮蓝细菌的菌株，该培养基所需的营养物质有无机碳源、 (写两种)，但不需要添加 营养物质，并在有光条件下培养。
（2）利用PCR技术以图2中的DNA片段为模板扩增B基因时，需要的引物有 (填写图中引物代号)。
（3）在构建含B基因的表达载体时，需要用限制酶 切割Ti质粒和B基因，不选用其他限制酶的原因是 。实践中，双酶切与单酶切相比，优点是 。
（4）为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可采用抗原一抗体杂交法在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路： 。
【答案】（1）水、无机盐；氮源
（2）引物B和引物C
（3）BclI和HindIII；BamHI会破坏四环素抗性基因（和氨苄青霉素抗性基因），Sau3AI不能切割Ti质粒；防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接
（4）将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量（或测定两组水稻根系吸收NO3-的速率）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；培养基概述及其分类；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1） 固氮蓝细菌能独立固氮，且能进行光合作用，因此该培养基所需的营养物质有无机碳源、水、无机盐，不需要添加氮源，并在有光条件下培养。
故填： 水、无机盐、氮源。
（2）PCR技术，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，故利用PCR技术以图2中的DNA片段为模板扩增B基因时，需要的引物有引物B和引物C。
故填： 引物B和引物C。
（3）限制酶BamHⅠ会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，限制酶Sau3AⅠ不能切割Ti质粒，在构建含B基因的表达载体时，需要用限制酶BclⅠ和HindⅢ切割Ti质粒和B基因。与单酶切相比，双酶切可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接，故一般选择双酶切。
故填： BclI和HindIII、BamHI会破坏四环素抗性基因（和氨苄青霉素抗性基因），Sau3AI不能切割Ti质粒、防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接。
（4）蓝细菌中B基因表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO3-的载体蛋白，如果转基因水稻中含有了B基因，且成功表达后，能高效吸收NO3-，因而与普通水稻相比，在相同条件下，其培养液中的NO3-浓度要低，故为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，在个体水平上检测的实验思路为：将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量，如果转基因水稻的培养液中NO3-剩余较少，则可说明转基因水稻培育成功。
故填： 将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量（或测定两组水稻根系吸收NO3-的速率） 。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
18．（2023高二下·吕梁期末） 已知金黄色葡萄球菌（Sau）的最适生长温度为37℃，并且具有高度的耐盐性，可以在10%-15%NaCl肉汤培养基中生长。A、B、C、D四种抗生素均可治疗金黄色葡萄球菌引起的肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者将分别含等剂量抗生素A、B、C、D的四张大小相同的滤纸片a、b、c、d置于Sau均匀分布的培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图。请回答下列问题：
（1）某同学欲培养金黄色葡萄球菌，应该如何操作 ，该培养基属于 培养基（从功能上考虑）。
（2）实验中一般采用 方法对培养基进行灭菌。在接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是 。图中微生物的接种方法最可能是 。
（3）据图分析， 治疗Sau感染引起的肺炎效果最好。判断依据是 。
【答案】（1）配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天；选择
（2）高压蒸汽灭菌；检验培养基灭菌是否合格；稀释涂布平板法
（3）抗生素A；抗生素A的抑菌圈最大
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】（1） 由题意“ 已知金黄色葡萄球菌（Sau）的最适生长温度为37℃，并且具有高度的耐盐性，可以在10%-15%NaCl肉汤培养基中生长 ”可知，为培养大量的金黄色葡萄球菌，需配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天；从功能上讲，该培养基属于选择培养基。
故填： 配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天、选择。
（2）实验中一般采用高压蒸汽灭菌的方法对培养基进行灭菌；接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检验培养基灭菌是否合格。图中菌落分布相对均匀，接种方法最可能是稀释涂布平板法。
故填： 高压蒸汽灭菌、检验培养基灭菌是否合格、稀释涂布平板法。
（3）根据抑菌圈的大小，含等剂量抗生素接种到培养基上，抗生素A的抑菌圈最大，因此，其治疗Sau感染引起的肺炎效果最好。
故填： 抗生素A、抗生素A的抑菌圈最大 。
【分析】 1、选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抵制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
2、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
19．（2024·邯郸）豆酱是我国特色传统调味品，如图为制作豆酱的工艺流程。其中，制曲是蒸熟的大豆自然晾凉后用牛皮纸包裹，毛霉等多种微生物在大豆表面大量繁殖的过程。发酵期间需要定期搅拌，30天后酱即成。回答下列问题：
（1）制作豆酱过程中，蒸熟操作一方面可以使其组织细胞软化，所含蛋白质能够适度变性，淀粉能够达到糊化的程度，另一方面还可以起到 作用，以免影响所需菌种的生长。
（2）在制曲的过程中，豆块上生长的毛霉会产生 ，使蛋白质分解为 和 ，从而产生酱类所特有的风味。
（3）发酵过程中，煮沸后的盐水需要冷却后才能加入到粉碎的酱料中，原因是 。
（4）在豆酱发酵过程中定期搅拌的目的是 (答出2点即可)。
【答案】（1）灭菌(杀灭杂菌)
（2）蛋白酶；小分子肽；氨基酸
（3）防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活
（4）加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等
【知识点】腐乳的制作；灭菌技术
【解析】【解答】（1） 制作豆酱过程中， 加入的大豆经蒸熟、冷却后使用，这样既可以使淀粉能够达到糊化的程度，又可以起到灭菌的作用。
故填： 灭菌(杀灭杂菌)。
（2）在制曲的过程中，豆块上生长的毛霉会产生蛋白酶，蛋白酶使蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
故填： 蛋白酶、小分子肽、氨基酸。
（3）煮沸后的盐水需要冷却后才能加入到粉碎的酱料中，这样可以防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活。
故填： 防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活。
（4） 在豆酱发酵过程中，定期搅拌可以加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等。
故填： 加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等 。
【分析】参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，其新陈代谢类型是异养需氧型。腐乳制作的原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
20．（2024高三下·长春）泡菜是许多亚洲国家的传统食品，在发酵液中发现的微生物通常含有乳酸菌和酵母菌等。我国民间泡菜制作历史悠久，早在《齐名要术》中就有相关记载，清代《中馈录》中详细记载了泡菜的做法：“泡盐菜法，定要覆水坛。此坛有一外沿如暖帽式，四周内可盛水，坛口上覆一盖，浸于水中，使空气不得入内，则所泡之菜不得坏矣。泡菜之水，用花椒和盐煮沸……”。回答下列问题。
（1）泡菜制作将水坛坛盖浸于水中，使空气不得入内的原因是 。煮沸的盐水需 后，再倒进已装好干净蔬菜的坛中。
（2）正常发酵的初期，可听到泡菜坛发出“叮当”的声响，并看到气泡从坛沿的水槽中冒出，这些气泡中的气体主要由 菌产生。泡菜发酵过程中，除乳酸菌外，其它微生物在密封发酵2天后均大幅度减少的主要原因是 。
（3）为探究泡菜食用的最佳时间，某同学用质量分数为5%的食盐水制作泡菜，在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见下图。
由图可知，在发酵10天后食用泡菜比较合适，原因是 。
【答案】（1）为乳酸菌无氧呼吸创造无氧条件；冷却
（2）酵母；酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存
（3）此时亚硝盐含量已经降低到较低水平
【知识点】泡菜的制作；亚硝酸盐含量的测定
【解析】【解答】（1）由于泡菜利用的是乳酸菌的无氧呼吸，发酵时必须在无氧环境下进行，因此 泡菜制作将水坛坛盖浸于水中 。煮沸的盐水直接使用会导致菌种被烫死，因此需要冷却后才倒入 已装好干净蔬菜的坛中。
故填： 为乳酸菌无氧呼吸创造无氧条件 ；冷却
（2）泡菜发酵初期能听到声响并且看到气泡从水槽冒出，是因为泡菜坛中有部分空气，酵母菌进行呼吸作用产生了CO2。随着泡菜发酵的持续进行，坛中空气耗尽，乳酸菌进行乳酸发酵，使乳酸含量逐渐上升，发酵液的pH下降，这种 酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存 ，因此其他微生物大幅度减少。
故填： 酵母 ； 酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存
（3）亚硝酸盐在一定条件下可转变为致癌的亚硝胺，对人体有害。分析图可知，泡菜发酵过程中，第5天亚硝酸盐含量最高，之后逐渐下降，在发酵10天后亚硝盐含量已经降低到较低水平，适宜食用。
故填：此时亚硝盐含量已经降低到较低水平
【分析】泡菜的制作原理是，乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸，反应式为：
C6H12O62C3H6O3+能量。
21．透明质酸(HA)又称玻尿酸，是一种具有高黏度氨基多糖，也是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶(HAS)，但含有 HA代谢的其它途径，而动物病原体链球菌含有HAS的基因(H基因)。研究者通过基因工程来改变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产 HA。
（1）目的基因的获取和扩增：链球菌破碎后提取 DNA，经 酶切割获取H基因。PCR扩增目的基因，需要根据H基因 设计合适的引物，是由于 DNA 聚合酶发挥作用时需要引物参与形成 作为核苷酸缩合作用的起点；DNA 聚合酶在延伸子链时需要把核苷酸加到 端。
（2）表达载体的构建：下图为H基因与p质粒示意图，其中H基因以a链为转录模板链。为通过添加诱导剂来控制H基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为了使下图中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2所对应的酶分别是 。酶切后加入 酶催化重组质粒形成。
（3）表达载体的导入与筛选：将构建好的重组质粒转入经 处理的枯草芽孢杆菌，在含 的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
（4）菌种的扩大培养：配制 (填“液体”或“固体”)培养基，成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物，其中蛋白胨为微生物生长主要提供 ；调整 pH；灭菌；枯草芽孢杆菌 A 接种到摇瓶培养。
（5）大型发酵：进行现代工业发酵时，在发酵罐加入适宜的培养基外，还需严格控制 等发酵条件。经扩大培养的枯草芽孢杆菌A 接种 定时间后添加 ，诱导合成HA。HA 对枯草芽孢杆菌来说属于 (填“初生代谢产物”或“次生代谢产物”)。
（6）产品输出：发酵液中大部分为水，发酵产物浓度较低；发酵液中悬浮固形物主要是菌体和蛋白质的胶状物，故最后对发酵产物进行 ，获得所需产品。
【答案】（1）限制性内切核酸/限制；两端的已知序列；一小段双链 DNA；3′
（2）Xho 酶和 Bsal 酶；DNA 连接酶
（3）CaCl2/Ca 2+；四环素
（4）液体；氮源、生长因子/氮源、碳源、维生素
（5）温度、pH、溶解氧；木糖；次生代谢产物
（6）分离、提纯
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用；基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】（1）、第1空、限制性内切核酸/限制；第2空、两端的已知序列；第3空、一小段双链 DNA；第4空、3′。用限制性内切核酸酶或限制酶切割DNA就可以获取目的基因H。PCR扩增目的基因，需要根据H基因设计合适的引物，是由于DNA聚合酶发挥作用时需要引物参与形成两端的已知序列作为核苷酸缩合作用的起点；DNA聚合酶在延伸子链时需要一小段双链DNA把核苷酸加到3'端。
（2）、第1空、Xho 酶和 Bsal 酶；第2空、DNA 连接酶。透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中p质粒位点1和2所对应的酶分别是Xho酶和Bsal酶。DNA连接酶连接的是DNA片段，因此，酶切后加入DNA连接酶催化重组质粒形成。
（3）、第1空、CaCl2/Ca2+；第2空、四环素。将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（钙离子处理法），故需要将构建好的重组质粒转入经CaCl2或Ca2+处理的枯草芽孢杆菌；结合图示可知，该质粒上含有四环素抗性基因，属于标记基因，故可在含四环素的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
（4）、第1空、液体；第2空、氮源、生长因子/氮源、碳源、维生素。菌种的扩大培养是在液体培养基中进行的，故需要配制液体培养基，成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物；蛋白胨含有C、H、O、N等物质，为微生物生长主要提供氮源、碳源、维生素等；调整pH；灭菌；枯草芽孢杆菌A接种到摇瓶培养。
（5）、第1空、温度、pH、溶解氧；第2空、木糖；第3空、次生代谢产物。现代工业发酵时，在发酵罐加入适宜的培养基外，还需严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件；经扩大培养的枯草芽孢杆菌A接种定时间后添加木糖，诱导合成HA；植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物。分析题意，HA是是一种具有高黏度氨基多糖，HA对枯草芽孢杆菌来说属于次生代谢产物。
（6）、 第1空、分离、提纯 。产品输出时需要对发酵产物进行分离、提纯，获得所需产品。
【分析】DNA连接酶和DNA聚合酶是两种不同的酶，主要的区别就在于它们的底物是不一样的，DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，但是DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术；将目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法。
1 / 12024年高考生物学二轮复习16：微生物的培养及发酵工程
一、选择题
1．（2023高三上·茂名月考）某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。 如图为某同学接种后培养得到的结果，推测该同学的接种方法及操作失误是（ ）
A．稀释涂布平板法，菌液浓度过高
B．平板划线法，接种环未灼烧灭菌
C．稀释涂布平板法，菌液未涂布均匀
D．平板划线法，菌液未涂布均匀
2．（2024高三下·月考） 酸笋是螺蛳粉的灵魂，腌酸笋季节在春季。当竹子出笋后，长出约30cm高时便可砍下，剥去笋壳，切成块或是切成笋丝、笋片，放于陶罐中，清水过面，撒上适量食盐，置于阴凉处一个月左右，酸味即出，便可随食随取。下列相关叙述错误的是（ ）
A．制作酸笋所需菌种的代谢类型为异养厌氧型
B．为防止杂菌污染，需对鲜笋进行灭菌处理
C．“清水过面”的目的是为了创造无氧环境
D．在制作酸笋时若加入上一批次的发酵液可加快发酵进程
3．（2023高三上·福田月考）益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌。市售的益生菌产品质量参差不齐，某益生菌品牌宣传其产品中活菌数不少于107个/g。研究小组尝试检测该品牌益生菌中的活菌含量是否与宣传一致，实验步骤为：制备培养基→调节pH→灭菌→倒平板→梯度稀释样品→接种→培养→计数。下列叙述错误的是（ ）
A．经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板培养时均需要倒置
B．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
C．培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢
D．对该品牌益生菌进行计数时，稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略大
4．（2024高三上·汕头期末） 尿酸氧化酶能分解尿酸（C5H4N4O3）。为获取尿酸氧化酶高产菌株用以研制治疗高尿酸血症的酶类药物，科研人员从某泥土中取样后富集培养，3天后吸取培养液梯度稀释到10-6，然后接种到固体培养基上分离培养。挑取单菌落检测尿酸氧化酶的酶活力（用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示），结果如表所示。下列最适合作为实验目的菌落的是（ ）
菌落 1 2 3 4
酶活力 100 50 14 20
A．菌落1 B．菌落2 C．菌落3 D．菌落4
（2024高三上·期末）阅读下面材料回答以下问题
某技术人员设计了青霉素生产菌——产黄青霉菌的诱变育种方案，具体包括：①配制中性偏酸的培养基，准备相关的培养皿，稀释用水；②进行菌种的紫外线诱变；③用接种环蘸取诱变后的产黄青霉菌孢子悬液在固体培养基上划线；④放在恒温培养箱中培养到长出单菌落；⑤挑取单菌落，接种至均匀分布野生型金黄色葡萄球菌（葡萄糖为主要碳源的培养基上）进行生产青霉素性能的测定。
5．下列对该方案不合理之处的叙述正确的是（ ）
A．①中应配置中性偏碱的培养基
B．③中分离菌种应用稀释涂布平板法
C．步骤②、③的顺序应该调换
D．⑤中应将单菌落接种至含酚红的培养基上
6．下列关于该方案中无菌操作的叙述正确的是（ ）
A．①中调节pH值需在灭菌之后进行
B．实验结束时可用紫外线照射的方法对④中残余的培养基彻底灭菌
C．⑤过程培养基中添加的葡萄糖可用G6玻璃砂漏斗过滤除菌
D．青霉素具有杀菌作用，此发酵罐不需严格灭菌
7．（2024高三上·海淀期末）嗜盐单胞菌可利用海水合成聚羟基脂肪酸酯(PHA，一种新型生物塑料)，在细胞内形成由膜包裹的不溶性颗粒。科研人员从海水中分离得到一株嗜盐单胞菌，在非灭菌、高盐、高pH的发酵液中连续发酵生产PHA，其流程如下图所示。下列相关叙述不正确的是（ ）
A．利用含PHA的选择培养基筛选嗜盐单胞菌
B．高盐、高pH的发酵液抑制了杂菌生长
C．培养液上清循环利用，有利于节约物质和能量
D．发酵完成后收集沉淀的菌体以得到PHA
8．（2024·河南模拟） 黄豆酱是人们喜爱的传统美食，早在春秋时期就有制作方法的相关记载。它以黄豆为主要原料，经米曲霉（好氧菌）、酵母菌、乳酸菌等微生物发酵而成。劳动人民在制作过程中不断改进发酵技术，总结出以下经验。下列叙述错误的是（ ）
①选用具有高蛋白酶活性的米曲霉
②用蒸煮后的大豆与米曲霉混合堆积
③将初步发酵后含米曲霉等微生物的曲料摊薄，并适当通风
④在装坛时，添加适量食盐
⑤发酵过程中，需保持发酵坛密封
⑥发酵过程中，需定期搅拌
A．①和④对黄豆酱风味的形成起重要作用，利于提升品质
B．②和⑥可以促使微生物和物料充分混合，提高发酵效率
C．③有利于米曲霉和酵母菌进行有氧呼吸并快速大量增殖
D．⑤中乳酸菌主要集中于发酵坛上部而米曲霉集中于下部
9．（2024·黑龙江模拟） 鸡蛋表面污染的细菌会逐渐侵入蛋内，缩短鸡蛋保质期。对某地不同季节及不同养殖模式下生产的鸡蛋取样，按每克鸡蛋用1mL无菌生理盐水清洗鸡蛋表面，收集清洗液，培养计数结果如下表。下列叙述错误的是（ ）
季节 菌落数（个·g-1）
半封闭式养殖模式 全封闭式养殖模式
夏季 3.92×104 7.24×103
冬季 7.60×104 1.24×104
A．表中数据是对清洗液稀释1×10 倍后涂板获得的
B．稀释涂布平板法得到的鸡蛋表面菌落数比实际数略少
C．比较两种养殖模式可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境
D．冬季鸡舍更需要消毒以减少鸡蛋表面的细菌污染
二、非选择题
10．（2024高三上·罗湖期末）苹果富含矿物质和维生素，真菌X可引起苹果树腐烂病，对苹果树威胁很大，目前该病仍以化学防治为主。研究人员欲从土壤中分离筛选出能抑制真菌X的芽孢杆菌进行生物防治。分离筛选芽孢杆菌的实验流程如下图所示，分析回答以下问题：
（1）生物防治较化学防治的优势是 。
（2）上图所示分离筛选细菌的方法是 。所取5g土壤中加入 mL无菌水，可得到10倍的土壤悬液；经过梯度稀释后即可接种到培养基上，再根据培养基上的 特征鉴别出芽孢杆菌并进一步纯化，即可获得若干种纯化的芽孢杆菌。
（3）若10 稀释倍数下的三个平板菌落数分别为165、179、166，则每克土壤中含相关微生物数目为 个。
（4）目的菌株筛选时，需在上图中多个实验组和对照组的A处接种等量真菌X，并在不同实验组的B处接种一系列不同含量的同种芽孢杆菌，然后在相同且适宜的条件下培养合适的时间。判断目的菌株抑菌效果最佳的依据是 。
（5）为进一步检测芽孢杆菌的抑菌效果，某同学选用健康果树枝条进行测定，请为该同学设计简要的实验思路。
11．（2024·江西模拟） 蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题。研究人员成功地从环境样品中分高得到能降解蒽的菌株A和B．回答下列问题：
（1）用于分离菌株A和B的固体培养基含有（NH4）3SO4、MgSO4、CaCl2、NaH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、H2O、琼脂、蒽等成分。其中为细菌生长提供碳源的成分是 ；该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）为鉴定菌株A和B，研究人员提取了菌株A和B的基因组DNA，并用PCR扩增16S rRNA基因。为了验证提取基因组DNA是否成功，采用二苯胺试剂鉴定，其原理是 。在PCR扩增16SrRNA基因过程中，反应体系中引物的作用是 。在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是 。
（3）菌株A和B降解蒽的过程相同，均由按严格顺序排列的一系列静催化反应组成。为探究菌株A和B对蒽的降解能力，研究人员采用单独、混合接种（菌株AB接种量之比为1：1）方式开展实验（所有实验组接种总量一致）结果如表，由表可以看出菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，其原因可能是 。
接种方式 单独接种 混合接种
菌株A 菌株B
降解率（%） 41.7 20.9 65.2
12．（2024高三上·龙岗期末）有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能 被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株通常需要经过选择培养和划线纯化 等操作。回答下列问题：
（1）微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、 四类，该实验所用的选 择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是 。
（2）某同学在划线操作时，接种环灼烧后未冷却，这样操作的后果是 。
（3）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做下图所示实验。 该实验的假设是 ，该实验设计是否合理？为什么？ 。
（4）将目的菌种用于环境保护实践时，还有需要解决的问题有 （举出一列）。
13．（2023高三上·松江月考）在未断奶的小牛胃中存在一种凝乳酶，其凝乳及蛋白水解功能可使奶制品形成特殊风味和质地，被广泛应用于奶酪和酸奶生产。图10为利用生物工程技术生产凝乳酶的过程，①-④为具体操作步骤。
（1）根据题干信息及所学知识，步骤①中提取的质粒中应含有（ ）。（多选）
A．目的基因 B．启动子和终止子
C．标记基因 D．起始密码子和终止密码子
（2）图11是从小牛胃中分离得到的含凝乳酶基因的DNA，其两端的序列已知。限制性内切核酸酶的酶切位点如图所示。
可以采用 扩增该DNA。（编号选填）
①化学合成法 ②聚合酶链式反应 ③大规模筛选法
（3）要成功扩增出凝乳酶基因，所设计的引物应结合在图11中的 位置。（用图11中的编号选填）
（4）切割目的基因选用的限制性内切核酸酶是 。（编号选填）
①HindⅢ ②EcoRⅠ ③Bam HⅠ
（5）图12是研究人员利用平板划线法，分离纯化得到的含重组质粒的大肠杆菌。由菌落分布规律可知，划线顺序应为 。（用编号和箭头表示）
（6）挑取图12中的菌落转接至图13所示培养基，用于扩大培养。下列步骤可能涉及图13培养基的配制过程，请选择正确的编号并排序 。（用编号和箭头表示）
①倒平板 ②调整pH ③溶解 ④灭菌 ⑤称量 ⑥分装
（7）研究发现，通过图10过程获得的凝乳酶活性较低，请分析可能的原因。
（8）已知凝乳酶第20、24位氨基酸变成半胱氨酸，其活性可显著提高。科研人员希望运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝乳酶，请选用合适的措施编号并排序 。（用编号和箭头表示）
①重组DNA分子导入大肠杆菌 ②随机改变凝乳酶基因的序列
③对突变蛋白进行结构和功能分析 ④改变凝乳酶基因的特定序列
⑤培养细胞后提纯突变蛋白 ⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组
14．（2023高二下·桂林期末） 生物柴油是以动植物油脂以及餐饮垃圾油等为原料，通过化学反应制成的可供内燃机使用的燃料，是一种绿色能源。微生物脂肪酶在催化生产生物柴油中起者重要作用，为筛选产脂肪酶的微生物，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
（1）产脂肪酶的微生物主要从油污土壤或水体中寻找，原因是 。
（2）为确保能够分离得到产脂肪酶的微生物，配置的培养基时应选择以 为唯一碳源。
（3）需要对分解脂肪的微生物进行分离和计数，可采用 法接种，从而得到分布均匀的单菌落。为了提高实验结果的可信度，研究人员设置了对照实验
对照组 作用 应出现的现象
接种的牛肉膏蛋白胨培养基 对照组培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数
判断选择培养基是否被污染
15．（2023高一下·大同期末） 碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广、抗菌活性最强的一类抗生素。为了探究抗生素对细菌的选择作用，某兴趣小组的同学利用碳青霉烯类抗生素进行了如下实验：
步骤一：取大肠杆菌菌液均匀涂布在已灭菌的培养基平板上，并将平板划分为四个大小一致的区域，分别标记①—④。①区域放一张不含碳青霉烯类抗生素的圆形滤纸片，②—④区域各放入一个含碳青霉烯类抗生素的相同圆形滤纸片，将培养皿倒置于适宜条件下培养12~16h，结果如下图。
步骤二：挑取该平板上位于抑菌圈边缘菌落上的细菌配制成菌液，重复上述实验操作，培养至第3代，观察、测量并记录每一代的实验结果。
请回答下列问题。
（1）大肠杆菌耐药性变异一般来源于 ，该变异产生于碳青霉烯类抗生素广泛使用 （填“前”或“后”）。
（2）本实验可以根据 判定碳青霉烯类抗生素的选择作用。步骤二中从抑菌圈边缘菌落挑取细菌，原因是该处的细菌可能具有 。
（3）该小组同学通过实验得到如下表数据。
抑菌圈直径/cm
区域 第一代 第二代 第三代
② 2.26 1.89 1.62
③ 2.41 191 1.67
④ 2.42 1.87 1.69
平均值 2.36 1.89 1.66
实验数据表明，随着培养代数的增加， ，说明细菌的耐药性 。从进化的角度解释细菌耐药性变化的原因是 。
（4）该小组同学将含碳青霉烯类抗生素的圆形滤纸片替换为含有卡那霉素的相同圆形滤纸片，从第3代抑菌圈边缘挑取细菌接种，重复培养3代；又在抑菌圈边缘重新挑取细菌培养，恢复使用含有碳青霉烯类抗生素的滤纸片，测得抑菌圈直径平均值大于第三代的平均值1.66cm。这一结果为我们防止“超级细菌”的出现提供的思路是：建立细菌耐药预警机制，当细菌耐药率超过一定值时， 。
16．（2024高三上·哈尔滨期末）油菜素内酯被认为是第六类植物激素，广泛分布于植物体内，其能促进细胞生长、细胞分裂和农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因（如 P450基因和红霉素抗性基因）的表达和酶活性都得到了提高，在这些基因指导下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。根据以上信息，研究人员进行了如下实验操作，请回答下列问题：
（1）用 PCR扩增获取目的基因，首先要制备2种引物，为 提供结合位点，并从引物 端（填“5”或“3”）开始拼接单个的脱氧核苷酸。
（2）在构建重组质粒1时，最好用两种不同的限制酶进行切割，这样可以有效防止酶切产物 。将构建的重组质粒2与用 处理的受体细菌混合，从而将目的基因导入受体细菌，且在受体细菌内 该过程称为转化。
（3）培养菌落的实验过程中，应向培养基中加入 可将含有目的基因的细菌筛选出来，图中将受体细菌的菌液接种到培养基上的方法是 。
17．（2023高二下·运城期末） 稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养)。蓝细菌中B基因表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收的载体蛋白，科学家利用基因工程和细胞工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1、2分别是农杆菌的T质粒和蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题：
（1）为获得可用于进一步研究的固氮蓝细菌的菌株，该培养基所需的营养物质有无机碳源、 (写两种)，但不需要添加 营养物质，并在有光条件下培养。
（2）利用PCR技术以图2中的DNA片段为模板扩增B基因时，需要的引物有 (填写图中引物代号)。
（3）在构建含B基因的表达载体时，需要用限制酶 切割Ti质粒和B基因，不选用其他限制酶的原因是 。实践中，双酶切与单酶切相比，优点是 。
（4）为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可采用抗原一抗体杂交法在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路： 。
18．（2023高二下·吕梁期末） 已知金黄色葡萄球菌（Sau）的最适生长温度为37℃，并且具有高度的耐盐性，可以在10%-15%NaCl肉汤培养基中生长。A、B、C、D四种抗生素均可治疗金黄色葡萄球菌引起的肺炎，为选出最佳疗效的抗生素，研究者将分别含等剂量抗生素A、B、C、D的四张大小相同的滤纸片a、b、c、d置于Sau均匀分布的培养基上，在适宜条件下培养48h，结果如图。请回答下列问题：
（1）某同学欲培养金黄色葡萄球菌，应该如何操作 ，该培养基属于 培养基（从功能上考虑）。
（2）实验中一般采用 方法对培养基进行灭菌。在接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是 。图中微生物的接种方法最可能是 。
（3）据图分析， 治疗Sau感染引起的肺炎效果最好。判断依据是 。
19．（2024·邯郸）豆酱是我国特色传统调味品，如图为制作豆酱的工艺流程。其中，制曲是蒸熟的大豆自然晾凉后用牛皮纸包裹，毛霉等多种微生物在大豆表面大量繁殖的过程。发酵期间需要定期搅拌，30天后酱即成。回答下列问题：
（1）制作豆酱过程中，蒸熟操作一方面可以使其组织细胞软化，所含蛋白质能够适度变性，淀粉能够达到糊化的程度，另一方面还可以起到 作用，以免影响所需菌种的生长。
（2）在制曲的过程中，豆块上生长的毛霉会产生 ，使蛋白质分解为 和 ，从而产生酱类所特有的风味。
（3）发酵过程中，煮沸后的盐水需要冷却后才能加入到粉碎的酱料中，原因是 。
（4）在豆酱发酵过程中定期搅拌的目的是 (答出2点即可)。
20．（2024高三下·长春）泡菜是许多亚洲国家的传统食品，在发酵液中发现的微生物通常含有乳酸菌和酵母菌等。我国民间泡菜制作历史悠久，早在《齐名要术》中就有相关记载，清代《中馈录》中详细记载了泡菜的做法：“泡盐菜法，定要覆水坛。此坛有一外沿如暖帽式，四周内可盛水，坛口上覆一盖，浸于水中，使空气不得入内，则所泡之菜不得坏矣。泡菜之水，用花椒和盐煮沸……”。回答下列问题。
（1）泡菜制作将水坛坛盖浸于水中，使空气不得入内的原因是 。煮沸的盐水需 后，再倒进已装好干净蔬菜的坛中。
（2）正常发酵的初期，可听到泡菜坛发出“叮当”的声响，并看到气泡从坛沿的水槽中冒出，这些气泡中的气体主要由 菌产生。泡菜发酵过程中，除乳酸菌外，其它微生物在密封发酵2天后均大幅度减少的主要原因是 。
（3）为探究泡菜食用的最佳时间，某同学用质量分数为5%的食盐水制作泡菜，在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见下图。
由图可知，在发酵10天后食用泡菜比较合适，原因是 。
21．透明质酸(HA)又称玻尿酸，是一种具有高黏度氨基多糖，也是重要的医学材料和化妆品添加原料。枯草芽孢杆菌无透明质酸合成酶(HAS)，但含有 HA代谢的其它途径，而动物病原体链球菌含有HAS的基因(H基因)。研究者通过基因工程来改变枯草芽孢杆菌代谢通路，以实现枯草芽孢杆菌生产 HA。
（1）目的基因的获取和扩增：链球菌破碎后提取 DNA，经 酶切割获取H基因。PCR扩增目的基因，需要根据H基因 设计合适的引物，是由于 DNA 聚合酶发挥作用时需要引物参与形成 作为核苷酸缩合作用的起点；DNA 聚合酶在延伸子链时需要把核苷酸加到 端。
（2）表达载体的构建：下图为H基因与p质粒示意图，其中H基因以a链为转录模板链。为通过添加诱导剂来控制H基因的表达，研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒。为了使下图中酶切后的H基因按照正确的方向与p质粒连接，p质粒位点1和2所对应的酶分别是 。酶切后加入 酶催化重组质粒形成。
（3）表达载体的导入与筛选：将构建好的重组质粒转入经 处理的枯草芽孢杆菌，在含 的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
（4）菌种的扩大培养：配制 (填“液体”或“固体”)培养基，成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物，其中蛋白胨为微生物生长主要提供 ；调整 pH；灭菌；枯草芽孢杆菌 A 接种到摇瓶培养。
（5）大型发酵：进行现代工业发酵时，在发酵罐加入适宜的培养基外，还需严格控制 等发酵条件。经扩大培养的枯草芽孢杆菌A 接种 定时间后添加 ，诱导合成HA。HA 对枯草芽孢杆菌来说属于 (填“初生代谢产物”或“次生代谢产物”)。
（6）产品输出：发酵液中大部分为水，发酵产物浓度较低；发酵液中悬浮固形物主要是菌体和蛋白质的胶状物，故最后对发酵产物进行 ，获得所需产品。
答案解析部分
1．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】据图可知，该同学使用的接种方法是稀释涂布平板法，菌落均匀分布，但只出现在培养基的一边，推测可能是在使用涂布器的时候未将菌液涂布均匀。ABD不符合题意，C符合题意。
故答案为：C。
【分析】(1)欲筛选出能降解原油的菌株，培养基中应只含有原油而无其它碳源，不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。
(2)分离纯化菌种时，需采用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，使聚集在一起的细菌细胞分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便纯化菌种。
2．【答案】B
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、腌制过程中产酸的细菌主要是乳酸菌，利用的是乳酸菌的无氧呼吸，需要厌氧环境，其代谢类型为异养厌氧型，A正确；
BC、“清水过面”可以创造无氧环境，利于乳酸菌生存繁殖，同时减少杂菌污染，无需对鲜笋进行灭菌处理，B错误，C正确；
D、上一批次的发酵液含有乳酸菌，在制作酸笋时若加入上一批次的发酵液可加速发酵进程，D正确。
故答案为：B。
【分析】酸笋的制作使用的微生物是乳酸菌，代谢类型是异养厌氧型，在无氧条件下乳酸菌能够将蔬菜中的葡萄糖氧化为乳酸。
3．【答案】D
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；灭菌技术
【解析】【解答】A、经高压蒸汽灭菌的空白平板和接种后的平板均需要倒置，防止冷凝水对培养基造成污染，A不符合题意；
B、若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养，如果出现了菌落，则说明培养基制作不合格，被污染，B不符合题意；
C、根据题意“益生菌是一类食用后能在肠道内发挥调节功能的活菌”，看推测其代谢类型是厌氧型，因此培养箱中氧含量的变化会影响所培养的益生菌的繁殖和代谢，C不符合题意；
D、对益生菌计数时，可能会有两个或多个细菌形成一个菌落，所以稀释涂布平板法统计的数目会比实际值略小，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】（1）稀释涂布平板法：除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。值得注意的是，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（2）显微镜进行直接计数：该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
4．【答案】C
【知识点】微生物的分离和培养
【解析】【解答】分析题意，酶活力用每分钟转化1μmol尿酸所需要的酶量表示，故所需酶量越少，说明酶活力越大，可知菌落3的酶活力最高，可作为实验所需的目的菌，C正确，ABD错误。
故答案为：C。
【分析】微生物分离时，利用该分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使该微生物大量增殖，这些物质主要是一些特殊的碳源、氮源，如纤维素可用来富集纤维素分解微生物，尿素可用来富集尿素分解微生物。
【答案】5．B
6．C
【知识点】微生物的分离和培养；灭菌技术
【解析】【解答】1、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
2、实验室常用的灭菌方法：
（1）灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰燃烧来灭菌。
（2）干热灭菌：能耐高温的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。
（3）高压蒸汽灭菌：将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100kPa，温度为121℃的条件下，维持15～30min。
5．A、培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性， ①中应配置酸性的培养基，A错误；
B、 分离青霉菌突变菌种应该用稀释涂布平板法，即③中分离菌种应用稀释涂布平板法，B正确；
C、先进行诱变育种，再进行分离、纯化处理， 故步骤②、③的顺序不应该调换，C错误；
D、 青霉素生产菌不需要用酚红的培养基进行鉴定，D错误。
故答案为：B。
6．A、为了避免杂菌污染， ①中调节pH值需在灭菌之前进行，A错误；
B、实验结束时可用高温蒸汽的方法对④中残余的培养基彻底灭菌，B错误；
C、 G6玻璃砂漏斗的孔径最小，细菌不能滤过，⑤过程培养基中添加葡萄糖可用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，C正确；
D、 由于杂菌能分泌青霉素酶，从而分解青霉素，为防止杂菌生长，故发酵罐需要严格灭菌，D错误。
故答案为：C。
7．【答案】A
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、嗜盐单胞菌可利用海水合成PHA，不能用含PHA的选择培养基筛选嗜盐单胞菌，A错误；
B、高盐、高pH的发酵液使杂菌因失水过多或蛋白质变性而死亡，故可抑制杂菌生长，B正确；
C、培养液上清可以循环利用，可避免物质和能量的浪费，有利于节约物质和能量，C正确；
D、嗜盐单胞菌可利用海水合成PHA，在细胞内形成由膜包裹的不溶性颗粒，因此发酵完成后收集沉淀的菌体以得到PHA，D正确。
故答案为：A。
【分析】发酵工程的基本操作过程为： （1）菌种的选育：从自然界中筛选，也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。 （2）扩大培养：发酵之前需对菌种进行扩大培养。 （3）培养基的配制：在菌种确定后，要选择原料制备培养基，培养基的配方须经反复试验才能确定。 （4）灭菌：培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。 （5）接种：对发酵过程进行监控和控制，还可以进行反馈控制。 （6）发酵过程：这是发酵工程的中心环节，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等，以了解发酵进程。还要及时添加需要的营养组分，要严格控制温度、pH和溶解氧等发酵条件。 （7）产品的分离提纯：如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥。若产品是代谢物，可采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。
8．【答案】D
【知识点】微生物发酵及其应用
【解析】【解答】A、米曲霉能够分泌蛋白酶，能够将黄豆酱中的蛋白质分解成氨基酸，而食盐一方面可以抑制杂菌生长，避免黄豆酱腐败变质，另一方面可以调味，故①和④对黄豆酱风味的形成起重要作用，利于提升品质，A不符合题意；
B、米曲霉是好氧菌，且能够分泌蛋白酶将黄豆酱中的蛋白质分解，故②和⑥可以促使微生物和物料充分混合，提高发酵效率，B不符合题意；
C、米曲霉是好氧菌，而酵母菌也可以进行有氧呼吸，故③有利于米曲霉和酵母菌进行有氧呼吸并快速大量增殖，C不符合题意；
D、乳酸菌属于厌氧菌，米曲霉是好氧菌，故⑤中米曲霉主要集中于发酵坛上部，而乳酸菌集中于下部，D符合题意。
故答案为：D。
【分析】米曲霉是真菌的一种，米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶(如蛋白酶和脂肪酶)中能将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分。
9．【答案】A
【知识点】测定某种微生物的数量
【解析】【解答】A、题中信息没有提到对清洗液如何进行稀释，只给了培养后的菌落数，因此无法推测出稀释倍数，A符合题意；
B、稀释涂布平板法得到的稀释菌落中会存在两个或者多个细菌粘合在一起的情况，在读数时往往产生误差，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，B不符合题意；
C、表格中，半封闭式养殖模式下的菌落数明显多于全封闭式养殖模式，可知鸡蛋表面的细菌主要来自环境，C不符合题意；
D、表格中，在两种模式下，冬季的菌落数均高于夏季，故冬季鸡舍更需要消毒来减少鸡蛋表面的细菌污染，D不符合题意。
故答案为：A。
【分析】稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散敏肢开，但实际操作中往往会出现菌落粘合在一起的情况，菌落数比实际数略少。
10．【答案】（1）防治效果持久，且对环境无污染（答出“不污染环境”即可得分）
（2）稀释涂布平板法；45；菌落
（3）1.7×106
（4）实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小）
（5）选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况
【知识点】微生物的分离和培养；测定某种微生物的数量；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）生物防治与化学防治相比，生物物防治具有防治效果持久，且对环境无污染等的优势。
故填： 防治效果持久，且对环境无污染 。
（2） 上图所示分离筛选细菌的方法是稀释涂布平板法，取土样5g应加入45mL的无菌水， 可得到10倍的土壤悬液。不同种类的细菌形成的菌落不同，根据培养基上的菌落特征鉴别出芽孢杆菌并进一步纯化，即可获得若干种纯化的芽孢杆菌。
故填：稀释涂布平板法；45；菌落。
（3）若10 稀释倍数下的三个平板菌落数分别为165、179、166，则每克土壤中含相关微生物数目为=（C÷V）×M=（165+179+166）÷3÷0.1×103=1.7×106。
故填：1.7×106。
（4）土壤中分离筛选出的芽孢杆菌能抑制真菌X，在上图A处均接种等量真菌X，如果实验组A菌落直径最小，说明目的菌株抑菌效果最佳，因此判断目的菌株抑菌效果最佳的依据是实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小） 。
故填： 实验组A菌落直径最小（或实验组与对照组的A菌落的直径之比最小） 。
（5）为进一步检测芽孢杆菌的抑菌效果，某同学选用健康果树枝条进行测定， 选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况 。
故填： 选取健康果树枝条均分为甲、乙两组，甲组枝条上涂抹适量的目的菌菌液，乙组枝条上涂抹等量的无菌水，两组均接种等量的真菌X，一段时间后观察枝条的生长状况 。
【分析】间接计数法（活菌计数法）：
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作：a、设置重复组，增强实验的说服力与准确性；b、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
11．【答案】（1）蒽；蛋白质、核酸
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色；界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸；变性
（3）菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；DNA的粗提取和鉴定；培养基概述及其分类
【解析】【解答】 （1）蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，菌株A和B能够降解蒽，因此蒽为细菌生长提供碳源，生物大分子蛋白质、核酸的组成元素中含有N，因此该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成蛋白质、核酸等生物大分子。
故填：蒽、 蛋白质、核酸。
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色，所以DNA可以采用二苯胺试剂鉴定。在PCR中，引物能为DNA聚合酶提供结合位点，能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，即在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是变性。
故填：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 、 界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 、变性。
（3）由表格内容可知：菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，有可能是因为菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
故填：菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
【分析】PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
12．【答案】（1）氮源和无机盐；只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖
（2）接种环灼烧以后未冷却进行划线的区域没有菌落
（3）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质；不合理，缺少空白对照
（4）目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株 是否可以大量繁殖等（只要写出一条）
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类
【解析】【解答】（1）培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，选择培养基只允许特定种类的微生物生长，又要抑制或阻止其他种类微生物生长，因此为筛选出分离降解苯磺隆的菌株，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖。
故填：氮源和无机盐、只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长和繁殖。
（2）在用平板划线法进行接种时，接种环灼烧后未冷却会烫死上次划线末端菌株，造成划线上没有菌株。
故填：接种环灼烧以后未冷却进行划线的区域没有菌落。
（3）由图可知，上清液中加入蛋白酶溶液是用于水解上清液中的某蛋白质的，由此可判定实验假设是目的菌株通过分泌某种蛋白质来降解苯磺隆，但由于没有设置不加入蛋白酶的对照组实验，因此该实验设计没有说服力，不合理。
故填：目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 、不合理，缺少空白对照。
（4）将目的菌种用于环境保护实践时，需要考虑目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株是否可以大量繁殖等。
故填：目的菌株是否会产生对环境有害的代谢物、降解以后是否会产生二次污染、目的菌株 是否可以大量繁殖等 。
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。
13．【答案】（1）B；C
（2）②
（3）②③
（4）②③
（5）③→①→②
（6）⑤→③→②→⑥→④
（7）凝乳酶是真核细胞合成的蛋白质，有内质网和高尔基体的加工过程（或其他真核细胞对蛋白质合成、加工的机制），而图10所用的受体细胞是大肠杆菌，未经过内质网和高尔基体的加工，所合成的凝乳酶空间结构可能不同，影响了酶的功能，导致活性减弱
（8）④→⑥→①→⑤→③
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；蛋白质工程；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】(1)将目的基因插入载体质粒后，要想目的基因得到成功表达，还需要在目的基因前插入启动子，在目的基因后插入终止子，此外为了便于筛选出含有目的基因的受体细胞，还要求运载体上有标记基因。因此，作为载体应具备的结构有启动子、终止子、标记基因等。故选BC。
(2)PCR(聚合酶链式反应)技术是一项体外扩增DNA的技术，故若两端的序列已知，可用聚合酶链式反应扩增DNA。故选②。
（3）引物需要与模板的3'端结合，故要成功扩增出凝乳酶基因，所设计的引物应结合在图中的②③位置。
（4）据图可知，HindIII会破坏目的基因，故不能选择，且为避免反向连接和自身环化，通常需要选择两种限制酶进行切割，故可选择EcoRI和BamHI。故选②③。
(5)采用划线接种时，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后，就可以得到单菌落，据此分析图示可知：划线的顺序依次是③→①→②。
(6)培养基的配置过程为：⑤称量 →③溶解 →②调整pH→⑥分装→④倒平板。
(7)分析题意可知，通过图A过程获得的凝乳酶活性较低，原因是：凝乳酶是真核细胞合成的蛋白质，有内质网和高尔基体的加工过程(或其他真核细胞对蛋白质合成、加工的机制)，而图所用的受体细胞是大肠杆菌，未经过内质网和高尔基体的加工，所合成的凝乳酶空间结构可能不同，影响了酶的功能，导致活性减弱。
(8)蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)，其前提是基因工程，故运用蛋白质工程技术从大肠杆菌中获得活性更强的凝乳酶，具体过程为：④改变凝乳酶基因的特定序列→⑥将改变后的凝乳酶基因与质粒重组→①重组DNA分子导入大肠杆菌→⑤培养细胞后提纯突变蛋白→③对突变蛋白进行结构和功能分析。
【分析】1、基因工程技术的基本步骤︰（1）目的基因的获取︰方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建︰是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。启动子的本质是DNA片段，其为RNA聚合酶识别和结合的位点。( 3 )将目的基因导入受体细胞∶根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定∶分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定︰抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
3、分泌蛋白合成与分泌过程：核糖体合成蛋白质→内质网进行粗加工→内质网“出芽“形成囊泡→高尔基体进行再加工形成成熟的蛋白质→高尔基体“出芽“形成囊泡→细胞膜，整个过程还需要线粒体提供能量。
4、“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
5、 蛋白质工程的实质是：改造基因。蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列；进行基因修饰或基因合成；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成问题。因此，蛋白质工程生产合成的蛋白质是自然界中不存在的新型蛋白质分子。
14．【答案】（1）油污土壤或水体中分解脂肪的微生物数量较多
（2）脂肪
（3）稀释涂布平板；判断选择培养基是否具有选择作用；未接种的选择培养基；对照组培养基中未出现菌落
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】（1）微生物生活需要一定的环境条件，产脂肪酶的微生物大多生活在富含油脂的环境中，由于油污土壤或水体中产脂肪酶的微生物数量较多，故筛选产脂肪酶的微生物，应主要从油污土壤或水体中寻找。
（2）欲筛选某种微生物，需要人为提供有利于目的菌的生长条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。为确保能够分离得到产脂肪酶的微生物，配制培养基时应选择以脂肪(油脂)为唯一碳源。
（3）纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法；平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。可见，需要对分解脂肪的微生物进行分离和计数，可采用稀释涂布平板法接种。由接种的牛肉膏蛋白胨培养基上应出现的现象(对照组培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数)可推知，接种的牛肉膏蛋白胨培养基所起的作用是：判断选择培养基是否具有选择作用。若要判断选择培养基是否被污染，则需要将未接种的选择培养基培养一段时间，观察菌落的有无，若对照组培养基中未出现菌落，则说明培养培养基没有被杂菌污染。
【分析】（1）培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。选择培养基作用的原理是在培养基中加入某一化学物质或改变某一理化性质，使某种微生物正常生长，而其他微生物则被杀灭或生长受到抑制，从而选出所需要的微生物。
（2）微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落；②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
15．【答案】（1）基因突变；前
（2）抑菌圈的直径（或抑菌圈的大小）；耐药性
（3）抑菌圈直径逐渐变小；（随着细菌培养代数的增加）逐渐增强；碳青霉烯类抗生素对大肠杆菌起到（定向）选择的作用（或“碳青霉烯类抗生素的使用，使耐药菌生存和繁殖的机会增加，耐药性基因频率升高”）
（4）及时更换抗生素类药物（将细菌耐药率控制在较低水平）
【知识点】基因突变的类型；培养基对微生物的选择作用
【解析】【解答】(1)大肠杆菌是原核生物，耐药性变异一般来源于基因突变，无基因重组和染色体变异。变异在前，抗生素的选择作用在后。
(2)本实验目的是探究抗生素对细菌的选择作用，抗生素能抑制细菌的生长，可根据抑菌圈的大小判定碳青霉烯类抗生素的选择作用，抑菌圈越大，说明选择作用越强。在抑菌圈边缘可能有突变后产生耐药性的菌株，所以从抑菌圈边缘菌落挑取细菌，可能获得目的菌株。
(3)由表可知，随着实验代数的增加，抑菌圈逐渐减小，说明细胞的耐药性逐渐增强。由于碳青霉烯类抗生素对大肠杆菌起到选择的作用，所以随着培养代数的增加，耐药性会逐渐增强。
(4)由题意可知，换其他抗生素后，细菌的耐药性降低，说明及时更换抗生素类药物有利于防止超级细菌的出现，可将细菌的耐药性控制在较低水平。
【分析】1、基因突变：
（1）概念：指基因中碱基对的增添、缺失或替换。
（2）时间：突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期。
（3）基因突变的类型：自发突变和人工诱变。
（4）基因突变的特点：①基因突变具有普遍性：生物界中普遍存在；②低频性：自然情况下突变频率很低；③随机性：个体发育的任何时期和部位；④不定向性：突变是不定向的；⑤多害少利性：多数对生物有害。
（5）基因突变是点突变，在光学显微镜下观察不到，在染色体变异在显微镜下可以观察到。
（6）基因突变的意义：基因突变是新基因产生的途径；基因突变能为生物进化提供原材料；基因突变是生物变异的根本来源。
2、微生物常见的接种的方法①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
16．【答案】（1）TaqDNA聚合酶或耐高温的DNA聚合酶或DNA聚合酶；3’
（2）自身环化或反向连接；Ca2+；维持稳定存在并表达
（3）红霉素；稀释涂布平板法
【知识点】微生物的分离和培养；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）用PCR扩增DNA，首先要制备2种引物，以便为热稳定DNA聚合（或Taq）酶提供结合位点，并从引物的3’端开始拼接单个的脱氧核苷酸。
（2）同种限制酶切割目的基因，目的基因两端的产生的黏性末端是相同的，可能出现自身环化现象以及目的基因和质粒反向连接，因此研究者使用不同的限制酶切割目的基因能有效防止酶切产物自身环化或反向连接。转化是将构建的重组质粒2与用Ca2+处理的受体细菌混合，从而将目的基因导入受体细菌，且在受体细菌内维持稳定与表达。
（3）重组质粒抗性基因是红霉素基因，故在培养基中加入红霉素可将含有目的基因的细胞筛选出来。图中将受体细菌的菌液接种到平板上用稀释涂布平板法。
【分析】1、基因工程的操作程序： （1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。 （3）将目的基因导入受体细胞——农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
2、微生物常见的接种的方法： （1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种、划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。 （2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
17．【答案】（1）水、无机盐；氮源
（2）引物B和引物C
（3）BclI和HindIII；BamHI会破坏四环素抗性基因（和氨苄青霉素抗性基因），Sau3AI不能切割Ti质粒；防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接
（4）将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量（或测定两组水稻根系吸收NO3-的速率）
【知识点】PCR技术的基本操作和应用；培养基概述及其分类；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1） 固氮蓝细菌能独立固氮，且能进行光合作用，因此该培养基所需的营养物质有无机碳源、水、无机盐，不需要添加氮源，并在有光条件下培养。
故填： 水、无机盐、氮源。
（2）PCR技术，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的，故利用PCR技术以图2中的DNA片段为模板扩增B基因时，需要的引物有引物B和引物C。
故填： 引物B和引物C。
（3）限制酶BamHⅠ会破坏四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，限制酶Sau3AⅠ不能切割Ti质粒，在构建含B基因的表达载体时，需要用限制酶BclⅠ和HindⅢ切割Ti质粒和B基因。与单酶切相比，双酶切可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接，故一般选择双酶切。
故填： BclI和HindIII、BamHI会破坏四环素抗性基因（和氨苄青霉素抗性基因），Sau3AI不能切割Ti质粒、防止质粒和目的基因的自身环化及质粒和目的基因的反向连接。
（4）蓝细菌中B基因表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO3-的载体蛋白，如果转基因水稻中含有了B基因，且成功表达后，能高效吸收NO3-，因而与普通水稻相比，在相同条件下，其培养液中的NO3-浓度要低，故为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，在个体水平上检测的实验思路为：将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量，如果转基因水稻的培养液中NO3-剩余较少，则可说明转基因水稻培育成功。
故填： 将等量的生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量（或测定两组水稻根系吸收NO3-的速率） 。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
18．【答案】（1）配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天；选择
（2）高压蒸汽灭菌；检验培养基灭菌是否合格；稀释涂布平板法
（3）抗生素A；抗生素A的抑菌圈最大
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；培养基概述及其分类；灭菌技术
【解析】【解答】（1） 由题意“ 已知金黄色葡萄球菌（Sau）的最适生长温度为37℃，并且具有高度的耐盐性，可以在10%-15%NaCl肉汤培养基中生长 ”可知，为培养大量的金黄色葡萄球菌，需配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天；从功能上讲，该培养基属于选择培养基。
故填： 配制含15%NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基，在无菌条件下接种金黄色葡萄球菌，在37℃恒温箱中培养1-2天、选择。
（2）实验中一般采用高压蒸汽灭菌的方法对培养基进行灭菌；接种前，随机选取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是检验培养基灭菌是否合格。图中菌落分布相对均匀，接种方法最可能是稀释涂布平板法。
故填： 高压蒸汽灭菌、检验培养基灭菌是否合格、稀释涂布平板法。
（3）根据抑菌圈的大小，含等剂量抗生素接种到培养基上，抗生素A的抑菌圈最大，因此，其治疗Sau感染引起的肺炎效果最好。
故填： 抗生素A、抗生素A的抑菌圈最大 。
【分析】 1、选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，以抵制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
2、 微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
19．【答案】（1）灭菌(杀灭杂菌)
（2）蛋白酶；小分子肽；氨基酸
（3）防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活
（4）加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等
【知识点】腐乳的制作；灭菌技术
【解析】【解答】（1） 制作豆酱过程中， 加入的大豆经蒸熟、冷却后使用，这样既可以使淀粉能够达到糊化的程度，又可以起到灭菌的作用。
故填： 灭菌(杀灭杂菌)。
（2）在制曲的过程中，豆块上生长的毛霉会产生蛋白酶，蛋白酶使蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
故填： 蛋白酶、小分子肽、氨基酸。
（3）煮沸后的盐水需要冷却后才能加入到粉碎的酱料中，这样可以防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活。
故填： 防止高温杀死微生物或防止微生物产生的各种酶失活。
（4） 在豆酱发酵过程中，定期搅拌可以加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等。
故填： 加快散热，防止温度过高影响菌种生长和各种酶发挥作用；增加氧气含量，有利于菌种生长繁殖；有利于菌种、酶与营养物质接触等 。
【分析】参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，其新陈代谢类型是异养需氧型。腐乳制作的原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
20．【答案】（1）为乳酸菌无氧呼吸创造无氧条件；冷却
（2）酵母；酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存
（3）此时亚硝盐含量已经降低到较低水平
【知识点】泡菜的制作；亚硝酸盐含量的测定
【解析】【解答】（1）由于泡菜利用的是乳酸菌的无氧呼吸，发酵时必须在无氧环境下进行，因此 泡菜制作将水坛坛盖浸于水中 。煮沸的盐水直接使用会导致菌种被烫死，因此需要冷却后才倒入 已装好干净蔬菜的坛中。
故填： 为乳酸菌无氧呼吸创造无氧条件 ；冷却
（2）泡菜发酵初期能听到声响并且看到气泡从水槽冒出，是因为泡菜坛中有部分空气，酵母菌进行呼吸作用产生了CO2。随着泡菜发酵的持续进行，坛中空气耗尽，乳酸菌进行乳酸发酵，使乳酸含量逐渐上升，发酵液的pH下降，这种 酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存 ，因此其他微生物大幅度减少。
故填： 酵母 ； 酸性、缺氧的条件不利于其他微生物生存
（3）亚硝酸盐在一定条件下可转变为致癌的亚硝胺，对人体有害。分析图可知，泡菜发酵过程中，第5天亚硝酸盐含量最高，之后逐渐下降，在发酵10天后亚硝盐含量已经降低到较低水平，适宜食用。
故填：此时亚硝盐含量已经降低到较低水平
【分析】泡菜的制作原理是，乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸，反应式为：
C6H12O62C3H6O3+能量。
21．【答案】（1）限制性内切核酸/限制；两端的已知序列；一小段双链 DNA；3′
（2）Xho 酶和 Bsal 酶；DNA 连接酶
（3）CaCl2/Ca 2+；四环素
（4）液体；氮源、生长因子/氮源、碳源、维生素
（5）温度、pH、溶解氧；木糖；次生代谢产物
（6）分离、提纯
【知识点】微生物的分离和培养；微生物发酵及其应用；基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）；基因工程的基本操作程序
【解析】【解答】（1）、第1空、限制性内切核酸/限制；第2空、两端的已知序列；第3空、一小段双链 DNA；第4空、3′。用限制性内切核酸酶或限制酶切割DNA就可以获取目的基因H。PCR扩增目的基因，需要根据H基因设计合适的引物，是由于DNA聚合酶发挥作用时需要引物参与形成两端的已知序列作为核苷酸缩合作用的起点；DNA聚合酶在延伸子链时需要一小段双链DNA把核苷酸加到3'端。
（2）、第1空、Xho 酶和 Bsal 酶；第2空、DNA 连接酶。透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中p质粒位点1和2所对应的酶分别是Xho酶和Bsal酶。DNA连接酶连接的是DNA片段，因此，酶切后加入DNA连接酶催化重组质粒形成。
（3）、第1空、CaCl2/Ca2+；第2空、四环素。将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法（钙离子处理法），故需要将构建好的重组质粒转入经CaCl2或Ca2+处理的枯草芽孢杆菌；结合图示可知，该质粒上含有四环素抗性基因，属于标记基因，故可在含四环素的培养基上筛选，得到枯草芽孢杆菌A。
（4）、第1空、液体；第2空、氮源、生长因子/氮源、碳源、维生素。菌种的扩大培养是在液体培养基中进行的，故需要配制液体培养基，成分有水、无机盐、蛋白胨和酵母提取物；蛋白胨含有C、H、O、N等物质，为微生物生长主要提供氮源、碳源、维生素等；调整pH；灭菌；枯草芽孢杆菌A接种到摇瓶培养。
（5）、第1空、温度、pH、溶解氧；第2空、木糖；第3空、次生代谢产物。现代工业发酵时，在发酵罐加入适宜的培养基外，还需严格控制温度、pH、溶解氧等发酵条件；经扩大培养的枯草芽孢杆菌A接种定时间后添加木糖，诱导合成HA；植物代谢产生的一些一般认为不是植物基本生命活动所必需的产物。分析题意，HA是是一种具有高黏度氨基多糖，HA对枯草芽孢杆菌来说属于次生代谢产物。
（6）、 第1空、分离、提纯 。产品输出时需要对发酵产物进行分离、提纯，获得所需产品。
【分析】DNA连接酶和DNA聚合酶是两种不同的酶，主要的区别就在于它们的底物是不一样的，DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，但是DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术；将目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法。
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