2024年高考生物学二轮复习17：基因工程和蛋白质工程
一、选择题
1．（2023·新课标卷）某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E coli DNA连接酶连接
2．（2023·江苏）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
3．（2023·天津）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1需要MII期去核卵母细胞
C．过程2可以大幅改良动物性状
D．过程2为过程3提供了量产方式，过程3为过程1、2提供了改良性状的方式
4．（2023·湖南）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
5．（2023高三下·海淀模拟）为利用链霉菌生产药物A，研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是（ ）
A．导入成功的链霉菌细胞内可能发生基因重组
B．诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变
C．卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量
D．生产药物A最适合选用培养基b上的菌株
6．（2023·朝阳模拟）下列生物学实验中，对材料的选择不合理的是（ ）
A．物质鉴定一般选择本身无色或色浅的材料
B．DNA粗提取需选择猪血等DNA含量高的材料
C．可选择植物花药观察减数分裂各时期的图像
D．选择胚胎或幼龄动物组织进行动物细胞培养
7．（2023高三下·海淀模拟）科研人员从四川卧龙自然保护区采集到的大熊猫粪便中提取DNA，通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，进而统计大熊猫种群密度。下列叙述不正确的是（ ）
A．野生大熊猫种群密度调查不适合用标记重捕法
B．PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异
C．大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA
D．不同粪便样本的PCR扩增结果一定存在明显差异
8．（2023·顺义模拟）下列生物学实验的相关操作，叙述正确的是（ ）
A．二苯胺鉴定DNA粗提物——借助显微镜观察实验结果
B．培养液中酵母菌种群数量变化——先向计数室滴加培养液再盖好盖玻片
C．探究pH对H2O2酶的影响——先向酶溶液中加不同pH的缓冲液再加底物
D．模拟生物体维持pH的稳定——滴加酸碱前无需测试溶液的起始pH
9．（2020·海淀模拟）某新型病毒是一种RNA病毒，医务工作者利用PCR技术进行病毒检测时，所使用的方法中合理的是（ ）
A．用细菌培养基直接培养被测试者体内获取的病毒样本
B．分析该病毒的RNA序列是设计PCR引物的前提条件
C．PCR扩增过程需使用RNA聚合酶和耐高温DNA聚合酶
D．在恒温条件下进行PCR扩增避免温度变化导致酶失活
10．（2020·海淀模拟）在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是（ ）
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
二、非选择题
11．（2023·全国乙卷）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
12．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用____。
A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’
（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有____。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
13．（2023·海南）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。
14．（2023·天津）某植物四号染色体上面的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A基因缺失3个和25个碱基对产生的基因，已知前者不影响植酸合成，后者效果未知。
（1）现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是 基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，原因是 ，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为 的植物，比例为 。
（2）将一个A基因导入基因型为A3-A25-的植物的6号染色体，构成基因型为A3-A25- A的植物、该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是 。
（3）在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A的植物，若该种植物严格自交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小数）：
代 亲代 子一代 子二代
A基因频率 50% % 46.9%
A3-基因频率 50% % 53.1%
基因频率改变，是 的结果。
15．（2023·天津）基因工程：制备新型酵母菌
（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
（2）同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导大。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C'序列，以便对UGA基因进行切除。C．C'的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
（4）综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
16．（2023·北京）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
（1）我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是 。
（2）科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为 条。
（3）油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大规模种植成为可能。品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，由此可大量繁殖A。
在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来提高种子S的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1生产种子S的育种流程见图丙。
①图丙中，A植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1杂交，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为 。
②为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，简单易行的田间操作用 。
17．（2023·北京）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
（1）EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 （用字母表示）互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。
（3）为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；
②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；
③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；
④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。
请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
（4）各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
18．（2023·湖南）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
（1）此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是 。
（2）此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
19．（2023高三下·海淀模拟）自然界中的光强常在短时间内剧烈变化，影响植物的光合作用效率。科研人员对拟南芥的叶绿体响应光强变化的机理进行了探究。
（1）类囊体膜上的蛋白复合物PSI催化水在光下分解，变化的光强会影响这一过程，从而影响光反应产生 ，最终影响暗反应过程有机物的合成。
（2）PSII复合物的主要部分延伸到类囊体腔中，科研人员推测类囊体腔中的蛋白参与PSⅡ的组装。为此，利用农杆菌转化拟南芥，由于农杆菌的 会随机整合到拟南芥的核基因组中，因而可得到类囊体腔内蛋白基因发生突变的突变体。
（3）科研人员在所得突变体中观察到，B基因突变体无法编码类囊体腔内的蛋白B，该突变体表现为缺乏PSⅡ复合物。科研人员进行实验，处理及结果如图。
实验结果
a组 b组 c组 d组
B基因突变体 ++ + ++ +++
野生型 ++ ++ ++ ++
注：“+” 数量多代表生长状况好。
①据图分析，本实验的自变量是 。
②依据实验结果推测，PSII复合物的功能是 对变化光强的适应。
（4）进一步将b组植株的叶肉细胞置于电镜下观察，结果如图。
基于本实验结果推断，B基因参与PSII复合物的组装，PSII复合物帮助植物适应变化的光强。请对观察结果能否证实该推断作出判断，并阐明理由 。
20．（2023·朝阳模拟）儿童癫痫是由大脑神经元异常放电所致的神经系统疾病，遗传因素是其重要病因。
（1）研究者对某儿童癫痫患者家系进行调查，结果如图1，据图可知该病为 遗传病。对患者和健康志愿者进行基因组测序，推测S基因为致病基因。
（2）核基因转录的前体RNA中内含子对应序列被识别并剪切，外显子对应序列拼接为成熟mRNA.对患者及父母的S基因测序后发现 ，推测S基因外显子4突变导致癫痫。为验证该推测，研究者分别设计如图2中的引物 扩增外显子1及外显子1-内含子1交界处，并对其他外显子及外显子-内含子交界处扩增、测序（除外显子4外），发现患者及父母的测序结果相同。对外显子-内含子交界处进行测序的原因是该部位 。
（3）研究者利用基因工程技术将人突变S基因外显子4替换小鼠正常S基因外显子4，并利用标记基因N筛选出成功替换的小鼠胚胎干细胞，进而培育出杂合转基因小鼠甲。为进一步得到去除N基因的纯合突变鼠，可利用转Flp基因小鼠（Flp酶可识别并敲除同一条DNA两个FRT序列间的序列）与甲杂交。
①从以下选项中选出正确的重组质粒以获得小鼠甲 。
A. B.
C. D.
②在图中补充培育纯合突变鼠的杂交流程：
（4）出生两周的幼鼠乙可在尖锐嘈杂声的刺激下诱发癫痫。进一步研究表明S基因突变增强了脑内兴奋性突触的活性。S基因表达产物是一种膜蛋白，参与调节细胞内囊泡膜与细胞膜的融合。推测S基因突变导致 ，引发了癫痫。
答案解析部分
1．【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由图可知，酶3切割产生平末端，用E.coliDNA连接酶连接只能连接粘性末端，A错误；
B、质粒用酶3切割产生平末端，目的基因用酶1切割产生粘性末端，末端不同不能用T4 DNA连接酶连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割二者产生的粘性末端不同，既保证质粒和目的基因两侧产生相同的黏性末端，用T4DNA连接酶连接，也能防止目的基因和质粒自我连接，C正确；
D、质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，二者产生的粘性末端相同，质粒和目的基因产生相同的粘性末端，用E.coli DNA连接酶连接不能防止目的基因和质粒自我连接，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程的基本工具：
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸组成），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：
①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
a、相同点：都缝合磷酸二酯键。
b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．【答案】A
【知识点】检测还原糖的实验；观察细胞的有丝分裂；DNA的粗提取和鉴定；渗透作用
【解析】【解答】A、洋葱鳞片叶内表皮细胞具有原生质层，原生质层相当于一层半透膜，可用于探究膜的透性，A符合题意；
B、洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，且需要在50～65℃温水条件下反应产生砖红色沉淀，B不符合题意；
C、制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开，漂洗的目的是将解离液洗去，防止解离过度，C不符合题意；
D、粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后，需在水浴条件下才能显蓝色，D不符合题意。
故答案为：A。
【分析】观察植物根尖细胞有丝分裂制片流程
①解离：用解离液使组织中的细胞相互分离开来；
②漂洗：洗去解离液，防止解离过度；
③染色：用甲紫溶液或醋酸洋红液能使染色体着色；
④制片：用镊子将处理过的根尖放在载玻片上，加一滴清水，并用镊子尖将根尖弄碎，盖上盖玻片。然后，用拇指轻轻按压盖玻片，使细胞分散开来，有利于观察。
3．【答案】D
【知识点】基因工程的应用；动物细胞核移植技术；胚胎移植
【解析】【解答】A、胚胎移植过程中，受体动物只是为移植的胚提供良好的发育环境，与子代遗传性状基本没有影响，A错误；
B、过程1是培育试管动物，要进行体外受精过程，而体外受精选用的卵母细胞不需要去核，B错误；
C、过程2是培育克隆动物，要进行动物细胞核移植，属于无性繁殖，不能大幅改良动物性状，C错误；
D、过程2通过克隆可以短时间内培育多个保持亲本优良性状的个体，为过程3提供了量产方式；过程3转基因技术可以改造生物的性状，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。
2、移植胚胎的来源及生殖方式：
(1)核移植→ 无性繁殖
(2)体外受精 有性生殖
(3)体内受精→收集胚胎→移植→有性生殖
(4)基因工程→转入目的基因的受精卵 胚胎移植→转基因动物→有性生殖
4．【答案】B
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】A、由题图可知，AT1蛋白缺陷时，无法和Gβ结合，可以解除对PIP2s蛋白的磷酸化的抑制，PIP2s蛋白被磷酸化，外排H2O2增加，A正确；
B、由左图可知，AT1蛋白与Gβ结合后抑制PIP2s蛋白的磷酸化，H2O2外排量减少，导致抗氧化胁迫能力弱，细胞死亡，B错误；
C、敲除AT1基因或降低其表达，PIP2s蛋白被磷酸化，外排H2O2增加，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，提高成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，通过基因工程技术导入农作物中使其表达，可以改良农作物抗逆性，D正确。
故答案为：B。
【分析】由题图可知：AT1蛋白通过与Gβ结合抑制PIP2s蛋白的磷酸化，从而抑制细胞内H2O2外排量，导致植物抗氧化胁迫能力减弱，细胞死亡。当AT1蛋白缺陷时，可提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2的外排，提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
5．【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因），导入受体细胞中，目的基因会插入到受体细胞的基因组中，发生的可遗传变异类型为基因重组，A正确；
B、诱变处理所依据的原理是基因突变，基因突变是不定向的，所以诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变，B正确；
C、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）共用一个启动子，二者共表达，所以卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量，C正确；
D、诱变处理后将菌液稀释后涂布，在含不同浓度卡那霉素的培养基上各接种等量同一稀释度的培养液，应该选择含卡那霉素浓度最高的培养基上所长出的菌落，其生产药物A的能力也较强，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、基因重组的方式有同源染色体上非姐妹单体之间的交叉互换和非同源染色体上非等位基因之间的自由组合，另外，外源基因的导入也会引起基因重组。
2、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换。基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期。基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
6．【答案】B
【知识点】观察细胞的减数分裂实验；DNA的粗提取和鉴定；动物细胞培养技术
【解析】【解答】A、物质鉴定实验中，材料本身不能干扰实验结果，所以一般选择本身无色或色浅的材料，A正确；
B、猪成熟的红细胞没有DNA，B错误；
C、植物花药可以进行减数分裂的细胞多，故可以用来观察减数分裂各时期的图像，C正确；
D、动物细胞培养时，一般选择胚胎或分化程度低的细胞，如幼龄动物组织，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核。
2、DNA的粗提取： （1） 取待测大豆组织切碎，加研磨液充分研磨。 （2）过滤研磨液，将滤液放在4℃冰箱中放置几分钟后，取上清液。 （3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3分钟，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
7．【答案】D
【知识点】估算种群密度的方法；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、题意显示，野生大熊猫数量较少，且其体型较大，调查分布范围小、数量少、个体较大的种群的密度时，可采用逐个计数法，不适合用标记重捕法，A正确；
B、由于DNA分子具有特异性，因而可推测，PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异，B正确；
C、大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA，进而可通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，据此统计大熊猫种群密度，C正确；
D、由于大熊猫个体数量过少，即遗传多样性较低，因此，不同粪便样本的PCR扩增结果未必一定存在明显差异，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、种群密度的调查方法： （1）逐个计数法：分布范围小，个体较大的生物。 （2）黑灯诱捕法：趋光性昆虫。 （3）样方法：多数植物和活动范围小活动能力弱的动物。 （4）标志重捕法：活动范围大活动能力强的动物。
2、PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
8．【答案】C
【知识点】探究影响酶活性的因素；探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化；DNA的粗提取和鉴定；稳态的调节机制
【解析】【解答】A、二苯胺试剂鉴定DNA粗提物是将DNA溶于NaCl中加入二苯胺试剂沸水浴加热，该过程无需使用显微镜观察，A错误；
B、培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，应先盖好盖玻片，再向计数室滴加培养液，若先向计数室滴加培养液再盖好盖玻片则会导致实验数据偏大，B错误；
C、酶具有高效性，酶一旦与底物接触，反应就开始了，所以在探究pH对H2O2酶的影响的实验中，应先向酶溶液中加不同pH的缓冲液再加底物，C正确；
D、模拟生物体维持pH的稳定的实验中，在滴加酸碱前需测试溶液的起始pH，作为pH的起始对照，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、血细胞计数板计数时，应先放置盖玻片，在盖玻片的边缘滴加培养液，待培养液从边缘处自行渗入计数室，吸去多余培养液，再进行计数。如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释，以便于酵母菌的计数。
2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
9．【答案】B
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、病毒没有细胞结构，不能用培养基直接培养，A错误；
B、PCR进行的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，B正确；
C、RNA病毒的RNA通过PCR扩增需要先进行逆转录形成DNA，然后使用耐高温DNA聚合酶进行DNA复制，不需要使用RNA聚合酶，C错误；
D、根据上述分析可知，PCR扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程，而不是在恒温条件下进行的，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、病毒没有细胞结构，不能独立代谢，需要在宿主细胞内才能增殖。2、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA，四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
10．【答案】D
【知识点】基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；
B、由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；
C、由题知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；
D、限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
故答案为：D。
【分析】基因工程又称基因拼接技术或DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程的操作步骤：1.提取目的基因；2.目的基因与运载体结合；3.将目的基因导入受体细胞；4.目的基因的检测和表达
11．【答案】（1）含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
（2）终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【知识点】遗传信息的翻译；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因文库是指含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
故答案为：含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
（2）图中结构是基因表达载体，GFP突变基因是目的基因，目的基因位于启动子和终止子之间，所以初步确定①、②是启动子或者终止子。由于箭头指的是目的基因转录的方向，②位于目的基因的上游，①位于目的基因的下游，所以可判断①是终止子，②是启动子。启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
故答案为：终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
（3）由于密码子具有简并性，不同的密码子可能决定相同的氨基酸，所以GFP突变的基因转录出的mRNA与原来正常基因转录出的mRNA翻译出的蛋白质仍然可能是相同的。因此从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性。
故答案为：密码子具有简并性。
（4）题干信息指出要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，那么就需要将目的基因YFP插入到运载体上构建基因表达载体，再将其导入基因工程中常用的真核生物（如酵母菌）体内从而让目的基因在真核生物体内表达，因此实验思路是：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
故答案为：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
【分析】1、将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包含一种生物所有基因的文库，叫做基因组文库。包含一种生物的一部分基因的文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。
2、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
3、简并性：绝大多数氨基酸都有几个密码子的现象。意义：（1）当密码子中有一个碱基发生改变时，由于密码子的简并，可能并不会改变其对应的氨基酸。（2）当某种氨基酸使用频率高时，几种不同的密码子都编码一种氨基酸可保证翻译的效率。
12．【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物；延伸的时间和退火的温度
（2）B；C
（3）限制性核酸内切酶（限制酶）
（4）A；B；C
（5）P3、P4
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR反应体系中包括DNA模板，耐高温的DNA聚合酶、引物和四种脱氧核苷酸，引物是根据扩增的基因序列设计的，据此推测，分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物；扩增步骤包括变性、退火、延伸，扩增的DNA片段长度不同，则延伸设置的时间不同，所使用的引物不同，则退火的温度也可能不同，所以扩增程序中最主要的不同是延伸的时间和退火的温度。
（2）由图分析可知，引物F2-F与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧相同，所以引物F2-F对应的序列是C选项；同理，引物F1-R与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧互补，所以引物F1-R对应的序列是D选项。
故答案为：CD。
（3）传统重组质粒构建过程需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶，而题干中的过程使用的是重组酶，所以这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）当通过稀释涂布平板法接种后，对微生物进行计数时，需要控制每个平板30~300个菌落，但本实验的目的是筛选出转化成功的大肠杆菌，所以不用控制每个平板的菌落数，A符合题意；一般是先将培养基冷却后，再进行接种，所以抗性平板上未长出菌落的原因不可能是培养基温度太高所致，B符合题意；转化后的大肠杆菌采用含有抗生素的培养基筛选，只有转化成功的大肠杆菌才能在该培养基上生长，而未转化成功的大肠杆菌和其它杂菌无法生长，所以抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C符合题意；单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物，所以抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D不符合题意。
故答案为：ABC。
（5）由图可知，EGFP和AnB1的长度总和是720＋390＝1110bp，电泳结果显示，P1和P2片段长度接近该值，而P3没有条带，P4片段长度显著小于该值，所以可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，所以对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
【分析】一、PCR技术
1、PCR技术是体外扩增目的基因的技术，是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
2、条件
DNA母链：提供DNA复制的模板； 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）； 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸； 原料：四种脱氧核糖核苷酸。
二、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
三、 微生物的分离纯化一般可用平板划线法或稀释涂布平板法，其中平板划线法使用接种环等进行接种，不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法使用涂布器等进行接种，可用于微生物的计数，在样品稀释时，要保证计数用的平板中的菌落数落在30-300之间。
13．【答案】（1）脱分化；细胞分裂素；诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
（2）遗传特性；转基因标识
（3）Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
（4）荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根；观察幼苗是否表现出白化特征；PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
（5）操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【知识点】基因工程的应用；植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，生长素/细胞分裂素浓度＞1，则有利于生根，生长素/细胞分裂素浓度＜1，则有利于芽的分化，该过程还需要光照，其作用是诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
（2）含重组载体的农杆菌会侵染愈伤组织，将重组载体上的T-DNA上的基因导入愈伤组织细胞中，使愈伤组织的遗传特性发生改变，所以若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性；我国对农业转基因生物实行了标识制度，根据规定，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因标识。
（3）Ti质粒中的T-DNA是一种可转移的DNA，所以农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）由题意可知，CRISPR/Cas9基因编辑载体含有绿色荧光蛋白标记基因，所以从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根；由图2可知，该实验是从个体水平鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的，所以相应的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，依据是PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）通过图1和图2对比可知，与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】1、植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，并给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。整个过程包括外植体消毒、脱分化形成愈伤组织、愈伤组织再被诱导生根发芽，最终培育成完整植株。利用的生物学原理是植物细胞的全能性。
2、生长素/细胞分裂素=1，有利于愈伤组织的形成；生长素/细胞分裂素＞1，有利于根的形成；生长素/细胞分裂素＜1，有利于芽的形成。
3、脱分化过程不需要光照，而再分化过程需要光照，以利于叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
4、将目的基因导入植物细胞的方法一般是农杆菌转化法，利用的原理是农杆菌的Ti质粒中的T-DNA是一种可转移的DNA，农杆菌侵染植物细胞时，外源基因可通过Ti质粒中的T-DNA递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起，最终使目的基因在植物细胞中表达，使植物个体表现出相应的性状。
14．【答案】（1）等位；自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带；AA；1/3
（2）1/5
（3）48.8%；51.2%；自然选择
【知识点】基因的自由组合规律的实质及应用；基因频率的概念与变化；PCR技术的基本操作和应用；自然选择与适应
【解析】【解答】（1）因A25-基因是由A基因缺失25个碱基对产生的新基因，即A基因通过基因突变产生A25-基因，这两个基因是等位基因。基因型为AA25-的植物自交后代有AA、AA25-和A25-A25-三种基因型，其比例为1：2：1。进行PCR时，因正向引物与A25-缺失的碱基配对，缺失这25个碱基对的A25-基因无法与正向引物配对从而不能扩增，故只含有A25-基因的个体A25-A25-不具有条带；A基因含有该25个碱基对，能与正向引物和反向引物进行碱基互补配对从而扩增出条带，因此基因型为AA、AA25-的个体均具有条带，且A基因个数越多，扩增产物越多，条带越明亮，因此基因型为AA的个体具有较明亮的条带，基因型为AA25-的个条带较暗。由题意可知，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，说明基因型为A25-A25-的个体无法存活，只有基因型为AA和AA25-的个体，其中较明亮条带代表基因型为AA，占子代的比例为1/3。
故填：等位；自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带；AA；1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4号染色体上，导入的A基因存在于6号染色体上，A基因与 A3-和A25- 位于非同源染色体上，遵循基因自由组合定律，产生配子的基因组成为A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例为1：1：1：1；该植物自交后代中基因型为A25-A25-的个体占1/4×1/4=1/16，该基因型个体不能存活，因此存活个体占子代的15/16，其中含有A25-A25-的后代个体基因型共有2种，分别是AAA25-A25-和AA25-A25-，所占比例分别为1/16和2/16，二者共占3/16，因此基因型为A3-A25- A的植物自交子代中含有A25-A25-的比例为3/16÷15/16=1/5。
故填：1/5。
（3）基因型为A3-A的植物自交产生子一代的基因型及比例为AA：A3-A：A3-A3-=1：2：1。由题干信息可知，基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，则子一代中基因型为A3-A3-所占比例为1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中各基因型及其比例为AA：A3-A：A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10：20：11，由此可计算出子一代中各基因型频率分别是AA=10/（10+20+11）=10/41，A3-A=20/（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11/（10+20+11）=11/41，因此子一代中A基因频率为（10/41+1/2×20/41）×100％=48.8%，A3-基因频率为1-48.8%=51.2%。自然选择决定生物进化的方向，具有有利变异的个体更适应环境被选择下来，而具有不利变异的个体则会被自然选择淘汰，因此决定有利变异的基因频率逐渐增大，因此基因频率的改变是自然选择的结果。
故填：48.8%；51.2%；自然选择。
【分析】（1）基因突变：①基因突变概念：指基因中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因碱基序列的改变。②基因突变的结果：产生新基因。③基因突变的特点：普遍性、随机性、不定向性、低频性、多害少益性。④时期：一般发生在分裂间期。
（2）现代生物进化理论的主要内容：种群是生物进化的基本单位；突变和基因重组产生生物进化的原材料；自然选择决定生物进化的方向；隔离是新物种形成的必要条件。生物进化的实质在于种群基因频率的改变。
（3）基因自由组合定律是指位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的，在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
15．【答案】（1）细胞外
（2）P1和P6
（3）缺乏尿嘧啶；方式二；含有5-氟乳清酸
（4）图3
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）因为酵母菌不能吸收淀粉，所以导入多步分解淀粉所需的多种酶后这些酶生效的场所应该是在细胞外。
故填：细胞外。
（2）因为当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入，所以要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
故填： P1和P6。
（3）（i）因尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，所以将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果没有成功导入该基因，则酵母菌体内无尿嘧啶合成，酵母菌不能生存；如果导入成功，则酵母菌能正常生存和繁殖并形成菌落；方式一中C和C'方向相反，无法连接起来，方式二C和C'连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由题意可知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，因此在含有5-氟乳清酸的培养基上进行培养，如果对UGA基因进行切除时切割成功，则不含尿嘧啶，酵母菌能生存并形成菌落，如果切割不成功，则会产生对酵母菌有毒物质，不能形成菌落。
故填：缺乏尿嘧啶；方式二；含有5-氟乳清酸。
（4）因UGA基因要插入C和C'之间，目的基因插入A和B之间，所以图3正确。
故填：图3。
【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中基因表达载体的构建是核心步骤，基因表达载体要包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
16．【答案】（1）黄化叶
（2）用限制酶B处理；3
（3）50%；在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；杂交育种；诱变育种；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】（1）亲本野生型与黄花叶杂交后代都是野生型，且野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，因此黄化叶是隐性性状。
故填： 黄化叶。
（2）F2中野生型个体既有纯合子（用AA表示）又有杂合子（用Aa表示），故检测F2基因型的实验主要是检测是否含有导致新生叶黄化的基因a。因与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点，所以在PCR并回收扩增产物后要用限制酶B处理并用电泳分离。野生型基因无限制酶B切点，电泳结果为一条带，导致新生叶黄化的基因a含有限制酶B切点，电泳结果为两条带，故F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
故填：用限制酶B处理；3。
（3）①因黄化叶是隐性性状，基因型为aa，与A植株杂交得到绿叶雄性不育植株，基因型为Aa。A植株的绿叶雄性不育子代（Aa）与黄化A1（aa）杂交，则子代表现性及比例为绿叶：黄花叶=1：1，因此筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为50%。②在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。因此为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，应在开花前除去田间的绿叶植株。
故填：50%；在开花前把田间出现的绿叶植株除去。
【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。基因突变会产生新基因，新产生的基因与原基因为等位基因。基因突变有以下特点：普遍性、随机性、不定向性、低频性、多害少益性。
17．【答案】（1）A
（2）Q；R
（3）将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T
（4）大多数B细胞没有被BrdU标记
【知识点】基因工程的应用；DNA分子的复制；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，根据碱基互补配对原则T与A配对，因此掺入DNA的EdU和BrdU均能与A互补配对。
故填：A。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，则EdU会与腺嘌呤碱基互补配对，导致子链出现放射性。随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与腺嘌呤结合，使放射性增强，最终实现双标记，随DNA复制不断进行，双标记细胞占EdU标记细胞的百分比不断增大，且在DNA复制完成时达到最大值，因此图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
故填：Q；R。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要将L基因敲除。因Ce酶基因编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失，而纯合小鼠Lx的L基因两侧已插入特异DNA序列（x），因此需要将Ce酶基因和Er基因连接；而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，因此在筛选目标小鼠之后要饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）从而获得小鼠IK。
故填：将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T。
（4）变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况，此时已经经过途径Ⅱ的一个完整细胞周期，细胞应都含有BrdU标记；如果变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，该过程未完成一次细胞周期，故t2时间后用BrdU饲喂也无法被利用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
故填：大多数B细胞没有被BrdU标记。
【分析】DNA复制为半保留复制，以DNA的两条链为模版，四种脱氧核苷酸为原料，在解旋酶和DNA聚合酶的催化作用下，根据碱基互补配对原则合成两条新的子链，每个DNA分子各含一条亲代DNA分子的母链和一条新形成的子链。DNA分子复制时间：有丝分裂和减数分裂前的间期；过程：边解旋边复制；结果：一分子DNA复制出两分子相同的DNA。
18．【答案】（1）常染色体隐性遗传；1/32
（2）CCAGAT；305
（3）4
【知识点】基因的自由组合规律的实质及应用；基因突变的特点及意义；人类遗传病的类型及危害；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1与I-2均表现正常，关于甲病的基因组成均为+/-说明父母双方均携带突变基因，而他们的女儿Ⅱ-4患病，基因组成为-/-，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传；由I-1、I-2和Ⅱ-3关于乙病的基因组成可推出乙基因突变导致的胎儿神经管缺陷（NTDs）也是常染色体隐性遗传，所以I-1和I-2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
故填：常染色体隐性遗传；1/32。
（2）引物与模板DNA的3'端碱基互补，正常基因互补链的3'端的碱基序列为TAAGGTCTAG，且包含酶切位点，因此另一条引物为5'-CCAGAT-3'，由限制酶的识别序列和切割位点可知，Ⅱ-1的目的基因被切割后，酶切产物长度为2+293+10=305bp。
故填：CCAGAT；305。
（3）因Ⅲ-2的乙的基因型为-/-，胎儿有患神经管缺陷（NTDs）NTDs的可能，因此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为4mg·d-1。
故填：4。
【分析】利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA半保留复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
过程 说明
变性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
19．【答案】（1）ATP和NADPH
（2）T-DNA
（3）变化的光强；光强变化的规律性；缺乏PSⅡ复合物；提高
（4）不能证实。观察结果为，与野生型相比较B基因突变体的淀粉颗粒明显小而少；无法证实B蛋白参与PSⅡ复合物的组装，但支持PSⅡ复合物帮助适应变化的光强
【知识点】光合作用的过程和意义；影响光合作用的环境因素；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）光强变化影响类囊体上水的光解，从而影响其产物ATP和NADPH的生成。
（2）农杆菌转化法中Ti质粒的T-DNA（可转移的DNA）会随机整合到植物细胞中。
（3）由图可知，光照强度及其变化规律属于自变量；由表可知，B基因是否突变（是否缺乏PSⅡ复合物）为自变量。突变体表现为缺乏PSⅡ复合物，从而导致bcd三组生长状况变差，a组光强下无论突变生长状况均一致，说明PSⅡ复合物可提高植物对变化光强的适应。
（4）由图可知，观察结果为，与野生型相比较B基因突变体的淀粉颗粒明显小而少；无法证实B蛋白参与PSⅡ复合物的组装，但支持PSⅡ复合物帮助适应变化的光强。
【分析】1、光合作用：绿色植物通过叶绿体，利用光能把二氧化碳和水转变成储存着能量的有机物，并释放出氧气的过程。光合作用的光反应阶段（场所是叶绿体的类囊体膜上）：水的光解产生[H]与氧气，以及ATP的形成．光合作用的暗反应阶段（场所是叶绿体的基质中）：CO2被C5固定形成C3，C3在光反应提供的ATP和[H]的作用下还原生成糖类等有机物。
2、农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
20．【答案】（1）常染色体隐性
（2）患者S基因外显子4仅具突变序列，其父母既有突变序列也有正常序列；2(或3)和5、3和6；影响RNA正确加工
（3）B；
（4）S蛋白功能异常，对脑内兴奋性递质释放的抑制作用减弱，增强了兴奋性突触的活性
【知识点】人类遗传病的类型及危害；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据遗传规律“无中生有有为隐性，隐性遗传看女病，女病男正非伴性”可知，女患者的父亲正常，所以是常染色体隐性遗传病。
（2）S基因为致病基因，S基因外显子4突变导致癫痫，且该病为常染色体隐性遗传病，患者为隐性纯合子，其S基因外显子4仅具突变序列，其父母为杂合子，既有突变序列也有正常序列。DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链，因此，可以设计引物2(或3)和5、3和6扩增外显子1及外显子1-内含子1交界处。核基因转录的前体RNA中内含子对应序列被识别并剪切，外显子对应序列拼接为成熟mRNA，由于外显子-内含子交界处能影响RNA正确加工，故应对外显子-内含子交界处进行测序。
（3）①由题意可知：杂合转基因小鼠甲中“正常S基因外显子4”被“人突变S基因外显子4”替换，且需要删除标记基因N，标记基因N通过转Flp基因小鼠（Flp酶可识别并敲除同一条DNA两个FRT序列间的序列）进行去除，故重组区域为“人突变S基因外显子4”+N基因，由于N基因需要被敲除，故N基因位于两个FRT序列间，B正确。
故答案为：B。
②由①可知，杂合转基因小鼠甲与转Flp基因小鼠进行杂交，经过筛选可获得去除N基因且S基因Flp基因均杂合的小鼠，将该小鼠与野生型小鼠（不含Flp基因）进行杂交，获得去除N基因和Flp基因且S基因杂合的小鼠，最后将该雌雄小鼠进行交配，经过筛选后，可获得去除N基因和Flp基因且S基因纯合的突变鼠乙，其杂交流程如下：
（4）S基因突变可导致S蛋白功能异常，S基因表达产物是一种膜蛋白，参与调节细胞内囊泡膜与细胞膜的融合，S蛋白功能异常后对脑内兴奋性递质释放的抑制作用减弱，增强了兴奋性突触的活性，引发了癫痫。
【分析】遗传系谱图判断遗传的方式： （1）父病子全病——伴Y遗传。 （2）判断显隐性：无中生有为隐性，隐性遗传看女病，父子皆病为伴X，父子无病为常显。有中生无为显性，显性遗传看男病，母女皆病为伴X，母女无病为常显。 （3）不可判断显隐性：若连续遗传可能为显性。隔代遗传可能为隐性。若男女患者比例相当可能为常染色体遗传，患者男多于女或女多于男可能为伴性遗传。
1 / 12024年高考生物学二轮复习17：基因工程和蛋白质工程
一、选择题
1．（2023·新课标卷）某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E coli DNA连接酶连接
【答案】C
【知识点】基因工程的基本工具（详细）；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、由图可知，酶3切割产生平末端，用E.coliDNA连接酶连接只能连接粘性末端，A错误；
B、质粒用酶3切割产生平末端，目的基因用酶1切割产生粘性末端，末端不同不能用T4 DNA连接酶连接，B错误；
C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割二者产生的粘性末端不同，既保证质粒和目的基因两侧产生相同的黏性末端，用T4DNA连接酶连接，也能防止目的基因和质粒自我连接，C正确；
D、质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，二者产生的粘性末端相同，质粒和目的基因产生相同的粘性末端，用E.coli DNA连接酶连接不能防止目的基因和质粒自我连接，D错误。
故答案为：C。
【分析】基因工程的基本工具：
（1）“分子手术刀”-限制性核酸内切酶（限制酶）：
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸组成），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
（2）“分子缝合针”-DNA连接酶：
①两种DNA连接酶（E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
a、相同点：都缝合磷酸二酯键。
b、区别：E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率较低。
②与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
2．（2023·江苏）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
【答案】A
【知识点】检测还原糖的实验；观察细胞的有丝分裂；DNA的粗提取和鉴定；渗透作用
【解析】【解答】A、洋葱鳞片叶内表皮细胞具有原生质层，原生质层相当于一层半透膜，可用于探究膜的透性，A符合题意；
B、洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，且需要在50～65℃温水条件下反应产生砖红色沉淀，B不符合题意；
C、制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开，漂洗的目的是将解离液洗去，防止解离过度，C不符合题意；
D、粗提取的DNA溶于2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂后，需在水浴条件下才能显蓝色，D不符合题意。
故答案为：A。
【分析】观察植物根尖细胞有丝分裂制片流程
①解离：用解离液使组织中的细胞相互分离开来；
②漂洗：洗去解离液，防止解离过度；
③染色：用甲紫溶液或醋酸洋红液能使染色体着色；
④制片：用镊子将处理过的根尖放在载玻片上，加一滴清水，并用镊子尖将根尖弄碎，盖上盖玻片。然后，用拇指轻轻按压盖玻片，使细胞分散开来，有利于观察。
3．（2023·天津）根据下图，正确的是（ ）
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1需要MII期去核卵母细胞
C．过程2可以大幅改良动物性状
D．过程2为过程3提供了量产方式，过程3为过程1、2提供了改良性状的方式
【答案】D
【知识点】基因工程的应用；动物细胞核移植技术；胚胎移植
【解析】【解答】A、胚胎移植过程中，受体动物只是为移植的胚提供良好的发育环境，与子代遗传性状基本没有影响，A错误；
B、过程1是培育试管动物，要进行体外受精过程，而体外受精选用的卵母细胞不需要去核，B错误；
C、过程2是培育克隆动物，要进行动物细胞核移植，属于无性繁殖，不能大幅改良动物性状，C错误；
D、过程2通过克隆可以短时间内培育多个保持亲本优良性状的个体，为过程3提供了量产方式；过程3转基因技术可以改造生物的性状，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。
故答案为：D。
【分析】1、动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物。
2、移植胚胎的来源及生殖方式：
(1)核移植→ 无性繁殖
(2)体外受精 有性生殖
(3)体内受精→收集胚胎→移植→有性生殖
(4)基因工程→转入目的基因的受精卵 胚胎移植→转基因动物→有性生殖
4．（2023·湖南）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【知识点】基因工程的应用
【解析】【解答】A、由题图可知，AT1蛋白缺陷时，无法和Gβ结合，可以解除对PIP2s蛋白的磷酸化的抑制，PIP2s蛋白被磷酸化，外排H2O2增加，A正确；
B、由左图可知，AT1蛋白与Gβ结合后抑制PIP2s蛋白的磷酸化，H2O2外排量减少，导致抗氧化胁迫能力弱，细胞死亡，B错误；
C、敲除AT1基因或降低其表达，PIP2s蛋白被磷酸化，外排H2O2增加，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，提高成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，通过基因工程技术导入农作物中使其表达，可以改良农作物抗逆性，D正确。
故答案为：B。
【分析】由题图可知：AT1蛋白通过与Gβ结合抑制PIP2s蛋白的磷酸化，从而抑制细胞内H2O2外排量，导致植物抗氧化胁迫能力减弱，细胞死亡。当AT1蛋白缺陷时，可提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2的外排，提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
5．（2023高三下·海淀模拟）为利用链霉菌生产药物A，研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是（ ）
A．导入成功的链霉菌细胞内可能发生基因重组
B．诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变
C．卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量
D．生产药物A最适合选用培养基b上的菌株
【答案】D
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因），导入受体细胞中，目的基因会插入到受体细胞的基因组中，发生的可遗传变异类型为基因重组，A正确；
B、诱变处理所依据的原理是基因突变，基因突变是不定向的，所以诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变，B正确；
C、药物A基因和Neo基因（卡那霉素抗性基因）共用一个启动子，二者共表达，所以卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量，C正确；
D、诱变处理后将菌液稀释后涂布，在含不同浓度卡那霉素的培养基上各接种等量同一稀释度的培养液，应该选择含卡那霉素浓度最高的培养基上所长出的菌落，其生产药物A的能力也较强，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、基因重组的方式有同源染色体上非姐妹单体之间的交叉互换和非同源染色体上非等位基因之间的自由组合，另外，外源基因的导入也会引起基因重组。
2、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换。基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期。基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
6．（2023·朝阳模拟）下列生物学实验中，对材料的选择不合理的是（ ）
A．物质鉴定一般选择本身无色或色浅的材料
B．DNA粗提取需选择猪血等DNA含量高的材料
C．可选择植物花药观察减数分裂各时期的图像
D．选择胚胎或幼龄动物组织进行动物细胞培养
【答案】B
【知识点】观察细胞的减数分裂实验；DNA的粗提取和鉴定；动物细胞培养技术
【解析】【解答】A、物质鉴定实验中，材料本身不能干扰实验结果，所以一般选择本身无色或色浅的材料，A正确；
B、猪成熟的红细胞没有DNA，B错误；
C、植物花药可以进行减数分裂的细胞多，故可以用来观察减数分裂各时期的图像，C正确；
D、动物细胞培养时，一般选择胚胎或分化程度低的细胞，如幼龄动物组织，D正确。
故答案为：B。
【分析】1、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核。
2、DNA的粗提取： （1） 取待测大豆组织切碎，加研磨液充分研磨。 （2）过滤研磨液，将滤液放在4℃冰箱中放置几分钟后，取上清液。 （3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3分钟，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。
7．（2023高三下·海淀模拟）科研人员从四川卧龙自然保护区采集到的大熊猫粪便中提取DNA，通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，进而统计大熊猫种群密度。下列叙述不正确的是（ ）
A．野生大熊猫种群密度调查不适合用标记重捕法
B．PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异
C．大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA
D．不同粪便样本的PCR扩增结果一定存在明显差异
【答案】D
【知识点】估算种群密度的方法；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】A、题意显示，野生大熊猫数量较少，且其体型较大，调查分布范围小、数量少、个体较大的种群的密度时，可采用逐个计数法，不适合用标记重捕法，A正确；
B、由于DNA分子具有特异性，因而可推测，PCR扩增的序列应在大熊猫的不同个体间存在差异，B正确；
C、大熊猫粪便中的脱落细胞可为PCR提供模板DNA，进而可通过PCR技术扩增DNA来区分不同大熊猫个体，据此统计大熊猫种群密度，C正确；
D、由于大熊猫个体数量过少，即遗传多样性较低，因此，不同粪便样本的PCR扩增结果未必一定存在明显差异，D错误。
故答案为：D。
【分析】1、种群密度的调查方法： （1）逐个计数法：分布范围小，个体较大的生物。 （2）黑灯诱捕法：趋光性昆虫。 （3）样方法：多数植物和活动范围小活动能力弱的动物。 （4）标志重捕法：活动范围大活动能力强的动物。
2、PCR扩增过程： （1）变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
8．（2023·顺义模拟）下列生物学实验的相关操作，叙述正确的是（ ）
A．二苯胺鉴定DNA粗提物——借助显微镜观察实验结果
B．培养液中酵母菌种群数量变化——先向计数室滴加培养液再盖好盖玻片
C．探究pH对H2O2酶的影响——先向酶溶液中加不同pH的缓冲液再加底物
D．模拟生物体维持pH的稳定——滴加酸碱前无需测试溶液的起始pH
【答案】C
【知识点】探究影响酶活性的因素；探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化；DNA的粗提取和鉴定；稳态的调节机制
【解析】【解答】A、二苯胺试剂鉴定DNA粗提物是将DNA溶于NaCl中加入二苯胺试剂沸水浴加热，该过程无需使用显微镜观察，A错误；
B、培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，应先盖好盖玻片，再向计数室滴加培养液，若先向计数室滴加培养液再盖好盖玻片则会导致实验数据偏大，B错误；
C、酶具有高效性，酶一旦与底物接触，反应就开始了，所以在探究pH对H2O2酶的影响的实验中，应先向酶溶液中加不同pH的缓冲液再加底物，C正确；
D、模拟生物体维持pH的稳定的实验中，在滴加酸碱前需测试溶液的起始pH，作为pH的起始对照，D错误。
故答案为：C。
【分析】1、血细胞计数板计数时，应先放置盖玻片，在盖玻片的边缘滴加培养液，待培养液从边缘处自行渗入计数室，吸去多余培养液，再进行计数。如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释，以便于酵母菌的计数。
2、DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
9．（2020·海淀模拟）某新型病毒是一种RNA病毒，医务工作者利用PCR技术进行病毒检测时，所使用的方法中合理的是（ ）
A．用细菌培养基直接培养被测试者体内获取的病毒样本
B．分析该病毒的RNA序列是设计PCR引物的前提条件
C．PCR扩增过程需使用RNA聚合酶和耐高温DNA聚合酶
D．在恒温条件下进行PCR扩增避免温度变化导致酶失活
【答案】B
【知识点】基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】A、病毒没有细胞结构，不能用培养基直接培养，A错误；
B、PCR进行的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物，B正确；
C、RNA病毒的RNA通过PCR扩增需要先进行逆转录形成DNA，然后使用耐高温DNA聚合酶进行DNA复制，不需要使用RNA聚合酶，C错误；
D、根据上述分析可知，PCR扩增过程经历了高温变性、低温复性和中温延伸的过程，而不是在恒温条件下进行的，D错误。
故答案为：B。
【分析】1、病毒没有细胞结构，不能独立代谢，需要在宿主细胞内才能增殖。2、PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA，四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
10．（2020·海淀模拟）在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是（ ）
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
【答案】D
【知识点】基因工程的应用；基因工程的基本工具（详细）
【解析】【解答】A、由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；
B、由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；
C、由题知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；
D、限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
故答案为：D。
【分析】基因工程又称基因拼接技术或DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程的操作步骤：1.提取目的基因；2.目的基因与运载体结合；3.将目的基因导入受体细胞；4.目的基因的检测和表达
二、非选择题
11．（2023·全国乙卷）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
（2）构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
（3）目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4）新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
【答案】（1）含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
（2）终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
（3）密码子具有简并性
（4）将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【知识点】遗传信息的翻译；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）基因文库是指含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
故答案为：含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
（2）图中结构是基因表达载体，GFP突变基因是目的基因，目的基因位于启动子和终止子之间，所以初步确定①、②是启动子或者终止子。由于箭头指的是目的基因转录的方向，②位于目的基因的上游，①位于目的基因的下游，所以可判断①是终止子，②是启动子。启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
故答案为：终止子；启动子；RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录；鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
（3）由于密码子具有简并性，不同的密码子可能决定相同的氨基酸，所以GFP突变的基因转录出的mRNA与原来正常基因转录出的mRNA翻译出的蛋白质仍然可能是相同的。因此从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性。
故答案为：密码子具有简并性。
（4）题干信息指出要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，那么就需要将目的基因YFP插入到运载体上构建基因表达载体，再将其导入基因工程中常用的真核生物（如酵母菌）体内从而让目的基因在真核生物体内表达，因此实验思路是：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
故答案为：将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达。
【分析】1、将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。包含一种生物所有基因的文库，叫做基因组文库。包含一种生物的一部分基因的文库叫做部分基因文库，如cDNA文库。
2、基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
3、简并性：绝大多数氨基酸都有几个密码子的现象。意义：（1）当密码子中有一个碱基发生改变时，由于密码子的简并，可能并不会改变其对应的氨基酸。（2）当某种氨基酸使用频率高时，几种不同的密码子都编码一种氨基酸可保证翻译的效率。
12．（2023·江苏）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
（2）有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用____。
A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’
（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有____。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】（1）模板（片段F1、片段F2）、引物；延伸的时间和退火的温度
（2）B；C
（3）限制性核酸内切酶（限制酶）
（4）A；B；C
（5）P3、P4
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【知识点】微生物的分离和培养；培养基对微生物的选择作用；PCR技术的基本操作和应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）PCR反应体系中包括DNA模板，耐高温的DNA聚合酶、引物和四种脱氧核苷酸，引物是根据扩增的基因序列设计的，据此推测，分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物；扩增步骤包括变性、退火、延伸，扩增的DNA片段长度不同，则延伸设置的时间不同，所使用的引物不同，则退火的温度也可能不同，所以扩增程序中最主要的不同是延伸的时间和退火的温度。
（2）由图分析可知，引物F2-F与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧相同，所以引物F2-F对应的序列是C选项；同理，引物F1-R与EGFP5'端到3'端碱基序列右侧加上AnB15'端到3'端碱基序列左侧互补，所以引物F1-R对应的序列是D选项。
故答案为：CD。
（3）传统重组质粒构建过程需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶，而题干中的过程使用的是重组酶，所以这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有限制性核酸内切酶（限制酶）和DNA连接酶。
（4）当通过稀释涂布平板法接种后，对微生物进行计数时，需要控制每个平板30~300个菌落，但本实验的目的是筛选出转化成功的大肠杆菌，所以不用控制每个平板的菌落数，A符合题意；一般是先将培养基冷却后，再进行接种，所以抗性平板上未长出菌落的原因不可能是培养基温度太高所致，B符合题意；转化后的大肠杆菌采用含有抗生素的培养基筛选，只有转化成功的大肠杆菌才能在该培养基上生长，而未转化成功的大肠杆菌和其它杂菌无法生长，所以抗性平板上不会出现大量杂菌形成的菌落，C符合题意；单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物，所以抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D不符合题意。
故答案为：ABC。
（5）由图可知，EGFP和AnB1的长度总和是720＋390＝1110bp，电泳结果显示，P1和P2片段长度接近该值，而P3没有条带，P4片段长度显著小于该值，所以可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，所以对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
【分析】一、PCR技术
1、PCR技术是体外扩增目的基因的技术，是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
2、条件
DNA母链：提供DNA复制的模板； 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）； 引物：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸； 原料：四种脱氧核糖核苷酸。
二、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
三、 微生物的分离纯化一般可用平板划线法或稀释涂布平板法，其中平板划线法使用接种环等进行接种，不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法使用涂布器等进行接种，可用于微生物的计数，在样品稀释时，要保证计数用的平板中的菌落数落在30-300之间。
13．（2023·海南）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。
【答案】（1）脱分化；细胞分裂素；诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
（2）遗传特性；转基因标识
（3）Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
（4）荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根；观察幼苗是否表现出白化特征；PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
（5）操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【知识点】基因工程的应用；植物组织培养的过程；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，生长素/细胞分裂素浓度＞1，则有利于生根，生长素/细胞分裂素浓度＜1，则有利于芽的分化，该过程还需要光照，其作用是诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
（2）含重组载体的农杆菌会侵染愈伤组织，将重组载体上的T-DNA上的基因导入愈伤组织细胞中，使愈伤组织的遗传特性发生改变，所以若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性；我国对农业转基因生物实行了标识制度，根据规定，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因标识。
（3）Ti质粒中的T-DNA是一种可转移的DNA，所以农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）由题意可知，CRISPR/Cas9基因编辑载体含有绿色荧光蛋白标记基因，所以从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根；由图2可知，该实验是从个体水平鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的，所以相应的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，依据是PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）通过图1和图2对比可知，与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【分析】1、植物组织培养是指将离体的植物器官、组织或细胞等，培养在人工配制的培养基上，并给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。整个过程包括外植体消毒、脱分化形成愈伤组织、愈伤组织再被诱导生根发芽，最终培育成完整植株。利用的生物学原理是植物细胞的全能性。
2、生长素/细胞分裂素=1，有利于愈伤组织的形成；生长素/细胞分裂素＞1，有利于根的形成；生长素/细胞分裂素＜1，有利于芽的形成。
3、脱分化过程不需要光照，而再分化过程需要光照，以利于叶绿素的形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
4、将目的基因导入植物细胞的方法一般是农杆菌转化法，利用的原理是农杆菌的Ti质粒中的T-DNA是一种可转移的DNA，农杆菌侵染植物细胞时，外源基因可通过Ti质粒中的T-DNA递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起，最终使目的基因在植物细胞中表达，使植物个体表现出相应的性状。
14．（2023·天津）某植物四号染色体上面的A基因可以指导植酸合成，不能合成植酸的该种植物会死亡。现有A3-和A25-两种分别由A基因缺失3个和25个碱基对产生的基因，已知前者不影响植酸合成，后者效果未知。
（1）现有基因型为AA25-的植物，这两个基因是 基因。该植物自交后代进行PCR，正向引物与A25-缺失的碱基配对，反向引物在其下游0.5kb处，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，原因是 ，其中明亮条带分为较明亮和较暗两种，其中较明亮条带代表基因型为 的植物，比例为 。
（2）将一个A基因导入基因型为A3-A25-的植物的6号染色体，构成基因型为A3-A25- A的植物、该植物自交子代中含有A25-A25-的比例是 。
（3）在某逆境中，基因型为A3-A3-的植物生存具有优势，现有某基因型为A3-A的植物，若该种植物严格自交，且基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，补齐下面的表格中，子一代基因频率数据（保留一位小数）：
代 亲代 子一代 子二代
A基因频率 50% % 46.9%
A3-基因频率 50% % 53.1%
基因频率改变，是 的结果。
【答案】（1）等位；自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带；AA；1/3
（2）1/5
（3）48.8%；51.2%；自然选择
【知识点】基因的自由组合规律的实质及应用；基因频率的概念与变化；PCR技术的基本操作和应用；自然选择与适应
【解析】【解答】（1）因A25-基因是由A基因缺失25个碱基对产生的新基因，即A基因通过基因突变产生A25-基因，这两个基因是等位基因。基因型为AA25-的植物自交后代有AA、AA25-和A25-A25-三种基因型，其比例为1：2：1。进行PCR时，因正向引物与A25-缺失的碱基配对，缺失这25个碱基对的A25-基因无法与正向引物配对从而不能扩增，故只含有A25-基因的个体A25-A25-不具有条带；A基因含有该25个碱基对，能与正向引物和反向引物进行碱基互补配对从而扩增出条带，因此基因型为AA、AA25-的个体均具有条带，且A基因个数越多，扩增产物越多，条带越明亮，因此基因型为AA的个体具有较明亮的条带，基因型为AA25-的个条带较暗。由题意可知，PCR后进行电泳，发现植物全部后代PCR产物电泳结果均具有明亮条带，说明基因型为A25-A25-的个体无法存活，只有基因型为AA和AA25-的个体，其中较明亮条带代表基因型为AA，占子代的比例为1/3。
故填：等位；自交后代中基因型为A25-A25-的个体死亡，基因型为A25-A和AA的个体由于都至少含有一个A基因，因此可以与正向引物和反向引物结合进而完成PCR，获得明亮条带；AA；1/3。
（2）已知基因A3-和A25-都在4号染色体上，导入的A基因存在于6号染色体上，A基因与 A3-和A25- 位于非同源染色体上，遵循基因自由组合定律，产生配子的基因组成为A3-A、A25-A、A3-、A25-，比例为1：1：1：1；该植物自交后代中基因型为A25-A25-的个体占1/4×1/4=1/16，该基因型个体不能存活，因此存活个体占子代的15/16，其中含有A25-A25-的后代个体基因型共有2种，分别是AAA25-A25-和AA25-A25-，所占比例分别为1/16和2/16，二者共占3/16，因此基因型为A3-A25- A的植物自交子代中含有A25-A25-的比例为3/16÷15/16=1/5。
故填：1/5。
（3）基因型为A3-A的植物自交产生子一代的基因型及比例为AA：A3-A：A3-A3-=1：2：1。由题干信息可知，基因型为A3-A3-的植物每代数量增加10%，则子一代中基因型为A3-A3-所占比例为1/4+1/4×10%=11/40，因此子一代中各基因型及其比例为AA：A3-A：A3-A3-=1/4：1/2：11/40=10：20：11，由此可计算出子一代中各基因型频率分别是AA=10/（10+20+11）=10/41，A3-A=20/（10+20+11）=20/41，A3-A3-=11/（10+20+11）=11/41，因此子一代中A基因频率为（10/41+1/2×20/41）×100％=48.8%，A3-基因频率为1-48.8%=51.2%。自然选择决定生物进化的方向，具有有利变异的个体更适应环境被选择下来，而具有不利变异的个体则会被自然选择淘汰，因此决定有利变异的基因频率逐渐增大，因此基因频率的改变是自然选择的结果。
故填：48.8%；51.2%；自然选择。
【分析】（1）基因突变：①基因突变概念：指基因中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因碱基序列的改变。②基因突变的结果：产生新基因。③基因突变的特点：普遍性、随机性、不定向性、低频性、多害少益性。④时期：一般发生在分裂间期。
（2）现代生物进化理论的主要内容：种群是生物进化的基本单位；突变和基因重组产生生物进化的原材料；自然选择决定生物进化的方向；隔离是新物种形成的必要条件。生物进化的实质在于种群基因频率的改变。
（3）基因自由组合定律是指位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的，在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。
15．（2023·天津）基因工程：制备新型酵母菌
（1）已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
（2）同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A、B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
（3）已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导大。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C'序列，以便对UGA基因进行切除。C．C'的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
（4）综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。
【答案】（1）细胞外
（2）P1和P6
（3）缺乏尿嘧啶；方式二；含有5-氟乳清酸
（4）图3
【知识点】基因工程的应用；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）因为酵母菌不能吸收淀粉，所以导入多步分解淀粉所需的多种酶后这些酶生效的场所应该是在细胞外。
故填：细胞外。
（2）因为当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入，所以要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
故填： P1和P6。
（3）（i）因尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，所以将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果没有成功导入该基因，则酵母菌体内无尿嘧啶合成，酵母菌不能生存；如果导入成功，则酵母菌能正常生存和繁殖并形成菌落；方式一中C和C'方向相反，无法连接起来，方式二C和C'连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由题意可知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，因此在含有5-氟乳清酸的培养基上进行培养，如果对UGA基因进行切除时切割成功，则不含尿嘧啶，酵母菌能生存并形成菌落，如果切割不成功，则会产生对酵母菌有毒物质，不能形成菌落。
故填：缺乏尿嘧啶；方式二；含有5-氟乳清酸。
（4）因UGA基因要插入C和C'之间，目的基因插入A和B之间，所以图3正确。
故填：图3。
【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中基因表达载体的构建是核心步骤，基因表达载体要包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
16．（2023·北京）二十大报告提出“种业振兴行动”。油菜是重要的油料作物，筛选具有优良性状的育种材料并探究相应遗传机制，对创制高产优质新品种意义重大。
（1）我国科学家用诱变剂处理野生型油菜（绿叶），获得了新生叶黄化突变体（黄化叶）。突变体与野生型杂交，结果如图甲，其中隐性性状是 。
（2）科学家克隆出导致新生叶黄化的基因，与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点（如图乙）。据此，检测F2基因型的实验步骤为：提取基因组DNA→PCR→回收扩增产物→ →电泳。F2中杂合子电泳条带数目应为 条。
（3）油菜雄性不育品系A作为母本与可育品系R杂交，获得杂交油菜种子S（杂合子），使杂交油菜的大规模种植成为可能。品系A1育性正常，其他性状与A相同，A与A1杂交，子一代仍为品系A，由此可大量繁殖A。
在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。油菜新生叶黄化表型易辨识，且对产量没有显著影响。科学家设想利用新生叶黄化性状来提高种子S的纯度。育种过程中首先通过一系列操作，获得了新生叶黄化的A1，利用黄化A1生产种子S的育种流程见图丙。
①图丙中，A植株的绿叶雄性不育子代与黄化A1杂交，筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为 。
②为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，简单易行的田间操作用 。
【答案】（1）黄化叶
（2）用限制酶B处理；3
（3）50%；在开花前把田间出现的绿叶植株除去
【知识点】基因的分离规律的实质及应用；杂交育种；诱变育种；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】（1）亲本野生型与黄花叶杂交后代都是野生型，且野生型油菜进行自交，后代中既有野生型又有叶黄化，因此黄化叶是隐性性状。
故填： 黄化叶。
（2）F2中野生型个体既有纯合子（用AA表示）又有杂合子（用Aa表示），故检测F2基因型的实验主要是检测是否含有导致新生叶黄化的基因a。因与野生型相比，它在DNA序列上有一个碱基对改变，导致突变基因上出现了一个限制酶B的酶切位点，所以在PCR并回收扩增产物后要用限制酶B处理并用电泳分离。野生型基因无限制酶B切点，电泳结果为一条带，导致新生叶黄化的基因a含有限制酶B切点，电泳结果为两条带，故F2中杂合子电泳条带数目应为3条。
故填：用限制酶B处理；3。
（3）①因黄化叶是隐性性状，基因型为aa，与A植株杂交得到绿叶雄性不育植株，基因型为Aa。A植株的绿叶雄性不育子代（Aa）与黄化A1（aa）杂交，则子代表现性及比例为绿叶：黄花叶=1：1，因此筛选出的黄化A植株占子一代总数的比例约为50%。②在大量繁殖A的过程中，会因其他品系花粉的污染而导致A不纯，进而影响种子S的纯度，导致油菜籽减产。因此为减少因花粉污染导致的种子S纯度下降，应在开花前除去田间的绿叶植株。
故填：50%；在开花前把田间出现的绿叶植株除去。
【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变；如果发生在编码区，则可能因此基因控制合成的蛋白质的氨基酸序列改变。基因突变会产生新基因，新产生的基因与原基因为等位基因。基因突变有以下特点：普遍性、随机性、不定向性、低频性、多害少益性。
17．（2023·北京）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
（1）EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 （用字母表示）互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。
（3）为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；
②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；
③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；
④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。
请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
（4）各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
【答案】（1）A
（2）Q；R
（3）将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T
（4）大多数B细胞没有被BrdU标记
【知识点】基因工程的应用；DNA分子的复制；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，根据碱基互补配对原则T与A配对，因此掺入DNA的EdU和BrdU均能与A互补配对。
故填：A。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，则EdU会与腺嘌呤碱基互补配对，导致子链出现放射性。随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与腺嘌呤结合，使放射性增强，最终实现双标记，随DNA复制不断进行，双标记细胞占EdU标记细胞的百分比不断增大，且在DNA复制完成时达到最大值，因此图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
故填：Q；R。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要将L基因敲除。因Ce酶基因编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失，而纯合小鼠Lx的L基因两侧已插入特异DNA序列（x），因此需要将Ce酶基因和Er基因连接；而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，因此在筛选目标小鼠之后要饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）从而获得小鼠IK。
故填：将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T。
（4）变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况，此时已经经过途径Ⅱ的一个完整细胞周期，细胞应都含有BrdU标记；如果变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，该过程未完成一次细胞周期，故t2时间后用BrdU饲喂也无法被利用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
故填：大多数B细胞没有被BrdU标记。
【分析】DNA复制为半保留复制，以DNA的两条链为模版，四种脱氧核苷酸为原料，在解旋酶和DNA聚合酶的催化作用下，根据碱基互补配对原则合成两条新的子链，每个DNA分子各含一条亲代DNA分子的母链和一条新形成的子链。DNA分子复制时间：有丝分裂和减数分裂前的间期；过程：边解旋边复制；结果：一分子DNA复制出两分子相同的DNA。
18．（2023·湖南）基因检测是诊断和预防遗传病的有效手段。研究人员采集到一遗传病家系样本，测序后发现此家系甲和乙两个基因存在突变：甲突变可致先天性耳聋；乙基因位于常染色体上，编码产物可将叶酸转化为N5-甲基四氢叶酸，乙突变与胎儿神经管缺陷（NTDs）相关；甲和乙位于非同源染色体上。家系患病情况及基因检测结果如图所示。不考虑染色体互换，回答下列问题：
（1）此家系先天性耳聋的遗传方式是 。1-1和1-2生育育一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率是 。
（2）此家系中甲基因突变如下图所示：
正常基因单链片段5'-ATTCCAGATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
突变基因单链片段5'-ATTCCATATC……（293个碱基）……CCATGCCCAG-3'
研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，再用某限制酶（识别序列及切割位点为）酶切检测甲基因突变情况，设计了一条引物为5′-GGCATG-3'，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。用上述引物扩增出家系成员Ⅱ-1的目的基因片段后，其酶切产物长度应为 bp（注：该酶切位点在目的基因片段中唯一）。
（3）女性的乙基因纯合突变会增加胎儿NTDs风险。叶酸在人体内不能合成，孕妇服用叶酸补充剂可降低NTDs的发生风险。建议从可能妊娠或孕前至少1个月开始补充叶酸，一般人群补充有效且安全剂量为0.4~1.0mg.d-1，NTDs生育史女性补充4mg.d-1。经基因检测胎儿（Ⅲ-2）的乙基因型为-/-，据此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为 mg.d-1。
【答案】（1）常染色体隐性遗传；1/32
（2）CCAGAT；305
（3）4
【知识点】基因的自由组合规律的实质及应用；基因突变的特点及意义；人类遗传病的类型及危害；PCR技术的基本操作和应用
【解析】【解答】（1）由遗传系谱图可知，由于I-1与I-2均表现正常，关于甲病的基因组成均为+/-说明父母双方均携带突变基因，而他们的女儿Ⅱ-4患病，基因组成为-/-，因此可判断甲基因突变导致的先天性耳聋是常染色体隐性遗传；由I-1、I-2和Ⅱ-3关于乙病的基因组成可推出乙基因突变导致的胎儿神经管缺陷（NTDs）也是常染色体隐性遗传，所以I-1和I-2生出一个甲和乙突变基因双纯合体女儿的概率为1/4×1/4×1/2=1/32 。
故填：常染色体隐性遗传；1/32。
（2）引物与模板DNA的3'端碱基互补，正常基因互补链的3'端的碱基序列为TAAGGTCTAG，且包含酶切位点，因此另一条引物为5'-CCAGAT-3'，由限制酶的识别序列和切割位点可知，Ⅱ-1的目的基因被切割后，酶切产物长度为2+293+10=305bp。
故填：CCAGAT；305。
（3）因Ⅲ-2的乙的基因型为-/-，胎儿有患神经管缺陷（NTDs）NTDs的可能，因此推荐该孕妇（Ⅱ-1）叶酸补充剂量为4mg·d-1。
故填：4。
【分析】利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：DNA半保留复制。
②条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
③扩增过程
过程 说明
变性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
19．（2023高三下·海淀模拟）自然界中的光强常在短时间内剧烈变化，影响植物的光合作用效率。科研人员对拟南芥的叶绿体响应光强变化的机理进行了探究。
（1）类囊体膜上的蛋白复合物PSI催化水在光下分解，变化的光强会影响这一过程，从而影响光反应产生 ，最终影响暗反应过程有机物的合成。
（2）PSII复合物的主要部分延伸到类囊体腔中，科研人员推测类囊体腔中的蛋白参与PSⅡ的组装。为此，利用农杆菌转化拟南芥，由于农杆菌的 会随机整合到拟南芥的核基因组中，因而可得到类囊体腔内蛋白基因发生突变的突变体。
（3）科研人员在所得突变体中观察到，B基因突变体无法编码类囊体腔内的蛋白B，该突变体表现为缺乏PSⅡ复合物。科研人员进行实验，处理及结果如图。
实验结果
a组 b组 c组 d组
B基因突变体 ++ + ++ +++
野生型 ++ ++ ++ ++
注：“+” 数量多代表生长状况好。
①据图分析，本实验的自变量是 。
②依据实验结果推测，PSII复合物的功能是 对变化光强的适应。
（4）进一步将b组植株的叶肉细胞置于电镜下观察，结果如图。
基于本实验结果推断，B基因参与PSII复合物的组装，PSII复合物帮助植物适应变化的光强。请对观察结果能否证实该推断作出判断，并阐明理由 。
【答案】（1）ATP和NADPH
（2）T-DNA
（3）变化的光强；光强变化的规律性；缺乏PSⅡ复合物；提高
（4）不能证实。观察结果为，与野生型相比较B基因突变体的淀粉颗粒明显小而少；无法证实B蛋白参与PSⅡ复合物的组装，但支持PSⅡ复合物帮助适应变化的光强
【知识点】光合作用的过程和意义；影响光合作用的环境因素；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）光强变化影响类囊体上水的光解，从而影响其产物ATP和NADPH的生成。
（2）农杆菌转化法中Ti质粒的T-DNA（可转移的DNA）会随机整合到植物细胞中。
（3）由图可知，光照强度及其变化规律属于自变量；由表可知，B基因是否突变（是否缺乏PSⅡ复合物）为自变量。突变体表现为缺乏PSⅡ复合物，从而导致bcd三组生长状况变差，a组光强下无论突变生长状况均一致，说明PSⅡ复合物可提高植物对变化光强的适应。
（4）由图可知，观察结果为，与野生型相比较B基因突变体的淀粉颗粒明显小而少；无法证实B蛋白参与PSⅡ复合物的组装，但支持PSⅡ复合物帮助适应变化的光强。
【分析】1、光合作用：绿色植物通过叶绿体，利用光能把二氧化碳和水转变成储存着能量的有机物，并释放出氧气的过程。光合作用的光反应阶段（场所是叶绿体的类囊体膜上）：水的光解产生[H]与氧气，以及ATP的形成．光合作用的暗反应阶段（场所是叶绿体的基质中）：CO2被C5固定形成C3，C3在光反应提供的ATP和[H]的作用下还原生成糖类等有机物。
2、农杆菌转化法：适用于双子叶植物、裸子植物和少数单子叶植物的细胞。 ①将植物组织与农杆菌混合培养；②将花序直接浸没在含有农杆菌的的溶液中一段时间；③培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
20．（2023·朝阳模拟）儿童癫痫是由大脑神经元异常放电所致的神经系统疾病，遗传因素是其重要病因。
（1）研究者对某儿童癫痫患者家系进行调查，结果如图1，据图可知该病为 遗传病。对患者和健康志愿者进行基因组测序，推测S基因为致病基因。
（2）核基因转录的前体RNA中内含子对应序列被识别并剪切，外显子对应序列拼接为成熟mRNA.对患者及父母的S基因测序后发现 ，推测S基因外显子4突变导致癫痫。为验证该推测，研究者分别设计如图2中的引物 扩增外显子1及外显子1-内含子1交界处，并对其他外显子及外显子-内含子交界处扩增、测序（除外显子4外），发现患者及父母的测序结果相同。对外显子-内含子交界处进行测序的原因是该部位 。
（3）研究者利用基因工程技术将人突变S基因外显子4替换小鼠正常S基因外显子4，并利用标记基因N筛选出成功替换的小鼠胚胎干细胞，进而培育出杂合转基因小鼠甲。为进一步得到去除N基因的纯合突变鼠，可利用转Flp基因小鼠（Flp酶可识别并敲除同一条DNA两个FRT序列间的序列）与甲杂交。
①从以下选项中选出正确的重组质粒以获得小鼠甲 。
A. B.
C. D.
②在图中补充培育纯合突变鼠的杂交流程：
（4）出生两周的幼鼠乙可在尖锐嘈杂声的刺激下诱发癫痫。进一步研究表明S基因突变增强了脑内兴奋性突触的活性。S基因表达产物是一种膜蛋白，参与调节细胞内囊泡膜与细胞膜的融合。推测S基因突变导致 ，引发了癫痫。
【答案】（1）常染色体隐性
（2）患者S基因外显子4仅具突变序列，其父母既有突变序列也有正常序列；2(或3)和5、3和6；影响RNA正确加工
（3）B；
（4）S蛋白功能异常，对脑内兴奋性递质释放的抑制作用减弱，增强了兴奋性突触的活性
【知识点】人类遗传病的类型及危害；基因工程的操作程序（详细）
【解析】【解答】（1）根据遗传规律“无中生有有为隐性，隐性遗传看女病，女病男正非伴性”可知，女患者的父亲正常，所以是常染色体隐性遗传病。
（2）S基因为致病基因，S基因外显子4突变导致癫痫，且该病为常染色体隐性遗传病，患者为隐性纯合子，其S基因外显子4仅具突变序列，其父母为杂合子，既有突变序列也有正常序列。DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链，因此，可以设计引物2(或3)和5、3和6扩增外显子1及外显子1-内含子1交界处。核基因转录的前体RNA中内含子对应序列被识别并剪切，外显子对应序列拼接为成熟mRNA，由于外显子-内含子交界处能影响RNA正确加工，故应对外显子-内含子交界处进行测序。
（3）①由题意可知：杂合转基因小鼠甲中“正常S基因外显子4”被“人突变S基因外显子4”替换，且需要删除标记基因N，标记基因N通过转Flp基因小鼠（Flp酶可识别并敲除同一条DNA两个FRT序列间的序列）进行去除，故重组区域为“人突变S基因外显子4”+N基因，由于N基因需要被敲除，故N基因位于两个FRT序列间，B正确。
故答案为：B。
②由①可知，杂合转基因小鼠甲与转Flp基因小鼠进行杂交，经过筛选可获得去除N基因且S基因Flp基因均杂合的小鼠，将该小鼠与野生型小鼠（不含Flp基因）进行杂交，获得去除N基因和Flp基因且S基因杂合的小鼠，最后将该雌雄小鼠进行交配，经过筛选后，可获得去除N基因和Flp基因且S基因纯合的突变鼠乙，其杂交流程如下：
（4）S基因突变可导致S蛋白功能异常，S基因表达产物是一种膜蛋白，参与调节细胞内囊泡膜与细胞膜的融合，S蛋白功能异常后对脑内兴奋性递质释放的抑制作用减弱，增强了兴奋性突触的活性，引发了癫痫。
【分析】遗传系谱图判断遗传的方式： （1）父病子全病——伴Y遗传。 （2）判断显隐性：无中生有为隐性，隐性遗传看女病，父子皆病为伴X，父子无病为常显。有中生无为显性，显性遗传看男病，母女皆病为伴X，母女无病为常显。 （3）不可判断显隐性：若连续遗传可能为显性。隔代遗传可能为隐性。若男女患者比例相当可能为常染色体遗传，患者男多于女或女多于男可能为伴性遗传。
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