专题4 酶的研究与应用
课题4.3 酵母细胞的固定化
一、【课题目标】
（一）知识与技能
1、识记固定化技术的常用方法
2、理解固定化酵母细胞的制备过程
3、知道固定化酶的实例
???（二）过程与方法
1、固定化细胞技术
2、制备固定化酵母细胞的过程
（三）情感、态度与价值观
通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法
二、【课题重点】
制备固定化酵母细胞
三、【课题难点】
制备固定化酵母细胞
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用
（二）进行新课
1．基础知识
1．固定化酶的应用实例――生产高果糖浆
（1）高果糖浆的生产原理：
（2）葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。
（3）高果糖浆的生产操作（识图4－5反应柱）：
从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。
2．固定化技术的方法（识图4－6固定方法）：
将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
【比较】酶和细胞的固定方法和特点
固定对象
酶
细胞
适宜固定法
化学结合法、物理吸附法
包埋法
特 点
体积小，固定一种酶。包埋法容易丢失
体积大，固定一系列酶。难以化学结合和吸附
〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法。
〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。
3．固定细胞的材料：
固定细胞时应当选用不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等
2．实验设计
1．制备固定化酵母细胞
（1）酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考3〗活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
（2）配制CaCl2溶液：
0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。
（3）配制海藻酸钠溶液：
0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
〖思考4〗微火加热并不断搅拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。
（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：
将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。
〖思考5〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？
防止高温杀死酵母细胞。
（5）固定化酵母细胞：
以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。
2．固定化酵母细胞的发酵
（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。
（7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。
〖思考6〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？
酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考7〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。
〖思考8〗在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作码？
需要。
3．发酵操作
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1关于酵母菌的叙述，正确的是
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型是异养厌氧型
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
解析：酵母菌在环境适宜时进行出芽生殖，环境不良时进行孢子生殖。代谢类型为异养兼性厌氧型。酵母菌细胞为真核细胞，因此具有生物膜系统。在酿酒时，应当先通气后密封。
答案：C
例2研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
解析：本题考察酶和细胞的比较，二者的正常活动都需要一定的条件，如温度、酸碱度、水份等，但是酶本身是一种大分子物质，不需要营养，而细胞的生活离不开营养物质。
答案：D
☆综合应用
例3．下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ）
A．固定化酶只是在细胞内才能发挥作用
B．固定化酶能提高酶的利用率
C．酶的固定是酶分离纯化的常用方法
D．固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。
解析：制成固定化酶的步骤是：酶的生产、提取、酶的分离纯化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固体表面，有将酶相互连接起来．将酶包埋在细微的网格里等；这样的固定化酶能重复利用，从而提高了酶的利用率；而酶在条件适宜时，既可在细胞内起作用，也能在细胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在细胞外发挥作用。
答案选B
（五）巩固练习
1．酶的固定化常用的方式不包括
A．吸附 B．包埋 C．连接 D．将酶加工成固体
2．溶解海藻酸钠，最好采用 加热的方法
A．小火间断 B．小火持续 C．大火间断 D．大火持续
3．高果糖浆生产需要的酶是
A．葡萄糖异构酶 B．蔗糖酶 C．麦芽糖酶 D．果糖酶
4．关于酵母菌的叙述，正确的是
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型时异养厌氧型
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
5．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
6．将酵母菌的培养液由富氧状态变为缺氧状态，下面加快的一项是
A．CO2的释放 B．丙酮酸的氧化 C．葡萄糖的利用 D．ATP的形成
7．固定化酶的优点是
A．有利于增加酶的活性 B．有利于产物的纯化
C．有利于提高反应速度 D．有利于酶发挥作用
8．下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是
A．琼脂糖 B．醋酸纤维素 C．聚丙烯酰胺 D．聚乙烯树脂
9．关于固定化细胞的叙述，正确的是
A．催化效率高，低耗能、低污染
B．对环境的条件非常敏感，容易失活
C．既能与反应物充分接触，又能与产物分离
D．成本低、操作简单，但反应效果可能很低
10．固定化细胞技术不包括
A．包埋法 B．化学结合化 C．物理法 D．生物法
答案：
1．D 2．A 3．A 4．B 5．D 6．C 7．B 8．D 9.C 10.D
七、【课余作业】
1．什么是细胞的活化。
2．如何检验凝胶珠的质量是否合格。
八、【教学体会】
固定化酶的技术要求比较高，因此在教学过程中重点介绍固定化酵母细胞的操作。对于固定化酶的作用、原理及其在生产中的应用，主要是让学生通过生产实例来了解。教师在教学时可以采用让学生能够阅读自学的方式。例如，在葡萄糖的异构反应中，如果不将葡萄糖异构酶固定化，而是直接使用葡萄糖异构酶，会对生产产生哪些影响？
九、【资料袋】
固定化细胞的载体
固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定。寿命长、价格低廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。
有机高分子载体又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在厌氧条件下易被生物分解。有机合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对细胞活性有影响，易造成细胞失活。
无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应，从而把微生物固定。它的操作方法是把载体放人含有一定微生物浓度的溶液中，固定一段时间（24h左右）即可。
由有机载体和无机载体材料组成的复合载体材料，可以改进载体材料的性能。Lin等将粉末活性炭和Phanerochaete chrysosporium联合包埋固定，结果表明了复合固定化体系能更加有效地用于降解五氮酚，显示出复合载体材料的优越性。
课件18张PPT。■高中生物课件（人教课标版） 安义中学 课题2： 酵母细胞的固定化思考：通过课题背景分析，你有何体会？酶： 优点：摧化效率高，低耗能，低污染
实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶 很难收回，不能被再次利用，提高了生产成本；
反应后酶混在产物中，如不去除，会影响产品的品质
设想：将酶固定在不容于水的载体上固定化酶：优点：酶即能与反应物接触，又容易与反应物分离，同时，还可以反复利用
实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能完成的
设想：酶是细胞合成的，能否将合成酶的细胞直接固定？ 固定化细胞：成本低，操作更容易一、课题目标
1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。
2．尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。思考：1、如何利用固定化酶生产高果糖浆的？2、有哪些优点？3、固定化酶的方式有哪些？阅读教材P50，解决以下问题：（1）参照固定化酶，给细胞固定化下个定义
（2）细胞固定化的常用方法
（3）固定化细胞技术有哪些优势？
（4）如果想把微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种技术？如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？
（5）一般来说，酶更适合用吸附法和交联法固定，而细胞多采用包埋法固定，想想看为什么？思考：直接使用酶、固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点？课堂讨论： 1．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？
2．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？
3．如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？
4．如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？
固定化细胞技术固定化细胞固定的是一系列酶固定化细胞技术固定化酶技术在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5～1 h，教师需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。三．实验操作
（一）制备固定化酵母细胞
1．酵母细胞的活化思考：1、什么叫酵母细胞的活化？ 2．配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液思考：2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液有什么作用？3．配制海藻酸钠溶液思考：①配制的海藻酸钠溶液具体作用是什么？
②在加热的过程中，为什么要用小火，或者间断加热？包埋酶或细胞防止焦糊4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
5．固定化酵母细胞思考：①为什么刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中浸泡30min左右？
②如何检验凝胶珠的质量是否合格？形成稳定的凝胶珠说明：刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。（二）用固定化酵母细胞发酵
问题思考：发酵时为什么要将温度控制在25℃？四．实验操作结果分析与评价1．观察凝胶珠的颜色和形状
问题思考：①如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，则说明什么？
②如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明什么？如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。2．观察发酵的葡萄糖溶液
问题思考：当观察到哪些现象时，可说明实验获得成功？为什么？利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。3、固定化酶和固定化细胞技术有哪些？各有什么优缺点？固定化细胞常用的载体有哪些？有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
固定化酶分子小更适合采用化学结合法和物理吸附法，用包埋法却容易从包埋材料中漏出。固定化细胞因细胞大不易被吸附或结合适宜采用包埋法。
常用载体：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。4、固定化酶和固定化细胞的原理是什么？就是将酶固定在不溶于水的载体上，或者将微生物细胞均匀地包埋于不溶于水的多孔性载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用的技术。巩固练习1、酶固定化技术与细胞固定化技术的关系是
A 酶固定化技术是细胞固定化技术的基础
B 细胞固定化技术是酶固定化技术的基础
C 酶固定化技术与细胞固定化技术是同时发展起来的
D 固定化细胞技术先于酶固定化技术2、固定化酶技术常采用
A 包埋法 B 化学结合和物理吸附法
C 活化法 D 微囊化法
3、海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要经过加热促进其溶解，采用的最好加热方法是
A 快速加热 B 持续高温加热
C 小火间断加热 D 灼烧加热4、酵母菌的活化是指
A 让酵母细胞恢复运动状态
B 让酵母细胞在缺水状态下更容易休眠
C 让酵母细胞内酶活性加倍
D 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态5、细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是
A 成本更低、操作更容易、不能连续性生产
B 成本更高、操作更难、不能连续性生产
C 成本更低、操作更容易、能连续性生产
D 成本更低、操作更难、能连续性生产
