2019-2023年生物学高考真题分类练--专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题(含解析）
文档属性
| 名称 | 2019-2023年生物学高考真题分类练--专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题(含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.4MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-04-21 23:40:04 | ||
图片预览
文档简介
中小学教育资源及组卷应用平台
2019-2023年生物学高考真题分类
专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
题组一
一、选择题
1. [2023广东，2分]“ 粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解 分离 沉淀 鉴定。下列叙述错误的是( )
A. 裂解:使细胞破裂释放出 等物质
B. 分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀:可反复多次以提高 的纯度
D. 鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2. [2023浙江1月选考，2分]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A. 试管婴儿技术应全面禁止
B. 治疗性克隆不需要监控和审查
C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
3. [2021湖北，2分]某实验利用 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A. 增加模板 的量 B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度
二、非选择题
4. [2023全国甲理综节选，11分]接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1） 接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2） 制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3） 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
5. [2022湖南节选，13分]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1） 蛋白质工程流程如图所示，物质 是 ，物质 是 。在生产过程中，物质 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
（2） 技术遵循的基本原理是 。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是 。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路： 。
6. [2021全国甲理综，15分] 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析 扩增结果;②从病人组织样本中提取 ;③利用 扩增 片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
（1） 若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2） 操作③中使用的酶是 。 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步,其中复性的结果是 。
（3） 为了做出正确的诊断， 反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4） （多聚酶链式反应）技术是指 。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
7. [2021海南，11分] 是一种高效的基因编辑技术， 9基因表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 引导下，切割 双链以敲除目标基因或插入新的基因。 基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题。
（1） 过程①中，为构建 重组质粒，需对含有特定 编码序列的 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
（2） 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
（3） 过程③~⑤中， 与 蛋白形成复合体，该复合体中的 可识别并与目标 序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后， 蛋白可切割 序列。
（4） 利用 基因编辑技术敲除一个长度为 的基因，在 水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
（5） 某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组 中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组 的编辑过程： 。
题组二
一、选择题
1. [2023新课标理综，6分]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
2. [2022辽宁，2分]抗虫和耐除草剂玉米双抗 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A. 预变性过程可促进模板 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
二、非选择题
3. [2023全国乙理综节选，10分] 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以 基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库。科研人员将 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出 基因的突变基因文库。
（2） 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如图所示（箭头为 突变基因的转录方向）。图中①为 ;②为 ，其作用是 。
（3） 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4） 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的 突变基因进行测序，发现其碱基序列与 基因的不同，将该 突变基因命名为 基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
4. [2022山东，12分]某种类型的白血病由蛋白 引发，蛋白 可使 被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白 和 。 是缺失特定氨基酸序列的 ， 是一种短肽，连接在 或 的氨基端，使融合蛋白能与含有 抗体的介质结合，但不影响 或 的功能。
（1） 为构建重组载体，需先设计引物，通过 特异性扩增 基因。用于扩增 基因的引物需满足的条件是 。为使 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“ 端”或“ 端”）。
（2） 扩增得到的 基因经酶切连接插入载体后，与编码 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ ”为 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的 序列正确，翻译出的融合蛋白中 的氨基酸序列正确，但 基因对应的氨基酸序列与 不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
图甲
（3） 融合蛋白表达成功后，将 、 、药物A和 按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，检测结果如图丙所示。已知 和 不能降解 ，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测， 中缺失的特定序列的作用是 。
（4） 根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
5. [2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1） 研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2） 研究者构建了一种表达载体 ，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ，终止子的作用是 。
（3） 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4） 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
题组三
一、选择题
1. [2023湖北，2分]用氨苄青霉素抗性基因 、四环素抗性基因 作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A. 若用 Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B. 若用 Ⅰ酶切，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C. 若用 Ⅰ酶切,可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D. 若用 Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含 （氨苄青霉素）和 的培养基中能形成菌落
2. [2023浙江6月选考，2分]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因 整合到野生型小鼠 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于 扩增， 产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是( )
A. 基因的启动子无法控制 基因表达
B. 翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白
C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是 基因纯合子
D. 若用引物1和引物3进行 ,能更好地区分杂合子和纯合子
二、非选择题
3. [2023广东，14分]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥 进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 基因发生一个碱基 到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题:
（1） 拟采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
（2） 用 反应扩增 基因，用限制性核酸内切酶对 产物和 进行切割，用 连接酶将两者连接。为确保插入的 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3） 转化后， （其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
① 农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
② 阳性植株自交所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③ 将②中选出的 阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图所示，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
4. [2022北京，11分]生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白 等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体 物质监测方法。
（1） 将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
（2） 为监测 物质，研究者设计了如图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 和酵母来源的 是两种诱导型启动子，分别被 物质—受体复合物和酵母来源的 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼 。
（3） 现拟制备一种不育的监测鱼 ，用于实际监测。 需经 和另一亲本 杂交获得。欲获得 ，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：
③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（ 生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（ 肌）
Ⅱ.基因：
A. B. 4 C.雌激素受体基因 D.仅导致生殖细胞凋亡的基因
（4） 不育的原因是：成体 自身产生雌激素，与受体结合后 ，造成不育。
（5） 使拟用于实际监测的 不育的目的是 。
题组四
1. [2023浙江6月选考，14分]赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
（1） 植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
（2） 随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
① 构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）,可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
② 表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与 膜发生 ,表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③ 核移植。将转基因的 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到
了 重组细胞发育的作用。
④ 重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤ 检测。 水平检测：利用 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，
以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总 ,对总 进行 处理，以去除 污染，再经逆转录形成 ,并以此为 ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？
2. [2022天津，10分]研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1） 如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有 （卡那霉素抗性基因）和 两个标记基因，为去除筛选效率较低的 ,应选择引物 和 ，并在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列，进行 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
（2） 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包
含 （ Ⅰ/ Ⅲ/ Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
（3） 将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
（4） 用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ,且载体5上其他 片段全部丢失。该菌的表型为 。
A. 卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B. 卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C. 卡那霉素和链霉素都敏感 D. 卡那霉素和链霉素都不敏感
（5） 可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
3. [2022江苏，12分]纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1） 纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
（2） 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因 是否发生了变异,对基因 进行了 扩增与产物测序。从细胞样品中分离 时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的 分离出来，溶液中添加 至 的目的是 。
扩增时,需在 催化下，在引物 端进行 链的延伸，获得扩增产物，用于测序。
（3） 为研究蛋白质 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白 与 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将 基因融合片段 导入如图2所示载体质粒 ,构建 重组质粒（在 Ⅴ识别位点插入片段）。请完成表。
图2
图3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
鉴定正向重组质粒 （图2中融合片段 中有白色的箭头，代表方向） ①选择图2中引物 、 ； 目的产物约为 。
确保 及连接处序列正确, 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图3中正确的是 （选填序列编号）。
检测融合蛋白定位 ④对照质粒 （仅表达 ）与实验质粒 分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
（4） 为研究另一纤毛病相关基因 表达的变化，采用荧光定量 法检测健康人与病人基因 的转录水平。采集样本、提取总 ，经 形成 作为模板， 扩增结果显示，在总 模板量相等的条件下,健康人 值为15,而病人 值为20（ 值是产物荧光强度达到设定阈值时的 循环数）。从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
题组一
一、选择题
1. [2023广东，2分]“ 粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解 分离 沉淀 鉴定。下列叙述错误的是( D )
A. 裂解:使细胞破裂释放出 等物质
B. 分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀:可反复多次以提高 的纯度
D. 鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
[解析] 粗提取与鉴定实验的基本过程是：裂解、分离、沉淀、鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出 等物质， 正确。 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 与蛋白质等， 分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除， 正确。 在不同浓度的 溶液中溶解度不同，通过控制 溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高 的纯度， 正确。进行 鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化， 错误。
2. [2023浙江1月选考，2分]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( D )
A. 试管婴儿技术应全面禁止
B. 治疗性克隆不需要监控和审查
C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
[解析]试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的， 错误；对治疗性克隆要进行有效监控和严格审查， 错误；生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题， 错误。
3. [2021湖北，2分]某实验利用 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( D )
A. 增加模板 的量 B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度
[解析] 过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板 的量不会减少反应中非特异条带的产生， 项错误；延长热变性的时间，有利于双链 解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生， 项错误；延长延伸的时间，有利于合成新的 链，但不能减少反应中非特异条带的产生， 项错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合， 项正确。
二、非选择题
4. [2023全国甲理综节选，11分]接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1） 接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒（3分）。
[解析]重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。
（2） 制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是鉴别受体细胞（酵母菌）中是否含有目的基因（乙肝病毒表面抗原基因），从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 聚合酶。
[解析]抗生素抗性基因为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。启动子是一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的上游，它是 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 ，最终获得所需要的蛋白质。
（3） 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
[答案]从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，观察是否有杂交带出现。（4分）
[解析]若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，应从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已表达出目的蛋白。
5. [2022湖南节选，13分]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1） 蛋白质工程流程如图所示，物质 是多肽链，物质 是 。在生产过程中，物质 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并（一种氨基酸对应多个密码子）（2分）。
[解析]蛋白质工程的流程一般为:预期蛋白质功能 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。密码子的简并指的是同一种氨基酸可以由几种不同的密码子决定。
（2） 技术遵循的基本原理是 双链复制（2分）。
[解析] 技术遵循的基本原理是 双链复制。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类（填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是不同肽链的氨基酸数目、排列顺序不同导致功能出现差异（2分）。
[解析]由题图可知，将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量差别不大，但抗凝血活性差别较大，推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。不同肽的功能不同主要与氨基酸的数目、排列顺序不同有关。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：取四支试管，分别加入等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素，再向四支试管中各加入等量的新鲜血液，观察四支试管中血液的凝血情况（4分）。
6. [2021全国甲理综，15分] 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析 扩增结果;②从病人组织样本中提取 ;③利用 扩增 片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
（1） 若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 （3分）（用数字序号表示）。
[解析]用 技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取 ，再利用 技术扩增 片段，分析 扩增结果。
（2） 操作③中使用的酶是热稳定 聚合酶（ 酶）。 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性的结果是两种引物分别与两条单链 模板结合（3分）。
[解析]利用 扩增 片段过程中使用的酶是热稳定 聚合酶（ 酶）。 由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链 模板结合。
（3） 为了做出正确的诊断， 反应所用的引物应该能与病原菌 特异性结合。
[解析]要扩增病原菌 ，设计的引物应该能和病原菌 特异性结合。
（4） （多聚酶链式反应）技术是指根据 半保留复制的原理，在体外提供参与 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术（3分）。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
[解析]多聚酶链式反应 是一项根据 半保留复制的原理，在体外提供参与 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
7. [2021海南，11分] 是一种高效的基因编辑技术， 9基因表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 引导下，切割 双链以敲除目标基因或插入新的基因。 基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题。
（1） 过程①中，为构建 重组质粒，需对含有特定 编码序列的 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 连接酶（1分）。
[解析]基因工程中所需的工具酶有限制酶和 连接酶，限制酶负责“切割”， 连接酶负责“连接”。
（2） 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是感受态细胞法（1分）。
[解析]将目的基因导入大肠杆菌细胞常用的方法是感受态细胞法。
（3） 过程③~⑤中， 与 蛋白形成复合体，该复合体中的 可识别并与目标 序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对原则（1分）。随后， 蛋白可切割目标 上特定的核苷酸（2分）序列。
[解析] 与 蛋白形成的复合体中的 可通过碱基互补配对原则与目标 序列特异性结合。由题图可知， 蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标 上特定的核苷酸序列。
（4） 利用 基因编辑技术敲除一个长度为 的基因，在 水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 分子杂交技术（1分），基因敲除成功的判断依据是不出现杂交带（2分）。
[解析]在 水平上,可利用 分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若不出现杂交带，则说明基因敲除成功。
（5） 某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组 中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组 的编辑过程： 重组质粒中的 编码序列、 9基因分别在受体细胞内进行转录和表达， 编码序列转录的产物是 ， 9基因表达的产物是 蛋白，二者形成复合体，该复合体中的 可引导识别目标 序列，并与之结合， 蛋白在特定位点对基因组 进行切割，以便蛋白酶基因插入到基因组 中（3分）。
【高分必备】
与 相关的几种酶
项目种类 作用底物 作用结果
限制酶 分子 切开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端
连接酶 分子片段 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的 分子
聚合酶 脱氧核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的 分子
酶 分子 断开磷酸二酯键，形成脱氧核苷酸
解旋酶 分子 断开碱基对间的氢键，形成单链 分子
聚合酶 核糖核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成单链 分子
题组二
一、选择题
1. [2023新课标理综，6分]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( C )
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
[解析]只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，而且酶3切割产生平末端， 连接酶不能连接具有平末端的 片段， 错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接， 错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用 连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中， 正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因， 错误。
【高分必备】在基因工程操作中， 连接酶主要有两类:一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 连接酶；另一类是从 噬菌体中分离出来的，称为 连接酶。这两类酶都能将双链 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。 连接酶只能将具有互补黏性末端的 片段连接起来，不能连接具有平末端的 片段。而 连接酶既可以“缝合”双链 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
2. [2022辽宁，2分]抗虫和耐除草剂玉米双抗 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是( B )
A. 预变性过程可促进模板 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
[解析]预变性的温度为 ，在这个温度下，双链 解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制， 错误。延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分， 正确。延伸过程需要引物与模板链结合,在引物的 端加上相应的核苷酸， 错误。转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市， 错误。
二、非选择题
3. [2023全国乙理综节选，10分] 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以 基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库。科研人员将 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出 基因的突变基因文库。
（2） 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如图所示（箭头为 突变基因的转录方向）。图中①为终止子（1分）;②为启动子（1分），其作用是被 聚合酶识别并结合，驱动 突变基因的转录（2分）。
[解析]一个基因表达载体的组成，除了目的基因，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的上游，它是 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 ，最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 片段。
（3） 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性， 基因突变后编码的蛋白质与突变前相同（2分）（答出1点即可）。
[解析]结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即 蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性， 基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。
（4） 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的 突变基因进行测序，发现其碱基序列与 基因的不同，将该 突变基因命名为 基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是选择合适的运载体，利用合适的限制酶和 连接酶将 基因和运载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光（4分）。
[解析]基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。欲通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明 基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明 基因能在真核细胞中表达。
4. [2022山东，12分]某种类型的白血病由蛋白 引发，蛋白 可使 被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白 和 。 是缺失特定氨基酸序列的 ， 是一种短肽，连接在 或 的氨基端，使融合蛋白能与含有 抗体的介质结合，但不影响 或 的功能。
（1） 为构建重组载体，需先设计引物，通过 特异性扩增 基因。用于扩增 基因的引物需满足的条件是能与 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸（2分）。为使 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 端（2分）（填“ 端”或“ 端”）。
[解析]引物是一小段能与 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，且 复制时，子链的延伸方向为 ,因此用于扩增 基因的引物需要满足的条件是：两种引物分别与两条模板链 端的碱基序列互补配对。由于 聚合酶只能从引物的 端延伸 链，为使 产物能被限制酶切割，需要在引物的 端添加限制酶识别序列。
（2） 扩增得到的 基因经酶切连接插入载体后，与编码 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ ”为 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的 序列正确，翻译出的融合蛋白中 的氨基酸序列正确，但 基因对应的氨基酸序列与 不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 基因编码链的第一个碱基 与 Ⅰ识别序列的最后两个碱基 编码一个氨基酸，导致 的密码子被错位读取（2分）。修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是在引物中的 Ⅰ识别序列 端添加1个碱基（2分）。
图甲
[解析]分析图甲可知， 基因编码链的第一个碱基 与 Ⅰ识别序列的最后两个碱基 编码一个氨基酸 ，导致 基因对应 的密码子被错位读取，因此 基因对应的氨基酸序列发生了改变。若通过修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，则可以在引物中的 Ⅰ识别序列的 端添加1个（或 个）碱基，从而使 基因编码链编码正确的氨基酸序列。
（3） 融合蛋白表达成功后，将 、 、药物A和 按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，检测结果如图丙所示。已知 和 不能降解 ，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是增强 与 的结合（1分）；由②④组或③⑤组的差异推测， 中缺失的特定序列的作用是参与 与 的结合（1分）。
[解析]①组仅添加 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，不能分离出与介质结合的物质，不出现杂交带；②组添加 和 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，出现杂交带（较窄）；③组添加 、药物 和 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，杂交带较宽，说明药物 的作用是促进 与 的结合。分析可知，②③组出现杂交带；④⑤组没有出现杂交带，再结合②③④⑤组中添加的物质推测， 中缺失的特定序列的作用是参与 与 的结合。（4）根据（3）的分析可知，药物 可促进 与 的结合，据此推测，药物 治疗该病的机理是通过增强 与 的结合促进 被蛋白酶识别并降解，从而治疗该病。
（4） 根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是药物 通过增强 与 结合促进 降解（2分）。
5. [2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1） 研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对引物，利用 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
[解析]利用 技术扩增目标酶基因的前提是根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物。
（2） 研究者构建了一种表达载体 ，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞，终止子的作用是终止转录，使转录在所需要的地方停下来。
[解析]基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯，可使转录在所需要的地方停下来。
（3） 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
[解析]重组梭菌可大量表达题述酶蛋白，在这些酶蛋白的作用下， 等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致其生长迟缓。
（4） 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于不仅不排放 ，而且还可以消耗工业废气中的 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
[解析]根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染排放企业排出的 等一碳温室气体为原料，生产丙酮，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看,利用该技术生产丙酮的过程中不仅不排放 ，还可以消耗工业废气中的 ，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【高分必备】 复制需要引物的原因及其要求归纳
1.需要引物的原因 引物为一段已知脱氧核苷酸序列的 单链或 ，它是子链合成延伸的基础。 复制时， 聚合酶不能从 端开始合成 ，而只能从 端延伸 链，因此， 复制需要引物。当引物与 母链通过碱基互补配对结合后， 聚合酶就能从引物的 端开始延伸 链， 的合成方向总是从子链的 端向 端延伸。
2.引物必须符合的基本要求
（1）与目的基因一端碱基互补；
（2） 端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 端开始的；
（3）引物相互之间不能有多个连续的碱基互补；
（4）引物自身不能有多个连续的碱基互补。
题组三
一、选择题
1. [2023湖北，2分]用氨苄青霉素抗性基因 、四环素抗性基因 作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( D )
A. 若用 Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B. 若用 Ⅰ酶切，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C. 若用 Ⅰ酶切,可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D. 若用 Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含 （氨苄青霉素）和 的培养基中能形成菌落
[解析]若用 Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的 片段，用 连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同， 正确；若用 Ⅰ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含 （四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因， 正确；若用 Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否， 正确；若用 Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌能在含 （氨苄青霉素）的培养基中形成菌落，不能在含 （四环素）的培养基中形成菌落， 错误。
【高分必备】 图解限制酶的选择依据
（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择位于目的基因两端的限制酶，如图甲中可选择 Ⅰ。
②不能选择目的基因内部的限制酶，如图甲中不能选择 Ⅰ。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，以确保出现相同的黏性末端，如图乙中的 Ⅰ。
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶不能破坏标记基因，如图乙中限制酶 Ⅰ会破坏标记基因。
2. [2023浙江6月选考，2分]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因 整合到野生型小鼠 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于 扩增， 产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是( B )
A. 基因的启动子无法控制 基因表达
B. 翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白
C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是 基因纯合子
D. 若用引物1和引物3进行 ,能更好地区分杂合子和纯合子
[解析]由图甲可知， 基因与 基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质， 错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录 基因，再转录 基因，由于转录和翻译的方向均是沿 的 ，因此翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白， 正确；由图乙可知，大片段包含 基因编码区片段，小片段不包含 基因编码区片段，则2号小鼠是 基因纯合子，4号小鼠是野生型， 错误；若用引物1和引物3进行 ，杂合子和 基因纯合子均能扩增出条带，仅有 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子， 错误。
【考情速递】
运用新技术解决常规问题
该题灵活运用电泳技术鉴定转基因小鼠的基因型，试题新颖，反映了生物技术进步能够帮助人们解决实际问题，同时能帮助考生转变思维习惯，多角度认识常规问题，并采用多种方法解决它。
二、非选择题
3. [2023广东，14分]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥 进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 基因发生一个碱基 到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题:
（1） 拟采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型（1分）植株的种子大小相近。
[解析]据题干信息可知，突变体是由野生型 基因发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2） 用 反应扩增 基因，用限制性核酸内切酶对 产物和 质粒（1分）进行切割，用 连接酶将两者连接。为确保插入的 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子（2分）。
[解析]构建基因表达载体时，需要用限制性核酸内切酶对经过 扩增的 基因和作为运载体的 质粒进行切割。为确保插入的 基因可以正常表达， 基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。
（3） 转化后， （其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
① 农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 基因和卡那霉素抗性基因（2分）。
[解析]卡那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在含有卡那霉素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 基因和卡那霉素抗性基因。
② 阳性植株自交所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约75（2分）%的培养基中幼苗继续培养。
[解析] 阳性植株都含 基因，由于 可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入。若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3:1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约 的培养基中幼苗继续培养。
③ 将②中选出的 阳性植株自交（2分）（填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 100 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图所示，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
如图所示（2分）
[解析]将②中选出的 阳性植株自交，所得的 种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即为需要选择的植株，因此阳性率达到 的培养基中的幼苗为目标转基因植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性核酸内切酶 的识别序列，不能被该酶切割，已知 基因的长度为 ，因此，野生型相关基因被限制性核酸内切酶 切割并电泳后得到的条带为 。突变型相关基因中含有限制性核酸内切酶 的识别序列，用该酶切割后，突变基因被切割成 、 两种 片段，经电泳后得到的条带为 和 。突变型和野生型相关基因经限制性核酸内切酶 切割并电泳后得到的结果见答案。
【考情速递】
创新考遗传，绘制电泳条带
该题将孟德尔遗传规律的应用与基因工程创新结合起来进行考查，考查了基因表达载体的构建、遗传规律的应用及相关计算、核酸电泳等知识，其中第（3）小题的最后一问要求考生在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑，设问创新，考点创新。
4. [2022北京，11分]生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白 等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体 物质监测方法。
（1） 将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射（1分）。
[解析]可通过显微注射将表达载体导入斑马鱼受精卵。
（2） 为监测 物质，研究者设计了如图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 和酵母来源的 是两种诱导型启动子，分别被 物质—受体复合物和酵母来源的 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1相比，方案2的主要优势是监测灵敏度更高（2分），因而被用于制备监测鱼 。
[解析]方案1中， 物质与受体结合形成 物质—受体复合物，该复合物可激活 ，进而启动 基因表达；而方案2中， 物质与受体结合形成 物质—受体复合物，该复合物激活 ，进而启动 4基因表达，产生 蛋白， 蛋白再激活 ， 可启动 基因表达。由于级联反应，与方案1相比，方案2的监测灵敏度会更高。
（3） 现拟制备一种不育的监测鱼 ，用于实际监测。 需经 和另一亲本 杂交获得。欲获得 ，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：□②（2分）
③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（ 生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（ 肌）
Ⅱ.基因：□ D（2分）
A. B. 4 C.雌激素受体基因 D.仅导致生殖细胞凋亡的基因
[解析]现拟制备一种不育的监测鱼 ，亲本 是可以产生配子的，同时保证亲本 和 的后代 既可以监测到物质 ，又是不育的。导入 的基因，应该是与不育相关的基因，则应该为仅导致生殖细胞凋亡的基因 。雌激素类物质可以使启动子 活化，则导入 的启动子不能为①； 是可以正常产生配子的，故启动子不能选择③；选择启动子④则无法使 不育，故启动子最好选择②。获得 的机理简单表述如下：由于亲本 中不含有 基因编码的 蛋白，则在亲本 的细胞内，启动子 不发挥作用，仅导致生殖细胞凋亡的基因 也不会表达，而在 和 的后代 细胞中会同时出现 基因编码的 蛋白和启动子 ，所以基因 可以在 细胞中表达，使 的生殖细胞凋亡，从而使 不育。
（4） 不育的原因是：成体 自身产生雌激素，与受体结合后激活 ，诱导 4基因表达， 蛋白结合 诱导 表达，生殖细胞凋亡（2分），造成不育。
[解析]结合第（3）小问的分析可知，成体 自身会产生雌激素（E物质），与受体结合后激活 ,诱导 4基因表达， 蛋白与 结合,诱导仅导致生殖细胞凋亡的基因 表达，生殖细胞凋亡，造成不育。
（5） 使拟用于实际监测的 不育的目的是避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题（2分）。
[解析]在研究中选取不育的斑马鱼是因为这样设计可以避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题。
题组四
1. [2023浙江6月选考，14分]赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
（1） 植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。根据这种调节方式，在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物（2分）,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
[解析]通过抑制或减弱一开始的变化，维持物质含量稳定，这种调节方式属于负反馈调节。人为添加一定浓度的赖氨酸类似物，使不抗赖氨酸类似物的细胞死亡，而抗赖氨酸类似物的细胞突变体能够存活。
（2） 随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
① 构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）,可通过检索生物信息数据库/遗传序列数据库（2分）获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
[解析]可通过检索生物信息数据库（或遗传序列数据库）获取目的基因的编码序列。
② 表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与 膜发生融合,表达载体最终进入细胞核，发生转化。
[解析]脂质体由磷脂等构成，脂质体可以与牛胚胎成纤维细胞的细胞膜发生融合，从而使表达载体进入细胞，最终进入细胞核，发生转化。
③ 核移植。将转基因的 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为受体细胞。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
[解析]卵母细胞去核后作为受体细胞。经核移植的重组细胞需利用电刺激进行胚激活。
④ 重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至早期囊胚，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
[解析]将重组细胞体外培养至早期囊胚后，可移植至代孕母牛子宫角。
⑤ 检测。 水平检测：利用 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以转基因牛耳组织细胞为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总 ,对总 进行 酶处理，以去除 污染，再经逆转录形成 ,并以此为模板,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？构建的表达载体含乳腺特异性启动子，使目的基因仅在乳腺细胞中表达（2分）。
[解析] 水平检测的目的是检测转基因牛中是否含有目的基因。分析可知，可以转基因牛耳组织细胞作为阳性对照。进行 水平检测时，需利用 酶（ 水解酶）处理总 ，以去除 污染。 经逆转录形成的 可作为 扩增的模板，通过 技术可获取大量的目的基因片段。目的基因只在转基因牛乳腺细胞中表达的原因是在构建基因表达载体时，将目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出了乳腺专一表达载体，该表达载体中的特异性启动子使目的基因仅在乳腺细胞中表达，而不会在其他细胞中表达。
【考情速递】
把知识形成过程作为考试内容
高考生物试题情境来源丰富，从设计实验方案、分析实验结果等多个维度考查考生的实验探究能力，引导考生注重科学思维素养的培养。该题在考查阳性对照和阴性对照的设置以及对实验结果的分析和讨论等的同时，引导考生提高运用生物技术解决实际问题的意识，探究过程就是知识形成过程，亦是考试内容，符合深度学习的趋势。
2. [2022天津，10分]研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1） 如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有 （卡那霉素抗性基因）和 两个标记基因，为去除筛选效率较低的 ,应选择引物1和4，并在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列，进行 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
[解析]据题中信息知，选择引物1和4扩增出来的片段不含 基因，故为去除筛选效率较低的 基因，应选择引物1和4。 时，引物与单链 结合后，从引物的 端开始延伸，故应在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列。
（2） 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包含 Ⅰ（2分）（ Ⅰ/ Ⅲ/ Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
[解析]分析题图可知，利用载体2构建载体4时，只使用了 Ⅰ限制酶，故扩增出的 基因片段应含 Ⅰ酶识别序列，所以 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包含 Ⅰ酶识别序列。
（3） 将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素（2分）的平板进行初步筛选。
[解析]分析可知，受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感，而载体5上具有 （链霉素敏感基因）和 （卡那霉素抗性基因），故为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4） 用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ,且载体5上其他 片段全部丢失。该菌的表型为B。
A. 卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B. 卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C. 卡那霉素和链霉素都敏感 D. 卡那霉素和链霉素都不敏感
[解析]据题意知， 基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ，载体5上其他 片段全部丢失，所以该菌的表型依然是受体菌的表型，即链霉素不敏感、卡那霉素敏感， 选项符合题意。
（5） 可采用 （聚合酶链式反应，答案合理即可）技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
[解析]提取受体菌的 ，以该 为模板，采用P1基因特异性引物进行 扩增，若获得大量P1基因，即可确定该菌株成功整合了P1基因。
3. [2022江苏，12分]纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1） 纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是参与纺锤体的形成。
[解析]细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。中心体可参与纺锤体的形成,其与有丝分裂有关。
（2） 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因 是否发生了变异,对基因 进行了 扩增与产物测序。从细胞样品中分离 时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的 分离出来，溶液中添加 至 的目的是溶解 。
扩增时,需在耐高温的 聚合酶（ 酶）催化下，在引物 端进行 链的延伸，获得扩增产物，用于测序。
[解析] 在 的 溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度， 的溶解度均会下降，因此实验过程中添加 至 的目的是溶解 。 扩增时，需在耐高温的 聚合酶（ 酶）的催化下，在引物的 端进行 链的延伸，获得扩增产物。
（3） 为研究蛋白质 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白 与 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将 基因融合片段 导入如图2所示载体质粒 ,构建 重组质粒（在 Ⅴ识别位点插入片段）。请完成表。
图2
图3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
鉴定正向重组质粒 （图2中融合片段 中有白色的箭头，代表方向） ①选择图2中引物 、 ； 目的产物约为 。
确保 及连接处序列正确, 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图3中正确的是 （选填序列编号）。
检测融合蛋白定位 ④对照质粒 （仅表达 ）与实验质粒 分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 蛋白定位在纤毛基部。
[解析]据题图可知，应选择图2中的引物 和引物 ， 目的产物约为 。结合题中信息知， 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列，又知构建 重组质粒时，在 Ⅴ识别位点插入片段，则 连接处测序后部分序列应含 Ⅴ的识别序列，根据各限制酶识别序列分析，质粒测序正确的是 。
（4） 为研究另一纤毛病相关基因 表达的变化，采用荧光定量 法检测健康人与病人基因 的转录水平。采集样本、提取总 ，经逆转录形成 作为模板， 扩增结果显示，在总 模板量相等的条件下,健康人 值为15,而病人 值为20（ 值是产物荧光强度达到设定阈值时的 循环数）。从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的32（2分）倍。
[解析] 在逆转录酶的作用下可形成 。结合题中信息知，在总 模板量相等的条件下，健康人 值为15，而病人 值为20，说明病人的基因 表达水平较低，设健康人 基因的 数为 ，病人 基因的 数为 ，则有 ，从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 （倍）。
21世纪教育网 www.21cnjy.com 精品试卷·第 2 页 （共 2 页）
21世纪教育网(www.21cnjy.com)
2019-2023年生物学高考真题分类
专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
题组一
一、选择题
1. [2023广东，2分]“ 粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解 分离 沉淀 鉴定。下列叙述错误的是( )
A. 裂解:使细胞破裂释放出 等物质
B. 分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀:可反复多次以提高 的纯度
D. 鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2. [2023浙江1月选考，2分]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A. 试管婴儿技术应全面禁止
B. 治疗性克隆不需要监控和审查
C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
3. [2021湖北，2分]某实验利用 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A. 增加模板 的量 B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度
二、非选择题
4. [2023全国甲理综节选，11分]接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1） 接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
（2） 制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
（3） 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
5. [2022湖南节选，13分]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1） 蛋白质工程流程如图所示，物质 是 ，物质 是 。在生产过程中，物质 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
（2） 技术遵循的基本原理是 。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是 。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路： 。
6. [2021全国甲理综，15分] 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析 扩增结果;②从病人组织样本中提取 ;③利用 扩增 片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
（1） 若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2） 操作③中使用的酶是 。 反应中的每次循环可分为变性、复性、 三步,其中复性的结果是 。
（3） 为了做出正确的诊断， 反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4） （多聚酶链式反应）技术是指 。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
7. [2021海南，11分] 是一种高效的基因编辑技术， 9基因表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 引导下，切割 双链以敲除目标基因或插入新的基因。 基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题。
（1） 过程①中，为构建 重组质粒，需对含有特定 编码序列的 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
（2） 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
（3） 过程③~⑤中， 与 蛋白形成复合体，该复合体中的 可识别并与目标 序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后， 蛋白可切割 序列。
（4） 利用 基因编辑技术敲除一个长度为 的基因，在 水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
（5） 某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组 中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组 的编辑过程： 。
题组二
一、选择题
1. [2023新课标理综，6分]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
2. [2022辽宁，2分]抗虫和耐除草剂玉米双抗 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A. 预变性过程可促进模板 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
二、非选择题
3. [2023全国乙理综节选，10分] 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以 基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库。科研人员将 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出 基因的突变基因文库。
（2） 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如图所示（箭头为 突变基因的转录方向）。图中①为 ;②为 ，其作用是 。
（3） 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 （答出1点即可）。
（4） 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的 突变基因进行测序，发现其碱基序列与 基因的不同，将该 突变基因命名为 基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
4. [2022山东，12分]某种类型的白血病由蛋白 引发，蛋白 可使 被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白 和 。 是缺失特定氨基酸序列的 ， 是一种短肽，连接在 或 的氨基端，使融合蛋白能与含有 抗体的介质结合，但不影响 或 的功能。
（1） 为构建重组载体，需先设计引物，通过 特异性扩增 基因。用于扩增 基因的引物需满足的条件是 。为使 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“ 端”或“ 端”）。
（2） 扩增得到的 基因经酶切连接插入载体后，与编码 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ ”为 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的 序列正确，翻译出的融合蛋白中 的氨基酸序列正确，但 基因对应的氨基酸序列与 不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
图甲
（3） 融合蛋白表达成功后，将 、 、药物A和 按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，检测结果如图丙所示。已知 和 不能降解 ，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测， 中缺失的特定序列的作用是 。
（4） 根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
5. [2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1） 研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
（2） 研究者构建了一种表达载体 ，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是 ，终止子的作用是 。
（3） 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 ，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
（4） 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
题组三
一、选择题
1. [2023湖北，2分]用氨苄青霉素抗性基因 、四环素抗性基因 作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A. 若用 Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B. 若用 Ⅰ酶切，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C. 若用 Ⅰ酶切,可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D. 若用 Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含 （氨苄青霉素）和 的培养基中能形成菌落
2. [2023浙江6月选考，2分]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因 整合到野生型小鼠 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于 扩增， 产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是( )
A. 基因的启动子无法控制 基因表达
B. 翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白
C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是 基因纯合子
D. 若用引物1和引物3进行 ,能更好地区分杂合子和纯合子
二、非选择题
3. [2023广东，14分]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥 进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 基因发生一个碱基 到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题:
（1） 拟采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
（2） 用 反应扩增 基因，用限制性核酸内切酶对 产物和 进行切割，用 连接酶将两者连接。为确保插入的 基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3） 转化后， （其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
① 农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
② 阳性植株自交所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③ 将②中选出的 阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图所示，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
4. [2022北京，11分]生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白 等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体 物质监测方法。
（1） 将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
（2） 为监测 物质，研究者设计了如图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 和酵母来源的 是两种诱导型启动子，分别被 物质—受体复合物和酵母来源的 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼 。
（3） 现拟制备一种不育的监测鱼 ，用于实际监测。 需经 和另一亲本 杂交获得。欲获得 ，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：
③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（ 生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（ 肌）
Ⅱ.基因：
A. B. 4 C.雌激素受体基因 D.仅导致生殖细胞凋亡的基因
（4） 不育的原因是：成体 自身产生雌激素，与受体结合后 ，造成不育。
（5） 使拟用于实际监测的 不育的目的是 。
题组四
1. [2023浙江6月选考，14分]赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
（1） 植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
（2） 随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
① 构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）,可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
② 表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与 膜发生 ,表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③ 核移植。将转基因的 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到
了 重组细胞发育的作用。
④ 重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤ 检测。 水平检测：利用 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，
以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总 ,对总 进行 处理，以去除 污染，再经逆转录形成 ,并以此为 ,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？
2. [2022天津，10分]研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1） 如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有 （卡那霉素抗性基因）和 两个标记基因，为去除筛选效率较低的 ,应选择引物 和 ，并在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列，进行 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
（2） 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包
含 （ Ⅰ/ Ⅲ/ Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
（3） 将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
（4） 用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ,且载体5上其他 片段全部丢失。该菌的表型为 。
A. 卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B. 卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C. 卡那霉素和链霉素都敏感 D. 卡那霉素和链霉素都不敏感
（5） 可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
3. [2022江苏，12分]纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1） 纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
（2） 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因 是否发生了变异,对基因 进行了 扩增与产物测序。从细胞样品中分离 时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的 分离出来，溶液中添加 至 的目的是 。
扩增时,需在 催化下，在引物 端进行 链的延伸，获得扩增产物，用于测序。
（3） 为研究蛋白质 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白 与 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将 基因融合片段 导入如图2所示载体质粒 ,构建 重组质粒（在 Ⅴ识别位点插入片段）。请完成表。
图2
图3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
鉴定正向重组质粒 （图2中融合片段 中有白色的箭头，代表方向） ①选择图2中引物 、 ； 目的产物约为 。
确保 及连接处序列正确, 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图3中正确的是 （选填序列编号）。
检测融合蛋白定位 ④对照质粒 （仅表达 ）与实验质粒 分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
（4） 为研究另一纤毛病相关基因 表达的变化，采用荧光定量 法检测健康人与病人基因 的转录水平。采集样本、提取总 ，经 形成 作为模板， 扩增结果显示，在总 模板量相等的条件下,健康人 值为15,而病人 值为20（ 值是产物荧光强度达到设定阈值时的 循环数）。从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
专题二十一 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题
题组一
一、选择题
1. [2023广东，2分]“ 粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解 分离 沉淀 鉴定。下列叙述错误的是( D )
A. 裂解:使细胞破裂释放出 等物质
B. 分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀:可反复多次以提高 的纯度
D. 鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
[解析] 粗提取与鉴定实验的基本过程是：裂解、分离、沉淀、鉴定。裂解的目的是使细胞破裂，释放出 等物质， 正确。 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离 与蛋白质等， 分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除， 正确。 在不同浓度的 溶液中溶解度不同，通过控制 溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高 的纯度， 正确。进行 鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化， 错误。
2. [2023浙江1月选考，2分]以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( D )
A. 试管婴儿技术应全面禁止
B. 治疗性克隆不需要监控和审查
C. 生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D. 我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
[解析]试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的， 错误；对治疗性克隆要进行有效监控和严格审查， 错误；生殖性克隆会引起严重的道德、伦理、社会和法律问题， 错误。
3. [2021湖北，2分]某实验利用 技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( D )
A. 增加模板 的量 B. 延长热变性的时间
C. 延长延伸的时间 D. 提高复性的温度
[解析] 过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板 的量不会减少反应中非特异条带的产生， 项错误；延长热变性的时间，有利于双链 解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生， 项错误；延长延伸的时间，有利于合成新的 链，但不能减少反应中非特异条带的产生， 项错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合， 项正确。
二、非选择题
4. [2023全国甲理综节选，11分]接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种 病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
（1） 接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒（3分）。
[解析]重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，故接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒。
（2） 制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是鉴别受体细胞（酵母菌）中是否含有目的基因（乙肝病毒表面抗原基因），从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 聚合酶。
[解析]抗生素抗性基因为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。启动子是一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的上游，它是 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 ，最终获得所需要的蛋白质。
（3） 若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
[答案]从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，观察是否有杂交带出现。（4分）
[解析]若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，应从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已表达出目的蛋白。
5. [2022湖南节选，13分]水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
（1） 蛋白质工程流程如图所示，物质 是多肽链，物质 是 。在生产过程中，物质 可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并（一种氨基酸对应多个密码子）（2分）。
[解析]蛋白质工程的流程一般为:预期蛋白质功能 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。密码子的简并指的是同一种氨基酸可以由几种不同的密码子决定。
（2） 技术遵循的基本原理是 双链复制（2分）。
[解析] 技术遵循的基本原理是 双链复制。
（3） 将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类（填“种类”或“含量”）有关，其活性不同的原因是不同肽链的氨基酸数目、排列顺序不同导致功能出现差异（2分）。
[解析]由题图可知，将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，水解产物中的肽含量差别不大，但抗凝血活性差别较大，推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。不同肽的功能不同主要与氨基酸的数目、排列顺序不同有关。
（4） 若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：取四支试管，分别加入等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素，再向四支试管中各加入等量的新鲜血液，观察四支试管中血液的凝血情况（4分）。
6. [2021全国甲理综，15分] 技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌,医生进行了相关操作:①分析 扩增结果;②从病人组织样本中提取 ;③利用 扩增 片段;④采集病人组织样本。回答下列问题:
（1） 若要得到正确的检测结果,正确的操作顺序应该是 （3分）（用数字序号表示）。
[解析]用 技术进行临床的病原菌检测时，首先应采集病人组织样本，从病人组织样本中提取 ，再利用 技术扩增 片段，分析 扩增结果。
（2） 操作③中使用的酶是热稳定 聚合酶（ 酶）。 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步,其中复性的结果是两种引物分别与两条单链 模板结合（3分）。
[解析]利用 扩增 片段过程中使用的酶是热稳定 聚合酶（ 酶）。 由变性—复性—延伸三个基本反应步骤构成，其中复性的结果是两种引物分别与两条单链 模板结合。
（3） 为了做出正确的诊断， 反应所用的引物应该能与病原菌 特异性结合。
[解析]要扩增病原菌 ，设计的引物应该能和病原菌 特异性结合。
（4） （多聚酶链式反应）技术是指根据 半保留复制的原理，在体外提供参与 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术（3分）。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
[解析]多聚酶链式反应 是一项根据 半保留复制的原理，在体外提供参与 复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
7. [2021海南，11分] 是一种高效的基因编辑技术， 9基因表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导 引导下，切割 双链以敲除目标基因或插入新的基因。 基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题。
（1） 过程①中，为构建 重组质粒，需对含有特定 编码序列的 进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 连接酶（1分）。
[解析]基因工程中所需的工具酶有限制酶和 连接酶，限制酶负责“切割”， 连接酶负责“连接”。
（2） 过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是感受态细胞法（1分）。
[解析]将目的基因导入大肠杆菌细胞常用的方法是感受态细胞法。
（3） 过程③~⑤中， 与 蛋白形成复合体，该复合体中的 可识别并与目标 序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对原则（1分）。随后， 蛋白可切割目标 上特定的核苷酸（2分）序列。
[解析] 与 蛋白形成的复合体中的 可通过碱基互补配对原则与目标 序列特异性结合。由题图可知， 蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标 上特定的核苷酸序列。
（4） 利用 基因编辑技术敲除一个长度为 的基因，在 水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 分子杂交技术（1分），基因敲除成功的判断依据是不出现杂交带（2分）。
[解析]在 水平上,可利用 分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若不出现杂交带，则说明基因敲除成功。
（5） 某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到 质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组 中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述 重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组 的编辑过程： 重组质粒中的 编码序列、 9基因分别在受体细胞内进行转录和表达， 编码序列转录的产物是 ， 9基因表达的产物是 蛋白，二者形成复合体，该复合体中的 可引导识别目标 序列，并与之结合， 蛋白在特定位点对基因组 进行切割，以便蛋白酶基因插入到基因组 中（3分）。
【高分必备】
与 相关的几种酶
项目种类 作用底物 作用结果
限制酶 分子 切开磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端
连接酶 分子片段 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的 分子
聚合酶 脱氧核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成新的 分子
酶 分子 断开磷酸二酯键，形成脱氧核苷酸
解旋酶 分子 断开碱基对间的氢键，形成单链 分子
聚合酶 核糖核苷酸 通过形成磷酸二酯键，进而形成单链 分子
题组二
一、选择题
1. [2023新课标理综，6分]某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( C )
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
[解析]只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，而且酶3切割产生平末端， 连接酶不能连接具有平末端的 片段， 错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接， 错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用 连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中， 正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因， 错误。
【高分必备】在基因工程操作中， 连接酶主要有两类:一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为 连接酶；另一类是从 噬菌体中分离出来的，称为 连接酶。这两类酶都能将双链 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。 连接酶只能将具有互补黏性末端的 片段连接起来，不能连接具有平末端的 片段。而 连接酶既可以“缝合”双链 片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链 片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
2. [2022辽宁，2分]抗虫和耐除草剂玉米双抗 是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用 方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是( B )
A. 预变性过程可促进模板 边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
[解析]预变性的温度为 ，在这个温度下，双链 解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制， 错误。延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分， 正确。延伸过程需要引物与模板链结合,在引物的 端加上相应的核苷酸， 错误。转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市， 错误。
二、非选择题
3. [2023全国乙理综节选，10分] 是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以 基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
（1）构建突变基因文库。科研人员将 基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出 基因的突变基因文库。
（2） 构建目的基因表达载体。科研人员从构建的 突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如图所示（箭头为 突变基因的转录方向）。图中①为终止子（1分）;②为启动子（1分），其作用是被 聚合酶识别并结合，驱动 突变基因的转录（2分）。
[解析]一个基因表达载体的组成，除了目的基因，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的 片段，位于基因的上游，它是 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 ，最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的 片段。
（3） 目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性， 基因突变后编码的蛋白质与突变前相同（2分）（答出1点即可）。
[解析]结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即 蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性， 基因突变后编码的蛋白质与突变前的相同。
（4） 新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的 突变基因进行测序，发现其碱基序列与 基因的不同，将该 突变基因命名为 基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，实验思路是选择合适的运载体，利用合适的限制酶和 连接酶将 基因和运载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光（4分）。
[解析]基因工程的基本操作程序包括：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。欲通过基因工程的方法探究 基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明 基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明 基因能在真核细胞中表达。
4. [2022山东，12分]某种类型的白血病由蛋白 引发，蛋白 可使 被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白 和 。 是缺失特定氨基酸序列的 ， 是一种短肽，连接在 或 的氨基端，使融合蛋白能与含有 抗体的介质结合，但不影响 或 的功能。
（1） 为构建重组载体，需先设计引物，通过 特异性扩增 基因。用于扩增 基因的引物需满足的条件是能与 基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸（2分）。为使 产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 端（2分）（填“ 端”或“ 端”）。
[解析]引物是一小段能与 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，且 复制时，子链的延伸方向为 ,因此用于扩增 基因的引物需要满足的条件是：两种引物分别与两条模板链 端的碱基序列互补配对。由于 聚合酶只能从引物的 端延伸 链，为使 产物能被限制酶切割，需要在引物的 端添加限制酶识别序列。
（2） 扩增得到的 基因经酶切连接插入载体后，与编码 的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ ”为 基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的 序列正确，翻译出的融合蛋白中 的氨基酸序列正确，但 基因对应的氨基酸序列与 不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 基因编码链的第一个碱基 与 Ⅰ识别序列的最后两个碱基 编码一个氨基酸，导致 的密码子被错位读取（2分）。修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是在引物中的 Ⅰ识别序列 端添加1个碱基（2分）。
图甲
[解析]分析图甲可知， 基因编码链的第一个碱基 与 Ⅰ识别序列的最后两个碱基 编码一个氨基酸 ，导致 基因对应 的密码子被错位读取，因此 基因对应的氨基酸序列发生了改变。若通过修改扩增 基因时使用的带有 Ⅰ识别序列的引物来解决该问题，则可以在引物中的 Ⅰ识别序列的 端添加1个（或 个）碱基，从而使 基因编码链编码正确的氨基酸序列。
（3） 融合蛋白表达成功后，将 、 、药物A和 按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，检测结果如图丙所示。已知 和 不能降解 ，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是增强 与 的结合（1分）；由②④组或③⑤组的差异推测， 中缺失的特定序列的作用是参与 与 的结合（1分）。
[解析]①组仅添加 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，不能分离出与介质结合的物质，不出现杂交带；②组添加 和 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，出现杂交带（较窄）；③组添加 、药物 和 ，样品混匀后流经含 抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用 抗体检测，杂交带较宽，说明药物 的作用是促进 与 的结合。分析可知，②③组出现杂交带；④⑤组没有出现杂交带，再结合②③④⑤组中添加的物质推测， 中缺失的特定序列的作用是参与 与 的结合。（4）根据（3）的分析可知，药物 可促进 与 的结合，据此推测，药物 治疗该病的机理是通过增强 与 的结合促进 被蛋白酶识别并降解，从而治疗该病。
（4） 根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是药物 通过增强 与 结合促进 降解（2分）。
5. [2022广东，12分]“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含 等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
（1） 研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对引物，利用 技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
[解析]利用 技术扩增目标酶基因的前提是根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物。
（2） 研究者构建了一种表达载体 ，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞，终止子的作用是终止转录，使转录在所需要的地方停下来。
[解析]基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。终止子相当于一盏红色信号灯，可使转录在所需要的地方停下来。
（3） 培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是 等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
[解析]重组梭菌可大量表达题述酶蛋白，在这些酶蛋白的作用下， 等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致其生长迟缓。
（4） 这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于不仅不排放 ，而且还可以消耗工业废气中的 ，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
[解析]根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染排放企业排出的 等一碳温室气体为原料，生产丙酮，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看,利用该技术生产丙酮的过程中不仅不排放 ，还可以消耗工业废气中的 ，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【高分必备】 复制需要引物的原因及其要求归纳
1.需要引物的原因 引物为一段已知脱氧核苷酸序列的 单链或 ，它是子链合成延伸的基础。 复制时， 聚合酶不能从 端开始合成 ，而只能从 端延伸 链，因此， 复制需要引物。当引物与 母链通过碱基互补配对结合后， 聚合酶就能从引物的 端开始延伸 链， 的合成方向总是从子链的 端向 端延伸。
2.引物必须符合的基本要求
（1）与目的基因一端碱基互补；
（2） 端不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从 端开始的；
（3）引物相互之间不能有多个连续的碱基互补；
（4）引物自身不能有多个连续的碱基互补。
题组三
一、选择题
1. [2023湖北，2分]用氨苄青霉素抗性基因 、四环素抗性基因 作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的 片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( D )
A. 若用 Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B. 若用 Ⅰ酶切，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C. 若用 Ⅰ酶切,可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D. 若用 Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含 （氨苄青霉素）和 的培养基中能形成菌落
[解析]若用 Ⅲ酶切质粒和含有目的基因的 片段，用 连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同， 正确；若用 Ⅰ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含 （四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含 （四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因， 正确；若用 Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过 凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否， 正确；若用 Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌能在含 （氨苄青霉素）的培养基中形成菌落，不能在含 （四环素）的培养基中形成菌落， 错误。
【高分必备】 图解限制酶的选择依据
（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择位于目的基因两端的限制酶，如图甲中可选择 Ⅰ。
②不能选择目的基因内部的限制酶，如图甲中不能选择 Ⅰ。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，以确保出现相同的黏性末端，如图乙中的 Ⅰ。
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶不能破坏标记基因，如图乙中限制酶 Ⅰ会破坏标记基因。
2. [2023浙江6月选考，2分]某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因 整合到野生型小鼠 基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得 基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于 扩增， 产物电泳结果如图乙所示。
图甲
图乙
下列叙述正确的是( B )
A. 基因的启动子无法控制 基因表达
B. 翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白
C. 2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是 基因纯合子
D. 若用引物1和引物3进行 ,能更好地区分杂合子和纯合子
[解析]由图甲可知， 基因与 基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质， 错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录 基因，再转录 基因，由于转录和翻译的方向均是沿 的 ，因此翻译时先合成 蛋白，再合成 蛋白， 正确；由图乙可知，大片段包含 基因编码区片段，小片段不包含 基因编码区片段，则2号小鼠是 基因纯合子，4号小鼠是野生型， 错误；若用引物1和引物3进行 ，杂合子和 基因纯合子均能扩增出条带，仅有 基因时无法扩增出条带，不利于区分杂合子和纯合子， 错误。
【考情速递】
运用新技术解决常规问题
该题灵活运用电泳技术鉴定转基因小鼠的基因型，试题新颖，反映了生物技术进步能够帮助人们解决实际问题，同时能帮助考生转变思维习惯，多角度认识常规问题，并采用多种方法解决它。
二、非选择题
3. [2023广东，14分]种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥 进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型 基因发生一个碱基 到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题:
（1） 拟采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型（1分）植株的种子大小相近。
[解析]据题干信息可知，突变体是由野生型 基因发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型 基因转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2） 用 反应扩增 基因，用限制性核酸内切酶对 产物和 质粒（1分）进行切割，用 连接酶将两者连接。为确保插入的 基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子（2分）。
[解析]构建基因表达载体时，需要用限制性核酸内切酶对经过 扩增的 基因和作为运载体的 质粒进行切割。为确保插入的 基因可以正常表达， 基因（目的基因）的上下游需具备启动子和终止子。
（3） 转化后， （其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
① 农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 基因和卡那霉素抗性基因（2分）。
[解析]卡那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化 植株并自交，将 种子播种在含有卡那霉素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 基因和卡那霉素抗性基因。
② 阳性植株自交所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约75（2分）%的培养基中幼苗继续培养。
[解析] 阳性植株都含 基因，由于 可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入。若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3:1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约 的培养基中幼苗继续培养。
③ 将②中选出的 阳性植株自交（2分）（填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的 种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 100 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用 扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶 切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图所示，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
如图所示（2分）
[解析]将②中选出的 阳性植株自交，所得的 种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即为需要选择的植株，因此阳性率达到 的培养基中的幼苗为目标转基因植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性核酸内切酶 的识别序列，不能被该酶切割，已知 基因的长度为 ，因此，野生型相关基因被限制性核酸内切酶 切割并电泳后得到的条带为 。突变型相关基因中含有限制性核酸内切酶 的识别序列，用该酶切割后，突变基因被切割成 、 两种 片段，经电泳后得到的条带为 和 。突变型和野生型相关基因经限制性核酸内切酶 切割并电泳后得到的结果见答案。
【考情速递】
创新考遗传，绘制电泳条带
该题将孟德尔遗传规律的应用与基因工程创新结合起来进行考查，考查了基因表达载体的构建、遗传规律的应用及相关计算、核酸电泳等知识，其中第（3）小题的最后一问要求考生在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑，设问创新，考点创新。
4. [2022北京，11分]生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在 物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白 等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体 物质监测方法。
（1） 将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射（1分）。
[解析]可通过显微注射将表达载体导入斑马鱼受精卵。
（2） 为监测 物质，研究者设计了如图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中 和酵母来源的 是两种诱导型启动子，分别被 物质—受体复合物和酵母来源的 蛋白特异性激活，启动下游基因表达。
与方案1相比，方案2的主要优势是监测灵敏度更高（2分），因而被用于制备监测鱼 。
[解析]方案1中， 物质与受体结合形成 物质—受体复合物，该复合物可激活 ，进而启动 基因表达；而方案2中， 物质与受体结合形成 物质—受体复合物，该复合物激活 ，进而启动 4基因表达，产生 蛋白， 蛋白再激活 ， 可启动 基因表达。由于级联反应，与方案1相比，方案2的监测灵敏度会更高。
（3） 现拟制备一种不育的监测鱼 ，用于实际监测。 需经 和另一亲本 杂交获得。欲获得 ，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：□②（2分）
③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（ 生） ④使基因仅在肌细胞表达的启动子（ 肌）
Ⅱ.基因：□ D（2分）
A. B. 4 C.雌激素受体基因 D.仅导致生殖细胞凋亡的基因
[解析]现拟制备一种不育的监测鱼 ，亲本 是可以产生配子的，同时保证亲本 和 的后代 既可以监测到物质 ，又是不育的。导入 的基因，应该是与不育相关的基因，则应该为仅导致生殖细胞凋亡的基因 。雌激素类物质可以使启动子 活化，则导入 的启动子不能为①； 是可以正常产生配子的，故启动子不能选择③；选择启动子④则无法使 不育，故启动子最好选择②。获得 的机理简单表述如下：由于亲本 中不含有 基因编码的 蛋白，则在亲本 的细胞内，启动子 不发挥作用，仅导致生殖细胞凋亡的基因 也不会表达，而在 和 的后代 细胞中会同时出现 基因编码的 蛋白和启动子 ，所以基因 可以在 细胞中表达，使 的生殖细胞凋亡，从而使 不育。
（4） 不育的原因是：成体 自身产生雌激素，与受体结合后激活 ，诱导 4基因表达， 蛋白结合 诱导 表达，生殖细胞凋亡（2分），造成不育。
[解析]结合第（3）小问的分析可知，成体 自身会产生雌激素（E物质），与受体结合后激活 ,诱导 4基因表达， 蛋白与 结合,诱导仅导致生殖细胞凋亡的基因 表达，生殖细胞凋亡，造成不育。
（5） 使拟用于实际监测的 不育的目的是避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题（2分）。
[解析]在研究中选取不育的斑马鱼是因为这样设计可以避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题。
题组四
1. [2023浙江6月选考，14分]赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
（1） 植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。根据这种调节方式，在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物（2分）,用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
[解析]通过抑制或减弱一开始的变化，维持物质含量稳定，这种调节方式属于负反馈调节。人为添加一定浓度的赖氨酸类似物，使不抗赖氨酸类似物的细胞死亡，而抗赖氨酸类似物的细胞突变体能够存活。
（2） 随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
① 构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因）,可通过检索生物信息数据库/遗传序列数据库（2分）获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
[解析]可通过检索生物信息数据库（或遗传序列数据库）获取目的基因的编码序列。
② 表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与 膜发生融合,表达载体最终进入细胞核，发生转化。
[解析]脂质体由磷脂等构成，脂质体可以与牛胚胎成纤维细胞的细胞膜发生融合，从而使表达载体进入细胞，最终进入细胞核，发生转化。
③ 核移植。将转基因的 作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为受体细胞。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
[解析]卵母细胞去核后作为受体细胞。经核移植的重组细胞需利用电刺激进行胚激活。
④ 重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至早期囊胚，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
[解析]将重组细胞体外培养至早期囊胚后，可移植至代孕母牛子宫角。
⑤ 检测。 水平检测：利用 技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以转基因牛耳组织细胞为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。 水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总 ,对总 进行 酶处理，以去除 污染，再经逆转录形成 ,并以此为模板,利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？构建的表达载体含乳腺特异性启动子，使目的基因仅在乳腺细胞中表达（2分）。
[解析] 水平检测的目的是检测转基因牛中是否含有目的基因。分析可知，可以转基因牛耳组织细胞作为阳性对照。进行 水平检测时，需利用 酶（ 水解酶）处理总 ，以去除 污染。 经逆转录形成的 可作为 扩增的模板，通过 技术可获取大量的目的基因片段。目的基因只在转基因牛乳腺细胞中表达的原因是在构建基因表达载体时，将目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出了乳腺专一表达载体，该表达载体中的特异性启动子使目的基因仅在乳腺细胞中表达，而不会在其他细胞中表达。
【考情速递】
把知识形成过程作为考试内容
高考生物试题情境来源丰富，从设计实验方案、分析实验结果等多个维度考查考生的实验探究能力，引导考生注重科学思维素养的培养。该题在考查阳性对照和阴性对照的设置以及对实验结果的分析和讨论等的同时，引导考生提高运用生物技术解决实际问题的意识，探究过程就是知识形成过程，亦是考试内容，符合深度学习的趋势。
2. [2022天津，10分]研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒状杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
（1） 如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有 （卡那霉素抗性基因）和 两个标记基因，为去除筛选效率较低的 ,应选择引物1和4，并在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列，进行 扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
[解析]据题中信息知，选择引物1和4扩增出来的片段不含 基因，故为去除筛选效率较低的 基因，应选择引物1和4。 时，引物与单链 结合后，从引物的 端开始延伸，故应在引物的 端引入 Ⅰ酶识别序列。
（2） 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包含 Ⅰ（2分）（ Ⅰ/ Ⅲ/ Ⅰ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
[解析]分析题图可知，利用载体2构建载体4时，只使用了 Ⅰ限制酶，故扩增出的 基因片段应含 Ⅰ酶识别序列，所以 扩增载体3中筛选效率较高的标记基因 （链霉素敏感基因）时，引物应包含 Ⅰ酶识别序列。
（3） 将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由 突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素（2分）的平板进行初步筛选。
[解析]分析可知，受体菌的表型为链霉素不敏感、卡那霉素敏感，而载体5上具有 （链霉素敏感基因）和 （卡那霉素抗性基因），故为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。
（4） 用一定的方法筛选出如下菌株:P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ,且载体5上其他 片段全部丢失。该菌的表型为B。
A. 卡那霉素不敏感、链霉素敏感 B. 卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C. 卡那霉素和链霉素都敏感 D. 卡那霉素和链霉素都不敏感
[解析]据题意知， 基因脱离载体5并整合到受体菌拟核 ，载体5上其他 片段全部丢失，所以该菌的表型依然是受体菌的表型，即链霉素不敏感、卡那霉素敏感， 选项符合题意。
（5） 可采用 （聚合酶链式反应，答案合理即可）技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
[解析]提取受体菌的 ，以该 为模板，采用P1基因特异性引物进行 扩增，若获得大量P1基因，即可确定该菌株成功整合了P1基因。
3. [2022江苏，12分]纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1） 纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是参与纺锤体的形成。
[解析]细胞膜主要由脂质和蛋白质组成。中心体可参与纺锤体的形成,其与有丝分裂有关。
（2） 某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因 是否发生了变异,对基因 进行了 扩增与产物测序。从细胞样品中分离 时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的 分离出来，溶液中添加 至 的目的是溶解 。
扩增时,需在耐高温的 聚合酶（ 酶）催化下，在引物 端进行 链的延伸，获得扩增产物，用于测序。
[解析] 在 的 溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度， 的溶解度均会下降，因此实验过程中添加 至 的目的是溶解 。 扩增时，需在耐高温的 聚合酶（ 酶）的催化下，在引物的 端进行 链的延伸，获得扩增产物。
（3） 为研究蛋白质 在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白 与 的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将 基因融合片段 导入如图2所示载体质粒 ,构建 重组质粒（在 Ⅴ识别位点插入片段）。请完成表。
图2
图3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
鉴定正向重组质粒 （图2中融合片段 中有白色的箭头，代表方向） ①选择图2中引物 、 ； 目的产物约为 。
确保 及连接处序列正确, 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图3中正确的是 （选填序列编号）。
检测融合蛋白定位 ④对照质粒 （仅表达 ）与实验质粒 分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 蛋白定位在纤毛基部。
[解析]据题图可知，应选择图2中的引物 和引物 ， 目的产物约为 。结合题中信息知， 的连接处上游含有 Ⅲ Ⅴ的识别序列，下游含有 Ⅴ Ⅰ的识别序列，又知构建 重组质粒时，在 Ⅴ识别位点插入片段，则 连接处测序后部分序列应含 Ⅴ的识别序列，根据各限制酶识别序列分析，质粒测序正确的是 。
（4） 为研究另一纤毛病相关基因 表达的变化，采用荧光定量 法检测健康人与病人基因 的转录水平。采集样本、提取总 ，经逆转录形成 作为模板， 扩增结果显示，在总 模板量相等的条件下,健康人 值为15,而病人 值为20（ 值是产物荧光强度达到设定阈值时的 循环数）。从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的32（2分）倍。
[解析] 在逆转录酶的作用下可形成 。结合题中信息知，在总 模板量相等的条件下，健康人 值为15，而病人 值为20，说明病人的基因 表达水平较低，设健康人 基因的 数为 ，病人 基因的 数为 ，则有 ，从理论上估算，在 扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 （倍）。
21世纪教育网 www.21cnjy.com 精品试卷·第 2 页 （共 2 页）
21世纪教育网(www.21cnjy.com)
同课章节目录