【考前冲刺】专项增分练五 生物技术与工程（含解析）
文档属性
| 名称 | 【考前冲刺】专项增分练五 生物技术与工程（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.7MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-04-24 21:27:27 | ||
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文档简介
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专项增分练五 生物技术与工程
一、非选择题
1．（2023·北京）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
（1）EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 （用字母表示）互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。
（3）为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；
②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；
③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；
④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。
请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
（4）各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
2．（2023·北京）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
（1）用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。
（2）A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。
（3）为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
（4）为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
3．（2023·广东）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的衣型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转其因植株的种了大小应与 植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基囚，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3）转化后，T-DNA (其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基囚稳定遗传的植株(图1)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为月标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图9，在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
4．（2023·浙江）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植林再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1：1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养血，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ （A.甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂C.培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂）
（4）愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
I.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
5．（2024·贵州模拟） 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。1993年，我国批准生产重组人干扰素α—1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎。请回答下列问题：
（1）干扰素属于免疫活性物质，免疫活性物质是指 。
（2）利用基因工程将干扰素基因导入大肠杆菌，可获得产生干扰素的工程菌。基因表达载体构建是基因工程的重要一环。质粒是一种常用于基因表达载体构建的运载体，构建重组质粒需要的工具酶有 ，重组质粒中标记基因的作用是 。
（3）科学家通过发酵工程大量培养具有干扰素生产能力的大肠杆菌细胞，从而生产大量的干扰素，在发酵过程中，除需观测发酵条件外，还要随时检测培养液中的 、 等，以了解发酵进程。
（4）干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子中的第十七位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸，则在—70℃的条件下，干扰素可以保存半年。请你据此事实，阐述利用蛋白质工程技术获得上述耐保存的干扰素的基本思路： 。
6．（2024·江西模拟） 蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题。研究人员成功地从环境样品中分高得到能降解蒽的菌株A和B．回答下列问题：
（1）用于分离菌株A和B的固体培养基含有（NH4）3SO4、MgSO4、CaCl2、NaH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、H2O、琼脂、蒽等成分。其中为细菌生长提供碳源的成分是 ；该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）为鉴定菌株A和B，研究人员提取了菌株A和B的基因组DNA，并用PCR扩增16S rRNA基因。为了验证提取基因组DNA是否成功，采用二苯胺试剂鉴定，其原理是 。在PCR扩增16SrRNA基因过程中，反应体系中引物的作用是 。在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是 。
（3）菌株A和B降解蒽的过程相同，均由按严格顺序排列的一系列静催化反应组成。为探究菌株A和B对蒽的降解能力，研究人员采用单独、混合接种（菌株AB接种量之比为1：1）方式开展实验（所有实验组接种总量一致）结果如表，由表可以看出菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，其原因可能是 。
接种方式 单独接种 混合接种
菌株A 菌株B
降解率（%） 41.7 20.9 65.2
7．（2024·贵州模拟） 风肉一般是以鲜肉为原料，用食盐腌制后，经风干和微生物后发酵而成。在后发酵期，风肉含有耐盐的微生物。某实验小组为研究耐盐微生物的耐盐基因，设计实验如下。回答下列问题。
（1）实验小组为获得耐盐纯培养物A，使用的培养基应是 （选填“普通培养基”或“选择培养基”），使用的接种方法是 。
（2）为获得纯培养物A的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA。在一定温度下，用二苯胺试剂对DNA进行检测，二苯胺检测DNA的原理是 。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有 （答出两点即可）。
（3）构建成功的表达载体将运用农杆菌介导技术转入某农作物，可获得耐盐转基因植株。与同种非转基因植株的染色体DNA序列相比，转基因植株的染色体DNA含有 。
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，需设计实验。写出实验思路 。
8．（2023高三上·遂宁模拟）［生物—选修3：现代生物科技专题］
基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。回答下列问题。
（1）相对于传统的转基因技术，基因敲除技术的最大优点是 。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有 。
（2）将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞进行培养。胚胎干细胞在功能上具有的特点是 。培养猪胚胎干细胞时，需要满足的条件有 。
（3）将筛选出的靶细胞导入猪的 中，再将其植入代孕猪体内，使其发育并生产。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取 （答出2点即可）等技术。
（4）若要证明肌生成抑制蛋白基因敲除后确实改变了猪的表现型，实验思路是： 。
9．（2023高三上·浙江模拟）人血清白蛋白（HSA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。回答下列小题：
（1）途径一：基因工程结合发酵工程构建人血清白蛋白工程菌
科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。
限制酶 I II III IV
识别序列及切割位点
①随着测序技术的发展，为获取人血清白蛋白基因，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶 进行共同切割。将受体酵母菌置于含有 的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
②采用PCR等技术可检测目的基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过 来鉴定，DNA分子的迁移速率与 有关（答出2点即可）。
③工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、 接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，将rHSA工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 （填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用 （答出2点即可）等方法获得所需的发酵产品。
（2）途径二：基因工程结合细胞工程构建人血清白蛋白乳腺反应器
I.采集良种供体牛的卵母细胞和精液，通过体外受精，形成奶牛受精卵；
II.构建基因的表达载体，并将其导人奶牛受精卵，形成转基因细胞；
III.电脉冲刺激转基因细胞促使其形成早期胚胎；
IV.将胚胎移植到受体母牛的子宫中，最终发育成转基因小牛。
①实验步骤I中，在体外受精前，需要对奶牛的精子进行 处理。
②实验步骤II中，将人的血清白蛋白基因导人奶牛受精卵最为有效的方法是 。
③实验步骤III中进行动物早期胚胎的体外培养时，培养液中通常要加入 等 天然成分，培养条件要求无毒、无菌的环境，具体措施有 （答出两点即可）。当胚胎发育至囊胚阶段，取其 做DNA分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的雄性胚胎进行移植。
④实验步骤IV进行胚胎移植，其实质是 。为实现这一工序，需用相应激素对受体
进行 处理。
⑤有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因 （答出两点即可）。
10．（2023高三上·浙江模拟）脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质，脱水素基因Dhn4的结构如图1所示，其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒，通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中，成功培育出了抗冻草莓植株。
（XhoI、KpnI、PstI为三种不同黏性末端的限制酶识别位点；amp'基因为氨苄青霉素抗性基因）
回答下列问题：
（1）获取目的基因提取青稞细胞的 ，经 过程获得cDNA。在PCR扩增Dhm4时应选择的引物组合是 ，为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物的 （填“5'”或“3'”）末端分别添加限制酶 的识别序列。
（2）构建基因表达载体启动子的作用是 ；多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率，如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及 （举两例即可）等。
（3）导入、筛选受体细胞将重组质粒导入用 处理过、处于感受态的农杆菌内，然后在含 的培养基上培养、筛选农杆菌，再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养，完成 实验。
（4）转基因植株的培育与检测转基因草莓叶片经脱分化形成 ，然后通过调整培养基中的 （填植物激素类型）配比，最终获得幼苗。可通过 处理，从个体水平对转基因是否成功进行检测。
11．（2023高三上·潮州模拟）β-1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。据图回答下列问题：
（1）BG2的克隆可利用PCR技术，需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的 作为引物，BG2在克隆前，需准备 种引物。
（2）上图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为DNA连接酶，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）的 （填“上游”或“下游”）。用Xba I 酶切、Spe I酶切、Not I酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以防止 、 以及防止目的基因与质粒反向连接。
（3）中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是 ，例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中、研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的染色体DNA上。
（4）在完成遗传转化后，培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于杀死农杆菌，另一种用于 。
12．（2023·高考模拟）科研人员研究调控蔗糖转移酶基因（SUC2）的两种蛋白质Snf1和Snf2之间的相互作用的原理如下：真核细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，由DNA结构功能域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。两个结构域分开时不能激活转录，只有当两者空间上接近时，才具有GAL4转录因子活性。BD与基因上游激活序列UAS结合后，激活AD与启动子结合，使启动子下游基因转录。图1为研究相互作用的X蛋白和Y蛋白的机制模式图。回答下列问题：
（1）操作中，需要用 酶将目的基因分别插入酵母表达载体中，得到两种融合表达载体（如图2）。酶切时通常选用两种不同的酶，这样做的目的是 。
（2）酵母染色体上能被GAL4激活转录、显示两种蛋白质相互作用的基因称为报告基因。若用AUR1—C（抗生素AbA抗性基因）和HIS3（组氨酸合成基因）作为报告基因，那么作为被转化的酵母细胞在抗生素抗性和营养需求上应满足的条件是 。转化后需要在添加 的培养基上培养筛选。除此之外，还要将酵母的GAL4基因敲除，原因是 。
（3）LacZ基因编码产生的β—半乳糖苷酶可以分解X—gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。科研人员采用LacZ作为报告基因，根据上述原理，验证了蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。写出实验思路并预期结果及推论： 。
13．（2023高三下·宁波模拟）蜂毒前溶血肽原是prepromelittin基因(以下简称PL基因)的表达产物，在蜜蜂体内合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前体蛋白)，被进一步水解形成分泌蛋白蜂毒肽。与蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度，且对细胞的破坏能力小，可利用基因工程方法合成蜂毒肽的前体产物。
（1）生产蜂毒肽常选用微生物做受体细胞，优点是 (答出两点即可)；原核细胞 (填"能"或“不能")将蜂毒溶血肽原加工成蜂毒肽，原因是 。
（2）为了解决(1)中的问题，对蜂毒前溶血肽原基因进行改造(如下图1)，以便后期用羟胺(一种能专一性裂解特定两个氨基酸之间肽键的化合物)对生产出的蜂毒前溶血肽原进行加工。根据图1推测羟胺的识别位点是 。为实现最终生产有活性的蜂毒肽，与原DNA序列相比，改造后的序列末端还删除了Gly的对应编码链序列 ，推测删除的理由是 。改造后的DNA编码区序列长度为 bp
注：①阴影：蜂毒肽序列；方框：Asn-Gly位点；
②图1中所示的“原DNA序列”为蜂毒前溶血肽原的编码区序列的编码链；
③甲硫氨酸，缩写为M，由起始密码子AUG编码；丙氨酸(Asn)，缩写为N；
④甘氨酸(Gly)，缩写为G，由密码子GGU、GGC、GGA、GGG编码。
⑤终止密码子UAA、UGA和UAG
（3）根据改造后的基因序列，利用人工化学合成方法进行全基因合成，设计并合成引物对合成基因进行PCR扩增，引物序列的长度越长、GC含量越高，PCR过程中退火温度的设定值越 。将PCR产物和pGEX-4T-1载体利用酶 进行基因表达载体的构建，获得蜂毒前溶血肽原与GST(一种标签蛋白)融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMe.(见图2)。扩增PL基因时设计了引物对M1和M2，其中M1的部分序列是：5'-GAATTC-3'且EcoRI的识别序列是GAATTC，请续写出该引物的后8个碱基5' 3'。
（4）将重组表达载体转化至 (“含有”或“不含有”)pGEX-4T-1/PPMel的大肠杆菌的感受态细胞，借助PCR和电泳鉴定是否转化成功：凝胶中DNA分子的迁移速率与 有关(答2点)。
（5）若培育相应的转基因植物；常用农杆菌转化法，需将目的基因插入质粒的 中，最后通过植物组织培养技术培育转基因植株。
14．（2023·广西模拟）某研究团队从沙漠野生柽柳中克隆出了一个耐盐碱基因TcSR1。该团队用限制酶BalⅡ切割目的基因TcSR1，用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3，两种限制酶的识别序列及酶切位点如图所示，经过体外重组和转化，最终获得了能够在盐碱地生长的杨树新品种。回答下列问题：
（1）使用限制酶BalⅡ和BamHⅠ切割得到的DNA片段末端均是 末端，用两种酶分别切割目的基因和质粒载体V3后，再用 酶处理，以构建基因表达载体，质粒载体V3一般应具有 以供重组DNA的筛选。
（2）将目的基因导入杨树细胞，最常采用的方法是 。若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录，可采用 技术，需要将 片段制成探针，通过检测放射性达到目的。
（3）植物组织培养技术与基因工程技术相结合可获得转基因植株，将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是 （用流程图表示）。
15．（2023·广东模拟）习近平总书记在参加十四届全国人大一次会议江苏代表团审议时强调，“农业强国是社会主义现代化强国的根基，推进农业现代化是实现高质量发展的必然要求”。目前，资源要素投入对粮食产量提升的驱动力明显减弱，亟须转基因等前沿技术新突破为保障粮食安全注入新动能。2023年，我国转基因大豆、转基因玉米的产业化试点已进一步扩大。如图所示是转抗草甘膦基因——cp4-epsps大豆培育时利用的质粒和目的基因。回答下列问题：
（1）用PCR获取抗除草剂基因时，连续扩增循环5次，需要的引物数为 个，在引物中加入限制酶识别的碱基序列时，应加在引物的 端。
（2）已知限制性内切核酸酶BamHI、BclI、Sau3AI、HindII识别的碱基序列分别为G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT，质粒与含抗除草剂基因的DNA片段中限制酶的切割位点如图所示，处理质粒和目的基因时选用的限制酶为 。若质粒中无位于左侧的HindIII切割位点，则对限制酶的最佳选择为 。
（3）若转化方法为农杆菌转化法，所用载体与图1最大的不同是质粒中一定含有 片段，并且用于切割质粒的限制酶其识别序列与该片段的位置关系为 。
（4）可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌 ，筛选出转化成功的细胞后进行植物组织培养时，在不同时期使用的培养基存在差异，不同培养基最大的区别是 。
答案解析部分
1．【答案】（1）A
（2）Q；R
（3）将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T
（4）大多数B细胞没有被BrdU标记
【解析】【解答】（1）因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，根据碱基互补配对原则T与A配对，因此掺入DNA的EdU和BrdU均能与A互补配对。
故填：A。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，则EdU会与腺嘌呤碱基互补配对，导致子链出现放射性。随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与腺嘌呤结合，使放射性增强，最终实现双标记，随DNA复制不断进行，双标记细胞占EdU标记细胞的百分比不断增大，且在DNA复制完成时达到最大值，因此图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
故填：Q；R。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要将L基因敲除。因Ce酶基因编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失，而纯合小鼠Lx的L基因两侧已插入特异DNA序列（x），因此需要将Ce酶基因和Er基因连接；而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，因此在筛选目标小鼠之后要饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）从而获得小鼠IK。
故填：将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T。
（4）变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况，此时已经经过途径Ⅱ的一个完整细胞周期，细胞应都含有BrdU标记；如果变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，该过程未完成一次细胞周期，故t2时间后用BrdU饲喂也无法被利用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
故填：大多数B细胞没有被BrdU标记。
【分析】DNA复制为半保留复制，以DNA的两条链为模版，四种脱氧核苷酸为原料，在解旋酶和DNA聚合酶的催化作用下，根据碱基互补配对原则合成两条新的子链，每个DNA分子各含一条亲代DNA分子的母链和一条新形成的子链。DNA分子复制时间：有丝分裂和减数分裂前的间期；过程：边解旋边复制；结果：一分子DNA复制出两分子相同的DNA。
2．【答案】（1）氮源、碳源
（2）A菌能在培养平板中生长繁殖
（3）稀释；溶菌圈
（4）假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
【解析】【解答】（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
故填：氮源、碳源。
（2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，说明A菌变多，能在培养平板中生长繁殖。
故填：A菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）未获得合适的菌落密度，将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。因为有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出，所以培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
故填：稀释；溶菌圈。
（4）分析题中所给实验材料和设备，P菌、A菌可以在培养基上生长，圆形滤纸小片可用于吸附某种化学物质，离心机可用于将不同物质分离开。结合本实验的目的-为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。
故填：假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂 。
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。培养基种类：①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
3．【答案】（1）野生型
（2）运载体；启动子和终止子
（3）DAI基因和卡那霉素抗性基因；75；自交；100；
【解析】【解答】（1）根据题干信息可知，该突变植株的DAI基因发生了隐性突变，相对的野生型DAI基因即是显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入该突变体植株，转化成功的话，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
故填：野生型。
（2）用PCR技术扩增DAI基因后，需要构建重组载体，将目的基因导入受体细胞，因此应该用限制性核酸内切酶对PCR产物DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；将目的基因接入基因表达载体启动子和终止子之间，可以确保插入的DAI基因在受体细胞中正常转录，因此其上下游序列需具备启动子和终止子。
故填：运载体；启动子和终止子。
（3）①T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体，根据图1可知，该运载体T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因，说明DAI基因和卡那霉素抗性基因经过转化，以及成功导入植物体基因组中。
②由①可知，T1代阳性植株细胞内都含有DAI基因，结合题干要求“选出单一位点插入的植株”，即单一位点插入目的基因，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代出现3∶1的性状分离比，所以选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③结合题干“进一步获得目的基囚稳定遗传的植株”，因此将以上获得的T2代阳性植株进行自交，纯合子自交不会发生性状分离，可以稳定遗传，反之杂合子会发生性状分离，因此再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，可以稳定遗传的种子在该培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，所以阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图9野生型和突变型基因片段PCR扩增序列可知，两者的基因长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，突变型的基因有限制酶X的切割位点，所以利用电泳鉴定PCR产物，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
故填：DAI基因和卡那霉素抗性基因；75；自交；100；电泳条带如图。
【分析】本题是基因工程于基因分离定律的实质相结合进行考查，比较创新。
（1）基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。其基本流程包括：目的基因的筛选和获取→基因表达载体的构建（核心）→将目的基因导入受体细胞（导入植物细胞常采用农杆菌转化法）→目的基因的检测与表达。
（2）基因工程的相关工具：限制酶，DNA连接酶，运载体的选择需要注意以下问题。①为防止目的基因与运载体自身换化和反向连接，一般选择同种限制酶对目的基因和运载体进行切割，使其产生相同的末端，然后选择DNA连接酶进行连接，构建重组载体。②为保障目的基因在受体细胞中稳定表达，目的基因应接入运载体启动子和终止子之间，因此不可以破坏启动子和终止子，以及标记基因。
（3）基因分离定律的实质是：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分开，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。
4．【答案】（1）再生植株；叶片
（2）纤维素；细胞质、细胞核；血细胞计数板；终止原生质体融合
（3）1个融合原生质体；ABD
（4）再分化；根和芽
（5）模板；M1、M2；电泳；1
【解析】【解答】（1）在甲、乙两种植物细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生植株的能力。为了便于观察细胞融合状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，根部细胞内不含叶绿体，原生质体无颜色，则乙植物可用幼苗的叶片为外植体，因为叶片细胞内含叶绿体，原生质体为绿色。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，甲植株需要提供细胞核，所以使甲原生质体的细胞质失活，乙植株需要提供细胞质，所以使乙原生质体的细胞核失活。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数。两种原生质体1：1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是终止原生质体融合。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织，所以同一块愈伤组织所有细胞源于同1个融合原生质体。愈伤组织只能来自于杂种细胞因为甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂，而同种细胞融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂，杂种细胞因为同时融合了甲原生质体内的细胞核和乙原生质体内的细胞质，结构和功能完整，可以生长分裂，所以ABD符合题意。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，以M1、M2为特异性引物，扩增序列a，以N1、N2为引物扩增序列b。
Ⅲ.将得到的2个PCR扩增产物进行电泳，若再生植株来自于杂种细胞，则该再生植株的总DNA中同时具有特异性DNA序列a和特异性DNA序列b，则每个PCR扩增产物在凝胶中均出现预期的1个条带。
故答案为：（1） 再生植株 ； 叶片 （2） 纤维素 ； 细胞质、细胞核 ； 血细胞计数板 ； 终止原生质体融合 （3） 1个融合原生质体 ； ABD （4） 再分化 ； 根和芽 （5） 模板 ； M1、M2 ； 电泳 ；1。
【分析】1、植物体细胞杂交技术：将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
过程：
优点：克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍，出现自然界没有的新品种。拓展了可用于杂交的亲本组合范围。
障碍：不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是细胞壁，用酶解法、纤维素酶、果胶酶去除。
意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
2、植物组织培养：指在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整的植株。
愈伤组织：由一团排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞组成。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
5．【答案】（1）由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质
（2）限制酶、 DNA连接酶；鉴定受体细胞中是否含有目的基因
（3）微生物的数量；产物浓度
（4）写出干扰素的氨基酸序列，替换半胱氨酸为丝氨酸，改变相对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因），再进行基因工程生产所需要的干扰素
6．【答案】（1）蒽；蛋白质、核酸
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色；界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸；变性
（3）菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化
【解析】【解答】 （1）蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，菌株A和B能够降解蒽，因此蒽为细菌生长提供碳源，生物大分子蛋白质、核酸的组成元素中含有N，因此该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成蛋白质、核酸等生物大分子。
故填：蒽、 蛋白质、核酸。
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色，所以DNA可以采用二苯胺试剂鉴定。在PCR中，引物能为DNA聚合酶提供结合位点，能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，即在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是变性。
故填：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 、 界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 、变性。
（3）由表格内容可知：菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，有可能是因为菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
故填：菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
【分析】PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
7．【答案】（1）选择培养基；稀释涂布平板法
（2）在酸性条件下DNA分子发生化学反应，与二苯胺试剂会产生蓝色的化合物；琼脂糖溶液的浓度、DNA分子的大小和构象
（3）耐盐基因
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，可用一定浓度的盐水浇灌鉴定植株的耐盐性
【解析】【解答】（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能，故实验小组为获得耐盐纯培养物A，需要使用选择培养基进行筛选；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数，故本实验使用的接种方法是稀释涂布平板法。
（2）为获得纯培养物A的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA。在一定温度下，用二苯胺试剂对DNA进行检测，二苯胺检测DNA的原理是：在酸性条件下DNA分子发生化学反应，与二苯胺试剂会产生蓝色的化合物。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有琼脂糖溶液的浓度、DNA分子的大小和构象等。
（3）与同种非转基因植株的染色体DNA序列相比，转基因植株的染色体DNA含有耐盐纯培养物中的耐盐基因。
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，在个体水平上进行检测，可用一定浓度的盐水浇灌鉴定植株的耐盐性。
【分析】（1）纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法：平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。
（2）基因工程的基本操作顺序：①基因表达载体的构建，②基因表达载体的构建，③将含有目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
8．【答案】（1）克服了传统转基因技术的盲目性和随机性；限制性核酸内切酶和DNA连接酶
（2）具有发育的全能性；无菌无毒的环境、营养、温度和pH、气体环境
（3）囊胚；胚胎分割、细胞核移植、克隆繁殖
（4）给基因敲除猪导入肌生成抑制蛋白基因（或“注射肌生成抑制蛋白”），养殖一段时间后观察猪骨骼肌的生长情况
【解析】【解答】（1）由题干可知：基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，后者的整合是随机的，故基因敲除技术的最大优点是克服了传统转基因技术的盲目性和随机性。构建基因表达载体时，需要的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
（2）胚胎干细胞在功能上具有的特点是有发育的全能性。猪胚胎干细胞是动物细胞，动物细胞培养需要满足的条件包括四方面：无菌无毒的环境、营养、温度和 pH 、气体环境。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的囊胚中，再将其植入代孕猪体内，使其发育并生产。要快速扩大基因敲除猪的种群，可以采取有性生殖、胚胎分割和细胞核移植、克隆繁殖技术。
（4）为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射肌生成抑制蛋白，如果猪表现型转为正常，说明确实是由于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。
【分析】1、基因工程的基本工具： （1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。 （3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、动物细胞培养条件： （1）营养：培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常需要加入血清等天然成分。 （2）无菌、无毒的环境。 （3）温度、pH和渗透压。 （4）气体环境：氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH。动物细胞培养需要将培养瓶置于含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养。
9．【答案】（1）基因数据库；Ⅱ、Ⅳ；四环素；琼脂糖凝胶电泳；凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象；培养基的配制、灭菌；菌体；过滤、沉淀、离心、静置
（2）获能；显微注射法；血清(或血清、血浆)；对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物；滋养层细胞；早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移；同期发情；雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
【解析】【解答(1)①化学合成法可合成已知序列的基因，可以检索基因数据库获取目的基因的编码序列，用化学合成法制备目的基因。图中四环素抗性基因中含有酶切位点I，氨苄青霉素抗性基因中含有I、II、IV三种酶切位点，若切割时使用限制酶I，则两种抗生素抗性基因均被破坏；若使用限制酶Ⅱ、IV进行酶切时，会将氨苄青霉素抗性基因破坏。为了能同时切割质粒和目的基因，防止反向连接和自身环化，同时使基因表达载体存在完整的标记基因，需要使用限制酶Ⅱ、IV。 氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因未被破坏，故筛选时可将受体酵母菌置于含有四环素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
②DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
③由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物菌体的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀、离心、静置等方法将菌体分离和干燥。
故填：基因数据库；Ⅱ、Ⅳ；四环素；琼脂糖凝胶电泳；凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象；培养基的配制、灭菌；菌体；过滤、沉淀、离心、静置。
(2)①精子经过获能后才具有与卵细胞结合形成受精卵的能力，因此在体外受精前，需要对奶牛的精子进行获能处理。
②将目的基因导入（动物）受体细胞最常用的方法是显微注射法。
③由于所需的成分可能有未知部分，动物细胞培养需要加入血清等天然成分；培养条件要求无毒无菌的环境，对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物都有助于提供无毒、无菌的环境。滋养层细胞可发育成胎膜和胎盘，对个体发育的关键部分没有影响，故取滋养层细胞做DNA分析来进行性别鉴定。
④在胚胎移植操作中，应对供体和受体母牛进行同期发情处理，以使供体和受体处于相同的生理状态，使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致。由此可见，胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
⑤乳腺生物反应器具有一定的局限性，雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大。
故填：获能；显微注射法；血清(或血清、血浆)；对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物；滋养层细胞；早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移；同期发情；雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大。
【分析】（1）化学合成法可合成已知序列的基因，因此可以检索基因数据库获取目的基因的编码序列，再用化学合成法制备更多的目的基因。基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。基因表达载体的构建需要用到限制性内酶，为了能同时切割质粒和目的基因，防止反向连接和自身环化，同时使基因表达载体存在完整的标记基因，需要使用两种不同的限制酶。目的基因的导入常常采用显微注射法（动物）和脓杆菌转化法（植物），（2）PCR的产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（3）微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。细菌的计数可以通过稀释涂布法计数，也可利用显微镜进行直接计数。显微镜直接计数是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物菌体的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
10．【答案】（1）mRNA；逆转录；引物Ⅱ、Ⅲ；5'；KpnⅠ及XhoI（顺序需与引物对应）
（2）RNA聚合酶识别与结合的部位，启动转录；Dhn4基因浓度（目的基因浓度）、载体与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度
（3）CaCl2；氨苄青霉素；转化
（4）愈伤组织；生长素与细胞分裂素；低温（抗冻性检测）
【解析】【解答】（1）青稞细胞中的mRNA经过逆转录获得cDNA；引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故应选择物方向是从5'→3'端延伸，即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列应添加在基因的外侧，不影响基因的序列，故添加在5'端，因为B链为模板链，转录的方向是沿着模板链的3'→5'端，应将Dhn4基因的左端与启动子一侧连接，又因为目的基因中含有PstI的识别序列，不能选用，故添加的限制酶序列分别是KpnI和XhoI。
（2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率，如温度与等操作环境反应时间、质粒浓度及Dhn4基因浓度（目的基因浓度）载体与Dhn4基因的比例、DNA连接浓度、酶切程度等。
（3）农杆菌是原核生物，需要Ca2+处理，使其处于易于吸收外源DNA的状态，完成将基因表达载体导入受体细胞的过程，其中基因表达载体上的amp'基因为氨苄青霉素抗性基因，属于标记基因，故可在含氨苄青霉素的培养基上培养、筛选农杆菌，再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养，完成转化实验，转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（4）转基因草莓叶片经脱分化形成愈伤组织，然后通过调整培养基中的生长素和细胞分裂素的浓度和比例，最终获得幼苗，从个体水平可通过温对转基因是否成功进行检测。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
11．【答案】（1）短单链核酸；2
（2）上游；Ti质粒自身环化；目的基因自身环化
（3）花粉管通道法；子房
（4）成功转化重组质粒细胞（组织）的筛选/检测目的基因是否导入受体细胞
【解析】【解答】(1) β-1，3葡聚糖酶基因( BG2 )在体外大量克隆，可利用PCR技术，PCR技术扩增目的基因时，需要一小段能与该基因( BG2 )碱基序列互补配对的短单链核酸作为引物，PCR技术过程中，如果两种引物序列互补，复性时，引物可与引物结合，母链没有引|物结合就不能得到子链，得不到的基因产物。
故填： 短单链核酸；2。
(2)人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高(增强)转录活性，它位于目的基因( BG2)上游，启动子是RNA聚合酶识别与结合结构，有它才能驱动基因转录出mRNA。双酶切，一定程度上防止Ti质粒自身环化与目的基因自身环化。
故填：上游；Ti质粒自身环化；目的基因自身环化。
(3) 中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是花粉管通道法，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
故填：花粉管通道法；子房。
(4)在完成遗传转化后，需要杀死农杆菌以及检测含有目的基因的质粒是否成功转入到受体细胞，因此选择培养基中至少要加入两种抗生素，一种用于杀死农杆菌，另一种用于成功转化质粒细胞(组织)的筛选(或检测目的基因是否导入受体细胞)，起到选择作用。
故填： 成功转化重组质粒细胞（组织）的筛选/检测目的基因是否导入受体细胞。
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的分离与获取、基因表达载体的构建、将目的基固导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面有广阔的应用前景。
12．【答案】（1）限制酶和DNA连接；防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接
（2）无AbA抗性，组氨酸缺陷；添加AbA和缺少组氨酸；排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响
（3）实验思路：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。 预期结果及推论：菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
【解析】【解答】（1）构建基因表达载体需要用限制酶和DNA连接酶，所以需要用限制酶和DNA连接酶将目的基因分别插入酵母表达载体中。酶切时通常选用两种不同的酶，这样做的目的是防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接。
故答案为：限制酶和DNA连接；防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接。
（2）题干指出若用AUR1-C（抗生素AbA抗性基因）和HIS3（组氨酸合成基因）作为报告基因，要将该报告基因导入受体酵母菌中，将来为了区分未成功导入和成功导入告基因的酵母菌，所以受体酵母菌就不能有报告基因控制的性状，故作为被转化的酵母细胞抗生素抗性和营养需求上应满足的条件是无AbA抗性，组氨酸缺陷。转化后需要在添加AbA和缺少组氨酸的培养基上培养筛选。酵母染色体上的报告基因能被GAL4激活转录，所以为了排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响，所以要敲除GAL4基因。
故答案为：无AbA抗性，组氨酸缺陷；添加AbA和缺少组氨酸；排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响。
（4）题干信息指出酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，由DNA结构功能域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。两个结构域分开时不能激活转录，只有当两者空间上接近时，才具有GAL4转录因子活性。BD与基因上游激活序列UAS结合后，激活AD与启动子结合，使启动子下游基因转录。结合题意和题图可知，只有蛋白质Snf1和Snf2连接上共同作用于启动子，才能使LacZ基因表达的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。因此本实验设计思路是：构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，然后分解菌落的颜色进行鉴定和分析。故实验思路及预期结果为：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。预期结果及推论是菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
故答案为：实验思路：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。
预期结果及推论：菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
【分析】1、基因表达载体的构建是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
2、切割目的基因时选用不同限制酶的目的是防止目的基因自身环化和保证目的基因的定向连接。
13．【答案】（1）微生物生理结构和遗传物质简单，生产成本低，生长繁殖快、容易进行遗传物质操作；不能；原核细胞无内质网和高尔基体，无法对表达出的蜂毒前溶血肽原进行加工
（2）Asn-Gly(NG丙氨酸-甘氨酸)；GGT；有活性的蜂毒肽末端没有甘氨酸；213
（3）高；EcoRI、SalI和DNA连接酶(限制酶+DNA连接酶)；5'-ATGAAATT-3'
（4）不含有；大小(长度)，构象(形状)，电荷，凝胶浓度，电压
（5）T-DNA
【解析】【解答】（1）生产蜂毒肽常选用微生物做受体细胞，是因为微生物结构和遗传物质较简单，生长繁殖速度快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作，生产成本也比较低；原核细胞不能直接获得蜂毒肽，因为原核细胞内没有内质网和高尔基体，不能对蜂毒前溶血肽原进行修饰和加工。
故填：微生物生理结构和遗传物质简单，生产成本低，生长繁殖快、容易进行遗传物质操作；不能；原核细胞内没有质网和高尔基体，无法对表达出的蜂毒前溶血肽原进行加工。
（2）图示提示阴影表示蜂毒肽序列，甘氨酸(Gly)，缩写为G，丙氨酸(Asn)，缩写为N，方框表示 Asn·Gly位点；羟胺是一种能专一性裂解特定两个氨基酸之间肽键的化合物，那么对比改造前后氨基酸序列的变化可知，羟胺的识别位点是在Asn-Gly，而蜂毒肽用阴影表示，那么其第一个氨基酸是G甘氨酸，要将其改造成丙氨酸Asn，应该在蜂毒肽对应的核酸序列前加入AAC，使其表达Asn从而形成Asn·Gly位点；同时与原DNA序列相比，改造后的序列中删除了Gly的对应序列GGT，因为蛋白质的功能取决于其结构，结构又与氨基酸的种类、数目等有关，因此改造后的序列中删除了Gly的对应序的原因是蜂毒肽末端没有Gly；据图可知，最终改造后的DNA序列是最下端的DNA序列，长度为213bp。
故填：Asn-Gly(NG丙氨酸-甘氨酸)；GGT；有活性的蜂毒肽末端没有甘氨酸；213。
（3）DNA含有的GC碱基对越多，氢键数越多，结构越稳定，则GC含量越高，PCR过程中退火温度的设定值越高。基因表达载体构建时需要用同种限制酶切割目的基因和运载体，使其产生相同的黏性末端，再利用DNA连接酶将切割后的目的基因和运载体连接起来形成重组质粒；观察目的基因与载体，目的基因两端含有EcoRI和 Sall识别序列，推测所选的限制酶是EcoRI和 Sall；PCR扩增时，需要引物与模板的3'端结合，若扩增PL基因时设计的一条引物的序列是引物M1：5'-GAATTC-3'，EcoRI的识别序列是GAATTC，结合（2）可知，PL基因序列为ATGAAATT........，根据EcoRI的识别序列和PL基因位置关系和耐高温DNA聚合酶的特性可知，该引物的后8个碱基是5'-ATGAAATT-3'。
故填：高；EcoRI、SalI和DNA连接酶(限制酶+DNA连接酶)；5'-ATGAAATT-3'。
（4）图2大肠杆菌的质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，那么要想获得转化成功的大肠杆菌，需要将大肠杆菌混合物全部转入含氨苄青霉素的选择培养基中进行筛选，为了排除大肠杆菌自身氨苄青霉素抗性基因的影响，就要将重组表达载体转化至不含有pGEX-4T-1/PPMel的大肠杆菌的感受态细胞；PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、电压、DNA分子的大小和构象有关。
故填：不含有；大小(长度)，构象(形状)，电荷，凝胶浓度，电压。
（5）采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，先将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用农杆菌的转化作用，再将目的基因随机整合到植物细胞染色体的DNA上。
故填： T-DNA 。
【分析】基因工程技术的基本操作流程：
1、目的基因的筛选与获取：从已知结构的基因中进行筛选，然后可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；导入植物细胞一般选用农杆菌转化法，导入动物细胞采用显微注射技术，导入微生物细胞用钙离子处理使其处于感受态。
4、目的基因的检测与鉴定。
14．【答案】（1）黏性；DNA连接；标记基因
（2）农杆菌转化法；分子杂交；放射性同位素标记的基因TcSR1
（3）
【解析】【解答】（1）由图可知，使用限制酶BalⅡ和BamHⅠ切割得到的DNA片段末端均是黏性末端；DNA连接酶可恢复被限制酶切割的磷酸二酯键，所以用两种酶分别切割目的基因和质粒载体V3后，再用DNA连接酶处理，以构建基因表达载体；质粒载体V3一般应具有标记基因，其功能是供重组DNA的筛选。
故填：黏性；DNA连接；标记基因。
（2）将目的基因导入植物细胞的方法有花粉管通道法、农杆菌转化法和基因枪法等，其中最常用的是农杆菌转化法；若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录出mRNA，则可采用分子杂交技术，即需要将放射性同位素标记的基因TcSR1片段制成探针，探针会与目的基因转录出的mRNA特异性结合，最终检测出放射性，若没有检测出放射性，则说明目的基因没有发生转录。
故填：农杆菌转化法；分子杂交；放射性同位素标记的基因TcSR1。
（3）植物组织培养的过程一般经历脱分化和再分化，最终形成完整植株个体。故将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是：
含目的基因的细胞愈伤组织完整植株
故填：含目的基因的细胞愈伤组织完整植株
【分析】1、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；在选择限制酶时，要保证该限制酶不会切割目的基因和载体上的标记基因、启动子、终止子和复制原点等，并且限制酶酶切位点应介于载体的启动子与终止子之间，最好选用两种能够产生不同黏性末端的限制酶分别对目的基因和载体的两侧进行切割，避免目的基因或载体自身环化；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
作为载体应具备的条件：能稳定存在并自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因以及对受体细胞无害。
2、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法或基因枪法，在自然条件下，农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力，所以农杆菌转化法一般适用于双子叶植物和裸子植物，但随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
3、一般用DNA分子杂交技术来检测目的基因是否插入受体细胞；使用分子杂交技术检测受体细胞是否转录出mRNA；使用抗原-抗体杂交技术检测受体细胞是否翻译出蛋白质；通过抗性实验等检测个体是否表达出相应的性状。
15．【答案】（1）62；5'
（2）BamH I、Sau3A I；BamH I、Hind Ⅲ
（3）T-DNA；位于该片段内部
（4）共培养；激素的比例和浓度
【解析】【解答】（1） PCR 扩增DNA分子时，以DNA的两条链为模板，每条链都需要引物引导子链DNA的合成，所以所需引物数量等于新合成的DNA单链数等于，扩增n次，新合成DNA单链为2n+1-2，所以连续扩增循环5次，需要的引物数为26-2=62个。限制酶的识别序列应位于目的基因的两端，这样不会破坏目的基因的碱基序列，DNA聚合酶在子链的3'端开始添加脱氧核苷酸，所以DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，那么，限制酶的识别序列应加在引物的5'端。
故填：62；5'。
（2）从图2可知BamH I、Bcl I的酶切位点位于抗除草剂基因的左侧，Sau3A I、Hind Ⅲ的酶切位点位于其右侧侧，必须选用目的基因两侧的各一种酶对目的基因进行切割，这样不会破坏目的基因。若用Hind Ⅲ切割质粒，会导致载体上缺少启动子或终止子而无法进行基因的转录；若用BclI切割， BclI 的识别序列中又包含Sau3AI的识别序列，会导致目的基因与载体产生的末端不完全相同而无法连接，故只能选BamH I、 Sau3A I进行切割。但由于这两种酶切出的黏性末端相同，容易导致目的基因和载体自身环化，故若质粒中无左侧的Hind Ⅲ切割位点，应选 BamH I 、Hind Ⅲ进行切割较好。
故填：BamH I、Sau3A I；BamH I、Hind Ⅲ。
（3）若转化方法为农杆菌转化法，所用载体与图1最大的不同是质粒中一定含有T-DNA，同时，用于切割质粒的限制酶的识别序列应位于该片段的内部，这样抗除草剂基因才能随着T-DNA转移，而转移到植物细胞的染色体基因中。
故填：T-DNA；位于该片段内部。
（4）将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，这样通过农杆菌的转化可以使除草剂基因进入受体细胞，筛选出转化成功的细胞后进行植物组织培养时，脱分化和再分化阶段使用的培养基存在差异，不同培养基最大的区别是使用激素的比例不一样，诱导外植体脱分化形成愈伤组织时，生长素和细胞分裂素的比例相当，再分化诱导愈伤组织生根时，生长素的比例较高，诱导形成芽时，生长素的比例偏低。
故填：激素的比例和浓度
【分析】PCR是依据DNA半保留复制进行的体外DNA复制，在高温作用下DNA双链解旋，每条DNA单链作为模板，在2种不同引物的作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始添加脱氧核苷酸，合成子链。
在构建基因表达载体时，所选择的限制酶要考虑以下几点：①不要破坏目的基因和标记基因；②不要破坏启动子和终止子，以及复制原点；③尽量选择双酶切，可以防止目的基因和载体的自身环化、或者反向连接。
将目的基因导入受体细胞，需根据受体细胞的不同采用不同的方法。导入植物细胞常采用农杆菌转化法；导入微生物细胞采用钙离子处理法使其处于感受态，易于吸收周围的DNA；导入动物细胞采用显微注射技术。
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专项增分练五 生物技术与工程
一、非选择题
1．（2023·北京）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
（1）EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 （用字母表示）互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。
（3）为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；
②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；
③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；
④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。
请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
（4）各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
2．（2023·北京）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
（1）用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。
（2）A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明 。
（3）为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
（4）为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
3．（2023·广东）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的衣型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转其因植株的种了大小应与 植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基囚，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
（3）转化后，T-DNA (其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基囚稳定遗传的植株(图1)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 (填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为月标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见图9，在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
4．（2023·浙江）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植林再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1：1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养血，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？ （A.甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂B.同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂C.培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D.杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂）
（4）愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
I.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
5．（2024·贵州模拟） 干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。1993年，我国批准生产重组人干扰素α—1b，它是我国批准生产的第一个基因工程药物，目前主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎。请回答下列问题：
（1）干扰素属于免疫活性物质，免疫活性物质是指 。
（2）利用基因工程将干扰素基因导入大肠杆菌，可获得产生干扰素的工程菌。基因表达载体构建是基因工程的重要一环。质粒是一种常用于基因表达载体构建的运载体，构建重组质粒需要的工具酶有 ，重组质粒中标记基因的作用是 。
（3）科学家通过发酵工程大量培养具有干扰素生产能力的大肠杆菌细胞，从而生产大量的干扰素，在发酵过程中，除需观测发酵条件外，还要随时检测培养液中的 、 等，以了解发酵进程。
（4）干扰素在体外保存相当困难，如果将干扰素分子中的第十七位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸，则在—70℃的条件下，干扰素可以保存半年。请你据此事实，阐述利用蛋白质工程技术获得上述耐保存的干扰素的基本思路： 。
6．（2024·江西模拟） 蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题。研究人员成功地从环境样品中分高得到能降解蒽的菌株A和B．回答下列问题：
（1）用于分离菌株A和B的固体培养基含有（NH4）3SO4、MgSO4、CaCl2、NaH2PO4、K2HPO4、NaCl、FeSO4、H2O、琼脂、蒽等成分。其中为细菌生长提供碳源的成分是 ；该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成 （答出2种即可）等生物大分子。
（2）为鉴定菌株A和B，研究人员提取了菌株A和B的基因组DNA，并用PCR扩增16S rRNA基因。为了验证提取基因组DNA是否成功，采用二苯胺试剂鉴定，其原理是 。在PCR扩增16SrRNA基因过程中，反应体系中引物的作用是 。在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是 。
（3）菌株A和B降解蒽的过程相同，均由按严格顺序排列的一系列静催化反应组成。为探究菌株A和B对蒽的降解能力，研究人员采用单独、混合接种（菌株AB接种量之比为1：1）方式开展实验（所有实验组接种总量一致）结果如表，由表可以看出菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，其原因可能是 。
接种方式 单独接种 混合接种
菌株A 菌株B
降解率（%） 41.7 20.9 65.2
7．（2024·贵州模拟） 风肉一般是以鲜肉为原料，用食盐腌制后，经风干和微生物后发酵而成。在后发酵期，风肉含有耐盐的微生物。某实验小组为研究耐盐微生物的耐盐基因，设计实验如下。回答下列问题。
（1）实验小组为获得耐盐纯培养物A，使用的培养基应是 （选填“普通培养基”或“选择培养基”），使用的接种方法是 。
（2）为获得纯培养物A的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA。在一定温度下，用二苯胺试剂对DNA进行检测，二苯胺检测DNA的原理是 。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有 （答出两点即可）。
（3）构建成功的表达载体将运用农杆菌介导技术转入某农作物，可获得耐盐转基因植株。与同种非转基因植株的染色体DNA序列相比，转基因植株的染色体DNA含有 。
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，需设计实验。写出实验思路 。
8．（2023高三上·遂宁模拟）［生物—选修3：现代生物科技专题］
基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。回答下列问题。
（1）相对于传统的转基因技术，基因敲除技术的最大优点是 。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有 。
（2）将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞进行培养。胚胎干细胞在功能上具有的特点是 。培养猪胚胎干细胞时，需要满足的条件有 。
（3）将筛选出的靶细胞导入猪的 中，再将其植入代孕猪体内，使其发育并生产。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取 （答出2点即可）等技术。
（4）若要证明肌生成抑制蛋白基因敲除后确实改变了猪的表现型，实验思路是： 。
9．（2023高三上·浙江模拟）人血清白蛋白（HSA）在临床上的需求量大，由于其来源有限和有生物污染的风险，重组人血清白蛋白（rHSA），成为其重要的替代品。回答下列小题：
（1）途径一：基因工程结合发酵工程构建人血清白蛋白工程菌
科研人员将HSA基因转入酵母菌细胞，获得了重组人血清白蛋白。图为酵母菌基因改造以及工业化发酵生产rHSA的过程示意图，其中I、II、III、IV是四种不同的限制酶，具各自识别的酶切位点如表所示。
限制酶 I II III IV
识别序列及切割位点
①随着测序技术的发展，为获取人血清白蛋白基因，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。将HSA基因插入质粒中时，最好选择限制酶 进行共同切割。将受体酵母菌置于含有 的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
②采用PCR等技术可检测目的基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过 来鉴定，DNA分子的迁移速率与 有关（答出2点即可）。
③工业化发酵生产rHSA的过程一般包括菌种的选育，扩大培养、 接种、发酵、产品的分离、提纯等方面，将rHSA工程菌接种至发酵罐内进行扩增，培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 （填“菌体”或“菌落”）进行直接计数，以评估增殖情况。发酵结束后，采用 （答出2点即可）等方法获得所需的发酵产品。
（2）途径二：基因工程结合细胞工程构建人血清白蛋白乳腺反应器
I.采集良种供体牛的卵母细胞和精液，通过体外受精，形成奶牛受精卵；
II.构建基因的表达载体，并将其导人奶牛受精卵，形成转基因细胞；
III.电脉冲刺激转基因细胞促使其形成早期胚胎；
IV.将胚胎移植到受体母牛的子宫中，最终发育成转基因小牛。
①实验步骤I中，在体外受精前，需要对奶牛的精子进行 处理。
②实验步骤II中，将人的血清白蛋白基因导人奶牛受精卵最为有效的方法是 。
③实验步骤III中进行动物早期胚胎的体外培养时，培养液中通常要加入 等 天然成分，培养条件要求无毒、无菌的环境，具体措施有 （答出两点即可）。当胚胎发育至囊胚阶段，取其 做DNA分析来进行性别鉴定，筛选出发育状态良好的雄性胚胎进行移植。
④实验步骤IV进行胚胎移植，其实质是 。为实现这一工序，需用相应激素对受体
进行 处理。
⑤有人提议将乳腺反应器改成膀胱反应器，请分析利用膀胱反应器比乳腺反应器产量高的原因 （答出两点即可）。
10．（2023高三上·浙江模拟）脱水素是青稞植株中的一种抗冻物质，脱水素基因Dhn4的结构如图1所示，其中B链为模板链。研究人员利用图2所示的质粒，通过农杆菌转化法将该基因导入草莓中，成功培育出了抗冻草莓植株。
（XhoI、KpnI、PstI为三种不同黏性末端的限制酶识别位点；amp'基因为氨苄青霉素抗性基因）
回答下列问题：
（1）获取目的基因提取青稞细胞的 ，经 过程获得cDNA。在PCR扩增Dhm4时应选择的引物组合是 ，为使扩增后的产物按照正确方向与质粒连接，需在引物的 （填“5'”或“3'”）末端分别添加限制酶 的识别序列。
（2）构建基因表达载体启动子的作用是 ；多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率，如温度与pH等操作环境、反应时间、质粒浓度及 （举两例即可）等。
（3）导入、筛选受体细胞将重组质粒导入用 处理过、处于感受态的农杆菌内，然后在含 的培养基上培养、筛选农杆菌，再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养，完成 实验。
（4）转基因植株的培育与检测转基因草莓叶片经脱分化形成 ，然后通过调整培养基中的 （填植物激素类型）配比，最终获得幼苗。可通过 处理，从个体水平对转基因是否成功进行检测。
11．（2023高三上·潮州模拟）β-1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。据图回答下列问题：
（1）BG2的克隆可利用PCR技术，需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的 作为引物，BG2在克隆前，需准备 种引物。
（2）上图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为DNA连接酶，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）的 （填“上游”或“下游”）。用Xba I 酶切、Spe I酶切、Not I酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以防止 、 以及防止目的基因与质粒反向连接。
（3）中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是 ，例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中、研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的染色体DNA上。
（4）在完成遗传转化后，培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于杀死农杆菌，另一种用于 。
12．（2023·高考模拟）科研人员研究调控蔗糖转移酶基因（SUC2）的两种蛋白质Snf1和Snf2之间的相互作用的原理如下：真核细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，由DNA结构功能域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。两个结构域分开时不能激活转录，只有当两者空间上接近时，才具有GAL4转录因子活性。BD与基因上游激活序列UAS结合后，激活AD与启动子结合，使启动子下游基因转录。图1为研究相互作用的X蛋白和Y蛋白的机制模式图。回答下列问题：
（1）操作中，需要用 酶将目的基因分别插入酵母表达载体中，得到两种融合表达载体（如图2）。酶切时通常选用两种不同的酶，这样做的目的是 。
（2）酵母染色体上能被GAL4激活转录、显示两种蛋白质相互作用的基因称为报告基因。若用AUR1—C（抗生素AbA抗性基因）和HIS3（组氨酸合成基因）作为报告基因，那么作为被转化的酵母细胞在抗生素抗性和营养需求上应满足的条件是 。转化后需要在添加 的培养基上培养筛选。除此之外，还要将酵母的GAL4基因敲除，原因是 。
（3）LacZ基因编码产生的β—半乳糖苷酶可以分解X—gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色。科研人员采用LacZ作为报告基因，根据上述原理，验证了蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。写出实验思路并预期结果及推论： 。
13．（2023高三下·宁波模拟）蜂毒前溶血肽原是prepromelittin基因(以下简称PL基因)的表达产物，在蜜蜂体内合成后首先加工成蜂毒溶血肽原(蜂毒肽前体蛋白)，被进一步水解形成分泌蛋白蜂毒肽。与蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有较大的溶解度，且对细胞的破坏能力小，可利用基因工程方法合成蜂毒肽的前体产物。
（1）生产蜂毒肽常选用微生物做受体细胞，优点是 (答出两点即可)；原核细胞 (填"能"或“不能")将蜂毒溶血肽原加工成蜂毒肽，原因是 。
（2）为了解决(1)中的问题，对蜂毒前溶血肽原基因进行改造(如下图1)，以便后期用羟胺(一种能专一性裂解特定两个氨基酸之间肽键的化合物)对生产出的蜂毒前溶血肽原进行加工。根据图1推测羟胺的识别位点是 。为实现最终生产有活性的蜂毒肽，与原DNA序列相比，改造后的序列末端还删除了Gly的对应编码链序列 ，推测删除的理由是 。改造后的DNA编码区序列长度为 bp
注：①阴影：蜂毒肽序列；方框：Asn-Gly位点；
②图1中所示的“原DNA序列”为蜂毒前溶血肽原的编码区序列的编码链；
③甲硫氨酸，缩写为M，由起始密码子AUG编码；丙氨酸(Asn)，缩写为N；
④甘氨酸(Gly)，缩写为G，由密码子GGU、GGC、GGA、GGG编码。
⑤终止密码子UAA、UGA和UAG
（3）根据改造后的基因序列，利用人工化学合成方法进行全基因合成，设计并合成引物对合成基因进行PCR扩增，引物序列的长度越长、GC含量越高，PCR过程中退火温度的设定值越 。将PCR产物和pGEX-4T-1载体利用酶 进行基因表达载体的构建，获得蜂毒前溶血肽原与GST(一种标签蛋白)融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMe.(见图2)。扩增PL基因时设计了引物对M1和M2，其中M1的部分序列是：5'-GAATTC-3'且EcoRI的识别序列是GAATTC，请续写出该引物的后8个碱基5' 3'。
（4）将重组表达载体转化至 (“含有”或“不含有”)pGEX-4T-1/PPMel的大肠杆菌的感受态细胞，借助PCR和电泳鉴定是否转化成功：凝胶中DNA分子的迁移速率与 有关(答2点)。
（5）若培育相应的转基因植物；常用农杆菌转化法，需将目的基因插入质粒的 中，最后通过植物组织培养技术培育转基因植株。
14．（2023·广西模拟）某研究团队从沙漠野生柽柳中克隆出了一个耐盐碱基因TcSR1。该团队用限制酶BalⅡ切割目的基因TcSR1，用限制酶BamHⅠ切割质粒载体V3，两种限制酶的识别序列及酶切位点如图所示，经过体外重组和转化，最终获得了能够在盐碱地生长的杨树新品种。回答下列问题：
（1）使用限制酶BalⅡ和BamHⅠ切割得到的DNA片段末端均是 末端，用两种酶分别切割目的基因和质粒载体V3后，再用 酶处理，以构建基因表达载体，质粒载体V3一般应具有 以供重组DNA的筛选。
（2）将目的基因导入杨树细胞，最常采用的方法是 。若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录，可采用 技术，需要将 片段制成探针，通过检测放射性达到目的。
（3）植物组织培养技术与基因工程技术相结合可获得转基因植株，将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是 （用流程图表示）。
15．（2023·广东模拟）习近平总书记在参加十四届全国人大一次会议江苏代表团审议时强调，“农业强国是社会主义现代化强国的根基，推进农业现代化是实现高质量发展的必然要求”。目前，资源要素投入对粮食产量提升的驱动力明显减弱，亟须转基因等前沿技术新突破为保障粮食安全注入新动能。2023年，我国转基因大豆、转基因玉米的产业化试点已进一步扩大。如图所示是转抗草甘膦基因——cp4-epsps大豆培育时利用的质粒和目的基因。回答下列问题：
（1）用PCR获取抗除草剂基因时，连续扩增循环5次，需要的引物数为 个，在引物中加入限制酶识别的碱基序列时，应加在引物的 端。
（2）已知限制性内切核酸酶BamHI、BclI、Sau3AI、HindII识别的碱基序列分别为G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT，质粒与含抗除草剂基因的DNA片段中限制酶的切割位点如图所示，处理质粒和目的基因时选用的限制酶为 。若质粒中无位于左侧的HindIII切割位点，则对限制酶的最佳选择为 。
（3）若转化方法为农杆菌转化法，所用载体与图1最大的不同是质粒中一定含有 片段，并且用于切割质粒的限制酶其识别序列与该片段的位置关系为 。
（4）可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌 ，筛选出转化成功的细胞后进行植物组织培养时，在不同时期使用的培养基存在差异，不同培养基最大的区别是 。
答案解析部分
1．【答案】（1）A
（2）Q；R
（3）将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T
（4）大多数B细胞没有被BrdU标记
【解析】【解答】（1）因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，根据碱基互补配对原则T与A配对，因此掺入DNA的EdU和BrdU均能与A互补配对。
故填：A。
（2）将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，因EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，则EdU会与腺嘌呤碱基互补配对，导致子链出现放射性。随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与腺嘌呤结合，使放射性增强，最终实现双标记，随DNA复制不断进行，双标记细胞占EdU标记细胞的百分比不断增大，且在DNA复制完成时达到最大值，因此图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
故填：Q；R。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要将L基因敲除。因Ce酶基因编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失，而纯合小鼠Lx的L基因两侧已插入特异DNA序列（x），因此需要将Ce酶基因和Er基因连接；而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，因此在筛选目标小鼠之后要饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）从而获得小鼠IK。
故填：将Ce酶基因和Er基因连接；饲喂口服药T。
（4）变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况，此时已经经过途径Ⅱ的一个完整细胞周期，细胞应都含有BrdU标记；如果变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，该过程未完成一次细胞周期，故t2时间后用BrdU饲喂也无法被利用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
故填：大多数B细胞没有被BrdU标记。
【分析】DNA复制为半保留复制，以DNA的两条链为模版，四种脱氧核苷酸为原料，在解旋酶和DNA聚合酶的催化作用下，根据碱基互补配对原则合成两条新的子链，每个DNA分子各含一条亲代DNA分子的母链和一条新形成的子链。DNA分子复制时间：有丝分裂和减数分裂前的间期；过程：边解旋边复制；结果：一分子DNA复制出两分子相同的DNA。
2．【答案】（1）氮源、碳源
（2）A菌能在培养平板中生长繁殖
（3）稀释；溶菌圈
（4）假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
【解析】【解答】（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
故填：氮源、碳源。
（2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，说明A菌变多，能在培养平板中生长繁殖。
故填：A菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）未获得合适的菌落密度，将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。因为有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出，所以培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
故填：稀释；溶菌圈。
（4）分析题中所给实验材料和设备，P菌、A菌可以在培养基上生长，圆形滤纸小片可用于吸附某种化学物质，离心机可用于将不同物质分离开。结合本实验的目的-为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。
故填：假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂 。
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。培养基种类：①按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。②按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
3．【答案】（1）野生型
（2）运载体；启动子和终止子
（3）DAI基因和卡那霉素抗性基因；75；自交；100；
【解析】【解答】（1）根据题干信息可知，该突变植株的DAI基因发生了隐性突变，相对的野生型DAI基因即是显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入该突变体植株，转化成功的话，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
故填：野生型。
（2）用PCR技术扩增DAI基因后，需要构建重组载体，将目的基因导入受体细胞，因此应该用限制性核酸内切酶对PCR产物DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；将目的基因接入基因表达载体启动子和终止子之间，可以确保插入的DAI基因在受体细胞中正常转录，因此其上下游序列需具备启动子和终止子。
故填：运载体；启动子和终止子。
（3）①T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体，根据图1可知，该运载体T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因，说明DAI基因和卡那霉素抗性基因经过转化，以及成功导入植物体基因组中。
②由①可知，T1代阳性植株细胞内都含有DAI基因，结合题干要求“选出单一位点插入的植株”，即单一位点插入目的基因，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代出现3∶1的性状分离比，所以选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③结合题干“进一步获得目的基囚稳定遗传的植株”，因此将以上获得的T2代阳性植株进行自交，纯合子自交不会发生性状分离，可以稳定遗传，反之杂合子会发生性状分离，因此再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，可以稳定遗传的种子在该培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，所以阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图9野生型和突变型基因片段PCR扩增序列可知，两者的基因长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，突变型的基因有限制酶X的切割位点，所以利用电泳鉴定PCR产物，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
故填：DAI基因和卡那霉素抗性基因；75；自交；100；电泳条带如图。
【分析】本题是基因工程于基因分离定律的实质相结合进行考查，比较创新。
（1）基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。其基本流程包括：目的基因的筛选和获取→基因表达载体的构建（核心）→将目的基因导入受体细胞（导入植物细胞常采用农杆菌转化法）→目的基因的检测与表达。
（2）基因工程的相关工具：限制酶，DNA连接酶，运载体的选择需要注意以下问题。①为防止目的基因与运载体自身换化和反向连接，一般选择同种限制酶对目的基因和运载体进行切割，使其产生相同的末端，然后选择DNA连接酶进行连接，构建重组载体。②为保障目的基因在受体细胞中稳定表达，目的基因应接入运载体启动子和终止子之间，因此不可以破坏启动子和终止子，以及标记基因。
（3）基因分离定律的实质是：在杂合子的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分开，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。
4．【答案】（1）再生植株；叶片
（2）纤维素；细胞质、细胞核；血细胞计数板；终止原生质体融合
（3）1个融合原生质体；ABD
（4）再分化；根和芽
（5）模板；M1、M2；电泳；1
【解析】【解答】（1）在甲、乙两种植物细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生植株的能力。为了便于观察细胞融合状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，根部细胞内不含叶绿体，原生质体无颜色，则乙植物可用幼苗的叶片为外植体，因为叶片细胞内含叶绿体，原生质体为绿色。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，甲植株需要提供细胞核，所以使甲原生质体的细胞质失活，乙植株需要提供细胞质，所以使乙原生质体的细胞核失活。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数。两种原生质体1：1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是终止原生质体融合。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织，所以同一块愈伤组织所有细胞源于同1个融合原生质体。愈伤组织只能来自于杂种细胞因为甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂，而同种细胞融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂，杂种细胞因为同时融合了甲原生质体内的细胞核和乙原生质体内的细胞质，结构和功能完整，可以生长分裂，所以ABD符合题意。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，以M1、M2为特异性引物，扩增序列a，以N1、N2为引物扩增序列b。
Ⅲ.将得到的2个PCR扩增产物进行电泳，若再生植株来自于杂种细胞，则该再生植株的总DNA中同时具有特异性DNA序列a和特异性DNA序列b，则每个PCR扩增产物在凝胶中均出现预期的1个条带。
故答案为：（1） 再生植株 ； 叶片 （2） 纤维素 ； 细胞质、细胞核 ； 血细胞计数板 ； 终止原生质体融合 （3） 1个融合原生质体 ； ABD （4） 再分化 ； 根和芽 （5） 模板 ； M1、M2 ； 电泳 ；1。
【分析】1、植物体细胞杂交技术：将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
过程：
优点：克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍，出现自然界没有的新品种。拓展了可用于杂交的亲本组合范围。
障碍：不同植物的体细胞完成融合，遇到的第一个障碍是细胞壁，用酶解法、纤维素酶、果胶酶去除。
意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
2、植物组织培养：指在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整的植株。
愈伤组织：由一团排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞组成。
再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。
5．【答案】（1）由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质
（2）限制酶、 DNA连接酶；鉴定受体细胞中是否含有目的基因
（3）微生物的数量；产物浓度
（4）写出干扰素的氨基酸序列，替换半胱氨酸为丝氨酸，改变相对应的脱氧核苷酸序列（或合成新基因），再进行基因工程生产所需要的干扰素
6．【答案】（1）蒽；蛋白质、核酸
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色；界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸；变性
（3）菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化
【解析】【解答】 （1）蒽是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，菌株A和B能够降解蒽，因此蒽为细菌生长提供碳源，生物大分子蛋白质、核酸的组成元素中含有N，因此该碳源在菌株A和B内的代谢产物可以参与合成蛋白质、核酸等生物大分子。
故填：蒽、 蛋白质、核酸。
（2）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色，所以DNA可以采用二苯胺试剂鉴定。在PCR中，引物能为DNA聚合酶提供结合位点，能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程包括：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，即在PCR播环的3个步骤中，温度设置最高的是变性。
故填：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色 、 界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 、变性。
（3）由表格内容可知：菌株A和B混合接种比单独接种对蒽的降解效果更好，有可能是因为菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
故填：菌株B整合了菌株A对蒽高降解的基因，发生了转化。
【分析】PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
（2）原理：DNA复制。
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。
7．【答案】（1）选择培养基；稀释涂布平板法
（2）在酸性条件下DNA分子发生化学反应，与二苯胺试剂会产生蓝色的化合物；琼脂糖溶液的浓度、DNA分子的大小和构象
（3）耐盐基因
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，可用一定浓度的盐水浇灌鉴定植株的耐盐性
【解析】【解答】（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能，故实验小组为获得耐盐纯培养物A，需要使用选择培养基进行筛选；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数，故本实验使用的接种方法是稀释涂布平板法。
（2）为获得纯培养物A的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA。在一定温度下，用二苯胺试剂对DNA进行检测，二苯胺检测DNA的原理是：在酸性条件下DNA分子发生化学反应，与二苯胺试剂会产生蓝色的化合物。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有琼脂糖溶液的浓度、DNA分子的大小和构象等。
（3）与同种非转基因植株的染色体DNA序列相比，转基因植株的染色体DNA含有耐盐纯培养物中的耐盐基因。
（4）为验证已获得的耐盐转基因植株具有耐盐性，在个体水平上进行检测，可用一定浓度的盐水浇灌鉴定植株的耐盐性。
【分析】（1）纯化微生物时常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法：平板划线法不易分离出单个菌落，不能计数；稀释涂布平板法能使单菌落分离，便于计数。
（2）基因工程的基本操作顺序：①基因表达载体的构建，②基因表达载体的构建，③将含有目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。
8．【答案】（1）克服了传统转基因技术的盲目性和随机性；限制性核酸内切酶和DNA连接酶
（2）具有发育的全能性；无菌无毒的环境、营养、温度和pH、气体环境
（3）囊胚；胚胎分割、细胞核移植、克隆繁殖
（4）给基因敲除猪导入肌生成抑制蛋白基因（或“注射肌生成抑制蛋白”），养殖一段时间后观察猪骨骼肌的生长情况
【解析】【解答】（1）由题干可知：基因敲除技术是将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，后者的整合是随机的，故基因敲除技术的最大优点是克服了传统转基因技术的盲目性和随机性。构建基因表达载体时，需要的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
（2）胚胎干细胞在功能上具有的特点是有发育的全能性。猪胚胎干细胞是动物细胞，动物细胞培养需要满足的条件包括四方面：无菌无毒的环境、营养、温度和 pH 、气体环境。
（3）筛选出靶细胞，导入猪的囊胚中，再将其植入代孕猪体内，使其发育并生产。要快速扩大基因敲除猪的种群，可以采取有性生殖、胚胎分割和细胞核移植、克隆繁殖技术。
（4）为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射肌生成抑制蛋白，如果猪表现型转为正常，说明确实是由于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。
【分析】1、基因工程的基本工具： （1）限制性内切核酸酶：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 （2）DNA连接酶：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。 （3）载体：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因，能携带外源DNA片段进入受体细胞。
2、动物细胞培养条件： （1）营养：培养基中应含有细胞所需要的各种营养物质，通常需要加入血清等天然成分。 （2）无菌、无毒的环境。 （3）温度、pH和渗透压。 （4）气体环境：氧气是细胞代谢所必需的，二氧化碳的主要作用是维持培养液的pH。动物细胞培养需要将培养瓶置于含95%空气和5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养。
9．【答案】（1）基因数据库；Ⅱ、Ⅳ；四环素；琼脂糖凝胶电泳；凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象；培养基的配制、灭菌；菌体；过滤、沉淀、离心、静置
（2）获能；显微注射法；血清(或血清、血浆)；对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物；滋养层细胞；早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移；同期发情；雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大
【解析】【解答(1)①化学合成法可合成已知序列的基因，可以检索基因数据库获取目的基因的编码序列，用化学合成法制备目的基因。图中四环素抗性基因中含有酶切位点I，氨苄青霉素抗性基因中含有I、II、IV三种酶切位点，若切割时使用限制酶I，则两种抗生素抗性基因均被破坏；若使用限制酶Ⅱ、IV进行酶切时，会将氨苄青霉素抗性基因破坏。为了能同时切割质粒和目的基因，防止反向连接和自身环化，同时使基因表达载体存在完整的标记基因，需要使用限制酶Ⅱ、IV。 氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因未被破坏，故筛选时可将受体酵母菌置于含有四环素的培养基中进行筛选培养，以获得能表达HSA的细胞。
②DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
③由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物菌体的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀、离心、静置等方法将菌体分离和干燥。
故填：基因数据库；Ⅱ、Ⅳ；四环素；琼脂糖凝胶电泳；凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象；培养基的配制、灭菌；菌体；过滤、沉淀、离心、静置。
(2)①精子经过获能后才具有与卵细胞结合形成受精卵的能力，因此在体外受精前，需要对奶牛的精子进行获能处理。
②将目的基因导入（动物）受体细胞最常用的方法是显微注射法。
③由于所需的成分可能有未知部分，动物细胞培养需要加入血清等天然成分；培养条件要求无毒无菌的环境，对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物都有助于提供无毒、无菌的环境。滋养层细胞可发育成胎膜和胎盘，对个体发育的关键部分没有影响，故取滋养层细胞做DNA分析来进行性别鉴定。
④在胚胎移植操作中，应对供体和受体母牛进行同期发情处理，以使供体和受体处于相同的生理状态，使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致。由此可见，胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。
⑤乳腺生物反应器具有一定的局限性，雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大。
故填：获能；显微注射法；血清(或血清、血浆)；对培养液和所用培养用具进行无菌处理；培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液以便清除代谢产物；滋养层细胞；早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移；同期发情；雌性牛只有在哺乳期才能分泌乳汁，而尿液不会受到性别和发育期的影响，尿液的分泌总量要比乳汁的分泌量大。
【分析】（1）化学合成法可合成已知序列的基因，因此可以检索基因数据库获取目的基因的编码序列，再用化学合成法制备更多的目的基因。基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。基因表达载体的构建需要用到限制性内酶，为了能同时切割质粒和目的基因，防止反向连接和自身环化，同时使基因表达载体存在完整的标记基因，需要使用两种不同的限制酶。目的基因的导入常常采用显微注射法（动物）和脓杆菌转化法（植物），（2）PCR的产物可通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（3）微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。细菌的计数可以通过稀释涂布法计数，也可利用显微镜进行直接计数。显微镜直接计数是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物菌体的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
10．【答案】（1）mRNA；逆转录；引物Ⅱ、Ⅲ；5'；KpnⅠ及XhoI（顺序需与引物对应）
（2）RNA聚合酶识别与结合的部位，启动转录；Dhn4基因浓度（目的基因浓度）、载体与Dhn4基因的比例、DNA连接酶浓度、酶切程度
（3）CaCl2；氨苄青霉素；转化
（4）愈伤组织；生长素与细胞分裂素；低温（抗冻性检测）
【解析】【解答】（1）青稞细胞中的mRNA经过逆转录获得cDNA；引物能使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，故应选择物方向是从5'→3'端延伸，即引物Ⅱ和引物Ⅲ。限制酶序列应添加在基因的外侧，不影响基因的序列，故添加在5'端，因为B链为模板链，转录的方向是沿着模板链的3'→5'端，应将Dhn4基因的左端与启动子一侧连接，又因为目的基因中含有PstI的识别序列，不能选用，故添加的限制酶序列分别是KpnI和XhoI。
（2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，多种因素会影响Dhn4与质粒的连接效率，如温度与等操作环境反应时间、质粒浓度及Dhn4基因浓度（目的基因浓度）载体与Dhn4基因的比例、DNA连接浓度、酶切程度等。
（3）农杆菌是原核生物，需要Ca2+处理，使其处于易于吸收外源DNA的状态，完成将基因表达载体导入受体细胞的过程，其中基因表达载体上的amp'基因为氨苄青霉素抗性基因，属于标记基因，故可在含氨苄青霉素的培养基上培养、筛选农杆菌，再将阳性农杆菌与草莓叶片共培养，完成转化实验，转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（4）转基因草莓叶片经脱分化形成愈伤组织，然后通过调整培养基中的生长素和细胞分裂素的浓度和比例，最终获得幼苗，从个体水平可通过温对转基因是否成功进行检测。
【分析】基因工程的操作程序：
（1）目的基因的筛选与获取：利用PCR获取和扩增目的基因：①变性：当温度上升到90℃以上时。双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时。两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：72℃左右时，耐高温的DNA聚合酶活性高。可使DNA新链由5'端向3'端延伸。（2）基因表达载体的构建： 基因表达载体的组成有目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。
（3）将目的基因导入受体细胞——感受态细胞法：适用于微生物。Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。
（4）目的基因的检测与鉴定：①分子水平：DNA分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA是否插入目的基因，也可检测目的基因是否转录出mRNA。抗原抗体杂交法检测目的基因是否表达出蛋白质。②个体生物学水平鉴定。
11．【答案】（1）短单链核酸；2
（2）上游；Ti质粒自身环化；目的基因自身环化
（3）花粉管通道法；子房
（4）成功转化重组质粒细胞（组织）的筛选/检测目的基因是否导入受体细胞
【解析】【解答】(1) β-1，3葡聚糖酶基因( BG2 )在体外大量克隆，可利用PCR技术，PCR技术扩增目的基因时，需要一小段能与该基因( BG2 )碱基序列互补配对的短单链核酸作为引物，PCR技术过程中，如果两种引物序列互补，复性时，引物可与引物结合，母链没有引|物结合就不能得到子链，得不到的基因产物。
故填： 短单链核酸；2。
(2)人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高(增强)转录活性，它位于目的基因( BG2)上游，启动子是RNA聚合酶识别与结合结构，有它才能驱动基因转录出mRNA。双酶切，一定程度上防止Ti质粒自身环化与目的基因自身环化。
故填：上游；Ti质粒自身环化；目的基因自身环化。
(3) 中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是花粉管通道法，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
故填：花粉管通道法；子房。
(4)在完成遗传转化后，需要杀死农杆菌以及检测含有目的基因的质粒是否成功转入到受体细胞，因此选择培养基中至少要加入两种抗生素，一种用于杀死农杆菌，另一种用于成功转化质粒细胞(组织)的筛选(或检测目的基因是否导入受体细胞)，起到选择作用。
故填： 成功转化重组质粒细胞（组织）的筛选/检测目的基因是否导入受体细胞。
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是一种DNA操作技术，需要借助限制酶、DNA连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的分离与获取、基因表达载体的构建、将目的基固导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等方面有广阔的应用前景。
12．【答案】（1）限制酶和DNA连接；防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接
（2）无AbA抗性，组氨酸缺陷；添加AbA和缺少组氨酸；排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响
（3）实验思路：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。 预期结果及推论：菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
【解析】【解答】（1）构建基因表达载体需要用限制酶和DNA连接酶，所以需要用限制酶和DNA连接酶将目的基因分别插入酵母表达载体中。酶切时通常选用两种不同的酶，这样做的目的是防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接。
故答案为：限制酶和DNA连接；防止目的基因和运载体自身环化，防止目的基因和运载体反向连接。
（2）题干指出若用AUR1-C（抗生素AbA抗性基因）和HIS3（组氨酸合成基因）作为报告基因，要将该报告基因导入受体酵母菌中，将来为了区分未成功导入和成功导入告基因的酵母菌，所以受体酵母菌就不能有报告基因控制的性状，故作为被转化的酵母细胞抗生素抗性和营养需求上应满足的条件是无AbA抗性，组氨酸缺陷。转化后需要在添加AbA和缺少组氨酸的培养基上培养筛选。酵母染色体上的报告基因能被GAL4激活转录，所以为了排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响，所以要敲除GAL4基因。
故答案为：无AbA抗性，组氨酸缺陷；添加AbA和缺少组氨酸；排出GAL4对细胞内其他报告基因的影响。
（4）题干信息指出酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，由DNA结构功能域（BD）和转录激活结构域（AD）组成。两个结构域分开时不能激活转录，只有当两者空间上接近时，才具有GAL4转录因子活性。BD与基因上游激活序列UAS结合后，激活AD与启动子结合，使启动子下游基因转录。结合题意和题图可知，只有蛋白质Snf1和Snf2连接上共同作用于启动子，才能使LacZ基因表达的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。因此本实验设计思路是：构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，然后分解菌落的颜色进行鉴定和分析。故实验思路及预期结果为：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。预期结果及推论是菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
故答案为：实验思路：分别构建BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体，转化酵母细胞，在添加X-gal的固体培养基上培养，观察菌落颜色。
预期结果及推论：菌落的颜色既有蓝色又有白色。蓝色的菌落是同时转化了BD-Snf1和AD-Snf2两种融合表达载体的酵母细胞，白色的菌落是单独转化其中任何一个载体或未转化的酵母细胞。出现蓝色菌落说明蛋白质Snf1和Snf2之间存在相互作用。
【分析】1、基因表达载体的构建是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点。
2、切割目的基因时选用不同限制酶的目的是防止目的基因自身环化和保证目的基因的定向连接。
13．【答案】（1）微生物生理结构和遗传物质简单，生产成本低，生长繁殖快、容易进行遗传物质操作；不能；原核细胞无内质网和高尔基体，无法对表达出的蜂毒前溶血肽原进行加工
（2）Asn-Gly(NG丙氨酸-甘氨酸)；GGT；有活性的蜂毒肽末端没有甘氨酸；213
（3）高；EcoRI、SalI和DNA连接酶(限制酶+DNA连接酶)；5'-ATGAAATT-3'
（4）不含有；大小(长度)，构象(形状)，电荷，凝胶浓度，电压
（5）T-DNA
【解析】【解答】（1）生产蜂毒肽常选用微生物做受体细胞，是因为微生物结构和遗传物质较简单，生长繁殖速度快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作，生产成本也比较低；原核细胞不能直接获得蜂毒肽，因为原核细胞内没有内质网和高尔基体，不能对蜂毒前溶血肽原进行修饰和加工。
故填：微生物生理结构和遗传物质简单，生产成本低，生长繁殖快、容易进行遗传物质操作；不能；原核细胞内没有质网和高尔基体，无法对表达出的蜂毒前溶血肽原进行加工。
（2）图示提示阴影表示蜂毒肽序列，甘氨酸(Gly)，缩写为G，丙氨酸(Asn)，缩写为N，方框表示 Asn·Gly位点；羟胺是一种能专一性裂解特定两个氨基酸之间肽键的化合物，那么对比改造前后氨基酸序列的变化可知，羟胺的识别位点是在Asn-Gly，而蜂毒肽用阴影表示，那么其第一个氨基酸是G甘氨酸，要将其改造成丙氨酸Asn，应该在蜂毒肽对应的核酸序列前加入AAC，使其表达Asn从而形成Asn·Gly位点；同时与原DNA序列相比，改造后的序列中删除了Gly的对应序列GGT，因为蛋白质的功能取决于其结构，结构又与氨基酸的种类、数目等有关，因此改造后的序列中删除了Gly的对应序的原因是蜂毒肽末端没有Gly；据图可知，最终改造后的DNA序列是最下端的DNA序列，长度为213bp。
故填：Asn-Gly(NG丙氨酸-甘氨酸)；GGT；有活性的蜂毒肽末端没有甘氨酸；213。
（3）DNA含有的GC碱基对越多，氢键数越多，结构越稳定，则GC含量越高，PCR过程中退火温度的设定值越高。基因表达载体构建时需要用同种限制酶切割目的基因和运载体，使其产生相同的黏性末端，再利用DNA连接酶将切割后的目的基因和运载体连接起来形成重组质粒；观察目的基因与载体，目的基因两端含有EcoRI和 Sall识别序列，推测所选的限制酶是EcoRI和 Sall；PCR扩增时，需要引物与模板的3'端结合，若扩增PL基因时设计的一条引物的序列是引物M1：5'-GAATTC-3'，EcoRI的识别序列是GAATTC，结合（2）可知，PL基因序列为ATGAAATT........，根据EcoRI的识别序列和PL基因位置关系和耐高温DNA聚合酶的特性可知，该引物的后8个碱基是5'-ATGAAATT-3'。
故填：高；EcoRI、SalI和DNA连接酶(限制酶+DNA连接酶)；5'-ATGAAATT-3'。
（4）图2大肠杆菌的质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，那么要想获得转化成功的大肠杆菌，需要将大肠杆菌混合物全部转入含氨苄青霉素的选择培养基中进行筛选，为了排除大肠杆菌自身氨苄青霉素抗性基因的影响，就要将重组表达载体转化至不含有pGEX-4T-1/PPMel的大肠杆菌的感受态细胞；PCR的产物常用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、电压、DNA分子的大小和构象有关。
故填：不含有；大小(长度)，构象(形状)，电荷，凝胶浓度，电压。
（5）采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，先将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用农杆菌的转化作用，再将目的基因随机整合到植物细胞染色体的DNA上。
故填： T-DNA 。
【分析】基因工程技术的基本操作流程：
1、目的基因的筛选与获取：从已知结构的基因中进行筛选，然后可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；导入植物细胞一般选用农杆菌转化法，导入动物细胞采用显微注射技术，导入微生物细胞用钙离子处理使其处于感受态。
4、目的基因的检测与鉴定。
14．【答案】（1）黏性；DNA连接；标记基因
（2）农杆菌转化法；分子杂交；放射性同位素标记的基因TcSR1
（3）
【解析】【解答】（1）由图可知，使用限制酶BalⅡ和BamHⅠ切割得到的DNA片段末端均是黏性末端；DNA连接酶可恢复被限制酶切割的磷酸二酯键，所以用两种酶分别切割目的基因和质粒载体V3后，再用DNA连接酶处理，以构建基因表达载体；质粒载体V3一般应具有标记基因，其功能是供重组DNA的筛选。
故填：黏性；DNA连接；标记基因。
（2）将目的基因导入植物细胞的方法有花粉管通道法、农杆菌转化法和基因枪法等，其中最常用的是农杆菌转化法；若要检测杨树植株中目的基因TcSR1是否发生转录出mRNA，则可采用分子杂交技术，即需要将放射性同位素标记的基因TcSR1片段制成探针，探针会与目的基因转录出的mRNA特异性结合，最终检测出放射性，若没有检测出放射性，则说明目的基因没有发生转录。
故填：农杆菌转化法；分子杂交；放射性同位素标记的基因TcSR1。
（3）植物组织培养的过程一般经历脱分化和再分化，最终形成完整植株个体。故将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是：
含目的基因的细胞愈伤组织完整植株
故填：含目的基因的细胞愈伤组织完整植株
【分析】1、基因工程的基本工具及作用
①限制酶：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，使一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有一定的专一性；在选择限制酶时，要保证该限制酶不会切割目的基因和载体上的标记基因、启动子、终止子和复制原点等，并且限制酶酶切位点应介于载体的启动子与终止子之间，最好选用两种能够产生不同黏性末端的限制酶分别对目的基因和载体的两侧进行切割，避免目的基因或载体自身环化；
②DNA连接酶：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键；
③载体：能运载目的基因进入受体细胞，并使目的基因能在受体细胞中稳定存在并表达。
作为载体应具备的条件：能稳定存在并自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因以及对受体细胞无害。
2、将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法或基因枪法，在自然条件下，农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力，所以农杆菌转化法一般适用于双子叶植物和裸子植物，但随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
3、一般用DNA分子杂交技术来检测目的基因是否插入受体细胞；使用分子杂交技术检测受体细胞是否转录出mRNA；使用抗原-抗体杂交技术检测受体细胞是否翻译出蛋白质；通过抗性实验等检测个体是否表达出相应的性状。
15．【答案】（1）62；5'
（2）BamH I、Sau3A I；BamH I、Hind Ⅲ
（3）T-DNA；位于该片段内部
（4）共培养；激素的比例和浓度
【解析】【解答】（1） PCR 扩增DNA分子时，以DNA的两条链为模板，每条链都需要引物引导子链DNA的合成，所以所需引物数量等于新合成的DNA单链数等于，扩增n次，新合成DNA单链为2n+1-2，所以连续扩增循环5次，需要的引物数为26-2=62个。限制酶的识别序列应位于目的基因的两端，这样不会破坏目的基因的碱基序列，DNA聚合酶在子链的3'端开始添加脱氧核苷酸，所以DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，那么，限制酶的识别序列应加在引物的5'端。
故填：62；5'。
（2）从图2可知BamH I、Bcl I的酶切位点位于抗除草剂基因的左侧，Sau3A I、Hind Ⅲ的酶切位点位于其右侧侧，必须选用目的基因两侧的各一种酶对目的基因进行切割，这样不会破坏目的基因。若用Hind Ⅲ切割质粒，会导致载体上缺少启动子或终止子而无法进行基因的转录；若用BclI切割， BclI 的识别序列中又包含Sau3AI的识别序列，会导致目的基因与载体产生的末端不完全相同而无法连接，故只能选BamH I、 Sau3A I进行切割。但由于这两种酶切出的黏性末端相同，容易导致目的基因和载体自身环化，故若质粒中无左侧的Hind Ⅲ切割位点，应选 BamH I 、Hind Ⅲ进行切割较好。
故填：BamH I、Sau3A I；BamH I、Hind Ⅲ。
（3）若转化方法为农杆菌转化法，所用载体与图1最大的不同是质粒中一定含有T-DNA，同时，用于切割质粒的限制酶的识别序列应位于该片段的内部，这样抗除草剂基因才能随着T-DNA转移，而转移到植物细胞的染色体基因中。
故填：T-DNA；位于该片段内部。
（4）将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，这样通过农杆菌的转化可以使除草剂基因进入受体细胞，筛选出转化成功的细胞后进行植物组织培养时，脱分化和再分化阶段使用的培养基存在差异，不同培养基最大的区别是使用激素的比例不一样，诱导外植体脱分化形成愈伤组织时，生长素和细胞分裂素的比例相当，再分化诱导愈伤组织生根时，生长素的比例较高，诱导形成芽时，生长素的比例偏低。
故填：激素的比例和浓度
【分析】PCR是依据DNA半保留复制进行的体外DNA复制，在高温作用下DNA双链解旋，每条DNA单链作为模板，在2种不同引物的作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始添加脱氧核苷酸，合成子链。
在构建基因表达载体时，所选择的限制酶要考虑以下几点：①不要破坏目的基因和标记基因；②不要破坏启动子和终止子，以及复制原点；③尽量选择双酶切，可以防止目的基因和载体的自身环化、或者反向连接。
将目的基因导入受体细胞，需根据受体细胞的不同采用不同的方法。导入植物细胞常采用农杆菌转化法；导入微生物细胞采用钙离子处理法使其处于感受态，易于吸收周围的DNA；导入动物细胞采用显微注射技术。
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