2024年高考生物复习冲刺：生物技术与工程（新高考专用）
1．(2023·北京·高考真题)自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明 。
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证(主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱) 。
[答案](1)氮源、碳源
(2)A菌能在培养平板中生长繁殖
(3) 稀释 溶菌圈
(4)假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
[解析](1)蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
(2)将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。
(3)将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
(4)根据实验实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌
物，为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。
2．(2023·全国·高考真题)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵(酒精发酵)。实验流程如图所示。
回答下列问题。
(1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是 。
(2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 (答出1点即可)。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有 (答出2点即可)。
(3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。
(4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。
[答案](1)菌T能够分泌纤维素酶
(2)为合成微生物细胞结构提供原料(微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂) ①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟。
(3) 制造无氧环境 排出二氧化碳 酸性的重铬酸钾溶液
(4) 葡萄糖 节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广
[解析](1)菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解。
(2)培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料(微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂)。 高压蒸汽灭菌法的注意的事项有①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求的高度，结果导致灭菌的失败；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121℃的条件下，维持15~30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，应使锅内蒸气压力缓慢降低，排气时间不少于10一12分钟，否则锅内蒸气压力突然降低，液体突然沸腾，冲走瓶盖，使液体喷出或使容器破裂。
(3)果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳，酒精可用酸性重铬酸钾溶液来检测，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
(4)与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，利用纤维素为原料生产乙醇具有节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广等优点。
3．(2023·湖南·高考真题)某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题：
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度/( g mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 (答出两点即可)。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 (答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体 ②MRSA感染的肺类装配体 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽 ④生理盐水 ⑤青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物) ⑥万古霉素(抗MRSA的药物)
[答案](1)无机盐、淀粉
(2) 金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 1.73~3.45
(3)淀粉酶编码基因M发生突变；重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失
(4) 无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境 否
(5)②③④⑥
[解析](1)由题意可知，根际促生菌具有固氮作用，可利用空气中的氮气作为氮源，因此用于筛选根际促生菌的培养基的主要营养物质包括水、无机盐和淀粉。
(2)由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45-55.20 μg·mL-1范围内，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均不能生
长，表明该抗菌肽对它们的抑菌效果较好；因为抗菌肽的浓度为1.73μg·mL-1时，它们均能生长，所以要确定抗菌肽抑菌效果的最低浓度，应在1.73~3.45 μg·mL-1的浓度区间进一步实验。
(3)在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M，可能的原因是淀粉酶编码基因M发生突变；或者是重组质粒在大肠杆菌分裂过程中丢失。
(4)肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及无菌、无毒环境，含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件；由图示可知，肺类装配体形成的过程中没有运用动物细胞融合技术，只涉及了细胞的分裂和分化等内容。
(5)科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力，必备实验材料为：②MRSA感染的肺类装配体、 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽、④生理盐水(设置对照实验使用)、 ⑥万古霉素(抗MRSA的药物，比较解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽的疗效)，故选②③④⑥。
4．(2023·湖北·高考真题)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞) (填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
[答案](1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
[解析](1)浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。故选④。
5．(2023·浙江·高考真题)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
[答案](1) 负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA酶
PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
[解析](1)负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
(2)①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对
照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
6．(2023·全国·高考真题)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
[答案](1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因
(2) 终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(3)密码子具有简并性
(4)将构建好的表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达
[解析](1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。
(3)正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。
(4)基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体(含有目的基因YFP基因)导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
[典例1](2024·河南濮阳·一模)可利用重叠延伸PCR诱变技术将两个独立的基因在指定位点进行连接，以获得融合目的基因。该技术需要一对内部致突变引物和一对侧翼引物，经过三个PCR反应。下图表示将基因A序列与基因B序列在ATG处定点拼接的过程。请回答下列问题：
(1)PCR反应体系中需要加入的物质除了图中所示的物质外，还必须加入4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和 等，其中Mg2+的作用是 。
(2)图中致突变引物1和致突变引物2序列的关系是 (填“相同”“碱基互补”或“无关”)。致突变引物1
的5'端序列是根据 的部分碱基序列设计的。
(3)PCR3第一次循环中理论上复性的产物有 种，其中能进行进一步延伸的是图中的 (填序号)，原因是 。
[答案](1) 缓冲液 激活耐高温的DNA聚合酶
(2) 碱基互补 基因A
(3) 4/四 ① 扩增的基因方向是一定的，需要引物与其3'端结合
[解析](1)利用PCR技术扩增DNA时，PCR反应体系中需要加入的物质除了图中所示的物质(模板DNA、引物)外，还必须加入4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和缓冲液(维持pH)等；使用的DNA聚合酶应用是耐高温的DNA聚合酶，其中Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。
(2)分析题意，该过程是利用重叠延伸PCR诱变技术将两个独立的基因在指定位点进行连接，以获得融合目的基因，则图中的致突变引物1和致突变引物2序列的关系是有一段序列碱基互补配对，从而保证融合后的基因能够重叠，向两侧延伸；致突变引物1与基因A的3'端结合，其5'端与基因A能够互补配对，故5'端序列是根据基因A的部分碱基序列设计的。
(3)PCR3是对改造后的基因A和改造后的基因B进行扩增，由于基因A和基因B各具有两条链，则分别于引物结合并延伸后，有4种PCR产物；由于要扩增的基因方向是一定的，需要引物与其3'端结合，则只有1种是进一步延伸的，对应图中的①。
技巧点拨：利用PCR获取和扩增目的基因
原理：DNA复制。
条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
扩增过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
[变式—1](2024·江西·模拟预测)表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)过表达和STC2(癌症相关基因)mRNA的m6A修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5基因沉默和STC2基因的过表达，以研究ALKBH5介导的m6A甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响(其中STC2基因的α链为转录的模板链)。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图3所示。
STC2基因：
注：A、B、C、D为四种引物序列；BamHI、HindⅢ、SacI为限制酶
(1)图1PCR反应体系中需加入4种dNTP、 、模板和 ，还需加入引物(选“A、B、C、D”)等。
(2)为达到图1目的需要对上述引物进行设计，你的设计思路是 。
(3)为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，太短会导致 ；也不能太长，太长会导致延伸的温度大于74℃，这样会造成 。
(4)据图3可知，ALKBH5基因过表达导致 。
[答案](1) 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、扩增缓冲液(或含Mg2+缓冲液) B、C
(2)需要在引物C的5'端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物B的5'端添加Sac Ⅰ识别序列
(3) 导致非特异性扩增 不适于耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化反应(或影响耐高
温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)的活性)
(4)STC2基因表达(转录)的mRNA去甲基化
[解析](1)图1PCR反应体系中需加入4种dNTP作为原料、还需要加入耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、模板和扩增缓冲液(或含Mg2+缓冲液)，由于子链延伸时是从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，因此引物需要连接在模板链的3’端，这样才能保证扩增的片段含有目的基因，据图1可知，还需加入引物B和C。
(2)利用PCR扩增目的基因STC2时，引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，且STC2基因的α链为转录的模板链，由于形成的mRNA与模板链互补，且方向相反，并且形成mRNA时mRNA链的延伸是从5'端→3'端，即图1中基因转录时是由右向左进行，因此启动子应在引物C的5'端，即需要在引物C的5'端添加BamH Ⅰ识别序列和强启动子序列，在引物B的5'端添加Sac Ⅰ识别序列。保证扩增的DNA片段用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ切割后形成的目的基因含有强启动子。
(3)为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，因为太短会与多个位点结合，会导致非特异性扩增；也不能太长，由于酶作用的发挥需要适宜的温度，引物过长则会使反应体系有关步骤温度提高，从而超过耐高温的DNA聚合酶的最适温度，不利于耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化反应。
(4)根据题意“胃癌细胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)过表达和STC2(癌症相关基因)mRNA的m6A修饰水平降低的异常现象”，并结合图示可知ALKBH5基因过表达导致STC2基因表达的mRNA去甲基化，进而导致STC2基因过表达而引起癌细胞迁移。
[典例2](2024·宁夏银川·模拟预测)CRlaa和mCRlaa是两种早期胚胎培养常用的培养液，这两种培养液中除NaCl浓度不同外，其他成分及浓度均相同。为了比较这两种培养液对体外胚胎培养的差异情况，科研人员进行了相关实验，所得实验结果如下表所示。回答下列问题。
组别 卵裂数 卵裂率 囊胚数 囊胚率
CRlaa 769 84.9% 189 20.6%
mCRlaa 750 83.7% 252 28.1%
注：卵裂率(％)＝卵裂数／卵母细胞总数x100％。囊胚率(％)＝囊胚数／卵母细胞总数x100％。
(1)实验所用胚胎可通过体外受精培育而来，哺乳动物的体外受精主要包括 精子的获取和受精等几个主要步骤。获得的精子需进行 处理。
(2)CRlaa和mCRlaa两种培养液的成分除了含无机盐和有机盐类外，还需添加 (答出1点即可)、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及 等物质。根据表中信息比较这两种培养液对卵
裂及囊胚发育的影响： 。
(3)囊胚期的滋养层细胞最终会发成 。
(4)将培养获得的囊胚通过 技术转移至受体的子宫内继续发育成胎儿。外来胚胎在受体内存活的生理学基础是 。
[答案](1) 卵母细胞的采集 获能
(2) 维生素 动物血清 CRlaa和mCRlaa对于卵裂期的发育影响接近，mCRlaa培养液更有利于囊胚发育
(3)胎膜和胎盘
(4) 胚胎移植 受体对移入子宫的胚胎基本不发生免疫排斥反应
[解析](1)哺乳动物的体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等几个主要步骤，采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行成熟培养和获能处理。
(2)动物细胞培养液需要糖类、氨基酸、无机盐、维生素等营养物质以及动物血清等成分。根据表中信息可知CRlaa和mCRlaa对于卵裂期的发育影响接近，mCRlaa培养液更有利于囊胚发育。
(3)囊胚期的滋养层细胞最终会发成胎盘和胎膜，内细胞团发育成胎儿的各种组织。
(4)将培养获得的囊胚通过胚胎移植技术转移至受体的子宫内继续发育成胎儿。外来胚胎在受体内存活的生理学基础是受体对移入子宫的胚胎基本不发生免疫排斥反应。
技巧点拨：胚胎移植的生理学基础
(1)胚胎能够移入受体基础：哺乳动物发情排卵后，同种生物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的
(2)胚胎能被收集基础：哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态
[变式—2](2024·全国·模拟预测)据最新报道，经过5年科研攻关，中国科学家培育出世界上首只高比例胚胎干细胞“嵌合体猴”。回答下列问题：
(1)在培养过程中，多能干细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单
层，这种现象称为 ；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是 。
(2)体外培养动物细胞时，首先应保证其处于 的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是 。
(3)得到的重构胚通常需要发育到 阶段才能进行胚胎移植，胚胎移植的实质是 。研究人员将早期胚胎进行分割后移植，结果接受分割胚胎的其中一头健康母猴发生流产。从胚胎分割的角度分析，造成这种现象的原因可能是 。
(4)早期胚胎通过胚胎移植技术移入受体的子宫内继续发育，早期胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是 。
[答案](1) 接触抑制 多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活
(2) 无菌、无毒 95%的空气和5%的CO2
(3) 桑椹胚或囊胚 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换 桑椹胚或囊胚的内细胞团未均等分割，胚胎发育停滞或无法发育
(4)受体子宫对早期胚胎基本不发生免疫排斥反应
[解析](1)在培养过程中，多能干细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为接触抑制现象；多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境中变性失活，因此进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理；
(2)体外培养动物细胞时，首先应保证其处于无菌、无毒的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是95%空气加5%CO2的混合气体；
(3)胚胎移植的是发育到桑椹胚(桑葚胚)或囊胚时期的胚胎，胚胎移植的实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换；早期胚胎进行分割时需要将桑椹胚或囊胚的内细胞团均等分割，否则将会影响胚胎的发育，因此接受分割胚胎的其中一头健康母猴发生流产的原因可能是桑椹胚或囊胚的内细胞团未均等分割，胚胎发育停滞或无法发育；
(4)早期胚胎通过胚胎移植技术移入受体的子宫内继续发育，早期胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是受体子宫对早期胚胎基本不发生免疫排斥反应。
[典例3] (2024·贵州黔西·一模)科学家提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的方法：利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。回答下列问题：
(1)利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要 酶。
(2)基因工程中的核心工作是 ，该过程需要的工具酶是 。
(3)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
在设计PCR引物时最好添加限制酶 的识别序列，选择依据是 。
经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，则其中一种引物设计的序列是5'— 3'。
[答案](1)逆转录/反转录
(2) 基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶
(3) EcoRI和XhoI MunI会破坏氨苄青霉素抗性基因，SalI和NheI会破坏目的基因 -GAATTCCGTAAGACTCCG
[解析](1)mRNA在逆转录酶的催化作用下通过逆转录过程把遗传信息传递到DNA分子，就获得了胰岛素基因。
(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建，该过程中需要使用限制酶(切割目的基因和运载体)和DNA连接酶(连接切割后的目的基因和运载体)。
(3)由图可知，对于目的基因，SalI和NheI的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，同时质粒上MunI的其中一个作用位点是在标记基因上，所以只能选择EcoRI和XhoI两种限制酶，故在设计PCR引物时最好添加限制酶EcoRI和XhoI的识别序列；
为了目的基因能正确表达，由目的基因的转录方向可知，目的基因必须左侧连接启动子，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，根据两种酶在质粒上的位置上可知，EcoRⅠ识别序列需要添加在目的基因的左侧，XhoI的识别序列需要添加在目的基因的右侧，其中一种引物设计的序列是胰岛素基因左端①处的碱基序列为为—GCATTCTGAGGC—，由于DNA合成时，新链的延伸方向为5′→3′，即其中一种引物与模板链3′(①处互补的位置)碱基互补配对，还需要再左侧加上-GATTC序列，所以其中
一种引物设计的序列为5′-GAATTCCGTAAGACTCCG-3′。
技巧点拨：基因表达载体的构建
(1)需要用到的工具：限制酶、DNA连接酶、载体。
(2)基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
(3)基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，还要能表达和发挥作用。
(4)启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。
(5)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。
(6)构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限制酶切割，以避免质粒或目的基因自身连接。
(7)限制酶切割载体时不能破坏标记基因，以避免标记基因不能表达，不能筛选出含有目的基因的受体细胞。
[变式—3] (2024·河北·模拟预测)EGFR是一种表皮生长因子受体，由信号肽区(可保证蛋白质在细胞中的定向运输)、胞外区、跨膜区和胞内区组成。当表皮生长因子与其胞外区结合后，可引起一系列基因活化，进而导致肿瘤细胞增殖，但EGFR缺失胞内区后形成的DNEGFR虽也可与表皮生长因子结合，却不会引起相应的基因活化。图1为EGFR cDNA结构及其对应的蛋白质的功能区，研究人员利用人结肠癌组织、pEGFP-N1质粒、大肠杆菌、cos-7细胞(一种常用的动物细胞系)等做了一系列实验，以探究DNEGFR基因在细胞中的表达和定位情况，基本流程如图2所示。
(1)研究人员从人结肠癌组织中提取总RNA，用 酶处理获得cDNA。图2中过程②应选择图1中的引物 (填数字)进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物 端加入使用的限制酶的识别序列。
(2)图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，以便根据绿色荧光蛋白的位置确定 。结合EGFR基因指导合成的蛋白质的各部分的功能，推测EGFP序列需在DNEGFR序列的 (填“上游”或“下游”)，原因是 。
(3)过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌和重组质粒混匀后培养在含有 (填抗生素)的培养基上，进行过程④和过程⑤的目的是 。
(4)过程⑥进行时需要提供的气体环境为 。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时荧光应主要分布在 部位。
[答案](1) 逆转录 1和3 5′
(2) DNEGFR蛋白在细胞中的位置 下游 若EGFP序列位于DNEGFR序列上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置
(3) 卡那霉素 获得更多的重组质粒
(4) 95%空气和5%的CO2 细胞膜
[解析](1)通过RNA逆转录获得cDNA，需用逆转录酶处理。图2中过程②的目的是获得只控制合成信号肽段、胞外区、跨膜区三个部分的DNEGFR cDNA，因此应选择图1中的引物1和引物3进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物5′端加入使用的限制酶的识别序列。
(2)图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，使得EGFP和DNEGFR同时表达，即以绿色荧光蛋白的位置来确定DNEGFR蛋白在细胞中的位置。若EGFP序列在DNEGFR序列的上游，则信号肽无法发挥作用，不能根据绿色荧光蛋白的位置判断DNEGFR的位置。
(3)过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌与重组质粒混匀，培养在含有卡那霉素的培养基上。由图2可知，进行过程④和过程⑤的目的是获得更多的重组质粒。
(4)过程⑥是对转染后的动物细胞进行培养，此过程通常需要提供的气体环境为95%空气(满足细胞代谢对氧气的需求)和5%的CO2(维持培养液的pH)。若DEGEP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时，荧光应主要分布在细胞膜部位。
1．(2024·陕西商洛·模拟预测)反硝化细菌是一类能将硝态氮(NO3-—N)通过一系列中间产物(NO2-、NO、N2O)还原为气态氮(N2)的细菌群，反硝化作用也是产碱过程。反硝化细菌对于解决水体富营养化和亚硝酸盐对水生动物的毒害，具有十分重要的意义。某课题小组通过采集活性污泥样品，并从中分离反硝化细菌，研究
影响菌株反硝化作用的主要环境因素，为反硝化细菌在养殖废水处理应用中提供理论指导。反硝化细菌的分离和鉴定流程如下，回答下列问题：
(1)将采集的活性污泥样品1mL加入到装有9mL、pH7．2的磷酸盐缓冲液的l00mL烧杯中，取样接种到富集培养基中培养，富集培养基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中为反硝化细菌提供氮源的是 ，富集培养的目的是 。
(2)将富集后的样品进行梯度稀释后，使用 (填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基(BTB培养基初始pH=6．8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色)上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了 ，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显 色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将液体培养基导入大试管中，将杜氏小试管倒立放入大试管中，试管中的气体排尽，接入纯菌株，30℃恒温培养5~7d，观察到小管内有气泡，检测到N20，即可鉴定纯菌株为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是 。
(4)向几组等量的灭菌后的反硝化培养基中分别以1%、3%、5%、7%和10%的接种量接入菌株N1，在30℃，120r/min摇床震荡培养，24h后测量NO3-—N等指标，结果如右图所示：
①本研究的目的是 。
②当投菌量达到 时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，推测可能的原因是 (答1点)。
[答案](1) KNO3 对反硝化细菌进行扩增
(2) 涂布器 设置重复，取平均值，减少实验误差 蓝
(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低
(4) 探究反硝化细菌投菌量(接种量)对反硝化效果的影响 5% 投菌量过大，使培养基中的碳源很快消耗完，细菌数量下降；或是由于投菌量过大，耗氧速度加快，使体系中氧气供应不足，不利于细菌生长和代谢
[解析](1)培养基的成分主要包括碳源、氮源、水、无机盐等，培养基中KNO3含有N，可以提供氮源。富集培养的目的是对反硝化细菌进行扩增，增加目的菌落的数量。
(2)稀释涂布平板法用到涂布器将样液均匀涂布在BTB培养基上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了设置重复，取平均值，减少实验误差；分析题干，反硝化细菌可以产生碱性物质，BTB是酸碱指示剂碱性条件下为蓝色，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)反硝化细菌和其他微生物都能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低，因此不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌。
(4)①分析题干，该实验的自变量是菌株N1的接种量，因变量是反硝化效果，因此可知，本研究的目的是探究反硝化细菌投菌量(接种量)对反硝化效果的影响；
②分析图，当投菌量达到5%时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，因为投菌量过大，使培养基中的碳源很快消耗完，细菌数量下降；或是由于投菌量过大，耗氧速度加快，使体系中氧气供应不足，不利于细菌生长和代谢。
2．(2024·全国·模拟预测)杨梅是中国特有水果，其可开发利用的途径如图所示。据研究，核仁占完整杨梅核重量的11.40%～16.35%，且杨梅核仁含油量达40%以上。随着人们对健康饮食的关注度不断提高，杨梅核仁油的营养价值研究及其加工利用也逐渐成为热点，有关杨梅核仁油的营养成分分析、提取方法及其工艺条件、加工利用技术等方面的研究正在逐步展开。回答下列问题：
(1)水酶法提油是一种较新油脂与蛋白质分离的方法。制作过程处理杨梅核仁使用的相关酶是 ；若用相关酶处理杨梅核仁，需要控制反应的温度，原因是 。
(2)为使相关酶能反复利用，常用到固定化酶技术，固定化酶一般不用 法；固定化技术常用的载体有 (答1点)。
(3)某研究小组为探究相关酶处理杨梅核仁的最适pH，在相同温度和时间内，测得在pH为4、5、7条件下降解100g杨梅核仁所需酶量依次为3mg、1mg、5mg，则上述三个pH中，pH为 条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适pH，应围绕pH为 设计后续实验。
(4)杨梅核仁油含有丰富的脂肪和维生素E，脂肪和维生素E的分子式分别为C57H110O6、C29H50O2，结合所学知识推测，凝胶色谱法 (填“适用于”或“不适用于”)分离脂肪和维生素E，理由是 。
[答案](1) 纤维素酶、果胶酶 温度会影响酶的活性，在适宜温度下出油率高
(2) 包埋 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺
(3) 7 5(或4～5)
(4) 适用于 脂肪和维生素E的相对分子质量相差很大
[解析](1)①利用纤维素酶、果胶酶可以有效去除杨梅核仁细胞的细胞壁，有利于后续提取核仁油；
②酶的作用条件比较温和，在最适温度下酶活性可达到最高，催化效率最好，因此在使用酶处理时，需要控制反应温度。
(2)酶分子较小，若使用包埋法，酶分子容易从包埋材料中漏处，所以固定化酶不能采用包埋法，固定化技术常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺。
(3)①酶的作用条件比较温和，过酸或过碱的环境都会使酶失活，结合在PH为7的条件下，降解100g杨梅核仁所需酶量最多，可判断PH为7的条件时，酶活力最小；
②在三组PH条件中，PH为5时水解100g杨梅核仁所需的酶量最少，说明该条件与该酶的最适PH
最接近，因此应围绕PH为5设计后续实验。
(4)根据脂肪和维生素E的分子式可知，脂肪与维生素E的相对分子质量相差很大，因此适用于凝胶色谱法来分离脂肪与维生素E。
3．(2024·全国·模拟预测)丙肝病毒(HCV)是一种致病性强的单链RNA病毒，主要侵染肝细胞，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，也是肝硬化和肝癌的元凶之一。为研制丙肝病毒的单克隆抗体，研究者以小鼠为实验材料设计了以下实验。回答下列问题。
(1)在HCV感染的急性期，会引发机体的特异性免疫应答。在体液免疫过程中，B细胞活化、增殖分化过程需要两次信号刺激，一是抗原的直接刺激，二是 。B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，浆细胞产生和分泌大量抗体发挥免疫效应。抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是 。
(2)为使单细胞悬液中的B淋巴细胞产生的抗体中一定含有能与丙肝病毒结合的抗体，需要进行的操作是 ,图中筛选1所采用的培养基从用途上分类，属于 培养基，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。
(3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，α-干扰素在丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。科学家们采用基因工程技术将干扰素基因导入大肠杆菌生产干扰素。图1、图2分别表示干扰素基因相关限制酶切割位点、质粒结构示意图。
①为确保成功获得基因工程菌，图1和图2最好用 (填限制酶)切割。
②PCR过程中延伸阶段选用72℃而非95℃，是综合考虑了两个因素，这两个因素分别是 。
③生产干扰素的工程菌可选用大肠杆菌或酵母菌，选用酵母菌作为受体细胞的优势是 。
[答案](1) 辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合 核糖体→内质网→囊泡→高尔基体→囊泡→细胞膜
(2) 给小鼠注射丙肝病毒使小鼠产生免疫反应 选择 只有杂交瘤细胞能正常生长，其他的
细胞均不能生长
(3) BamHI和EcoRI 防止DNA变性和为保持耐高温的DNA聚合酶所需温度条件 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少
[解析](1)病原体侵入机体后，一是抗原直接刺激B细胞，这为激活B细胞提供了第一个信号，其次抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞，辅助性T细胞表面的特定分子发生变化并与B细胞结合，这为激活B细胞提供了第二个信号。抗体属于分泌蛋白，分泌蛋白的合成、运输和分泌过程为：核糖体上合成蛋白质→内质网进行粗加工→内质网“出芽”形成囊泡→高尔基体进行再加工形成成熟的蛋白质→高尔基体“出芽”形成囊泡细胞膜，整个过程还需要线粒体提供能量。因此抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是：核糖体→内质网→囊泡→高尔基体→囊泡→细胞膜。
(2)用丙肝病毒(作为抗原)对小鼠进行免疫后，小鼠的B淋巴细胞能产生抗丙肝病毒的抗体，从该小鼠的脾细胞中能获得产生该抗体的B淋巴细胞。图中筛选1是用选择培养基筛选出经免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞，因此筛选过程所采用的培养基属于选择培养基，在该培养基上只有杂交瘤细胞能正常生长，其他的细胞均不能生长。
(3)①干扰素基因和质粒上都有BamHI和EcoRI的酶切位点，为了防止反向连接和自身环化，故切割时两种限制酶一起使用，产生两种不同的黏性末端，确保成功获得基因工程菌。
②DNA在高温条件下会解旋变性，且酶活性的发挥需要适宜条件，故延伸阶段选用72°C，主要是防止DNA变性和为保持TagDNA聚合酶所需温度条件。
③基因工程利用大肠杆菌作为受体菌的优点是：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
4．(2024·山东·二模)国家“863”计划在现代农业技术领域设置了多个具有重要价值的主题项目，其中“动植物生物反应器”课题组建立了植物油体、胚乳、悬浮细胞及动物乳腺生物反应器等几大技术平台、
(1)悬浮细胞生物反应器是指将脱分化的愈伤组织在液体培养基中繁殖以提取产物。该生物反应器用到细胞工程中的 技术，该技术的主要优点有 (至少答出两条)。
(2)叶绿体生物反应器是指通过特定的技术手段使外源基因能够进入到叶绿体中，与植物叶绿体基因组进行同源片段重组，在叶绿体中进行转录、翻译的技术体系。该技术可能存在的缺点是 。
(3)科学家利用水稻胚乳反应器表达重组HN蛋白生产新城疫(一种急性、致死性禽类传染病)疫苗，部分过程如下：
①利用双酶切法将HN基因成功连接到了植物载体上，重组载体中HN基因应该正确连接到 序列之间。为保证HN基因只在水稻胚乳细胞中正确表达，需要 。
②利用 法，将重组载体转入水稻愈伤组织。经过暗培养、愈伤筛选、分化、生根和移栽，4
个月后获得转基因水稻种子。为证明HN基因在水稻胚乳中已经转录，将待测胚乳细胞制成匀浆，采用逆转录PCR法进行检测。请你评价能否达成目的，并简要说明理由 。
[答案](1) 植物细胞培养 不占用土地；不受季节、天气等的限制
(2)叶绿体有双层膜结构，蛋白质产物分离(提取)不易；叶绿体中只有核糖体，没有内质网和高尔基体，蛋白质没有经过正确加工(没有活性)
(3) 启动子和终止子 所用启动子只在水稻胚乳细胞中启动转录过程 农杆菌转化法 不能；细胞匀浆中有DNA，其中的目的基因会对检测造成干扰；也可能有RNA酶能将待测RNA水解掉而检测不到
[解析](1)植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。悬浮细胞生物反应器是指将脱分化的愈伤组织在液体培养基中繁殖以提取产物，用到了植物细胞培养技术，植物细胞培养技术具有不占用土地；不受季节、天气等的限制等优点。
(2)叶绿体生物反应器是指通过特定的技术手段使外源基因能够进入到叶绿体中，与植物叶绿体基因组进行同源片段重组，在叶绿体中进行转录、翻译的技术体系，但由于叶绿体中只有核糖体，没有内质网和高尔基体，蛋白质没有经过正确加工，所生产出的蛋白质没有生物活性；且叶绿体有双层膜结构，蛋白质产物分离提取不易，这都是该技术所存在的问题。
(3)①启动子是驱动基因转录的元件，而终止子是指示转录终止的位置，重组载体中HN基因(目的基因)应该正确连接到启动子和终止子序列之间。图中构建基因表达载体时，需将HN基因与水稻胚乳蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，从而实现HN基因在水稻胚乳细胞中表达。
②将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法。为证明HN基因在水稻胚乳中已经转录，将待测胚乳细胞制成匀浆，采用逆转录PCR法进行检测，由于细胞匀浆中有DNA，其中的目的基因会对检测造成干扰；也可能有RNA酶能将待测RNA水解掉而检测不到，因此该方案不能达到目的。
5．(2024·广东·一模)我国是全球第三大盐碱地分布国家，可用于种植耐盐碱水稻的盐碱地约1000万hm2，培育耐盐碱水稻对确保我国的粮食安全具有重要的战略意义。我国科学家利用东农427水稻品种，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将水稻的两对耐盐负调控基因OsEILl和OsEIL2敲除而培育耐盐改良水稻新品种。图示意两对基因在染色体上的位置关系(不考虑其他基因突变与染色体互换)，图示意培育耐盐水稻的过程。
回答下列问题：
(1)愈伤组织培育成完整植株T1的过程称为 ，在该过程中所用到的关键植物激素有 。
(2)经初步筛选、培育，得到双等位基因突变体T1(3号和7号染色体各有1个耐盐负调控基因被敲除)。用T1自交，T2代中两对等位基因均有被敲除的突变体(简称“候选品种N”)的比例约为 ；在候选品种N中，两对等位基因全部被敲除的双基因纯合突变体的比例约为 。
(3)检测双基因纯合突变体的OsEIL1基因和OsEIL2基因，发现均在转录起始位点之后的某个位置增加了1个碱基，进一步检测发现，两个基因所表达蛋白质的相对分子质量较正常相对分子质量小。据此可推测该CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除这两个基因的原理是 。
(4)要在个体生物学水平上鉴定是否成功培育出耐盐水稻新品种，其思路是 。
[答案](1) 再分化 生长素和细胞分裂素
(2) 9/16 1/9
(3)插入1个碱基后诱导基因突变，使翻译提前终止
(4)在盐碱地种植耐盐水稻新品种，检测生长状况及与东农427水稻比较产量
[解析](1)愈伤组织经过再分化会发育成完整植株，在此过程中生长素和细胞分裂素起到了关键的调控作用。
(2)由题意和题图可知，水稻的两对耐盐负调控基因的遗传遵循基因的自由组合定律，双等位基因突变体T1相当于双杂合子。假设OsEILl基因及其敲除后分别用A和a表示，OsEIL2基因及其敲除后分别用B和b表示，则T1可以表示为AaBb。T1自交，T2代中两对等位基因均有被敲除的突变体(简称“候选品种N”)包括AaBb、aaBb、Aabb、aabb，它们在T2代中所占的比例约为9/16；在候选品种N中，两对等位基因全部被敲除的双基因纯合突变体(aabb)的比例约为1/9。
(3)双基因纯合突变体的OsEIL1基因和OsEIL2基因均在转录起始位点之后的某个位置增加了1个碱基，两个基因所表达的蛋白质的相对分子质量较正常相对分子质量小，说明敲除后的OsEIL1基因和OsEIL2基因在转录形成的mRNA分子上提前出现了终止密码子，导致翻译提前终止。据此可推测该CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除这两个基因的原理是：插入1个碱基后诱导基因突变，使翻译提前终止。
(4)要在个体生物学水平上鉴定是否成功培育出耐盐水稻新品种，可以在盐碱地种植耐盐水稻新品种，
检测生长状况及与东农427水稻比较产量。
6．(2024·天津河北·一模)由M基因编码的M蛋白是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用，它能在大肠杆菌和动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验如下：
1.实验一：科研人员将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过一定的技术手段获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图1所示。
2.实验二：将M基因导入大肠杆菌构建具有吸附重金属的作用的工程菌，如图2所示。
(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，用于切割质粒DNA的工具酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
(2)图1中③所使用的技术叫 。与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率 ，原因是 。
(3)根据M蛋白cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图2甲)，通过PCR扩增M基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(4)实验二中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的M基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将M基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图2乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 DNA连接酶将M基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②由于载体P′不具有表达M基因的 故应该选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的M基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出M工程菌。
[答案](1)磷酸二酯键
(2) 胚胎移植 低 由于动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，所以体细胞核移植技术的成功率较低
(3)引物a和引物d
(4) EcoR V T4 启动子和终止子 XhoI和PstI 钙
[解析](1)基因工程中，构建重组质粒时，用于切割质粒DNA的工具酶是限制酶，限制酶可以识别特定的双链DNA序列并在特定部位将两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(2)图1表示动物细胞核移植技术的过程图，③表示胚胎移植；由于动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，因此动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植。
(3)密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，PCR扩增M基因时，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物a和引物d。
(4)①由题干可知，中间载体P可将M基因接入载体E，而扩增出的M基因的末端为平末端，因此中间载体P经酶切后必须得到的是平末端，才能与M基因相连。分析图2可知，载体P上含有Xho I、Pst I、Sma I和EcoR V的识别序列，但是只有EcoR V切割能得到平末端，因此需要用EcoR V对载体P进行酶切。T4 DNA连接酶可以用于连接两个平末端，因此选择T4 DNA连接酶将M基因与载体P相连，构成重组载体P。
②分析图2中载体P的结构可知，载体P不含有启动子和终止子，故应该利用载体E的启动子和终止子，才能完成目的基因的表达，因此需要将重组载体P上的M基因切割下来，然后插入到载体E的启动子和终止子之间。重组载体P上的基因M位于限制酶Xho I和Pst I的识别序列之间，因此可利用Xho I和Pst I对重组载体P进行酶切，为使载体E上得到相同的黏性末端，以便基因M和载体E进行连接，载体E也应该用Xho I和Pst I进行酶切。当大肠杆菌作为基因工程的受体细胞时，常用Ca2+来处理大肠杆菌，处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组质粒的导入。2024年高考生物复习冲刺：生物技术与工程（新高考专用）
1．(2023·北京·高考真题)自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供 和维生素等。
(2)A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明 。
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样 后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现 。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证(主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱) 。
2．(2023·全国·高考真题)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵(酒精发酵)。实验流程如图所示。
回答下列问题。
(1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是 。
(2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 (答出1点即可)。通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有 (答出2点即可)。
(3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是 。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是 。发酵液中的乙醇可用 溶液检测。
(4)本实验收集的淋洗液中的 可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是 。
3．(2023·湖南·高考真题)某些植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。回答下列问题：
(1)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。
(2)现从植物根际土壤中筛选出一株解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果见表。据表推测该抗菌肽对 的抑制效果较好，若要确定其有抑菌效果的最低浓度，需在 μg·mL-1浓度区间进一步实验。
测试菌 抗菌肽浓度/( g mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
金黄色葡萄球菌 - - - - - + +
枯草芽孢杆菌 - - - - - + +
禾谷镰孢菌 - + + + + + +
假丝酵母 - + + + + + +
注：“+”表示长菌，“-”表示未长菌。
(3)研究人员利用解淀粉芽孢杆菌H的淀粉酶编码基因M构建高效表达质粒载体，转入大肠杆菌成功构建基因工程菌A。在利用A菌株发酵生产淀粉酶M过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生淀粉酶M。分析可能的原因是 (答出两点即可)。
(4)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体，如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及 (答出两点)等基本条件。肺类装配
体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术 (填“是”或“否”)。
(5)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种耐药菌，严重危害人类健康。科研人员拟用MRSA感染肺类装配体建立感染模型，来探究解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽是否对MRSA引起的肺炎有治疗潜力。以下实验材料中必备的是 。
①金黄色葡萄球菌感染的肺类装配体 ②MRSA感染的肺类装配体 ③解淀粉芽孢杆菌H抗菌肽 ④生理盐水 ⑤青霉素(抗金黄色葡萄球菌的药物) ⑥万古霉素(抗MRSA的药物)
4．(2023·湖北·高考真题)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞) (填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
5．(2023·浙江·高考真题)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
6．(2023·全国·高考真题)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP
基因的突变基因文库。通常，基因文库是指 。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ；②为 ，其作用是 ；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是 。
[典例1](2024·河南濮阳·一模)可利用重叠延伸PCR诱变技术将两个独立的基因在指定位点进行连接，以获得融合目的基因。该技术需要一对内部致突变引物和一对侧翼引物，经过三个PCR反应。下图表示将基因A序列与基因B序列在ATG处定点拼接的过程。请回答下列问题：
(1)PCR反应体系中需要加入的物质除了图中所示的物质外，还必须加入4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和 等，其中Mg2+的作用是 。
(2)图中致突变引物1和致突变引物2序列的关系是 (填“相同”“碱基互补”或“无关”)。致突变引物1的5'端序列是根据 的部分碱基序列设计的。
(3)PCR3第一次循环中理论上复性的产物有 种，其中能进行进一步延伸的是图中的 (填序号)，原因是 。
技巧点拨：利用PCR获取和扩增目的基因
原理：DNA复制。
条件：DNA模板、2种引物、耐高温的DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸。
扩增过程
过程 说明 图解
变性 温度上升到90 ℃以上，双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 温度上升到72 ℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
[变式—1](2024·江西·模拟预测)表观遗传调节异常是肿瘤发生发展的重要因素之一，N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常见的一种修饰。研究发现，胃癌细胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)过表达和STC2(癌症相关基因)mRNA的m6A修饰水平降低的异常现象。科研人员利用基因工程技术实现ALKBH5基因沉默和STC2基因的过表达，以研究ALKBH5介导的m6A甲基化修饰对胃癌细胞迁移的影响(其中STC2基因的α链为转录的模板链)。研究人员分别用不同方式处理胃癌细胞，并测得胃癌细胞迁移标志蛋白含量如图3所示。
STC2基因：
注：A、B、C、D为四种引物序列；BamHI、HindⅢ、SacI为限制酶
(1)图1PCR反应体系中需加入4种dNTP、 、模板和 ，还需加入引物(选“A、B、C、D”)等。
(2)为达到图1目的需要对上述引物进行设计，你的设计思路是 。
(3)为确保扩增的准确性，设计的引物不能太短，太短会导致 ；也不能太长，太长会导致延伸的温度大于74℃，这样会造成 。
(4)据图3可知，ALKBH5基因过表达导致 。
[典例2](2024·宁夏银川·模拟预测)CRlaa和mCRlaa是两种早期胚胎培养常用的培养液，这两种培养液中除NaCl浓度不同外，其他成分及浓度均相同。为了比较这两种培养液对体外胚胎培养的差异情况，科研人员进行了相关实验，所得实验结果如下表所示。回答下列问题。
组别 卵裂数 卵裂率 囊胚数 囊胚率
CRlaa 769 84.9% 189 20.6%
mCRlaa 750 83.7% 252 28.1%
注：卵裂率(％)＝卵裂数／卵母细胞总数x100％。囊胚率(％)＝囊胚数／卵母细胞总数x100％。
(1)实验所用胚胎可通过体外受精培育而来，哺乳动物的体外受精主要包括 精子的获取和受精等几个主要步骤。获得的精子需进行 处理。
(2)CRlaa和mCRlaa两种培养液的成分除了含无机盐和有机盐类外，还需添加 (答出1点即可)、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及 等物质。根据表中信息比较这两种培养液对卵裂及囊胚发育的影响： 。
(3)囊胚期的滋养层细胞最终会发成 。
(4)将培养获得的囊胚通过 技术转移至受体的子宫内继续发育成胎儿。外来胚胎在受体内存活的生理学基础是 。
技巧点拨：胚胎移植的生理学基础
(1)胚胎能够移入受体基础：哺乳动物发情排卵后，同种生物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的
(2)胚胎能被收集基础：哺乳动物的早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态
[变式—2](2024·全国·模拟预测)据最新报道，经过5年科研攻关，中国科学家培育出世界上首只高比例胚胎干细胞“嵌合体猴”。回答下列问题：
(1)在培养过程中，多能干细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，长成致密的单层，这种现象称为 ；若需要进行传代培养，需要用胰蛋白酶等处理后再收集细胞制成新的细胞悬液，不用胃蛋白酶处理的原因是 。
(2)体外培养动物细胞时，首先应保证其处于 的环境，除了适宜的营养物质、温度等条件外，还需
要控制的气体条件是 。
(3)得到的重构胚通常需要发育到 阶段才能进行胚胎移植，胚胎移植的实质是 。研究人员将早期胚胎进行分割后移植，结果接受分割胚胎的其中一头健康母猴发生流产。从胚胎分割的角度分析，造成这种现象的原因可能是 。
(4)早期胚胎通过胚胎移植技术移入受体的子宫内继续发育，早期胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是 。
[典例3] (2024·贵州黔西·一模)科学家提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的方法：利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。回答下列问题：
(1)利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因需要 酶。
(2)基因工程中的核心工作是 ，该过程需要的工具酶是 。
(3)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
在设计PCR引物时最好添加限制酶 的识别序列，选择依据是 。
经GenBank检索后，得知胰岛素基因左端①处的碱基序列为—GCATTCTGAGGC—，则其中一种引物设计的序列是5'— 3'。
技巧点拨：基因表达载体的构建
(1)需要用到的工具：限制酶、DNA连接酶、载体。
(2)基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
(3)基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，还要能表达和发挥作用。
(4)启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。
(5)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入启动
子和终止子之间的部位。
(6)构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限制酶切割，以避免质粒或目的基因自身连接。
(7)限制酶切割载体时不能破坏标记基因，以避免标记基因不能表达，不能筛选出含有目的基因的受体细胞。
[变式—3] (2024·河北·模拟预测)EGFR是一种表皮生长因子受体，由信号肽区(可保证蛋白质在细胞中的定向运输)、胞外区、跨膜区和胞内区组成。当表皮生长因子与其胞外区结合后，可引起一系列基因活化，进而导致肿瘤细胞增殖，但EGFR缺失胞内区后形成的DNEGFR虽也可与表皮生长因子结合，却不会引起相应的基因活化。图1为EGFR cDNA结构及其对应的蛋白质的功能区，研究人员利用人结肠癌组织、pEGFP-N1质粒、大肠杆菌、cos-7细胞(一种常用的动物细胞系)等做了一系列实验，以探究DNEGFR基因在细胞中的表达和定位情况，基本流程如图2所示。
(1)研究人员从人结肠癌组织中提取总RNA，用 酶处理获得cDNA。图2中过程②应选择图1中的引物 (填数字)进行PCR。为确保过程③中pEGFP-N1质粒与DNEGFR基因的定向连接，常常需要在引物 端加入使用的限制酶的识别序列。
(2)图2中的EGFP是绿色荧光蛋白基因，研究人员使用含有EGFP的质粒来构建重组质粒，以便根据绿色荧光蛋白的位置确定 。结合EGFR基因指导合成的蛋白质的各部分的功能，推测EGFP序列需在DNEGFR序列的 (填“上游”或“下游”)，原因是 。
(3)过程④中，将Ca2+处理过的大肠杆菌和重组质粒混匀后培养在含有 (填抗生素)的培养基上，进行过程④和过程⑤的目的是 。
(4)过程⑥进行时需要提供的气体环境为 。若pEGFP-N1-DNEGFR转染cos-7细胞成功，过程⑥检测获得的cos-7细胞时荧光应主要分布在 部位。
1．(2024·陕西商洛·模拟预测)反硝化细菌是一类能将硝态氮(NO3-—N)通过一系列中间产物(NO2-、NO、N2O)还原为气态氮(N2)的细菌群，反硝化作用也是产碱过程。反硝化细菌对于解决水体富营养化和亚硝酸盐对水生动物的毒害，具有十分重要的意义。某课题小组通过采集活性污泥样品，并从中分离反硝化细菌，研究影响菌株反硝化作用的主要环境因素，为反硝化细菌在养殖废水处理应用中提供理论指导。反硝化细菌的分离和鉴定流程如下，回答下列问题：
(1)将采集的活性污泥样品1mL加入到装有9mL、pH7．2的磷酸盐缓冲液的l00mL烧杯中，取样接种到富集培养基中培养，富集培养基的成分有：KNO32g，FeSO40．2g，KH2PO41．0g，MgSO40．5g，NaCl2g，CaCO35g，其中为反硝化细菌提供氮源的是 ，富集培养的目的是 。
(2)将富集后的样品进行梯度稀释后，使用 (填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基(BTB培养基初始pH=6．8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色)上，每个稀释度下涂布3个培养基是为了 ，放在30℃环境中培养2~3天后，挑选周围显 色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。
(3)将液体培养基导入大试管中，将杜氏小试管倒立放入大试管中，试管中的气体排尽，接入纯菌株，30℃恒温培养5~7d，观察到小管内有气泡，检测到N20，即可鉴定纯菌株为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是 。
(4)向几组等量的灭菌后的反硝化培养基中分别以1%、3%、5%、7%和10%的接种量接入菌株N1，在30℃，120r/min摇床震荡培养，24h后测量NO3-—N等指标，结果如右图所示：
①本研究的目的是 。
②当投菌量达到 时，反硝化效果最好，NO3-—N和总脱氮率均较高。当投菌量继续增加，NO3-—N和总脱氮率反而下降，推测可能的原因是 (答1点)。
2．(2024·全国·模拟预测)杨梅是中国特有水果，其可开发利用的途径如图所示。据研究，核仁占完整杨梅核重量的11.40%～16.35%，且杨梅核仁含油量达40%以上。随着人们对健康饮食的关注度不断提高，杨梅核仁油的营养价值研究及其加工利用也逐渐成为热点，有关杨梅核仁油的营养成分分析、提取方法及其工艺条件、加工利用技术等方面的研究正在逐步展开。回答下列问题：
(1)水酶法提油是一种较新油脂与蛋白质分离的方法。制作过程处理杨梅核仁使用的相关酶是 ；若用相关酶处理杨梅核仁，需要控制反应的温度，原因是 。
(2)为使相关酶能反复利用，常用到固定化酶技术，固定化酶一般不用 法；固定化技术常用的载体有 (答1点)。
(3)某研究小组为探究相关酶处理杨梅核仁的最适pH，在相同温度和时间内，测得在pH为4、5、7条件下降解100g杨梅核仁所需酶量依次为3mg、1mg、5mg，则上述三个pH中，pH为 条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适pH，应围绕pH为 设计后续实验。
(4)杨梅核仁油含有丰富的脂肪和维生素E，脂肪和维生素E的分子式分别为C57H110O6、C29H50O2，结合所学知识推测，凝胶色谱法 (填“适用于”或“不适用于”)分离脂肪和维生素E，理由是 。
3．(2024·全国·模拟预测)丙肝病毒(HCV)是一种致病性强的单链RNA病毒，主要侵染肝细胞，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，也是肝硬化和肝癌的元凶之一。为研制丙肝病毒的单克隆抗体，研究者以小鼠为实验材料设计了以下实验。回答下列问题。
(1)在HCV感染的急性期，会引发机体的特异性免疫应答。在体液免疫过程中，B细胞活化、增殖分化过程需要两次信号刺激，一是抗原的直接刺激，二是 。B细胞受到两个信号的刺激后开始分裂、分化，大部分分化为浆细胞，浆细胞产生和分泌大量抗体发挥免疫效应。抗体在浆细胞中合成、运输及分泌过程依次经历的结构是 。
(2)为使单细胞悬液中的B淋巴细胞产生的抗体中一定含有能与丙肝病毒结合的抗体，需要进行的操作是 ,图中筛选1所采用的培养基从用途上分类，属于 培养基，使用该培养基进行细胞培养的结果是 。
(3)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，α-干扰素在丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。科学家们采用基因工程技术将干扰素基因导入大肠杆菌生产干扰素。图1、图2分别表示干扰素基因相关限制酶切割位点、质粒结构示意图。
①为确保成功获得基因工程菌，图1和图2最好用 (填限制酶)切割。
②PCR过程中延伸阶段选用72℃而非95℃，是综合考虑了两个因素，这两个因素分别是 。
③生产干扰素的工程菌可选用大肠杆菌或酵母菌，选用酵母菌作为受体细胞的优势是 。
4．(2024·山东·二模)国家“863”计划在现代农业技术领域设置了多个具有重要价值的主题项目，其中“动植物生物反应器”课题组建立了植物油体、胚乳、悬浮细胞及动物乳腺生物反应器等几大技术平台、
(1)悬浮细胞生物反应器是指将脱分化的愈伤组织在液体培养基中繁殖以提取产物。该生物反应器用到细胞工程中的 技术，该技术的主要优点有 (至少答出两条)。
(2)叶绿体生物反应器是指通过特定的技术手段使外源基因能够进入到叶绿体中，与植物叶绿体基因组进行同源片段重组，在叶绿体中进行转录、翻译的技术体系。该技术可能存在的缺点是 。
(3)科学家利用水稻胚乳反应器表达重组HN蛋白生产新城疫(一种急性、致死性禽类传染病)疫苗，部分过程如下：
①利用双酶切法将HN基因成功连接到了植物载体上，重组载体中HN基因应该正确连接到 序列之间。为保证HN基因只在水稻胚乳细胞中正确表达，需要 。
②利用 法，将重组载体转入水稻愈伤组织。经过暗培养、愈伤筛选、分化、生根和移栽，4个月后获得转基因水稻种子。为证明HN基因在水稻胚乳中已经转录，将待测胚乳细胞制成匀浆，采用逆转录PCR法进行检测。请你评价能否达成目的，并简要说明理由 。
5．(2024·广东·一模)我国是全球第三大盐碱地分布国家，可用于种植耐盐碱水稻的盐碱地约1000万hm2，培育耐盐碱水稻对确保我国的粮食安全具有重要的战略意义。我国科学家利用东农427水稻品种，应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将水稻的两对耐盐负调控基因OsEILl和OsEIL2敲除而培育耐盐改良水稻新品种。图示意两对基因在染色体上的位置关系(不考虑其他基因突变与染色体互换)，图示意培育耐盐水稻的过程。
回答下列问题：
(1)愈伤组织培育成完整植株T1的过程称为 ，在该过程中所用到的关键植物激素有 。
(2)经初步筛选、培育，得到双等位基因突变体T1(3号和7号染色体各有1个耐盐负调控基因被敲除)。用T1自交，T2代中两对等位基因均有被敲除的突变体(简称“候选品种N”)的比例约为 ；在候选品种N中，两对等位基因全部被敲除的双基因纯合突变体的比例约为 。
(3)检测双基因纯合突变体的OsEIL1基因和OsEIL2基因，发现均在转录起始位点之后的某个位置增加了1个碱基，进一步检测发现，两个基因所表达蛋白质的相对分子质量较正常相对分子质量小。据此可推测该CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除这两个基因的原理是 。
(4)要在个体生物学水平上鉴定是否成功培育出耐盐水稻新品种，其思路是 。
6．(2024·天津河北·一模)由M基因编码的M蛋白是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用，它能在大肠杆菌和动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验如下：
1.实验一：科研人员将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过一定的技术手段获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图1所示。
2.实验二：将M基因导入大肠杆菌构建具有吸附重金属的作用的工程菌，如图2所示。
(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，用于切割质粒DNA的工具酶能将特定部位的两个核苷酸之间的 断开。
(2)图1中③所使用的技术叫 。与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率 ，原因是 。
(3)根据M蛋白cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图2甲)，通过PCR扩增M基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(4)实验二中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的M基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将M基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图2乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 DNA连接酶将M基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②由于载体P′不具有表达M基因的 故应该选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的M基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出M工程菌。
