【备考2025】苏教版（2019）生物学高考一轮基础练习-专题22基因工程（含答案）
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| 名称 | 【备考2025】苏教版（2019）生物学高考一轮基础练习-专题22基因工程（含答案） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 2.6MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 苏教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-05-20 22:39:56 | ||
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文档简介
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2025江苏版新教材生物学高考第一轮
专题22 基因工程
五年高考
考点1 重组DNA技术的基本工具
1.(2021 江苏,13,2分)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是( )
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
2.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
3.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
考点2 DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳鉴定
4.(2023江苏,9,2分)某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是( )
A.洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂,溶液即呈砖红色
C.制作根尖有丝分裂装片时,解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色
5.(2019江苏,10,2分)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
6.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
7.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
8.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
9.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成表格。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
考点3 基因工程的基本操作程序
10.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
11.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶),则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量(相对分子质量)DNA可分开成不同条带,相同分子量(相对分子质量)的为一条带。用某种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
12.(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
13.(2021江苏,23,11分)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有 。
A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进 ,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等,完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是
。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明 ,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
14.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
15.(2019江苏,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。
(2)用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在 酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是 (填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
平板类型 菌落类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是 。
16.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指
。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是
。
17.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0植株并自交,将T1种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1阳性植株自交所得的T2种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
18.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
19.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
20.(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;
由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是
。
21.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是
。
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程
22.(2019江苏,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是( )
A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌
B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株
C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
23.(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
24.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 ( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
25.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
三年模拟
限时拔高练1
1.(2024届扬州期初,14)科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因棉花新品系,下列相关叙述错误的是( )
A.可以用不同的限制酶切割目的基因与载体以避免目的基因与载体的自身环化和随意连接
B.可通过农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞
C.含耐盐基因的棉花细胞可经植物组织培养获得完整植株
D.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细胞
2.（新情境）(2023盐城三模,17)(多选)基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR(MSP)技术是测定基因是否甲基化的常用方法,其主要原理及过程如图。下列有关叙述正确的是( )
注:mC代表甲基化的胞嘧啶
A.基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B.MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C.PCR过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D.PCR完成后,可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP产物进行鉴定分析
3.(2023扬州三模,24)血凝素基因(H)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位,其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽,常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导,本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽,科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体,并导入大肠杆菌中表达和分泌,请回答:
(1)流感病毒囊膜主要由 组成,囊膜上血凝素的合成场所在 。
(2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于
,PCR扩增目的基因时应该选择图中引物 ,设计引物时,不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列,原因是 。
(3)应选择限制酶 来切割质粒A,然后直接将PCR产物与质粒A混合,同时加入 酶,使得目的基因与质粒A相连。
(4)若目的基因与质粒A正向连接,HA1基因转录时的模板链是由图中的引物 (填“a”“b”“c”或“d”)在PCR时延伸而成;若目的基因与质粒A反向连接,用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒,完全酶切后的产物进行凝胶电泳,其中最靠近加样孔的条带长度约为 bp。
(5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化,基因工程生产HA1作为疫苗时,选择人IgGFc作为标签的优点还有 。
4.(2024届常熟中学抽测一,23)养殖家禽的饲料中富含谷物,纤维素是谷物的重要成分,但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶,阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌,将其添加于饲料中,以提高家禽养殖效率。请分析并回答下列问题。
(1)乳酸杆菌是动物胃肠道的优势细菌之一。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质,抑制有害细菌的生长和繁殖,维持肠道的正常功能,乳酸杆菌与家禽的种间关系属于 。
(2)培养乳酸杆菌时培养基中除添加主要营养物质外还需要添加 以满足其生长对特殊营养物质的需求。农牧业上常将以制糖工业的废液为原料通过发酵获得的 制成微生物饲料提高饲料的品质。
(3)枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶,这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因,需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链。
①利用PCR技术扩增W基因时,需要用到 酶。扩增完成后,常采用 法来鉴定PCR的产物。
②很多启动子具有物种特异性,在图1质粒中插入W基因,其上游启动子应选择 (填字母)
A.枯草芽孢杆菌启动子
B.乳酸杆菌启动子
C.农杆菌启动子
③如表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ
识别位点
限制酶 KpnⅠ MfeⅠ
识别位点
限制酶 Hind Ⅲ
识别位点
根据上述信息,应使用限制酶 切割图1中质粒,使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段,以获得能正确表达W基因的重组质粒。
④所得重组质粒导入乳酸杆菌后,使用含氨苄青霉素的培养基筛选,以得到成功导入W基因的乳酸杆菌。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力,研究人员将导入了重组质粒的乳酸杆菌接种在含 的固体鉴别培养基上,若出现 现象,则证明导入成功。
5.(2023苏州八校联考,24)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系,为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐基因(RST1基因)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG……(省略3n个核苷酸序列)……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图,BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶(四种酶的识别序列详见表)。请回答下列问题:
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切 割位点(5'→3') G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG ↓GATC
(1)为获取更多RST1基因,可通过PCR扩增,在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR引物,其中可选用的引物是 (选填序号)。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
(2)若PCR反应未得到任何扩增产物,主要原因有 (选填序号)。
①退火温度过高 ②Taq酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度过低
(3)为将图中质粒A和RST1基因正确连接构建重组质粒B,设计RST1基因的引物时,在两种引物的5'端分别添加 酶的识别序列,选用 酶切割质粒A,酶切后的载体和目的基因片段通过 酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞,应首先在筛选平板培养基添加 ,再将平板上长出的菌落通过影印接种法(盖章)接种到添加 的平板培养基上继续培养观察。
(4)从平板上长出的菌落若提取重组质粒B利用Sau3AⅠ进行酶切,最多可以得到 种大小不同的DNA片段。
(5)图2是对重组质粒测序的部分序列,若目的基因与质粒正确连接(启动子顺时针转录),则图中连接处的序列正确的是 (填序列编号)。
限时拔高练2
1.（新情境）(2024届江苏期初调研,14)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。叙述正确的是( )
A.图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力
B.DNA的两条单链都可作为转录的模板链
C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D.四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
2.(2023徐州模拟,19)(多选)RNA干扰是小分子RNA介导的、一种抑制特殊基因表达的现象。RNA干扰通过形成并激活沉默复合体(RISC),降解靶基因mRNA使基因无法表达而沉默。利用人工合成的miRNA研究其作用原理如图所示。相关分析正确的是( )
A.需依据靶基因的启动子序列设计miRNA
B.整个过程至少需要7种酶参与
C.沉默复合体中的miRNA可结合并降解靶基因mRNA
D.RNA干扰可防止外来的有害基因或病毒基因整合到生物基因组中
3.(2024届南京零模,23)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链,B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题:
(注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色:ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。)
(1)获取目的基因:提取枣树细胞的 ,经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是 ,并在其 (填“5'或3'”)末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA分子的启动子是 识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项 (A.噬菌体基因启动子 B.乳酸菌基因启动子 C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子)
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。
①将得到的混合物导入用 处理的大肠杆菌完成 实验。
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含 的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。
(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 (填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用 等方法获得所需的发酵产品。
4.（新情境）(2023盐城三模,23)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端任意16个碱基,使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。请回答下列问题:
(1)为获得线性化质粒,除了图示利用PCR方法外,还可利用 方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是先将除 以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比,这样做的目的是可减少反应起始时 形成的产物。
(3)图中,同源序列1、2中的碱基序列 (选填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是 ,还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析,引物A或引物B要依据 序列进行设计。过程②经过 轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后,In-Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列,形成 ,然后降温使其发生
,进而在DNA聚合酶及 酶的作用下完成质粒的环化,形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势之一是
。
5.(2023扬州中学等4校联考,24)土壤盐渍化影响水稻生长发育,将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中,培育耐盐碱水稻新品种,其操作流程及可能用到的限制酶如图,其中bar为抗除草剂基因,Tetr为四环素抗性基因,Ampr为氨苄青霉素抗性基因,①~⑦表示操作过程。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切 割位点 ↓ -GGATCC- ↓ -TGATCA- ↓ -CCCGGG- ↓ -GATC-
(1)OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为 (“5'”或“3'”)端,过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化 键的形成,还需要添加引物,应选用引物组合 。
①5'-CTTGGATGAT-3'
②5'-TAAGTTGTCT-3'
③5'-TAGTAGGTTC-3'
④5'-TCTGTTGAAT-3'
⑤5'-ATTCAACAGA-3'
⑥5'-ATCATCCAAG-3'
(2)根据基因表达载体的结构组成分析,Ti质粒中的CaMV35S是 ,其功能是 。基因表达载体中,OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 (填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒,利用所选限制酶进行操作的优势是 ,切割后需要用 进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞,④过程应在添加 的选择培养基上培养,培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒,原因是 。
考法综合练
1.（新思维）(2023江苏考前适应,24)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应,使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域,第二组内引物称为巢式引物,其结合部位在中间产物内部的目标区域,从而扩增出目标产物,具体过程如图所示。请回答下列问题。
(1)巢式PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等。
(2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行,可防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增,则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会 (填“上升”或“下降”),不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 (填“高”或“低”)。
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义,科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植,获得高产奶牛。请完成表格相关内容。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品 DNA提取 选取 细胞提取DNA
PCR引物的 设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析
对受体牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品,其中为雌性的胚胎是 。下列奶牛胚胎性别的鉴定方法也可行的是 。
①染色体核型分析法 ②核酸探针杂交法 ③差速离心法 ④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
图2
(1)家禽等鸟类生物与哺乳动物均具有序列高相似度的p21基因,从 水平上为生物进化论提供了有力的证据。结合图1中过程①的结果分析,p21基因保守序列最可能位于基因的 部位。
(2)RNA的稳定性较低,细胞质中的RNA外切酶威胁着RNA的寿命。在真核细胞中,核基因经图2中过程② 、加工形成的成熟mRNA,其3'端通常具有几十到几百个腺苷酸构成的Poly(A)尾以进入细胞质,推测Poly(A)尾的作用可能是
。
(3)进行PCR1前需用TdT在cDNA的3'端添加Poly(C)尾,原因是 ;该过程中使用的TdT与DNA聚合酶在催化核苷酸链延伸上的差异为
。PCR2过程中采用的引物序列分别为 (写出含6个碱基的序列即可)。PCR3中需要添加的物质有dNTP、无菌水、片段1及
(至少写出2种)等。
(4)据图1和下表分析,为保证p21 cDNA和质粒正确连接,进行PCR4扩增时需要在引物的5'端添加限制酶 的识别序列,实际操作过程中需要先对p21 cDNA进行测序分析,原因是 。
限制酶的识别序列和切割位点
EcoRⅠ BamHⅠ Hind Ⅲ Sau3AⅠ BclⅠ
G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT ↓GATC T↓GATCA
(5)将重组质粒导入肌肉细胞常采用 法,体外培养肌肉细胞时可通过观察
初步分析p21蛋白在细胞周期调节过程的作用位置,为进一步分析提供参考。
专题22 基因工程
五年高考
考点1 重组DNA技术的基本工具
1.(2021 江苏,13,2分)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是( )
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
答案 D
2.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案 C
3.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C
考点2 DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳鉴定
4.(2023江苏,9,2分)某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是( )
A.洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂,溶液即呈砖红色
C.制作根尖有丝分裂装片时,解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色
答案 A
5.(2019江苏,10,2分)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
6.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案 C
7.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B
8.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B
9.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成表格。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
考点3 基因工程的基本操作程序
10.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D
11.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶),则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量(相对分子质量)DNA可分开成不同条带,相同分子量(相对分子质量)的为一条带。用某种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D
12.(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
答案 (1)模板、PCR引物 反应时间 (2)CD (3)限制酶、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳只能测定DNA长度,不能确定碱基序列是否产生突变
13.(2021江苏,23,11分)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有 。
A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进 ,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等,完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是
。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明 ,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
答案 (1)①RNA ②蛋白M上不含tag标签 ③BC (2)①黏性末端碱基配对 DNA连接 ②基因m的连接处、基因m的内部 (3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长,导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 ②融合基因表达(或融合基因正确解码)
14.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性核酸内切(限制性内切核酸)(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
15.(2019江苏,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。
(2)用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在 酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是 (填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
平板类型 菌落类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是 。
答案 (1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
16.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指
。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是
。
答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录 将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子的简并性 (4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光
17.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0植株并自交,将T1种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1阳性植株自交所得的T2种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
18.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
19.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
答案 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用 (2)遗传特性 转基因种子 (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增) 若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带) (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便
20.(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;
由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是
。
答案 (1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
21.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是
。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程
22.(2019江苏,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是( )
A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌
B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株
C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
答案 D
23.(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案 B
24.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 ( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D
25.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
三年模拟
限时拔高练1
1.(2024届扬州期初,14)科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因棉花新品系,下列相关叙述错误的是( )
A.可以用不同的限制酶切割目的基因与载体以避免目的基因与载体的自身环化和随意连接
B.可通过农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞
C.含耐盐基因的棉花细胞可经植物组织培养获得完整植株
D.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细胞
答案 D
2.（新情境）(2023盐城三模,17)(多选)基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR(MSP)技术是测定基因是否甲基化的常用方法,其主要原理及过程如图。下列有关叙述正确的是( )
注:mC代表甲基化的胞嘧啶
A.基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B.MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C.PCR过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D.PCR完成后,可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP产物进行鉴定分析
答案 BCD
3.(2023扬州三模,24)血凝素基因(H)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位,其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽,常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导,本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽,科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体,并导入大肠杆菌中表达和分泌,请回答:
(1)流感病毒囊膜主要由 组成,囊膜上血凝素的合成场所在 。
(2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于
,PCR扩增目的基因时应该选择图中引物 ,设计引物时,不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列,原因是 。
(3)应选择限制酶 来切割质粒A,然后直接将PCR产物与质粒A混合,同时加入 酶,使得目的基因与质粒A相连。
(4)若目的基因与质粒A正向连接,HA1基因转录时的模板链是由图中的引物 (填“a”“b”“c”或“d”)在PCR时延伸而成;若目的基因与质粒A反向连接,用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒,完全酶切后的产物进行凝胶电泳,其中最靠近加样孔的条带长度约为 bp。
(5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化,基因工程生产HA1作为疫苗时,选择人IgGFc作为标签的优点还有 。
答案 (1)磷脂和蛋白质 宿主细胞的核糖体 (2)融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外 b和引物c 防止产生的HA上不含IgGFc标签 (3)EcoR Ⅴ T4 DNA连接 (4)c 5 181 (5)降低免疫排斥反应
4.(2024届常熟中学抽测一,23)养殖家禽的饲料中富含谷物,纤维素是谷物的重要成分,但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶,阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌,将其添加于饲料中,以提高家禽养殖效率。请分析并回答下列问题。
(1)乳酸杆菌是动物胃肠道的优势细菌之一。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质,抑制有害细菌的生长和繁殖,维持肠道的正常功能,乳酸杆菌与家禽的种间关系属于 。
(2)培养乳酸杆菌时培养基中除添加主要营养物质外还需要添加 以满足其生长对特殊营养物质的需求。农牧业上常将以制糖工业的废液为原料通过发酵获得的 制成微生物饲料提高饲料的品质。
(3)枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶,这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因,需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链。
①利用PCR技术扩增W基因时,需要用到 酶。扩增完成后,常采用 法来鉴定PCR的产物。
②很多启动子具有物种特异性,在图1质粒中插入W基因,其上游启动子应选择 (填字母)
A.枯草芽孢杆菌启动子
B.乳酸杆菌启动子
C.农杆菌启动子
③如表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ
识别位点
限制酶 KpnⅠ MfeⅠ
识别位点
限制酶 Hind Ⅲ
识别位点
根据上述信息,应使用限制酶 切割图1中质粒,使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段,以获得能正确表达W基因的重组质粒。
④所得重组质粒导入乳酸杆菌后,使用含氨苄青霉素的培养基筛选,以得到成功导入W基因的乳酸杆菌。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力,研究人员将导入了重组质粒的乳酸杆菌接种在含 的固体鉴别培养基上,若出现 现象,则证明导入成功。
答案 (1)互利共生 (2)维生素 单细胞蛋白 (3)①耐高温的DNA聚合酶 (琼脂糖凝胶)电泳 ②B ③MfeⅠ、Hind Ⅲ EcoRⅠ、Hind Ⅲ (4)纤维素和刚果红 以菌落为中心的透明圈
5.(2023苏州八校联考,24)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系,为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐基因(RST1基因)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG……(省略3n个核苷酸序列)……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图,BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶(四种酶的识别序列详见表)。请回答下列问题:
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切 割位点(5'→3') G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG ↓GATC
(1)为获取更多RST1基因,可通过PCR扩增,在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR引物,其中可选用的引物是 (选填序号)。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
(2)若PCR反应未得到任何扩增产物,主要原因有 (选填序号)。
①退火温度过高 ②Taq酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度过低
(3)为将图中质粒A和RST1基因正确连接构建重组质粒B,设计RST1基因的引物时,在两种引物的5'端分别添加 酶的识别序列,选用 酶切割质粒A,酶切后的载体和目的基因片段通过 酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞,应首先在筛选平板培养基添加 ,再将平板上长出的菌落通过影印接种法(盖章)接种到添加 的平板培养基上继续培养观察。
(4)从平板上长出的菌落若提取重组质粒B利用Sau3AⅠ进行酶切,最多可以得到 种大小不同的DNA片段。
(5)图2是对重组质粒测序的部分序列,若目的基因与质粒正确连接(启动子顺时针转录),则图中连接处的序列正确的是 (填序列编号)。
答案 (1)与目的基因的模板链配对(结合),使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,延伸子链 ②④ (2)①②④⑥ (3)BamHⅠ、SmaⅠ BclⅠ、SmaⅠ T4 DNA连接 四环素 氨苄青霉素 (4)7 (5)Q3
限时拔高练2
1.（新情境）(2024届江苏期初调研,14)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。叙述正确的是( )
A.图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力
B.DNA的两条单链都可作为转录的模板链
C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D.四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
答案 B
2.(2023徐州模拟,19)(多选)RNA干扰是小分子RNA介导的、一种抑制特殊基因表达的现象。RNA干扰通过形成并激活沉默复合体(RISC),降解靶基因mRNA使基因无法表达而沉默。利用人工合成的miRNA研究其作用原理如图所示。相关分析正确的是( )
A.需依据靶基因的启动子序列设计miRNA
B.整个过程至少需要7种酶参与
C.沉默复合体中的miRNA可结合并降解靶基因mRNA
D.RNA干扰可防止外来的有害基因或病毒基因整合到生物基因组中
答案 BD
3.(2024届南京零模,23)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链,B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题:
(注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色:ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。)
(1)获取目的基因:提取枣树细胞的 ,经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是 ,并在其 (填“5'或3'”)末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA分子的启动子是 识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项 (A.噬菌体基因启动子 B.乳酸菌基因启动子 C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子)
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。
①将得到的混合物导入用 处理的大肠杆菌完成 实验。
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含 的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。
(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 (填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用 等方法获得所需的发酵产品。
答案 (1)mRNA 引物Ⅱ和引物Ⅲ 5' XhoⅠ和KpnⅠ (2)RNA聚合酶 D (3)①Ca2+ 转化 ②白色 ③普通大肠杆菌 (一定浓度的重金属)镉 (4)菌体 过滤、沉淀
4.（新情境）(2023盐城三模,23)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端任意16个碱基,使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。请回答下列问题:
(1)为获得线性化质粒,除了图示利用PCR方法外,还可利用 方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是先将除 以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比,这样做的目的是可减少反应起始时 形成的产物。
(3)图中,同源序列1、2中的碱基序列 (选填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是 ,还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析,引物A或引物B要依据 序列进行设计。过程②经过 轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后,In-Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列,形成 ,然后降温使其发生
,进而在DNA聚合酶及 酶的作用下完成质粒的环化,形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势之一是
。
答案 (1)限制酶处理(单酶切或双酶切) (2)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 引物错配 (3)不同 防止目的基因反向连接 (4)质粒(或引物1、2)与目的基因碱基(或脱氧核苷酸) 3(或三) (5)黏性末端 碱基互补配对 DNA连接 (6)不受限制酶切割位点的限制;可以把目的基因插入任何位点;避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等
5.(2023扬州中学等4校联考,24)土壤盐渍化影响水稻生长发育,将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中,培育耐盐碱水稻新品种,其操作流程及可能用到的限制酶如图,其中bar为抗除草剂基因,Tetr为四环素抗性基因,Ampr为氨苄青霉素抗性基因,①~⑦表示操作过程。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切 割位点 ↓ -GGATCC- ↓ -TGATCA- ↓ -CCCGGG- ↓ -GATC-
(1)OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为 (“5'”或“3'”)端,过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化 键的形成,还需要添加引物,应选用引物组合 。
①5'-CTTGGATGAT-3'
②5'-TAAGTTGTCT-3'
③5'-TAGTAGGTTC-3'
④5'-TCTGTTGAAT-3'
⑤5'-ATTCAACAGA-3'
⑥5'-ATCATCCAAG-3'
(2)根据基因表达载体的结构组成分析,Ti质粒中的CaMV35S是 ,其功能是 。基因表达载体中,OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 (填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒,利用所选限制酶进行操作的优势是 ,切割后需要用 进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞,④过程应在添加 的选择培养基上培养,培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒,原因是 。
答案 (1)5' 磷酸二酯 ①④ (2)启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位,(启动转录过程) 相反 (3)Bcl Ⅰ和SmaⅠ 防止酶切后的质粒自身环化,保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接 T4 DNA连接酶(仅答出DNA连接酶不正确) (4)四环素 含未重组Ti质粒(或普通Ti质粒)的受体细胞也能正常生长
考法综合练
1.（新思维）(2023江苏考前适应,24)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应,使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域,第二组内引物称为巢式引物,其结合部位在中间产物内部的目标区域,从而扩增出目标产物,具体过程如图所示。请回答下列问题。
(1)巢式PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等。
(2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行,可防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增,则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会 (填“上升”或“下降”),不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 (填“高”或“低”)。
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义,科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植,获得高产奶牛。请完成表格相关内容。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品 DNA提取 选取 细胞提取DNA
PCR引物的 设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析
对受体牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品,其中为雌性的胚胎是 。下列奶牛胚胎性别的鉴定方法也可行的是 。
①染色体核型分析法 ②核酸探针杂交法 ③差速离心法 ④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
答案 (1)Taq酶(耐高温的DNA聚合酶) dNTP(4种脱氧核苷酸) (2)复性(退火) 内引物(巢式引物) (3)上升 高 (4)滋养层 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,确定胚胎性别 同期发情处理 (5)1号、2号、4号 ①②④
2.（热点透）(2023江苏四市二调,23)p21蛋白是一种重要的细胞周期抑制因子,对家禽卵泡和肌肉发育、哺乳动物卵子成熟和胚胎发育均具有重要调节作用。为研究p21基
2025江苏版新教材生物学高考第一轮
专题22 基因工程
五年高考
考点1 重组DNA技术的基本工具
1.(2021 江苏,13,2分)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是( )
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
2.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
3.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
考点2 DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳鉴定
4.(2023江苏,9,2分)某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是( )
A.洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂,溶液即呈砖红色
C.制作根尖有丝分裂装片时,解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色
5.(2019江苏,10,2分)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
6.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
7.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
8.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
9.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成表格。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
考点3 基因工程的基本操作程序
10.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
11.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶),则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量(相对分子质量)DNA可分开成不同条带,相同分子量(相对分子质量)的为一条带。用某种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
12.(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
13.(2021江苏,23,11分)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有 。
A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进 ,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等,完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是
。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明 ,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
14.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
15.(2019江苏,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。
(2)用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在 酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是 (填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
平板类型 菌落类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是 。
16.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指
。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是
。
17.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0植株并自交,将T1种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1阳性植株自交所得的T2种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
18.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
19.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
20.(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;
由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是
。
21.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是
。
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程
22.(2019江苏,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是( )
A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌
B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株
C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
23.(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
24.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 ( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
25.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
三年模拟
限时拔高练1
1.(2024届扬州期初,14)科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因棉花新品系,下列相关叙述错误的是( )
A.可以用不同的限制酶切割目的基因与载体以避免目的基因与载体的自身环化和随意连接
B.可通过农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞
C.含耐盐基因的棉花细胞可经植物组织培养获得完整植株
D.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细胞
2.（新情境）(2023盐城三模,17)(多选)基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR(MSP)技术是测定基因是否甲基化的常用方法,其主要原理及过程如图。下列有关叙述正确的是( )
注:mC代表甲基化的胞嘧啶
A.基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B.MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C.PCR过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D.PCR完成后,可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP产物进行鉴定分析
3.(2023扬州三模,24)血凝素基因(H)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位,其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽,常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导,本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽,科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体,并导入大肠杆菌中表达和分泌,请回答:
(1)流感病毒囊膜主要由 组成,囊膜上血凝素的合成场所在 。
(2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于
,PCR扩增目的基因时应该选择图中引物 ,设计引物时,不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列,原因是 。
(3)应选择限制酶 来切割质粒A,然后直接将PCR产物与质粒A混合,同时加入 酶,使得目的基因与质粒A相连。
(4)若目的基因与质粒A正向连接,HA1基因转录时的模板链是由图中的引物 (填“a”“b”“c”或“d”)在PCR时延伸而成;若目的基因与质粒A反向连接,用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒,完全酶切后的产物进行凝胶电泳,其中最靠近加样孔的条带长度约为 bp。
(5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化,基因工程生产HA1作为疫苗时,选择人IgGFc作为标签的优点还有 。
4.(2024届常熟中学抽测一,23)养殖家禽的饲料中富含谷物,纤维素是谷物的重要成分,但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶,阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌,将其添加于饲料中,以提高家禽养殖效率。请分析并回答下列问题。
(1)乳酸杆菌是动物胃肠道的优势细菌之一。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质,抑制有害细菌的生长和繁殖,维持肠道的正常功能,乳酸杆菌与家禽的种间关系属于 。
(2)培养乳酸杆菌时培养基中除添加主要营养物质外还需要添加 以满足其生长对特殊营养物质的需求。农牧业上常将以制糖工业的废液为原料通过发酵获得的 制成微生物饲料提高饲料的品质。
(3)枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶,这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因,需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链。
①利用PCR技术扩增W基因时,需要用到 酶。扩增完成后,常采用 法来鉴定PCR的产物。
②很多启动子具有物种特异性,在图1质粒中插入W基因,其上游启动子应选择 (填字母)
A.枯草芽孢杆菌启动子
B.乳酸杆菌启动子
C.农杆菌启动子
③如表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ
识别位点
限制酶 KpnⅠ MfeⅠ
识别位点
限制酶 Hind Ⅲ
识别位点
根据上述信息,应使用限制酶 切割图1中质粒,使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段,以获得能正确表达W基因的重组质粒。
④所得重组质粒导入乳酸杆菌后,使用含氨苄青霉素的培养基筛选,以得到成功导入W基因的乳酸杆菌。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力,研究人员将导入了重组质粒的乳酸杆菌接种在含 的固体鉴别培养基上,若出现 现象,则证明导入成功。
5.(2023苏州八校联考,24)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系,为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐基因(RST1基因)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG……(省略3n个核苷酸序列)……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图,BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶(四种酶的识别序列详见表)。请回答下列问题:
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切 割位点(5'→3') G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG ↓GATC
(1)为获取更多RST1基因,可通过PCR扩增,在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR引物,其中可选用的引物是 (选填序号)。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
(2)若PCR反应未得到任何扩增产物,主要原因有 (选填序号)。
①退火温度过高 ②Taq酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度过低
(3)为将图中质粒A和RST1基因正确连接构建重组质粒B,设计RST1基因的引物时,在两种引物的5'端分别添加 酶的识别序列,选用 酶切割质粒A,酶切后的载体和目的基因片段通过 酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞,应首先在筛选平板培养基添加 ,再将平板上长出的菌落通过影印接种法(盖章)接种到添加 的平板培养基上继续培养观察。
(4)从平板上长出的菌落若提取重组质粒B利用Sau3AⅠ进行酶切,最多可以得到 种大小不同的DNA片段。
(5)图2是对重组质粒测序的部分序列,若目的基因与质粒正确连接(启动子顺时针转录),则图中连接处的序列正确的是 (填序列编号)。
限时拔高练2
1.（新情境）(2024届江苏期初调研,14)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。叙述正确的是( )
A.图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力
B.DNA的两条单链都可作为转录的模板链
C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D.四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
2.(2023徐州模拟,19)(多选)RNA干扰是小分子RNA介导的、一种抑制特殊基因表达的现象。RNA干扰通过形成并激活沉默复合体(RISC),降解靶基因mRNA使基因无法表达而沉默。利用人工合成的miRNA研究其作用原理如图所示。相关分析正确的是( )
A.需依据靶基因的启动子序列设计miRNA
B.整个过程至少需要7种酶参与
C.沉默复合体中的miRNA可结合并降解靶基因mRNA
D.RNA干扰可防止外来的有害基因或病毒基因整合到生物基因组中
3.(2024届南京零模,23)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链,B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题:
(注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色:ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。)
(1)获取目的基因:提取枣树细胞的 ,经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是 ,并在其 (填“5'或3'”)末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA分子的启动子是 识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项 (A.噬菌体基因启动子 B.乳酸菌基因启动子 C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子)
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。
①将得到的混合物导入用 处理的大肠杆菌完成 实验。
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含 的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。
(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 (填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用 等方法获得所需的发酵产品。
4.（新情境）(2023盐城三模,23)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端任意16个碱基,使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。请回答下列问题:
(1)为获得线性化质粒,除了图示利用PCR方法外,还可利用 方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是先将除 以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比,这样做的目的是可减少反应起始时 形成的产物。
(3)图中,同源序列1、2中的碱基序列 (选填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是 ,还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析,引物A或引物B要依据 序列进行设计。过程②经过 轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后,In-Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列,形成 ,然后降温使其发生
,进而在DNA聚合酶及 酶的作用下完成质粒的环化,形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势之一是
。
5.(2023扬州中学等4校联考,24)土壤盐渍化影响水稻生长发育,将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中,培育耐盐碱水稻新品种,其操作流程及可能用到的限制酶如图,其中bar为抗除草剂基因,Tetr为四环素抗性基因,Ampr为氨苄青霉素抗性基因,①~⑦表示操作过程。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切 割位点 ↓ -GGATCC- ↓ -TGATCA- ↓ -CCCGGG- ↓ -GATC-
(1)OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为 (“5'”或“3'”)端,过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化 键的形成,还需要添加引物,应选用引物组合 。
①5'-CTTGGATGAT-3'
②5'-TAAGTTGTCT-3'
③5'-TAGTAGGTTC-3'
④5'-TCTGTTGAAT-3'
⑤5'-ATTCAACAGA-3'
⑥5'-ATCATCCAAG-3'
(2)根据基因表达载体的结构组成分析,Ti质粒中的CaMV35S是 ,其功能是 。基因表达载体中,OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 (填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒,利用所选限制酶进行操作的优势是 ,切割后需要用 进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞,④过程应在添加 的选择培养基上培养,培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒,原因是 。
考法综合练
1.（新思维）(2023江苏考前适应,24)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应,使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域,第二组内引物称为巢式引物,其结合部位在中间产物内部的目标区域,从而扩增出目标产物,具体过程如图所示。请回答下列问题。
(1)巢式PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等。
(2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行,可防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增,则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会 (填“上升”或“下降”),不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 (填“高”或“低”)。
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义,科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植,获得高产奶牛。请完成表格相关内容。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品 DNA提取 选取 细胞提取DNA
PCR引物的 设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析
对受体牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品,其中为雌性的胚胎是 。下列奶牛胚胎性别的鉴定方法也可行的是 。
①染色体核型分析法 ②核酸探针杂交法 ③差速离心法 ④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
图2
(1)家禽等鸟类生物与哺乳动物均具有序列高相似度的p21基因,从 水平上为生物进化论提供了有力的证据。结合图1中过程①的结果分析,p21基因保守序列最可能位于基因的 部位。
(2)RNA的稳定性较低,细胞质中的RNA外切酶威胁着RNA的寿命。在真核细胞中,核基因经图2中过程② 、加工形成的成熟mRNA,其3'端通常具有几十到几百个腺苷酸构成的Poly(A)尾以进入细胞质,推测Poly(A)尾的作用可能是
。
(3)进行PCR1前需用TdT在cDNA的3'端添加Poly(C)尾,原因是 ;该过程中使用的TdT与DNA聚合酶在催化核苷酸链延伸上的差异为
。PCR2过程中采用的引物序列分别为 (写出含6个碱基的序列即可)。PCR3中需要添加的物质有dNTP、无菌水、片段1及
(至少写出2种)等。
(4)据图1和下表分析,为保证p21 cDNA和质粒正确连接,进行PCR4扩增时需要在引物的5'端添加限制酶 的识别序列,实际操作过程中需要先对p21 cDNA进行测序分析,原因是 。
限制酶的识别序列和切割位点
EcoRⅠ BamHⅠ Hind Ⅲ Sau3AⅠ BclⅠ
G↓AATTC G↓GATCC A↓AGCTT ↓GATC T↓GATCA
(5)将重组质粒导入肌肉细胞常采用 法,体外培养肌肉细胞时可通过观察
初步分析p21蛋白在细胞周期调节过程的作用位置,为进一步分析提供参考。
专题22 基因工程
五年高考
考点1 重组DNA技术的基本工具
1.(2021 江苏,13,2分)如图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略,下列相关叙述错误的是( )
A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒,都带有T-DNA序列
B.该方法建立在高转化频率基础上,标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C.若要获得剔除标记基因的植株,转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
答案 D
2.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
答案 C
3.(2021湖北,7,2分)限制性内切酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA,用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA,理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )
A.6 B.250 C.4 000 D.24 000
答案 C
考点2 DNA的粗提取与鉴定、PCR扩增与电泳鉴定
4.(2023江苏,9,2分)某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是( )
A.洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B.洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂,溶液即呈砖红色
C.制作根尖有丝分裂装片时,解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中,加入二苯胺试剂后显蓝色
答案 A
5.(2019江苏,10,2分)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是( )
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案 A
6.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案 C
7.(2022山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是( )
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
答案 B
8.(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B
9.(2022江苏,24,12分)纤毛是广泛存在的细胞表面结构,功能异常可引发多种疾病。因此,研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示,由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由 组成。基体由中心体转变而来,中心体在有丝分裂中的功能是 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常,为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异,对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时,可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来,溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是 。PCR扩增时,需在 催化下,在引物的 端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位,构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白,融合蛋白具有绿色荧光,可指示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y,构建Y-M重组质粒(在EcoRⅤ位点插入片段)。请完成表格。
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M ①选择图Ⅱ引物 ;②PCR目的产物约为 bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序,图Ⅲ中正确的是 (选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y-M分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部,说明
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化,采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经 形成cDNA作为模板,PCR扩增结果显示,在总cDNA模板量相等的条件下,健康人Ct值为15,而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算,在PCR扩增20个循环的产物中,健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
答案 (1)脂质和蛋白质 发出星射线,形成纺锤体 (2)溶解DNA Taq DNA聚合酶(或耐高温的DNA聚合酶) 3' (3)①a、b ②1 100 ③Q4 ④蛋白X定位于纤毛基部 (4)逆转录 32
考点3 基因工程的基本操作程序
10.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D
11.(2020浙江7月选考,24,2分)下列关于基因工程的叙述,正确的是( )
A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶),则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D.已知不同分子量(相对分子质量)DNA可分开成不同条带,相同分子量(相对分子质量)的为一条带。用某种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案 D
12.(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
答案 (1)模板、PCR引物 反应时间 (2)CD (3)限制酶、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳只能测定DNA长度,不能确定碱基序列是否产生突变
13.(2021江苏,23,11分)某小组为研究真菌基因m的功能,构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒。请结合实验流程回答下列问题。
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ,经逆转录获得cDNA,进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时,不能包含基因m终止密码子的编码序列,否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是:先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有 。
A.Taq酶最适催化温度范围为50~60 ℃
B.与常规PCR相比,热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C.两条子链的合成一定都是从5'端向3'端延伸
D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合,用特定DNA酶处理形成黏性末端,然后降温以促进 ,形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌,利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等,完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaⅠ切开,则SmaⅠ的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母,将其作为受体菌,导入质粒A-m,然后涂布于无尿嘧啶的培养基上,筛选获得目的菌株,其机理是
。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签,说明 ,后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
答案 (1)①RNA ②蛋白M上不含tag标签 ③BC (2)①黏性末端碱基配对 DNA连接 ②基因m的连接处、基因m的内部 (3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长,导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 ②融合基因表达(或融合基因正确解码)
14.(2020江苏,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得 ;Taq DNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'
答案 (1)限制性核酸内切(限制性内切核酸)(或限制) 核苷酸序列 (2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 (3)②④ (4)B
15.(2019江苏,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为 末端。
(2)用Taq酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在 酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是 (填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是 、 。
平板类型 菌落类型
A B C
无抗生素 + + +
氨苄青霉素 + + -
四环素 + - -
氨苄青霉素+四环素 + - -
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是 。
答案 (1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
16.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指
。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ;②为 ,其作用是 ;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是 。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是
。
答案 (1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录 将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子的简并性 (4)获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光
17.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备 。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0植株并自交,将T1种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1阳性植株自交所得的T2种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2阳性植株 (填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
答案 (1)野生型 (2)基因表达载体(或质粒,或载体) 启动子、终止子 (3)①T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因) ②75 ③自交100
(4)
18.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
答案 (1)RNA聚合酶 标记基因、复制原点(或限制性酶切位点) (2)F2和R1(或“F1和R2”) a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
19.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
植株A 外植体 愈伤组织 愈伤组织与含重组载
体的农杆菌共培养幼苗→ 转化
植株A
图1
植株B植株上半部分
浸入含重组载
体的农杆菌液植株长出
毛状根阳性毛
状根段幼苗→ 转化
植株B
图2
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ,该过程还需要光照,其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注 。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ,依据是 。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是 (答出2点即可)。
答案 (1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用 (2)遗传特性 转基因种子 (3)农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上 (4)检测毛状根段是否有绿色荧光 植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增) 若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带) (5)不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便
20.(2022山东,25,12分)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3'端”或“5'端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;
由②④组或③⑤组的差异推测,PΔ中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是
。
答案 (1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 (4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解
21.(2021山东,25,12分)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ,在R末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于 ,理由是
。
答案 (1)SalⅠ EcoRⅠ 6 (2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达 (3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
考点4 基因工程的应用及蛋白质工程
22.(2019江苏,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是( )
A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌
B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株
C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
答案 D
23.(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案 B
24.(2021辽宁,14,2分)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温,利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是 ( )
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
答案 D
25.(2022湖南,22,15分)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是 ,物质b是 。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是 。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 (填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是
。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路 。
答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较三组血液凝固所需时间长短,所需时间越长说明其抗凝血活性越大
三年模拟
限时拔高练1
1.(2024届扬州期初,14)科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因棉花新品系,下列相关叙述错误的是( )
A.可以用不同的限制酶切割目的基因与载体以避免目的基因与载体的自身环化和随意连接
B.可通过农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞
C.含耐盐基因的棉花细胞可经植物组织培养获得完整植株
D.通常通过检测目的基因产物来检测重组DNA是否已导入受体细胞
答案 D
2.（新情境）(2023盐城三模,17)(多选)基因启动子中胞嘧啶甲基化与生物的表观遗传密切相关。甲基化特异性PCR(MSP)技术是测定基因是否甲基化的常用方法,其主要原理及过程如图。下列有关叙述正确的是( )
注:mC代表甲基化的胞嘧啶
A.基因启动子中胞嘧啶甲基化造成基因碱基序列的改变
B.MSP过程中应根据亚硫酸钠处理前后的碱基序列设计两对引物
C.PCR过程中甲基化组的退火温度比非甲基化组的高
D.PCR完成后,可采用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计对MSP产物进行鉴定分析
答案 BCD
3.(2023扬州三模,24)血凝素基因(H)编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位,其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。IgGFc基因片段(长度为717 bp)编码人IgG抗体中的一段小肽,常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导,本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽,科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgGFc融合蛋白表达载体,并导入大肠杆菌中表达和分泌,请回答:
(1)流感病毒囊膜主要由 组成,囊膜上血凝素的合成场所在 。
(2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于
,PCR扩增目的基因时应该选择图中引物 ,设计引物时,不能包含基因HA1的终止密码子的编码序列,原因是 。
(3)应选择限制酶 来切割质粒A,然后直接将PCR产物与质粒A混合,同时加入 酶,使得目的基因与质粒A相连。
(4)若目的基因与质粒A正向连接,HA1基因转录时的模板链是由图中的引物 (填“a”“b”“c”或“d”)在PCR时延伸而成;若目的基因与质粒A反向连接,用BamHⅠ和SacⅠ同时切割重组质粒,完全酶切后的产物进行凝胶电泳,其中最靠近加样孔的条带长度约为 bp。
(5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化,基因工程生产HA1作为疫苗时,选择人IgGFc作为标签的优点还有 。
答案 (1)磷脂和蛋白质 宿主细胞的核糖体 (2)融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外 b和引物c 防止产生的HA上不含IgGFc标签 (3)EcoR Ⅴ T4 DNA连接 (4)c 5 181 (5)降低免疫排斥反应
4.(2024届常熟中学抽测一,23)养殖家禽的饲料中富含谷物,纤维素是谷物的重要成分,但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶,阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌,将其添加于饲料中,以提高家禽养殖效率。请分析并回答下列问题。
(1)乳酸杆菌是动物胃肠道的优势细菌之一。家禽肠道内的乳酸杆菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质,抑制有害细菌的生长和繁殖,维持肠道的正常功能,乳酸杆菌与家禽的种间关系属于 。
(2)培养乳酸杆菌时培养基中除添加主要营养物质外还需要添加 以满足其生长对特殊营养物质的需求。农牧业上常将以制糖工业的废液为原料通过发酵获得的 制成微生物饲料提高饲料的品质。
(3)枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶,这种酶由W基因编码。为在乳酸杆菌中表达W基因,需使用图1中质粒为载体。图2为克隆得到的含W基因的DNA片段,W基因以乙链为转录模板链。
①利用PCR技术扩增W基因时,需要用到 酶。扩增完成后,常采用 法来鉴定PCR的产物。
②很多启动子具有物种特异性,在图1质粒中插入W基因,其上游启动子应选择 (填字母)
A.枯草芽孢杆菌启动子
B.乳酸杆菌启动子
C.农杆菌启动子
③如表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点。
限制酶 EcoRⅠ BamHⅠ
识别位点
限制酶 KpnⅠ MfeⅠ
识别位点
限制酶 Hind Ⅲ
识别位点
根据上述信息,应使用限制酶 切割图1中质粒,使用限制酶 切割图2中含W基因的DNA片段,以获得能正确表达W基因的重组质粒。
④所得重组质粒导入乳酸杆菌后,使用含氨苄青霉素的培养基筛选,以得到成功导入W基因的乳酸杆菌。
(4)为确定导入重组质粒的乳酸杆菌是否具有分解纤维素的能力,研究人员将导入了重组质粒的乳酸杆菌接种在含 的固体鉴别培养基上,若出现 现象,则证明导入成功。
答案 (1)互利共生 (2)维生素 单细胞蛋白 (3)①耐高温的DNA聚合酶 (琼脂糖凝胶)电泳 ②B ③MfeⅠ、Hind Ⅲ EcoRⅠ、Hind Ⅲ (4)纤维素和刚果红 以菌落为中心的透明圈
5.(2023苏州八校联考,24)为扩大可耕地面积,增加粮食产量,沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系,为解决我国粮食问题做出了重要贡献。若测得某耐盐基因(RST1基因)编码链首端到末端(其中一条链)的序列为5'-ATCTACGCGCTCATCCG……(省略3n个核苷酸序列)……CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如图1为构建重组质粒的过程示意图,BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ为限制酶(四种酶的识别序列详见表)。请回答下列问题:
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及切 割位点(5'→3') G↓GATCC T↓GATCA CCC↓GGG ↓GATC
(1)为获取更多RST1基因,可通过PCR扩增,在反应体系中加入引物的作用是
。某同学设计了如下六种PCR引物,其中可选用的引物是 (选填序号)。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
(2)若PCR反应未得到任何扩增产物,主要原因有 (选填序号)。
①退火温度过高 ②Taq酶失活 ③设计的引物过短 ④变性温度过低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg2+浓度过低
(3)为将图中质粒A和RST1基因正确连接构建重组质粒B,设计RST1基因的引物时,在两种引物的5'端分别添加 酶的识别序列,选用 酶切割质粒A,酶切后的载体和目的基因片段通过 酶作用后获得重组质粒。为了筛选出转入了重组质粒的受体细胞,应首先在筛选平板培养基添加 ,再将平板上长出的菌落通过影印接种法(盖章)接种到添加 的平板培养基上继续培养观察。
(4)从平板上长出的菌落若提取重组质粒B利用Sau3AⅠ进行酶切,最多可以得到 种大小不同的DNA片段。
(5)图2是对重组质粒测序的部分序列,若目的基因与质粒正确连接(启动子顺时针转录),则图中连接处的序列正确的是 (填序列编号)。
答案 (1)与目的基因的模板链配对(结合),使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,延伸子链 ②④ (2)①②④⑥ (3)BamHⅠ、SmaⅠ BclⅠ、SmaⅠ T4 DNA连接 四环素 氨苄青霉素 (4)7 (5)Q3
限时拔高练2
1.（新情境）(2024届江苏期初调研,14)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。叙述正确的是( )
A.图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去侵染能力
B.DNA的两条单链都可作为转录的模板链
C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D.四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
答案 B
2.(2023徐州模拟,19)(多选)RNA干扰是小分子RNA介导的、一种抑制特殊基因表达的现象。RNA干扰通过形成并激活沉默复合体(RISC),降解靶基因mRNA使基因无法表达而沉默。利用人工合成的miRNA研究其作用原理如图所示。相关分析正确的是( )
A.需依据靶基因的启动子序列设计miRNA
B.整个过程至少需要7种酶参与
C.沉默复合体中的miRNA可结合并降解靶基因mRNA
D.RNA干扰可防止外来的有害基因或病毒基因整合到生物基因组中
答案 BD
3.(2024届南京零模,23)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中具有金属结合能力的蛋白质,决定该蛋白质合成的基因结构如图1所示,其中A链为编码链,B链为模板链。科研人员利用图2所示质粒构建枣树的MT基因重组DNA分子并导入大肠杆菌细胞,获得对重金属镉(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列问题:
(注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以催化无色物质X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色,否则菌落为白色:ampr基因为氨苄青霉素抗性基因。)
(1)获取目的基因:提取枣树细胞的 ,经逆转录获得cDNA。为了使PCR扩增后的产物按照正确的方向与已被酶切的载体连接,克隆MT基因时应选择的引物组合是 ,并在其 (填“5'或3'”)末端分别添加限制酶 的识别序列。
(2)构建重组DNA分子的启动子是 识别并结合的部位;基因工程中构建用于原核生物的表达载体时,常用的启动子不包括以下哪一项 (A.噬菌体基因启动子 B.乳酸菌基因启动子 C.大肠杆菌基因启动子 D.枣树MT基因启动子)
(3)导入、筛选和鉴定MT工程菌。
①将得到的混合物导入用 处理的大肠杆菌完成 实验。
②将菌液稀释并涂布在含X-gal和氨苄青霉素的培养基上进行培养后,随机挑取 的单菌落可获得MT工程菌。
③欲进一步对MT工程菌进行鉴定,可将挑取出的MT工程菌与 分别接种至含 的LB液体培养基中,置于恒温培养箱中培养,适宜时间后检测菌种数量。
(4)扩大菌种将MT工程菌接种至发酵罐内进行扩增,培养过程中可定期取样并使用细菌计数板对 (填“菌体”或“菌落”)进行直接计数,以评估增殖情况。发酵结束后,采用 等方法获得所需的发酵产品。
答案 (1)mRNA 引物Ⅱ和引物Ⅲ 5' XhoⅠ和KpnⅠ (2)RNA聚合酶 D (3)①Ca2+ 转化 ②白色 ③普通大肠杆菌 (一定浓度的重金属)镉 (4)菌体 过滤、沉淀
4.（新情境）(2023盐城三模,23)In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列,通常为15~20 bp),然后用In-Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5'→3'末端任意16个碱基,使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如图。请回答下列问题:
(1)为获得线性化质粒,除了图示利用PCR方法外,还可利用 方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率,方法之一是先将除 以外的各成分混合后,加热到80 ℃以上再混入酶,然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比,这样做的目的是可减少反应起始时 形成的产物。
(3)图中,同源序列1、2中的碱基序列 (选填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是 ,还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析,引物A或引物B要依据 序列进行设计。过程②经过 轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后,In-Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列,形成 ,然后降温使其发生
,进而在DNA聚合酶及 酶的作用下完成质粒的环化,形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比,In-Fusion技术的优势之一是
。
答案 (1)限制酶处理(单酶切或双酶切) (2)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶) 引物错配 (3)不同 防止目的基因反向连接 (4)质粒(或引物1、2)与目的基因碱基(或脱氧核苷酸) 3(或三) (5)黏性末端 碱基互补配对 DNA连接 (6)不受限制酶切割位点的限制;可以把目的基因插入任何位点;避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等
5.(2023扬州中学等4校联考,24)土壤盐渍化影响水稻生长发育,将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中,培育耐盐碱水稻新品种,其操作流程及可能用到的限制酶如图,其中bar为抗除草剂基因,Tetr为四环素抗性基因,Ampr为氨苄青霉素抗性基因,①~⑦表示操作过程。
限制酶 BamHⅠ BclⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别位点及切 割位点 ↓ -GGATCC- ↓ -TGATCA- ↓ -CCCGGG- ↓ -GATC-
(1)OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为 (“5'”或“3'”)端,过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化 键的形成,还需要添加引物,应选用引物组合 。
①5'-CTTGGATGAT-3'
②5'-TAAGTTGTCT-3'
③5'-TAGTAGGTTC-3'
④5'-TCTGTTGAAT-3'
⑤5'-ATTCAACAGA-3'
⑥5'-ATCATCCAAG-3'
(2)根据基因表达载体的结构组成分析,Ti质粒中的CaMV35S是 ,其功能是 。基因表达载体中,OsMYB56基因和bar基因编码链的方向 (填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶 切割质粒,利用所选限制酶进行操作的优势是 ,切割后需要用 进行连接才能获得重组质粒。
(4)为了筛选出含重组质粒的受体细胞,④过程应在添加 的选择培养基上培养,培养后获得的菌落不能判定是否含有重组质粒,原因是 。
答案 (1)5' 磷酸二酯 ①④ (2)启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位,(启动转录过程) 相反 (3)Bcl Ⅰ和SmaⅠ 防止酶切后的质粒自身环化,保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接 T4 DNA连接酶(仅答出DNA连接酶不正确) (4)四环素 含未重组Ti质粒(或普通Ti质粒)的受体细胞也能正常生长
考法综合练
1.（新思维）(2023江苏考前适应,24)巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应,使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段(中间产物)长度超出目标区域,第二组内引物称为巢式引物,其结合部位在中间产物内部的目标区域,从而扩增出目标产物,具体过程如图所示。请回答下列问题。
(1)巢式PCR反应体系中需加入模板、 、 、引物、Mg2+、缓冲液等。
(2)巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行,可防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
(3)若直接用图1中的内引物对模板DNA扩增,则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会 (填“上升”或“下降”),不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 (填“高”或“低”)。
(4)家畜胚胎性别鉴定对畜牧业发展具有重要意义,科研人员利用多重巢式PCR技术同时扩增奶牛Y染色体上雄性决定基因(SRY)和常染色体上的酪蛋白基因(CSN1S1),进行早期胚胎性别鉴定和胚胎移植,获得高产奶牛。请完成表格相关内容。
实验目的 方法步骤要点
囊胚样品 DNA提取 选取 细胞提取DNA
PCR引物的 设计和合成 根据牛的SRY和CSN1S1基因序列设计合成4对引物
PCR扩增 预变性→变性→复性→延伸
鉴定分析
对受体牛注射前列腺素
胚胎移植 将符合要求的胚胎移植到受体奶牛的子宫内
(5)巢式PCR产物鉴定结果如图所示,1~5号为取自不同胚胎的DNA样品,其中为雌性的胚胎是 。下列奶牛胚胎性别的鉴定方法也可行的是 。
①染色体核型分析法 ②核酸探针杂交法 ③差速离心法 ④抗HY血清免疫学法(HY抗原编码基因位于Y染色体上)
答案 (1)Taq酶(耐高温的DNA聚合酶) dNTP(4种脱氧核苷酸) (2)复性(退火) 内引物(巢式引物) (3)上升 高 (4)滋养层 采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定,确定胚胎性别 同期发情处理 (5)1号、2号、4号 ①②④
2.（热点透）(2023江苏四市二调,23)p21蛋白是一种重要的细胞周期抑制因子,对家禽卵泡和肌肉发育、哺乳动物卵子成熟和胚胎发育均具有重要调节作用。为研究p21基
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