(共62张PPT)
举一反三
典例精讲
考点梳理
思维导图
发酵工程与基因工程
专题一
考点串讲PPT
目
录
CONTENTS
1
传统发酵技术的应用
5
6
基因工程的应用
基因工程的基本操作程序
2
微生物的培养及应用
3
酶的研究与应用
4
基因工程的基本工具
7
蛋白质工程
思维导图
传统发酵技术的应用
考点01
考点01 传统发酵技术的应用
考点梳理
一、果酒果醋的制作
项目 果酒制作 果醋制作
菌种 酵母菌 醋酸菌
菌种来源(自然发酵) 附着在葡萄皮上的野生型酵母菌 酒变酸后表面的菌膜
发酵过程 ①有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖： ②无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸，产生酒精： ①当氧气、糖源充足时，醋酸菌将糖分解成醋酸：
②当糖源不足、氧气充足时：
条件 温度 酿酒酵母：28℃；野生酵母：18~30℃ 30~35℃
气体 前期需氧，后期无氧 需氧
时间 10-12d 7-8d
考点01 传统发酵技术的应用
考点梳理
一、果酒果醋的制作
(1)材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄,榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗和腐烂的籽粒，以防葡萄汁流失及被污染。冲洗以洗去灰尘为目的,不要冲洗次数过多，以防洗去野生型酵母菌。
(2)防止发酵液被污染
①榨汁机和发酵瓶等都需清洗干净并进行消毒；②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗和腐烂的籽粒；③发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管。
(3)控制发酵条件
①葡萄汁装入发酵瓶时,要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸,快速繁殖,耗尽O2后再进行酒精发酵，并防止发酵过程中产生的CO造成发酵液的溢出。
②严格控制温度：18~25‘C利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30~35‘C 利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵。
③充气：酒精发酵为无氧发酵，需关闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需打开充气口充气。
考点01 传统发酵技术的应用
考点梳理
二、腐乳的制作
蛋白质
脂肪
小肽
氨基酸
甘油
脂肪酸
酵母、曲霉和毛霉等多种微生物
+
+
蛋白酶
脂肪酶
(毛霉起主要作用)
让豆腐长出毛霉
直接利用空气中的毛霉孢子或者直接接种毛霉（15-18℃，一定湿度）
目的：让毛霉等产生蛋白酶和脂肪酶
加盐腌制
目的：析出豆腐中的水分、抑制不需要的微生物生长
加卤汤装瓶
卤汤包括酒和香辛料
酒（12%）：抑制微生物生长，并使腐乳具有独特香味；
香辛料：调味，防腐杀菌。
密封腌制
卤汤中酒的含量在12%左右的原因：过高会延长腐乳成熟的时间，过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。
方法：随豆腐层数加高增加盐用量，接近瓶口表面，铺厚一点
考点01 传统发酵技术的应用
考点梳理
三、泡菜的制作
乳酸菌
①菌种来源：
植物体表面天然的乳酸菌
②代谢类型：
异养厌氧型
③种类：
乳酸链球菌、乳酸杆菌
（原核生物）
在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸
C6H12O6 ——→2C3H6O3（乳酸）+能量
酶
发酵期间，乳酸会_________，当它的质量百分比为_____________时，泡菜的口味、品质最佳。
2.原理:
1.菌种:
不断积累
0.4%-0.8%
3.注意事项:
（1）泡菜坛的选择：
坛沿深、盖子吻合好
无裂纹、无砂眼
火候好
检查方法：可将坛口向上压入水中，看看坛内有无渗水现象。
（2）腌制的条件：
①要注意控制时间、温度和食盐的用量。
②温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
考点01 传统发酵技术的应用
考点梳理
三、泡菜的制作
配制
盐水
蔬菜处理装坛
加盐水
封坛
发酵
过高：乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；
过低：杂菌易繁殖，导致泡菜变质。
杀菌、除氧
泡菜发酵初期，大肠杆菌、酵母菌等较为活跃，产生较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；
防止因太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；
留有一定空间，方便拿取泡菜。
将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满；
创造无氧环境
将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过菜料，盖好坛盖；
向坛盖边缘的水槽中注满水，在发酵过程中注意向水槽中补充水；根据室内温度控制发酵时间；
不影响乳酸菌的生命活动
用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用；
考点01 传统发酵技术的应用
典例精讲
【典例01】图甲是果酒和果醋发酵的装置图，图乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化。下列叙述不正确的是( )
A.用甲装置制作果酒时，加入酵母菌后，一直关紧阀a，适时打开阀b几秒钟
B.用甲装置制作果醋时，阀a要关闭，阀b要持续打开
C.乙图中过程②只能发生在缺氧条件下
D.过程③和④都需要氧气的参与
B
解析：制作果醋需要的微生物是醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，所以阀a需要全程打开，阀b也需要全程打开。（若此选项换为乙醇发酵，则需要的是酵母菌，酵母菌属于兼性厌氧菌，无氧呼吸产生酒精，所以阀a需要全程关闭，阀b需要间断打开排气）所以B错误。
考点01 传统发酵技术的应用
典例精讲
【典例02】以下是以泡菜坛为容器制作泡菜的过程：①沸盐水冷却后倒入坛中，浸没全部菜料；②盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；③检测泡菜中亚硝酸盐的含量。相关叙述正确的是（ ）
A．①过程中沸盐水冷却为了防止醋酸菌被杀死
B．②过程的主要目的是为避免杂菌污染
C．③的检测结果是亚硝酸盐含量逐渐降低
D．过程①②③不必在无菌环境下进行
D
解析： A、①盐水煮沸是为了灭菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物生命活动不受影响，A错误;
B、③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，主要是为了隔绝空气，为乳酸菌提供无氧环境，B错误；C、③检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，C错误;
D、过程①目的是杀菌，②创造无氧环境，③对亚硝酸盐的含量进行检测，三者皆不必在无菌环境下进行。
考点01 传统发酵技术的应用
举一反三
【演练01】下列有关腐乳制作的叙述中，正确的是（ ）①在腐乳制作过程中必须有能产生蛋白酶的微生物参与；②用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形；③腐乳外部有一层致密的“皮”，对人体是有害的；④腐乳制作后期酒精含量过低使腐乳成熟时间延长；⑤装瓶密封瓶口时，最好进行灼烧灭菌，以防止瓶口污染；⑥可用豆腐本身渗出的水加盐腌制成绵软油滑、异臭奇香的青方腐乳
A．①②③⑤ B．②③④⑤
C．①②⑤⑥ D．②④⑤⑥
C
【演练02】南通某兴趣小组按下图流程制作苹果醋。相关叙述正确的是（ ）
A．菌种甲、乙都具有线粒体，都能进行有氧呼吸
B．加糖的目的是直接为菌种甲、乙提供碳源和能源
C．菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降、温度上升
D．发酵结束后取苹果醋加酸性重铬酸钾检测发酵效果
C
微生物的培养及应用
考点02
考点02 微生物的培养及应用
考点梳理
一、培养基的营养成分
一般都含有碳源、氮源、水、无机盐
碳源
无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-
有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
自养微生物
异养微生物
功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。
氮源
无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等
有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
功能：主要用于合成蛋白质、核酸及含氮代谢产物等。
含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。
无机盐
功能：提供无机营养；调剂PH；维持渗透压
水
功能：良好的溶剂；维持生物大分子结构的稳定
考点02 微生物的培养及应用
考点梳理
二、无菌技术的类型
类型 适用范围 操作方法
消 毒
灭 菌
较为温和理化方法，杀死部分微生物
强烈的理化方法，杀死所有微生物(包括芽孢、孢子)
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
62～65 ℃煮30 min或80-90 ℃煮30s-1 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线
紫外线照射30 min
灼烧灭菌
接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等
物品放入干热灭菌箱,160～170 ℃加热2～3h
湿热灭菌
培养基等,生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121℃,
15～30 min
接种室、实验室、超净工作台
考点02 微生物的培养及应用
考点梳理
三、纯培养的步骤
倒平板
待培养基冷却至50 ℃左右，酒精灯火焰附近倒平板；平板冷凝后，要将平板倒置。
①温度过高不安全（烫手），温度过低培养基会凝固；
②可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。
通过灼烧灭菌，防止瓶口微生物污染培养基。
防止培养基表面的水分过度挥发;防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
鉴定：将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。
①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红
⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。
⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞
②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞
③试管口通过火焰
④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。
考点02 微生物的培养及应用
考点梳理
四、微生物的计数
主要方法 稀释涂布平板法 平板划线法
主要步骤
接种工具
菌体获取
能否计数
共同点 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种环在固体培养基表面连续划线
涂布器
接种环
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
不能计数
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
稀释涂布平板计数法
M代表稀释倍数
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
每g样品中的菌落数＝
(C÷V)×M
显微镜直接计数法
血细胞计数板
常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数。
细菌计数板
对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
快速、直观
A.不能区分死菌和活菌→偏大
B.不适于对运动细菌的计数。
C.个体小的细菌在显微镜下难以观察。
优点
缺点
考点02 微生物的培养及应用
典例精讲
【典例01】下列有关培养基的叙述，正确的是( )
A.微生物的培养都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，缺一不可
B.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
C.培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性
D.培养基只能培养细菌
C
解析：A、微生物的培养不一定都需要提供水、碳源、氮源、无机盐，如培养自生固氮菌时不需要加入氨源，A错误；
B、微生物在固体培养基上生长时，可形成肉眼可见的菌落，单个细菌不能用肉眼看到，B错误；
C、不同微生物对培养基中的pH的要求不同，培养细菌时，需要将培养基调至中性或弱碱性，C正确；
D、培养基能培养细菌，也能培养真菌，D错误。
考点02 微生物的培养及应用
典例精讲
【典例02】取纯净微生物的关键在于无菌技术，主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌技术的叙述错误的是（ ）
A．牛奶一般通过100℃煮沸5~6min来消毒
B．紫外线照射30min可以杀死物体表面的微生物
C．吸管和培养皿通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D．接种环、试管口通过灼烧灭菌法进行灭菌
A
解析：A、牛奶不耐高温，牛奶的消毒应采用巴氏消毒法，即在62-65°C条件下消毒30分钟或在80-90°C条件下处理30s~1分钟，A错误;
B、接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可用紫外线照射30min进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，B正确；
C、吸管和培养血通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，也可用干热灭菌法进行，C正确；
D、接种环、试管口等实验中频繁使用的常使用灼烧灭菌法，D正确。
考点02 微生物的培养及应用
举一反三
【演练01】下列关于倒平板的叙述，错误的是( )
A.待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
B.倒平板整个过程应在酒精灯火焰旁进行
C.完全打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置
C
【演练02】下图为微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5，下列叙述正确的是( )
A.在每一区域内划线时接种环上的菌种直接来源于 菌液
B.划线操作时应在酒精灯火焰旁边打开皿盖放在桌面 上，划线接种
C.每次划线只能从上一次划线的末端开始，才能确保 菌种逐步稀释以得到单菌落
D.第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数
C
酶的研究与应用
考点03
考点03 酶的研究与应用
考点梳理
一、固定化计数比较（拓展）
名称 原理 图示
包埋法 将酶或细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中
化学结合法 利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖等载体上
物理吸附法 通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在活性炭、多孔玻璃等吸附剂表面
考点03 酶的研究与应用
考点梳理
二、直接使用酶、固定化酶、固定化细胞比较（拓展）
直接使用酶 固定化酶 固定化细胞
酶的种类 一种或几种 一种 一系列
适用方法 化学结合法、物理吸附法 包埋法
营养物质 不需要 不需要 需要
反应底物 各种物质
(大分子、小分子) 各种物质 (大分子、小分子) 小分子物质
优点 催化效率高、耗能低、污染小 酶既能与反应物结合，又能与产物分离，还可以被反复利用 成本更低，操作更容易
缺点 对环境条件非常敏感，易失活；难回收，提高了成本，影响产品质量 不适用于催化一系列的酶促反应 反应物不易与酶接触，尤其是大分子，反应效率下降
考点03 酶的研究与应用
典例精讲
【典例01】研究人员从土样中筛选出产果胶酶的菌株XW-18，研究不同碳源对XW-18的生长和果胶酶活性的影响，结果如下图。以下叙述错误的是（ ）
A．若要筛选产果胶酶的菌株，应以果胶作为唯一碳源
B．碳源越能促进XW-18的增殖，则果胶酶产量就越高
C．若要以XW-18发酵生产果胶酶，应该以蔗糖作为碳源
D．若要让XW-18扩大培养，应该以可溶性淀粉作为碳源
B
解析：A、果胶酶能水解果胶，以果胶作为唯一碳源，能筛选出产果胶酶的菌株，A正确；
B、一般来说碳源越能促进xW-18的增殖，则果胶酶活性就越高，但是图中以可溶性淀粉为碳源时，菌体量最大，而酶活性相对较低，因此两者之问不能说成正相关的关系，B错误;
C、若要以xW-18发酵生产果胶酶，应以蔗糖作为碳源，此条件下酶活性最高，菌株量也相对较多，C正确；
D、若要让xW-18扩大培养，应该以可溶性淀粉作为碳源，此时菌体数量最多，D正确。
考点03 酶的研究与应用
典例精讲
【典例02】下列关于果胶酶的叙述，错误的是（ ）
A．果胶酶能提高水果的出汁率，并使果汁变得澄清
B．食品加工中果胶酶主要是由植物中提取产生
C．酶的反应速度可以用单位时间内、单位体积反应物的减少量来表示
D．果胶酶包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶
B
解析：A、植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，果胶酶可以分解果胶，瓦解植物细胞的细胞壁和胞间层，从而提高水果出汁率并使果汁变得澄清，A正确；
B、食品加工中果胶酶主要是由霉菌发酵生产，B错误;
C、酶的反应速度可以用单位时问内、单位体积反应物的减少量或者产物的增加量来表示，C正确;
D、果胶酶是能分解果胶的一类酶的总称，包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶，D正确。
考点03 酶的研究与应用
举一反三
【演练01】下列有关固定化酶的说法正确的是（ ）
A．固定的酶可以长期永久使用
B．使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时还可以反复利用
C．固定后的酶可以不受强酸强碱和高温的限制
D．生产高果糖浆时，固定化酶反应柱底端分布着许多小孔的筛板属于半透膜
B
【演练02】某学习小组欲探究果胶酶用量对橙汁产量的影响，实验结果如图所示。有关实验的分析正确的是（ ）
A．果胶酶的单体是半乳糖醛酸，包含多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等
B．该实验的无关变量有温度、pH和果胶酶用量等
C．实验过程中玻璃棒搅拌的目的是增大溶液中的溶氧量
D．实验结果表明一定量的橙子泥需要果胶酶的最适用量为35mL
D
基因工程的基本工具
考点04
考点04 基因工程的基本工具
考点梳理
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
主要是原核生物
来源
种类
数千种
限制酶不是一种酶，而是一类酶
特点
（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列
（2）断开磷酸二酯键
识别序列长度
一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。
专一性
结果
形成黏性末端或平末端
限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
考点04 基因工程的基本工具
考点梳理
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
考点04 基因工程的基本工具
考点梳理
三、基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
载体的 作用
载体的必 要条件
载体的种类
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。
②具一个或多个限制酶切点，供外源DNA片段（目的基因）插入其中。
③具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。
④必须是安全的 ，对受体细胞无害。
①作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制
①细菌的质粒：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
考点04 基因工程的基本工具
考点梳理
四、 DNA的粗提取及鉴定
1.破碎细胞——
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ， 研磨。
洋葱
研磨液
充分
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而使研磨液中的DNA含量较低，影响最终提取的DNA量。
2.去除杂质——
在漏斗中垫上 过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
纱布
上清液
上清液
不可以用滤纸代替纱布。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
3.DNA的粗提取——
在上清液中加入体积相等的 溶液，静置2~3min，溶液中出现的
就是粗提取的DNA 。
预冷的酒精
白色丝状物
酒精作用：使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。
预冷的酒精的优点
①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。
用玻璃棒沿 搅拌，卷起 ，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取 晾干。
一个方向
沉淀物
丝状物
为什么要用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌？
避免破坏DNA
实验组
对照组
水浴加热
考点04 基因工程的基本工具
考点梳理
四、 DNA的粗提取及鉴定
4.DNA的鉴定——
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。
二苯胺
2mol/L的NaCl
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
加入2mol/L氯化钠溶液
加入丝状物
加入4mL二苯胺试剂
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
原理一
原理二
原理三
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
DNA能溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色
考点04 基因工程的基本工具
典例精讲
【典例01】某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（ ）
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b
C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
A
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
解析：第①组：细胞能在含氨共青霉素培养基上生长，说明抗氨芐青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因没有被破坏。由此可知，外源基因插入的位置不是a、6，而是c;
第②组：细胞能在含氨共青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上的生长，说明抗四环素基因被破坏。说明了外源基因插入位置是b，不是a;
第③组：细胞不能在含氨共青霉素培养基上生长，能在含四环素培养基上的生长，说明抗氨芐青霉素基因被破坏，抗四环素基因没有被破坏，由此可知，外源基因插入的位置是a，而不是b。
综上所述，A正确，BCD错误。
考点04 基因工程的基本工具
典例精讲
【典例02】关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
B．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
D
解析：A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4°C冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；
B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误;
C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；
D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
考点04 基因工程的基本工具
举一反三
【演练01】DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
C
【演练02】 “DNA粗提取与鉴定”实验需要对材料进行选择、处理。为了提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，下列对实验材料的选择和处理，正确的是（ ）
A．以猪成熟红细胞为实验材料时，可在滤液中加入适量的木瓜蛋白酶
B．以菜花为实验材料时，在研磨过程中可加入适量的纤维素酶
C．以植物叶片为实验材料时，一般使用体积分数为50%的预冷酒精提取DNA
D．以香蕉为实验材料时，将研磨液在4℃的冰箱中放置几分钟后，取沉淀物进行离心
B
基因工程的基本操作程序
考点05
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
一、目的基因的筛选与获取
（一）目的基因：
主要指的是编码蛋白质的基因
概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
实例：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
（二）筛选合适目的基因：
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
（三）利用PCR获取和扩增目的基因：
DNA半保留复制
原理
体外
操作环境
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
目的
可在短时间内大量扩增目的基因
优点
聚合酶链式反应
全称
它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
一、目的基因的筛选与获取
PCR技术与DNA复制过程比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成 考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
二、基因表达载体的构建
（一）目的：
①让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代;
（二）组成：
②使目的基因能够表达和发挥作用。
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来
④复制原点
⑤目的基因
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入
，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子
之间的部位
（三）构建过程：
①用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；
②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
③利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
二、基因表达载体的构建
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
三、将目的基因导入受体细胞
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
适用生物：开花植物
（2）农杆菌转化法
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。
1.将目的基因导入植物细胞
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
3.将目的基因导入微生物细胞
Ca2+处理法
Ca2+处理目的
可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
受体细胞
（1）原核细胞（常选择大肠杆菌）
（2）优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
四、目的基因的检测与鉴定
目的：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——“抗原—抗体杂交技术”
2.个体生物学水平鉴定
1.分子水平检测
抗性检测：
功能活性比较：
PCR技术或分子杂交技术
抗虫、抗病接种实验；
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
——检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
一、实验原理
（一）DNA体外扩增的原理：
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
变性
90 C
延伸
72 C
退火
50 C
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
②在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
（二）DNA片段电泳鉴定原理：
考点05 基因工程的基本操作程序
考点梳理
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
二、实验步骤
（一）DNA片段扩增的具体过程：
移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，反应液集中底部
扩增：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
（二）PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程：
制备凝胶
电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，质量体积比0.8%～1.2%琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽距离来设定电压，一般1～5V/cm。待指示剂迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
①融化：
②倒模:
③凝固:
①加液：
②加样：
③电泳：
考点05 基因工程的基本操作程序
典例精讲
【典例01】 DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
能连接DNA分子双链碱基对之问的氢键
能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
只能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
T4DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，也能连接平未端
C
解析： A、DNA连接酶连接的是磷酸二醋鍵，A错误;
B、DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误;
C、DNA连接酶能连接用不同种限制酶切开的具有相同黏性末端的两条DNA片段，重新形成磷酸二醋键，C错误；
D、T4DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，D正确。
考点05 基因工程的基本操作程序
典例精讲
【典例02】在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针,可应用PCR技术进行扩增,应选择的引物种类是( )
A.引物1与引物2 B.引物3与引物4
C.引物2与引物3 D.引物1与引物4
C
解析：要获得B链，则要获得引物之问的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5’端到3’端，故需选择引1物2与引1物3进行扩增，ABD错误，C正确。
考点05 基因工程的基本操作程序
典例精讲
【典例03】如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法不正确的是（ ）
A．a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物
B．b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵
C．a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶
D．b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
C
解析： A、a→b过程是多聚酶链式反应扩增DNA片段的过程，需要加入两种引l物和4种脱氧核苷酸，A正确；
B、b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵（因其全能性最高），B正确；
C、b→e过程是多聚酶链式反应扩增DNA片段过程，利用DNA复制原理，需使用耐高温的DNA聚合酶，C错误；
D、b→d为转基因植物培育过程，其中⑨过程是将目的基因导入植物细胞，常用方法是农杆菌转化法，D正确。
考点05 基因工程的基本操作程序
典例精讲
【典例04】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
解析： A、PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250~ 500bp， A不符合题意;
B、3号PCR结果包含250~500bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B符合题意;
9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C不符合题意;
D、10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D不符合题意。
考点05 基因工程的基本操作程序
举一反三
【演练01】如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使该基因与该质粒构建重组质粒，切割目的基因和质粒时应该选择哪两种酶( )
A.NdeⅠ和BamHⅠ
B.NdeⅠ和XbaⅠ
C.XbaⅠ和BamHⅠ
D.EcoRⅠ和KpnⅠ
A
【演练02】科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C 导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，所用的 Ti 质粒如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．该技术的原理是农杆菌的拟核DNA 与番木瓜基因发生重组
B．构建基因表达载体需要限制酶和耐高温的 DNA 聚合酶
C．可利用 PCR 技术筛选出含有抗病毒蛋白基因C 的受体细胞
D．可利用卡那霉素抗性基因检测是否成功构建抗病毒番木瓜
C
考点05 基因工程的基本操作程序
举一反三
【演练03】如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是( )
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ 是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
B
【演练04】如图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点，下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是（ ）
A.若通过PCR技术提取该目的基因应 该选用引物甲和引物丙
B.图1中的质粒用BclⅠ切割后，含有 2个游离的磷酸基团
C.构建基因表达载体时为了防止目的 基因和质粒的自身环化，可以选用BamHⅠ和HindⅢ剪切
D.在导入目的基因的受体细胞中，四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因不能同时表达
C
基因工程的应用
考点06
考点06 基因工程的应用
考点梳理
一、基因工程在农牧业方面的应用
考点06 基因工程的应用
考点梳理
二、基因工程在医药卫生领域的应用
考点06 基因工程的应用
考点梳理
三、基因工程在食品工业方面的应用
考点06 基因工程的应用
典例精讲
【典例01】科学研究发现的新技术，要变成实际应用，需要很多的实验才能应用到实际中。早在2006年，两个研究小组几乎同时发现，将四个特定基因导入处于高度分化的体细胞(如成纤维细胞等)中，可诱导其形成具有胚胎干细胞样分化潜能的诱导性多能干细胞。虽然至今这项技术还在深入研究，但这项先进技术的潜在应用前景是（ ）
A．突破干细胞定向分化的障碍 B．改造和优化人类基因组结构
C．克隆具有优良品质的动物个体 D．解决异体组织/器官排斥难题
D
解析： A、该项技术突破了分化的不可逆性的障碍，使得高度分化的细胞重新具备分裂能力，A错误;
B、该项技术只是将四个特定基因导入处于分化终端的体细胞(如成纤维细胞等)中，并没有改造和优化人类基因组结构，B错误；
C、这项技术属于转基因技术，不属于克隆技术，C错误;
D、可以用病人的体细胞进行此项技术处理，诱导其形成具有胚胎千细胞样分化潜能的诱导性多能千细胞，进而分裂和分化，形成组织、器官，解决异体组织、器官排斥难题，D正确。
考点06 基因工程的应用
举一反三
【演练01】如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“基因工程菌”的示意图，其中引物1-4在含有目的基因的DNA上的结合位置如甲图所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如乙图所示。以下说法错误的是（ ）
A．PCR第一轮循环的产物可作为第二轮反应的模板
B．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒
D．对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境
B
蛋白质工程
考点07
考点07 蛋白质工程
考点梳理
目标
实质
结果
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
通过改造或合成基因，来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质。
生产出自然界没有的蛋白质。
设计思路
①预期的蛋白质功能
②设计预期的蛋白质结构
③推测应有的氨基酸序列
④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因
⑤获得所需蛋白质
预期功能
生物功能
设计
推测
改造或合成
行使
折叠
目的基因
转录
mRNA
翻译
多肽链
蛋白质
(三维结构)
思
路
逆中心法则，与天然蛋白质合成的过程相反
考点07 蛋白质工程
考点梳理
项目 蛋白质工程 基因工程
操作对象
操作起点
操作水平
操作流程
结果
实质
联系 基因
基因
DNA分子水平
DNA分子水平
预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质
目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；
②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。
预期蛋白质功能
目的基因
考点06 基因工程的应用
典例精讲
【典例01】近年来，人工智能(AI)算法在蛋白质工程领域的应用已经被开发，下列关于AI算法在蛋白质工程领域应用的设想中，实现难度最大的是（ ）
A．根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构
B．根据蛋白质的空间结构推测其氨基酸序列
C．按照设定的氨基酸序列推测mRNA的碱基序列
D．按照设定的mRNA的碱基序列设计新基因
A
解析：蛋白质工程的过程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能一，设计预期的蛋白质结构一推测应有氨基酸序列一找到对应的脱氧核苷酸序列(基因）；最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。
根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能一设计预期的蛋白质结构一推测应有氨基酸序列一找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。其中根据人类对蛋白质的功能需求设计蛋白质的高级结构是最难实现的。A正确，BCD错误。
考点06 基因工程的应用
举一反三
【演练01】已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因
C．蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D．细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的
B
谢谢您的观看
THANKS
学霸培优
举一反三
典例精讲
考点梳理
思维导图专题01 发酵工程与基因工程
【题型1 传统发酵技术的应用】
【题型2 微生物的培养与应用】
【题型3 酶的研究与应用】
【题型4 基因工程的基本工具】
【题型5基因工程的基本操作程序】
【题型6 基因工程的应用】
【题型7 蛋白质工程】
【题型8 发酵工程综合】
【题型9 基因工程综合】
01传统发酵技术的应用
【例1】下列关于微生物培养和利用的叙述，正确的是（ ）
A．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利
B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、操作者双手等进行严格的灭菌处理
C．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落
D．腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先减少后增加
【答案】C
【分析】微生物的分离：①利用该分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使该微生物大量增殖。这些物质主要是一些特殊的碳源、氮源，如纤维素可用来富集纤维素分解微生物，尿素可用来富集尿素分解微生物。
②利用该分离对象对某种抑制物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物质，经培养后，由于原来占优势的它种微生物的生长受到抑制，而分离对象却可趁机大量增殖，使之在数量上占优势。如筛选酵母菌和霉菌，在培养基中加入青霉素，因青霉素可抑制细菌和放线菌的细胞壁的合成，从而抑制两类微生物的生长，而酵母菌和霉菌正常生长增殖。
【详解】A、培养基中的营养物质浓度越高，外界溶液渗透压越高，菌种失水过多影响其活性，故培养基中的营养物质浓度越高，并非对微生物的生长越有利，A错误；
B、操作者的双手只能使用消毒的方法，不能使用灭菌，B错误；
C、接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落，因此，每次划线从上一次划线的末端开始，C正确；
D、大白菜腌制泡菜的过程中会产生亚硝酸盐，发酵后期亚硝酸盐被分解，因此亚硝酸盐含量变化是先增加后减少，D错误。
故选C。
【变式1-1】南通某兴趣小组按下图流程制作苹果醋。相关叙述正确的是（ ）
A．菌种甲、乙都具有线粒体，都能进行有氧呼吸
B．加糖的目的是直接为菌种甲、乙提供碳源和能源
C．菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降、温度上升
D．发酵结束后取苹果醋加酸性重铬酸钾检测发酵效果
【答案】C
【分析】由题意可知，菌种甲是酵母菌，菌种乙是醋酸菌。
【详解】A、菌种乙是醋酸菌，醋酸菌为好氧细菌，为原核生物，没有线粒体，A错误；
B、加糖不能直接为菌种乙醋酸菌提供碳源和能源，糖应先经过菌种甲生成苹果酒，菌种乙再以苹果酒为碳源和能源，B错误；
C、菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降，果酒发酵产生二氧化碳，溶于水，果醋发酵产生醋酸，两种菌代谢过程会释放热能，使温度上升，C正确；
D、酸性重铬酸钾是检测酒精的，D错误。
故选C。
【变式1-2】酿造陈醋的主要原料是高粱、麸皮、谷糠等，还需要加入一些酿造用水，酿造流程如图所示。大曲是一种由糯米、小麦、大麦等多种谷物加工而成的发酵剂，其中富含发酵酵母和细菌。糖化主要是利用大曲中微生物产生的淀粉酶将原料中的淀粉分解成单糖。下列叙述正确的是（ ）
A．为了提高发酵效率，应在原料蒸熟后立即加入大曲
B．省略糖化的步骤，对陈醋的酿造不会产生影响
C．酒精发酵和醋酸发酵所需温度不同，但都会使发酵液的pH降低
D．各种微生物都适合在陈醋中生长，因此需通过杀菌来延长保质期
【答案】C
【分析】参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】A、原料蒸熟后，应冷却至室温后再加入大曲，以免因温度太高使大曲中的酵母等失效，A错误；
B、酵母菌可利用单糖进行发酵，糖化主要是利用大曲中微生物产生的淀粉酶将原料中的淀粉分解成单糖，省略糖化的步骤，原料中的淀粉不能充分水解为单糖，会影响陈醋的酿造，B错误；
C、醋酸发酵比酒精发酵所需的温度高，醋酸发酵会产生醋酸，使发酵液的pH降低，酒精发酵会产生CO2，也会使发酵液的pH降低，C正确；
D、陈醋中的环境偏酸性，大部分微生物都不能在其中生长，但仍有少部分微生物能生长，因此需通过杀菌来延长保质期，D错误。
故选C。
【变式1-3】某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。下列选项不正确的是（ ）
A．菌T可能产生分解纤维素的酶，能够高效催化纤维素分解
B．淋洗液中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是合成一些氨基酸、核苷酸等含氮物质
C．可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，在使用该方法时需要注意必须将冷空气充分排除再开始加压
D．将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。发酵过程中，要始终保持密封状态
【答案】D
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
【详解】A、菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，A正确；
B、培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂），B正确；
C、高压蒸汽灭菌法的注意要把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求的高度，结果导致灭菌的失败，C正确；
D、果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳，D错误。
故选D。
02 微生物的培养与应用
【例2】采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。下列叙述错误的是（ ）
A．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
B．平板划线法用到的接种环和稀释涂布平板法用到的涂布器均要灭菌处理
C．平板划线法操作过程中每次划线前都需要蘸取菌液
D．稀释涂布平板法统计得到的菌落数往往比活菌的实际数目要少
【答案】C
【分析】1、平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 ，这就是菌落。
2、稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
【详解】A、由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A正确；
B、平板划线法用到的接种环和稀释涂布平板法用到的涂布器均要灭菌处理，防止杂菌污染，B正确；
C、平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，每次划线前不需要蘸取菌液，应灼烧灭菌，操作期间灼烧接种环的目的是保证划线时菌种来自上一次划线的末端，C错误；
D、当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以稀释涂布平板法统计得到的菌落数往往比活菌的实际数目要少，D正确。
故选C。
【变式2-1】下表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是（ ）
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4 7H2O FeSO4 （CH2O） H2O 青霉素 （可杀死细菌）
含量 3g 1g 0.5g 0.5g 0.01g 30g 1L 0.1万单位
A．依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．若用该培养基培养筛选能分解纤维素的细菌，则应除去（CH2O），再添加纤维素作为唯一碳源
D．培养基中的唯一碳源是（CH2O），唯一氮源是NaNO3
【答案】C
【分析】微生物的营养物质主要包括碳源、氮源、水和无机盐等，有些微生物还需要特殊的营养物质，如维生素、生长因子等；培养基中含有琼脂的一般为固体培养基；选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，而其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
【详解】A、该培养基配方中没有凝固剂琼脂，依物理性质划分，该培养基属于液体培养基，A正确；
B、由培养基的原料可知，（CH2O）属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，酵母菌是异养型微生物，B正确；
C、细菌对青霉素敏感，含青霉素的培养基不能培养细菌，因此用该培养基培养纤维素分解菌，则应除去（CH2O）和青霉素，再添加纤维素，C错误；
D、碳源是指能为微生物提供碳元素的物质，氮源是指能为微生物提供氮元素的物质，培养基中的唯一碳源是（CH2O），唯一氮源是NaNO3，D正确。
故选C。
【变式2-2】自然界中微生物种类庞杂，要对其中的某种微生物进行研究，就必须获得具纯净培养物。下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是（ ）
A．培养基中加入牛肉膏和蛋白胨可以同时为微生物提供碳源和氮源
B．以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离得到能分解尿素的细菌
C．可以采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌
D．在培养霉菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性
【答案】D
【分析】牛肉膏、蛋白胨以为微生物提供碳源、氮源、磷酸盐和维生素等营养物质，其中牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。不同的微生物适宜的PH值不同，菌生长繁殖所需要的pH是中性或弱碱性，霉菌适宜的pH是酸性。
【详解】A、牛肉膏和蛋白胨的主要成分是蛋白质，含有碳、氮元素，可以为微生物同时提供碳源和氮源，A正确；
B、以尿素作为唯一氮源的培养基为选择培养基，只有能分解尿素的细菌才能在该培养基上生长繁殖，B正确；
C、灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子），可以采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，C正确；
D、培养霉菌时要将培养基的pH调至酸性，霉菌在碱性环境下不易繁殖，甚至会导致霉菌死亡，D错误。
故选D。
【变式2-3】某科研小组用如图所示方法统计1g土壤中淀粉分解菌的数量。下列叙述正确的是（ ）
A．该种方法的计数结果通常比显微镜直接计数法的结果小
B．平板中应以淀粉为唯一碳源，应选择稀释106倍的平板计数
C．应将涂布好的平板立即倒置放入30～37℃恒温箱中培养
D．经计算可知1g土壤中有5×107个淀粉分解菌
【答案】A
【分析】微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、题图中使用的方法为稀释涂布平板法，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此用稀释涂布平板法计数时，结果通常比实际值偏小，用显微镜直接计数法计数时，不能区分细胞死活，活菌和死菌都会被计数，因此结果通常比实际值偏大，A正确；
B、为了统计1g土壤中淀粉分解菌的数量，平板中应以淀粉为唯一碳源，为了保证结果准确，一般选择菌落数是30～300的平板计数，因此应选择稀释105倍的平板计数，B错误；
C、待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃恒温箱中培养，C错误；
D、应选择稀释105倍的平板计数，1g土壤中淀粉分解菌的数量为（59+68+62）÷3÷0.1×105=6.3×107个，D错误。
故选A。
03 酶的研究与应用
【例3】加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。某同学通过实验比较了几种洗衣粉的去渍效果（“+”越多表示去渍效果越好），实验结果见下表。
加酶洗衣粉A 加酶洗衣粉B 加酶洗衣粉C 无酶洗衣粉（对照）
血渍 +++ + +++ +
油渍 + +++ +++ +
下列叙述错误的是（ ）
A．通常用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水
B．加酶洗衣粉A、B中添加的酶分别是蛋白酶、脂肪酶
C．表中加酶洗衣粉B和加酶洗衣粉C不宜用于洗涤蚕丝织物
D．相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好
【答案】C
【分析】碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
【详解】A、新鲜血迹含有蛋白质，开水使血中的蛋白质变性而沉淀，难以清洗，因此通常用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水，A正确；
B、由于“+”越多表示去渍效果越好，因此据表可知，加酶洗衣粉A对血渍的洗涤效果更好，加酶洗衣粉B对油渍的洗涤效果更好，故加酶洗衣粉A、B中添加的酶分别是蛋白酶、脂肪酶，B正确；
C、蚕丝织物主要成分是蛋白质，加酶洗衣粉B对油渍的洗涤效果更好，对血渍的洗涤效果差，说明不含蛋白酶，可用于洗涤蚕丝织物，C错误；
D、“+”越多表示去渍效果越好，据表可知，相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好，主要是因为加酶洗衣粉中的酶可以将污渍中的大分子物质分解为小分子物质，使污渍易从衣物上脱落，D正确。
故选C。
【变式3-1】酶制剂在人们的生活实践中有着广泛的应用，下列对酶的应用的叙述，正确的是（ ）
A．加酶洗衣粉中的酶在结构上比较稳定，一般直接来自生物体
B．运用果胶酶可提高果汁的产量，并使果汁变得清亮
C．由于消化酶是蛋白质，故服用多酶片辅助消化食物时，效果并不理想
D．胃蛋白酶随食糜进入小肠后可继续发挥作用
【答案】B
【分析】酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA；酶的特性：专一性、高效性、作用条件温和；酶促反应的原理：酶能降低化学反应所需的活化能。
【详解】A、加酶洗衣粉中的酶不是直接来自生物体，而是经过酶工程改造，稳定性强，A错误；
B、果胶酶能分解果肉细胞壁中的果胶，使果汁变得澄清，提高果汁产量，B正确；
C、多酶片含有多种消化酶，口服进入消化道，可治疗消化不良，C错误；
D、胃蛋白酶适宜pH为1.5左右，小肠内环境为碱性，故其进入小肠后会失活，无法发挥作用，D错误。
故选B。
【变式3-2】纺织厂常用枯草芽孢杆菌生产的α-淀粉酶除去织物中的淀粉。为探究α-淀粉酶的最适温度，某科研小组在适宜条件下进行了实验，棉花初始质量为5g，每组在各自温度下保温20min后测量棉花减重，结果如下表所示。下列相关叙述错误的是（ ）
组别 1 2 3 4 5 6
棉花减重/g 0 0.12 0.16 0.22 0.23 0.15
温度/℃ 25 35 45 55 65 75
A．该实验应保证每组的α-淀粉酶浓度、体积及棉花的初始质量相同且适宜
B．每组应先将α-淀粉酶与棉花混合，再在相应温度条件下保温处理
C．图中实验结果表明α-淀粉酶的最适温度范围为55℃-75℃，具体温度还需要进一步探究
D．0℃左右时，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，因此酶制剂适宜在低温下保存
【答案】B
【分析】1、酶是由活细胞产生的具有催化活性的有机物，其中大部分是蛋白质、少量是RNA；
2、酶的特性：
①高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107～1013倍；
②专一性：每一种酶只能催化一种或者一类化学反应；
③酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低。
【详解】A、分析题意，本实验的目的为探究α-淀粉酶的最适温度，故本实验中自变量为温度，该实验中加入的α-淀粉酶的浓度、体积及棉花的初始质量等属于无关变量，应保证相同且适宜，A正确；
B、每组应先将α-淀粉酶和棉花分别预热到设置温度，再进行混合，B错误；
C、在本实验中，温度为65℃的实验组棉花减重量最大，说明其分解淀粉的效果最好，故α-淀粉酶的最适温度范围为55℃～75℃，C正确；
D、0℃左右时，酶的活性很低，是因为低温抑制了酶的活性，但未破坏酶的空间结构，因此酶制剂适宜在低温下保存，D正确。
故选B。
【变式3-3】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，在细胞代谢中起着重要作用，在食品生产中，酶的应用非常广泛，下列说法错误的是（ ）
A．溶菌酶能够溶解细菌的细胞壁，具有抗菌消炎作用
B．酶都需在核糖体中才能合成，且只能在胞内起作用
C．果胶酶能分解果胶，提高果汁产量和澄清度
D．工业化生产啤酒时，ɑ－淀粉酶可以增强糖化作用
【答案】B
【分析】酶促反应的原理：酶能降低化学反应的活化能。酶具有专一性、高效性和作用条件温和的特性。
【详解】A、溶菌酶能够溶解细菌的细胞壁，具有抗菌消炎的作用，A正确；
B、绝大多数酶是蛋白质，需在核糖体中才能合成，少数是RNA，其合成场所不是核糖体；酶发挥作用的场所可以是细胞内，细胞外甚至是体外均可，B错误；
C、果胶酶可将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。因此生产果汁时，加入果胶酶可以提高果汁产量，还能提高果汁的澄清度，C正确；
D、工业化生产啤酒时，ɑ－淀粉酶可以增强糖化作用，D正确。
故选B。
04 基因工程的基本工具】
【例4】研究人员将玉米的光敏色素基因A（256bp）导入到棉花体内，对获得的1~4号转基因棉花进行基因A的检测，电泳结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．转基因技术用到的工具有限制酶、DNA连接酶和载体
B．可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊
C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的不同的两次升温和一次降温
D．由电泳结果可知，1、3和4号棉花均导入基因A且培育成功
【答案】D
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、转基因技术需借助基因工程才能实现，因此操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶和载体，A正确；
B、棉花是植物，所以可以可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊，B正确；
C、PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温（第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸）和一次降温（使目的基因复性），C正确；
D、光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、3、4号均导入光敏色素基因A成功，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。
故选D。
【变式4-1】基因工程需要三种工具——限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是（ ）
A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合”
B．常用载体质粒的基本单位是脱氧核糖核酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
C．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D．限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核酸序列的能力
【答案】C
【分析】关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（3）结果：形成黏性末端或平末端。
【详解】A、不同限制酶切割后产生的DNA片段可被DNA连接酶连接，A正确；
B、在三种工具中最常用载体——质粒的化学本质是DNA，其基本单位是脱氧核糖核苷酸；另外两种工具酶的化学本质是蛋白质，其基本单位是氨基酸，B正确；
C、限制酶切割产生的DNA末端有黏性末端和平末端，其中T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，具有特异性（专一性），C错误；
D、限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核普酸序列的能力，即具有专一性，D正确。
故选C。
【变式4-2】下列关于载体的叙述中，错误的是（ ）
A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等
B．质粒DNA上要至少有一个限制酶切割位点
C．质粒是一种裸露的、结构简单、能自我复制的单链DNA分子
D．质粒上要有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
【答案】C
【分析】运载体：
（1）常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。）
（2）作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。
（3）天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
【详解】A、基因工程常用的运载体包括质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，A正确；
B、质粒DNA上具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接，B正确；
C、质粒是一种裸露的、结构简单、能自我复制的双链DNA分子，C错误；
D、作为载体的质粒存在特殊的标记基因，以便对重组DNA分子的筛选，D正确。
故选C。
【变式4-3】下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．DNA和蛋白质都不溶于酒精
B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液
C．提取DNA时，加入的酒精溶液应预冷
D．可用二苯胺试剂鉴定DNA
【答案】A
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，因此可初步分离DNA与蛋白质，A错误；
B、DNA可以溶于2mol/L的NaCl溶液，B正确；
C、由于DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，故在DNA粗提取与鉴定的实验中， 95%的冷酒精可提取出含杂质较少的DNA分子，C正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D正确。
故选A。
05 基因工程的基本操作程序
【例5】常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段
B．可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端
C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．PCR仪设置温度时，一个循环依次是高温变性、中温复性、低温延伸
【答案】D
【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制酶，环化时用DNA连接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。
【详解】A、每一次酶切都需要断开DNA分子的两条链，破坏两个磷酸二酯键，则对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段，A正确；
B、如图可知，酶切后的片段能够首尾相连，则可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端，B正确；
C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；
D、PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温复性（使DNA单链与引物结合）、中温延伸，D错误。
故选D。
【变式5-1】某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因AA2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A3的基因频率是（ ）
A．52% B．27% C．32% D．2%
【答案】B
【分析】基因频率是指在一个种群基因库中，某个基因占全部等位基因数的比率。群体中某一特定基因的频率可以从基因型频率来推算。
【详解】据图可知，该动物种群中基因型为A3A3的有2个，A2A2的有8个，A1A1的有9个，A1A3的有15个，A1A2的有31个，A2A3的有35个，A3的基因数为2×2+15+35=54，则种群中A3的基因频率为54÷200×100%=27%，B正确、ACD错误。
故选B。
【变式5-2】当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（ ）
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植株作对照
【答案】B
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物生成黄色所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；
B、步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；
C、步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；
D、为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含 目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。
故选B。
【变式5-3】为了获得未知序列的碱基序列，可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增，再对其扩增产物进行测序，其过程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B．以环化的DNA为模板进行PCR时，应选择引物2和引物3
C．第三轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占的比例为
D．常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，产物的相对分子质量比环化DNA小
【答案】A
【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，如采用基因工程技术将抗病基因导入玉米细胞，获得抗病玉米植株。
【详解】A、将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株，该过程需要采用基因工程技术和植物组织培养技术，A正确；
B、抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦，该过程采用的是杂交育种的方法，没有应用基因工程技术，B错误；
C、水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种，该过程采用的是单倍体育种的方法，没有应用基因工程技术，C错误；
D、用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆，该过程采用的是诱变育种的方法，没有应用基因工程技术，D错误。
故选A。
06 基因工程的应用
【例6】下列实践活动包含基因工程技术的是（ ）
A．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．水稻F1花药经培养和染色体数目加倍，获得基因型纯合新品种
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【答案】B
【分析】图中涉及已知序列的切割（用到限制酶），DNA的环化（用到DNA连接酶），PCR（用到耐高温聚合酶）。PCR的原理是DNA的半保留复制。
【详解】A、图示的酶切过程需要用到限制酶，环化的过程需要用到DNA连接酶，PCR的过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，A正确；
B、需添加方向相对的引物1和4以便DNA聚合酶从引物的3'端延伸子链，从而获得未知序列的PCR产物，B错误；
C、DNA复制为半保留复制，第三轮循环即DNA复制3次，共形成2 =8个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子只含有引物1或引物4，其余6个DNA分子均含有引物1和引物4，所以第三轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占的比例为2/8＝1/4，C正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，该过程使用引物1和4对未知序列进行扩增，因此PCR产物的相对分子质量比环化DNA小，D正确。
故选B。
【变式6-1】据悉多基因编辑猪皮移植手术已获成功，下列叙述错误的是（ ）
A．为防止免疫排斥反应，应该把患者的抗体基因进行删除
B．皮肤在人体的免疫中发挥重要作用，它属于人体免疫的第一道防线
C．器官移植中的免疫排斥反应既有细胞免疫也有体液免疫
D．更多的人加入到自愿捐献器官行列中，有助于缓解供体器官的短缺
【答案】A
【分析】免疫排斥是机体对移植物（异体细胞、组织或器官）通过特异性免疫应答使其破坏的过程。一般是指移植术后，受者可识别移植物抗原并产生应答，移植物中免疫细胞也可识别受者抗原组织并产生应答。
【详解】A、为防止免疫排斥反应，应该把猪器官上的抗原基因敲除，A错误；
B、皮肤在人体的免疫中发挥重要作用，属于物理屏障，它属于人体免疫的第一道防线，B正确；
C、器官移植中的免疫排斥反应既有细胞免疫也有体液免疫，其主要是细胞免疫，C正确；
D、器官移植是将异体器官转移到受体中，更多的人加入到自愿捐献器官行列中，有助于缓解供体器官的短缺，D正确。
故选A。
【变式6-2】下列关于基因工程及其应用的叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的任意位置
B．用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断转基因抗虫棉培育是否成功
C．建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到乳腺细胞中
D．通过基因工程获得工程菌，可用于生产人源胰岛素
【答案】D
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。动物基因工程的应用：用于提高动物的生长速度、用于改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物等。
【详解】A、农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的特定位置，A错误；
B、用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断目的基因是否转入受体细胞，B错误；
C、建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到受精卵中，C错误；
D、将人类的胰岛素基因转入微生物细胞中，获得工程菌，可用于生产人源胰岛素，D正确。
故选D。
【变式6-3】人乳铁蛋白（hLF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白（hLF）基因转入到山羊体内，从山羊的乳液中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是（ ）
A．可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
【答案】A
【分析】要利用基因工程将人乳铁蛋白基因导入牛的受精卵中，从牛分泌的乳汁中提取乳铁蛋白，则将人的乳铁蛋白基因导入牛的受精卵之前，需先构建基因表达载体，这一过程需要的工具有限制（或限制性核酸内切）酶、DNA连接酶和运载体；基因表达载体上的位于基因首端的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，是目的基因在受体细胞内进行转录的起点。
【详解】A、不可以直接用PCR扩增mRNA，需将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，A错误；
B、为保证在供体山羊的乳汁中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；
C、一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C正确；
D、为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因已翻译形成蛋白质，D正确。
故选A。
07 蛋白质工程
【例7】T4溶菌酶（A0）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．热稳定性高的T4溶菌酶（A1）是一种直接制造出的新蛋白质，需要进行功能的鉴定
【答案】B
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求；（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
2、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径。
【详解】A、蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，A错误；
B、分析题意可知，和A0相比，A1不仅仅是氨基酸的序列不同，同时还增加了一个二硫键，导致空间结构也有差异，是二者热稳定性不同的直接原因，B正确；
C、检测A1活性时应先将A1与底物分别置于高温环境，保温一段时间再混合，C错误；
D、耐热的T4溶菌酶（A1）是通过改造相应的基因而后借助基因工程的受体生产出的新蛋白质，需要进行功能的鉴定，D错误。
故选B。
【变式7-1】蛋白质工程取得的进展向人们展示出了诱人的前景，下列关于蛋白质工程应用的叙述，错误的是（ ）
A．经蛋白质工程改造后的抗体可以降低诱发免疫反应的强度
B．通过蛋白质工程改造的胰岛素类似物能抑制胰岛素的聚合
C．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素不属于蛋白质工程
D．通过蛋白质工程制造出了一种能降解石油的“超级细菌”
【答案】D
【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。
【详解】A、经蛋白质工程改造后的抗体可以降低诱发免疫反应的强度，A正确；
B、通过蛋白质工程改造的胰岛素类似物能抑制胰岛素的聚合，可以在临床上广泛应用，B正确；
C、科学家将人的生长激素基因插入小鼠基因组内制成膀胱生物反应器，使小鼠膀胱可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。该过程利用了基因工程的技术，即利用膀胱生物反应器生产人的生长激素，属于基因工程的应用，C正确；
D、制造出了一种能降解石油的“超级细菌”是转基因工程的产物，D错误。
故选D。
【变式7-2】研究发现，天然胰岛素制剂进入血液循环后容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后需要经历一个解离为单体的过程，这延缓了疗效。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，有效抑制了胰岛素的聚合，提高了胰岛素的作用效果。下列有关叙述错误的是（ ）
A．蛋白质工程的实质是在DNA分子水平上进行设计和改造
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否聚合的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质工程难度很大，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构
【答案】C
【分析】蛋白质工程的基本流程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。
【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终要利用基因工程上来解决蛋白质的合成，因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质，A正确；
B、氨基酸序列差异，导致胰岛素的空间结构有所改变，即氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否聚合的原因之一，B正确；
C、胰岛素属于蛋白质，改造胰岛素应首先从设计预期的蛋白质结构出发，进而根据氨基酸序列推测出基因中的脱氧核苷酸序列对原有的基因进行修饰和改造，C错误；
D、多数蛋白质除具有一级结构（即氨基酸顺序）外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的，因此实施蛋白质工程的难度很大，D正确。
故选C。
【变式7-3】干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。现采用以下方法对干扰素进行改造。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．预期新的干扰素的功能以干扰素基因的结构和功能的关系为基础
B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换
C．新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达
D．以上过程属于蛋白质工程，实质是改造干扰素基因的结构
【答案】A
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求，它是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。
【详解】A、蛋白质工程的目的是根据人们对蛋白质的功能需求改造或制造蛋白质，理论基础是蛋白质的结构与功能相适应，A错误；
B、比较半胱氨酸和丝氨酸的密码子，若第二个碱基由G替换为C，就可引起氨基酸的替换，所以基因上发生定点突变（C→G），可实现基因的改造，B正确；
C、基因的表达需要启动子和终止子，新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达，C正确；
D、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能违传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结 构，D正确。
故选A。
08 发酵工程综合
【例8】苹果醋富含果胶、维生素以及多种矿物质等营养成分，具有开胃护肝、排毒养颜、减肥降脂等多种功效，是近年来的流行饮品。图甲和图乙分别表示苹果醋的基本制作流程和简易制作装置，请分析回答
(1)酵母菌是制作苹果酒的重要发酵菌种，从代谢类型看，酵母菌属于 生物；酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖进行酒精发酵的反应式是 。酵母菌与醋酸菌细胞结构的主要区别是 。
(2)先用图乙所示装置制作苹果酒，加入鲜苹果汁总量不要超过发酵瓶体积的 。在果酒发酵过程中，气阀a、b应保持的状态分别是 、 。（填“定期开放”或“关闭”）
(3)继续用图乙所示装置制作苹果醋，除打开气阀a、b以外，还需要从气阀 处不断通入无菌空气，并将发酵温度适当 （填“升高”或“降低”）。
(4)图丙表示果酒发酵过程中，发酵液的糖度和酒精度随时间变化的关系曲线图。发酵的前24小时酒精度较低，原因是此阶段酵母菌主要进行 呼吸，大量繁殖；96小时后酒精度基本维持稳定的原因有 消耗殆尽，高浓度酒精和代谢废物会 酵母菌的代谢而影响发酵。
【答案】(1)异养兼性厌氧型 有无核膜（包被的细胞核）
(2)2/3 关闭 定期开放
(3)a 升高
(4)有氧 营养物质 抑制
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
2、果醋制作中起到主要作用的微生物是醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，其代谢类型属于异养需氧型。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解为醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。
3、分析题图：图示表示苹果醋的制作流程图，其中①表示果酒发酵，②表示果醋发酵。
【详解】（1）果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是异养兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖进行酒精发酵的反应式是C6H12O62C2H5OH +能量。酵母菌为真核生物，醋酸菌为原核生物，酵母菌与醋酸菌细胞结构的主要区别是有无核膜包被的细胞核。
（2）先用图乙所示装置制作苹果酒，加入鲜苹果汁总量不要超过发酵瓶体积的2/3，在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，发酵过程中会产生二氧化碳，因此在果酒发酵的生产过程中，应给发酵罐保持无氧环境、同时定时排出酵母菌产生的二氧化碳，以平衡瓶内气压，即气阀a关闭，气阀b定期开放。
（3）制作果醋利用的是醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，其最适生长温度为30~35℃，若继续用图乙所示装置制作苹果醋，则需要改变的条件是①打开气阀a，不断通入无菌空气（氧气）；②将温度升高到30~35℃。
（4）依据图丙可知，随着发酵的进行，发酵液的糖度逐渐降低，酒精度逐渐升高然后保持相对稳定。发酵前24h，酵母菌主要进行有氧呼吸，大量增殖，消耗葡萄糖较少，因此糖度变化很小，酒精度上升很慢。随着发酵的进行，酵母菌进行无氧呼吸消耗葡萄糖产生酒精，96h后，营养物质消耗殆尽，高浓度的酒精和代谢废物会抑制酵母菌的代谢而影响发酵，导致酒精度和糖度的变化都趋于平缓。
【变式8-1】某生态研究小组为了从纤维素分解菌中获取纤维素酶，以便将农作物秸秆作为酿酒工业的原料，设计了如下操作流程分离提取较纯的纤维素分解菌。请分析回答问题：
①土壤取样→②选择培养→③梯度稀释→④将样品接种到鉴别（加入刚果红）纤维素分解菌的培养基上→⑤挑选菌落
(1)纤维素分解菌选择培养的培养基该如何设计 。
(2)在培养基中还要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 。
(3)图甲所示接种方法常用的接种工具是接种环，对其通常用 法灭菌。
(4)若选择培养后预估锥形瓶中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在鉴别平板上涂布0.1ml稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落不超过200个，则至少应将锥形瓶中的菌液稀释 倍。在鉴别培养基中含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用是： （写两点）。
(5)图乙中出现的无透明带的菌落，其代谢类型（同化作用类型）最可能是 。
(6)流程图中步骤⑤的操作中，应挑选产生了 的菌落。
【答案】(1)以纤维素作为唯一的碳源
(2)参与蛋白质、核酸和磷脂等化合物的合成
(3)灼烧灭菌
(4)104 为细菌生长提供无机盐、维持培养基pH的相对稳定
(5)自养型
(6)透明圈
【分析】分解纤维素的微生物分离的实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解菌，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。②在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
【详解】（1）纤维素分解菌能够产生纤维素酶，从而利用纤维素，为了分离出纤维素分解菌，应以纤维素作为唯一的碳源，这样纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长，从而达到分离的目的。
（2）氮源的主要作用是参与蛋白质、核酸和磷脂等化合物的合成。
（3）接种环常用灼烧灭菌法灭菌。
（4）要保证每个平板上长出的菌落数不超过200，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布0.1mL稀释后的菌液，则根据计算公式（C÷V）×M可知，至少应将锥形瓶中的菌液稀释2×107÷200×10=104倍，即至少应将锥形瓶中的菌液稀释104倍。KH2PO4和Na2HPO4是两种无机盐，其可作为缓冲物质，因此在鉴别培养基中含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有：为细菌生长提供无机盐、保持细菌生长过程中pH的稳定等。
（5）该选择培养基是以纤维素为唯一碳源的培养基，只有纤维素分解菌能生存，将该菌接种到加有刚果红的鉴别纤维素分解菌的培养基上会出现透明圈，而图乙中出现了无透明带的菌落，说明它可以利用空气中的二氧化碳合成自身需要的有机物，推测其代谢类型最可能是自养型。
（6）该选择培养基是以纤维素为唯一碳源的培养基，只有纤维素分解菌能生存，将该菌接种到加有刚果红的鉴别纤维素分解菌的培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，故流程图中步骤⑤的操作中，应挑选产生了透明圈的菌落。
【变式8-2】蒽（C14H10）是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题，因此从土壤中分离和筛选出蒽降解菌有非常重要的意义。研究人员进行如下图实验，成功地从环境样品中分离得到蒽降解菌。已知蒽在水中溶解度低，含过量蒽的固体培养基不透明。请分析回答：
(1)蒽降解菌富集培养基含有K2HPO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、FeC3、MnSO4、水等，需再加入 作为唯一碳源，该培养基属于 （填“固体”或“液体”）培养基。
(2)配制培养基时，应在灭菌 （填“前”或“后”）调pH，对配制好的培养基应采用 法进行灭菌处理。
(3)上图所示的分离、纯化、计数蒽降解菌的方法是 ，使用该方法计算得到的细菌数量与待测样品中实际的细菌数量相比往往偏 （填“多”或“少”），其主要原因是一个菌落可以来源于 个细胞。
(4)实验中若在每个平板上涂布0.1mL稀释了105倍后的菌液，且每个平板上长出的菌落数约为150个，则初步估测A中细菌细胞数为 个/mL。
(5)研究人员为了进一步筛选出高降解能力的菌种，对上图得到的菌株再次进行纯化培养，测量不同菌株形成的菌落及透明圈直径，结果见下表：
编号 菌落直径（C，mm） 透明圈直径（H，mm） H/C
菌株I 8.1 13.0 1.6
菌株Ⅱ 5.1 11.2 2.2
菌株Ⅲ 9.5 17.1 1.8
根据表中数据，可推断其中降解蒽能力最高的菌株是 。
【答案】(1)蒽 液体
(2)前 高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌）
(3)稀释涂布平板法 少 2个或多
(4)1.5×108
(5)菌株Ⅱ
【分析】1、培养基的基本组成成分：碳源（提供能源）、氮源（参与代谢）、水（溶剂）、无机盐（保持渗透压、调节pH）。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。该方法能够分离微生物，但是不能计数。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。该方法既可以分离微生物，也可以对微生物进行计数。
【详解】（1）蒽降解菌富集培养基含有K2HPO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、FeC3、MnSO4、水等，因为需要从土壤中分离和筛选出蒽降解菌，所以需再加入蒽作为唯一碳源，该培养基没有加琼脂，属于液体培养基。
（2）配制培养基时，应在灭菌前调pH，防止后续调pH造成污染，对配制好的培养基应采用高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌）法进行灭菌处理。
（3）上图所示最后培养基中为单个菌落，所以分离、纯化、计数蒽降解菌的方法是稀释涂布平板法，使用该方法计算得到的细菌数量与待测样品中实际的细菌数量相比往往偏少其主要原因是一个菌落可以来源于2个或多个细胞。
（4）实验中若在每个平板上涂布0.1mL稀释了105倍后的菌液，且每个平板上长出的菌落数约为150个，则初步估测A中细菌细胞数为C/V×m=150/0.1×105=1.5×108。
（5）根据表中数据，可推断其中降解蒽能力最高的菌株是菌株Ⅱ，因为菌株Ⅱ的透明圈直径比菌落直径的值最高。
【变式8-3】北京传统小吃“豆汁”是一种以绿豆为原料，经过一系列制作工艺流程（如下图）得到的一种以酸味为主、掺杂着些许臭味的糊状流体食品。混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程实际属于乳酸发酵，其主要产酸微生物为乳酸菌。回答下列问题：
(1)混合浆发酵时所需乳酸菌主要来自 。乳酸是由乳酸菌在 氧条件下产生的，其产生量是影响豆汁风味的重要因素之一。乳酸发酵过程中，能为乳酸菌同时提供碳源和能源的物质主要是 。
(2)欲测定混合浆中乳酸菌的含量多少，研究小组可采用的接种方法是 （填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”），该方法测得的结果通常比实际值 （填“更高”、“更低”或“相同”），原因是 。
(3)为了筛选出产酸能力强的乳酸菌菌种，研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体（添加 ）培养基（添加质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，培养基常用的灭菌方法是 法，此外，实验室灭菌方法还有 。在适宜条件下培养一段时间后，应挑取 （“有”或“没有”）透明圈的菌落，进行进一步纯化。
【答案】(1)老浆 无 （绿豆乳中的）糖类
(2)稀释涂布平板法 更低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(3)琼脂 高压蒸汽灭菌/湿热灭菌 干热灭菌/灼烧灭菌 有
【分析】1、微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3、传统发酵食品的制作离不开各种各样的微生物。乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
【详解】（1）根据题干信息：混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，则混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自老浆；乳酸菌为厌氧生物，故乳酸是由乳酸菌在无氧条件下产生的，糖类是细胞生命活动的重要能源物质，乳酸发酵过程中，（绿豆乳中的）糖类能为乳酸菌同时提供碳源和能源的物质。
（2）稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。欲测定混合浆中乳酸菌的含量多少，研究小组可采用的接种方法是稀释涂布平板法。稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目更低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（3）培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌），根据题干信息：碳酸钙遇酸发生反应会出现透明圈，而产酸能力强的乳酸菌，则透明圈越大，故研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体培养基（添加了质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，在适宜条件下培养一段时间后，应挑取有透明圈的菌落，进行进一步纯化。
09 基因工程综合
【例9】结球甘蓝是我国重要的蔬菜品种，危害甘蓝生长的主要是菜青虫等鳞翅目害虫。为使结球甘蓝获得抗虫性状，科研人员将苏云金芽孢杆菌中的BT毒蛋白基因导入结球甘蓝。回答下列问题：
(1)转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入叶绿体。为构建BT 毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因（见图1），需用限制酶 处理相关的DNA片段，再用 连接。
图1
注： El、 E2、 E3、E4为限制酶。
(2)构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的 区。用Ca2+处理农杆菌后，使细胞处于一种 的生理状态，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（注：GUS基因表达产物经染色能由无色变成蓝色）
(3)鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可以用分子水平检测中的 等技术，还可以通过肉眼观察选择 的愈伤组织，以确定目的基因是否 。
(4)为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还需要进行个体生物学水平的签定。请设计实验方案 。
【答案】(1)E1、E3、E4 DNA连接酶
(2)T-DNA 感受态 潮霉素
(3)DNA分子杂交 蓝色 表达
(4)选取长势相似的野生型和转基因结球甘蓝，分别进行抗虫接种实验，一段时间后，统计被害虫啃食的叶面积比例
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）由图1可知：BT毒蛋白基因和转运肽基相邻，介于启动子与终止子之间，为构建BT毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因，需用限制酶E1、E3、E4处理相关的DNA片段，再用DNA连接酶连接。
（2）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区。用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，感受态细胞法是一种利用经过特殊处理的细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，从而吸收周围环境中的DNA分子的方法。将其与基因表达载体混合完成转化后，由于重组质粒中含有潮霉素的抗性基因，故在添加潮霉素的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（3）为鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可利用碱基互补配对的原理，用分子水平的DNA分子杂交技术进行鉴定，也可以通过肉眼观察选择蓝色的愈伤组织，以确定目的基因是否表达。
（4）为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还可以通过选取长势相似的野生型和转基因结球甘蓝，分别进行抗虫接种实验，一段时间后，统计被害虫啃食的叶面积比，进行个体水平的检测。
【变式9-1】毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。
(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。
(2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是 、 。
(3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。
(4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，获得的重组DNA的长度为 。
(5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。
【答案】(1)模板 引物
(2)TACGTA CCTAGG
(3)CaCl2（Ca2+溶液） 使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增
(4)Bg1Ⅱ 136kb
(5)诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量
【分析】据图分析：①为PCR扩增获得目的基因；②为重组DNA分子的构建；③将重组DNA分子导入受体细胞；④利用大肠杆菌扩增重组质粒；⑤酶切获得重组DNA分子。
【详解】（1）过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入模板和引物。
（2）题干信息“5'AOX1为AOX1基因启动子，3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一）”，分析可知HBsAg基因应该插入到5'AOX1和3'AOX1之间。结合质粒分析5'AOX1和3'AOX1之间存在SnaBI和AyrⅡ两种限制酶酶切位点，且HBsAg基因转录方向是由A到B，因此为了保证PCR扩增产物定向插入质粒，应选择在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是TACGTA和CCTAGG。
（3）过程③是将重组质粒导入大肠杆菌，因此需要一定浓度的CaCl2（Ca2+溶液）处理大肠杆菌，增大其细胞膜的通透性，使其成为感受态细胞，有利于重组质粒的导入。据图分析，④大肠杆菌扩增后产生了大量的重组质粒，因此将重组质粒导入大肠杆菌的目的是使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增。
（4）据图中的重组DNA分析（5'AOX1端是黑色标注，3'AOX1为斜线标注），3'AOX1即AOX1基因终止子是位于卡拉霉素抗性基因后，因此过程⑤应选用的限制酶是BglⅡ。结合题干信息和质粒上的酶切位点分析：以顺时针方向统计，BglⅡ和SnaBI之间的长度为27Kb，SnaBI和AyrⅡ之间的长度为23Kb，AyrⅡ和BglⅡ之间的长度为54Kb，BglⅡ和BglⅡ之间的长度为38Kb。已知HBsAg基因长度是55kb，因此获得的重组DNA的长度为27+54+55=136Kb。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量。
【变式9-2】T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。科研人员借助PCR技术对T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐热型的T4溶菌酶，改造后的T4溶菌酶基因如图所示，其中①～④表示引物。回答下列问题：
(1)为了使扩增后的T4溶菌酶基因中含有改造后的序列，要选择的图中的引物组合最好是 。
(2)PCR扩增时需要使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶的作用是 ；同时需要通过控制温度使DNA复制在体外反复进行，图中两种引物能够与两条单链DNA结合的温度是 ℃左右。
(3)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与下图中的质粒A正确连接，设计引物时需要在两种引物的 （填“3'”或“5'”）端连接上限制酶 识别和切割的序列。
(4)将重组质粒A导入大肠杆菌之前一般要先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。初步筛选含有重组质粒A的大肠杆菌的方法是 。
【答案】(1)②③
(2)催化合成DNA子链 50
(3)5' SalⅠ和BamHⅠ
(4)Ca2＋ 将大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，从而初步将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来
【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
【详解】（1）根据T4溶菌酶基因的编码序列可知，替换的碱基在编码序列中，要选择的引物应该把编码序列全部扩增在内，故所用的引物是②③。
（2）PCR扩增时需要使用耐高温的DNA聚合酶，DNA聚合酶能够催化合成DNA子链，两种引物与两条单链DNA的结合发生在复性阶段，复性时的温度是50℃左右。
（3）在对T4溶菌酶基因进行PCR扩增时，须在引物的5'端添加限制酶的切割位点，根据图中结构可知，不能选择EcoRⅠ来切割，以免将氨苄青霉素抗性基因破坏，因此需要选择SalⅠ和BamHⅠ两种限制酶，这两种限制酶的识别序列连接在引物的5′端。
（4）为了使重组DNA能够进入大肠杆菌，一般要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，导入了重组质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素，因此可将大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，从而初步将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来。
【变式9-3】人胰岛素原基因（insulin）在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体，增加了胰岛素的生产成本。以NusA蛋白作为N端标签时可提高融合蛋白的可溶性。若让大肠杆菌表达出带有NusA蛋白标签的人胰岛素原融合蛋白（His—NusA—insulin），再经蛋白酶酶切，即得到可溶性人胰岛素原，为降低胰岛素生产成本提供基础。下图为构建重组质粒pHis—NusA—insulin的基本流程，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。Taq为四环素抗性基因，几种限制酶的酶切位点已在图中标注。人胰岛素原基因中不含这几种限制酶的识别序列，实验所用大肠杆菌对氨苄青霉素和四环素均敏感。回答下列问题：
(1)经过程①，即PCR可大量扩增人胰岛素原基因，该过程中除了需要向反应体系内添加引物1、2和人胰岛素原基因外，还要添加 （答两点）等，图中引物1、2的 （填“3'”或“5'”）端应分别添加 的识别序列。除限制解外，过程②还需要用到 酶。
(2)先将重组载体1导入经 处理后的大肠杆菌，为便于筛选，该大肠杆菌培养基中应添加 。
(3)重组载体1和2在构成表达调控元件上的区别在于前者 。欲获得重组载体2，则载体2的 （填“A”“B”或“A和B”）区域应具有EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列。含有重组载体2的大肠杆菌，在含有四环素的培养基中 （填“能”或“不能”）生存并大量增殖。
(4)若要从个体水平鉴定合成的胰岛素是否具有生物活性，则实验组的操作是 。
【答案】(1)4种脱氧核苷酸、Taq酶（或耐高温的DNA聚合酶）、缓冲液等 5' EcoRⅠ、HindⅢ DNA连接
(2)Ca2+ 氨苄青霉素
(3)不含启动子和终止子 B 能
(4)给实验动物（如2型糖尿病小鼠）静脉注射合成的胰岛素，并监测其血糖变化
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR扩增目的基因时，除了需要向反应体系内添加两种引物、目的基因外，还要添加4种脱氧核苷酸、Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）、缓冲液等。据图可知，经PCR获得的目的基因要插入经EcoRⅠ、HindⅢ切割的载体中，且启动子在EcoRⅠ切口端。目的基因的转录方向由左向右，因此，引物1、2的应分别构建EcoRⅠ、HindⅢ的识别序列。子链的延长由引物5'端向3'端，限制酶切割时，不能切割到目的基因片段，因此，限制酶识别序列应添加在引物1、2的5'端。过程②，即构建重组表达载体时还需要使用到DNA连接酶。
（2）导入重组载体前可先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态。为便于筛选，该大肠杆菌培养基中应添加氨苄青霉素。
（3）据图可知，重组载体1和2在构成表达调控元件上的区别在于前者不含启动子和终止子。若欲获得重组载体2，则载体2的B区域应具有EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列。含有重组载体2的大肠杆菌，能在含有四环素的培养基中生存并大量增殖。
（4）若要从个体水平鉴定合成的胰岛素是否具有生物活性，则实验组的操作可以是给实验动物静脉注射合成的胰岛素，并监测其血糖变化。专题01 发酵工程与基因工程
【题型1 传统发酵技术的应用】
【题型2 微生物的培养与应用】
【题型3 酶的研究与应用】
【题型4 基因工程的基本工具】
【题型5基因工程的基本操作程序】
【题型6 基因工程的应用】
【题型7 蛋白质工程】
【题型8 发酵工程综合】
【题型9 基因工程综合】
01传统发酵技术的应用
【例1】下列关于微生物培养和利用的叙述，正确的是（ ）
A．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利
B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、操作者双手等进行严格的灭菌处理
C．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落
D．腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先减少后增加
【变式1-1】南通某兴趣小组按下图流程制作苹果醋。相关叙述正确的是（ ）
A．菌种甲、乙都具有线粒体，都能进行有氧呼吸
B．加糖的目的是直接为菌种甲、乙提供碳源和能源
C．菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降、温度上升
D．发酵结束后取苹果醋加酸性重铬酸钾检测发酵效果
【变式1-2】酿造陈醋的主要原料是高粱、麸皮、谷糠等，还需要加入一些酿造用水，酿造流程如图所示。大曲是一种由糯米、小麦、大麦等多种谷物加工而成的发酵剂，其中富含发酵酵母和细菌。糖化主要是利用大曲中微生物产生的淀粉酶将原料中的淀粉分解成单糖。下列叙述正确的是（ ）
A．为了提高发酵效率，应在原料蒸熟后立即加入大曲
B．省略糖化的步骤，对陈醋的酿造不会产生影响
C．酒精发酵和醋酸发酵所需温度不同，但都会使发酵液的pH降低
D．各种微生物都适合在陈醋中生长，因此需通过杀菌来延长保质期
【变式1-3】某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。下列选项不正确的是（ ）
A．菌T可能产生分解纤维素的酶，能够高效催化纤维素分解
B．淋洗液中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是合成一些氨基酸、核苷酸等含氮物质
C．可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，在使用该方法时需要注意必须将冷空气充分排除再开始加压
D．将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。发酵过程中，要始终保持密封状态
02 微生物的培养与应用
【例2】采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。下列叙述错误的是（ ）
A．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
B．平板划线法用到的接种环和稀释涂布平板法用到的涂布器均要灭菌处理
C．平板划线法操作过程中每次划线前都需要蘸取菌液
D．稀释涂布平板法统计得到的菌落数往往比活菌的实际数目要少
【变式2-1】下表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是（ ）
成分 NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4 7H2O FeSO4 （CH2O） H2O 青霉素 （可杀死细菌）
含量 3g 1g 0.5g 0.5g 0.01g 30g 1L 0.1万单位
A．依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．若用该培养基培养筛选能分解纤维素的细菌，则应除去（CH2O），再添加纤维素作为唯一碳源
D．培养基中的唯一碳源是（CH2O），唯一氮源是NaNO3
【变式2-2】自然界中微生物种类庞杂，要对其中的某种微生物进行研究，就必须获得具纯净培养物。下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是（ ）
A．培养基中加入牛肉膏和蛋白胨可以同时为微生物提供碳源和氮源
B．以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离得到能分解尿素的细菌
C．可以采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌
D．在培养霉菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性
【变式2-3】某科研小组用如图所示方法统计1g土壤中淀粉分解菌的数量。下列叙述正确的是（ ）
A．该种方法的计数结果通常比显微镜直接计数法的结果小
B．平板中应以淀粉为唯一碳源，应选择稀释106倍的平板计数
C．应将涂布好的平板立即倒置放入30～37℃恒温箱中培养
D．经计算可知1g土壤中有5×107个淀粉分解菌
03 酶的研究与应用
【例3】加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。某同学通过实验比较了几种洗衣粉的去渍效果（“+”越多表示去渍效果越好），实验结果见下表。
加酶洗衣粉A 加酶洗衣粉B 加酶洗衣粉C 无酶洗衣粉（对照）
血渍 +++ + +++ +
油渍 + +++ +++ +
下列叙述错误的是（ ）
A．通常用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水
B．加酶洗衣粉A、B中添加的酶分别是蛋白酶、脂肪酶
C．表中加酶洗衣粉B和加酶洗衣粉C不宜用于洗涤蚕丝织物
D．相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好
【变式3-1】酶制剂在人们的生活实践中有着广泛的应用，下列对酶的应用的叙述，正确的是（ ）
A．加酶洗衣粉中的酶在结构上比较稳定，一般直接来自生物体
B．运用果胶酶可提高果汁的产量，并使果汁变得清亮
C．由于消化酶是蛋白质，故服用多酶片辅助消化食物时，效果并不理想
D．胃蛋白酶随食糜进入小肠后可继续发挥作用
【变式3-2】纺织厂常用枯草芽孢杆菌生产的α-淀粉酶除去织物中的淀粉。为探究α-淀粉酶的最适温度，某科研小组在适宜条件下进行了实验，棉花初始质量为5g，每组在各自温度下保温20min后测量棉花减重，结果如下表所示。下列相关叙述错误的是（ ）
组别 1 2 3 4 5 6
棉花减重/g 0 0.12 0.16 0.22 0.23 0.15
温度/℃ 25 35 45 55 65 75
A．该实验应保证每组的α-淀粉酶浓度、体积及棉花的初始质量相同且适宜
B．每组应先将α-淀粉酶与棉花混合，再在相应温度条件下保温处理
C．图中实验结果表明α-淀粉酶的最适温度范围为55℃-75℃，具体温度还需要进一步探究
D．0℃左右时，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，因此酶制剂适宜在低温下保存
【变式3-3】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，在细胞代谢中起着重要作用，在食品生产中，酶的应用非常广泛，下列说法错误的是（ ）
A．溶菌酶能够溶解细菌的细胞壁，具有抗菌消炎作用
B．酶都需在核糖体中才能合成，且只能在胞内起作用
C．果胶酶能分解果胶，提高果汁产量和澄清度
D．工业化生产啤酒时，ɑ－淀粉酶可以增强糖化作用
04 基因工程的基本工具】
【例4】研究人员将玉米的光敏色素基因A（256bp）导入到棉花体内，对获得的1~4号转基因棉花进行基因A的检测，电泳结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．转基因技术用到的工具有限制酶、DNA连接酶和载体
B．可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊
C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的不同的两次升温和一次降温
D．由电泳结果可知，1、3和4号棉花均导入基因A且培育成功
【变式4-1】基因工程需要三种工具——限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是（ ）
A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合”
B．常用载体质粒的基本单位是脱氧核糖核酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
C．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D．限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核酸序列的能力
【变式4-2】下列关于载体的叙述中，错误的是（ ）
A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等
B．质粒DNA上要至少有一个限制酶切割位点
C．质粒是一种裸露的、结构简单、能自我复制的单链DNA分子
D．质粒上要有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
【变式4-3】下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．DNA和蛋白质都不溶于酒精
B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液
C．提取DNA时，加入的酒精溶液应预冷
D．可用二苯胺试剂鉴定DNA
05 基因工程的基本操作程序
【例5】常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段
B．可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端
C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．PCR仪设置温度时，一个循环依次是高温变性、中温复性、低温延伸
【变式5-1】某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因AA2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A3的基因频率是（ ）
A．52% B．27% C．32% D．2%
【变式5-2】当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（ ）
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植株作对照
【变式5-3】为了获得未知序列的碱基序列，可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增，再对其扩增产物进行测序，其过程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B．以环化的DNA为模板进行PCR时，应选择引物2和引物3
C．第三轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占的比例为
D．常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，产物的相对分子质量比环化DNA小
06 基因工程的应用
【例6】下列实践活动包含基因工程技术的是（ ）
A．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．水稻F1花药经培养和染色体数目加倍，获得基因型纯合新品种
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【变式6-1】据悉多基因编辑猪皮移植手术已获成功，下列叙述错误的是（ ）
A．为防止免疫排斥反应，应该把患者的抗体基因进行删除
B．皮肤在人体的免疫中发挥重要作用，它属于人体免疫的第一道防线
C．器官移植中的免疫排斥反应既有细胞免疫也有体液免疫
D．更多的人加入到自愿捐献器官行列中，有助于缓解供体器官的短缺
【变式6-2】下列关于基因工程及其应用的叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的任意位置
B．用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断转基因抗虫棉培育是否成功
C．建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到乳腺细胞中
D．通过基因工程获得工程菌，可用于生产人源胰岛素
【变式6-3】人乳铁蛋白（hLF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白（hLF）基因转入到山羊体内，从山羊的乳液中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是（ ）
A．可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
07 蛋白质工程
【例7】T4溶菌酶（A0）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．热稳定性高的T4溶菌酶（A1）是一种直接制造出的新蛋白质，需要进行功能的鉴定
【变式7-1】蛋白质工程取得的进展向人们展示出了诱人的前景，下列关于蛋白质工程应用的叙述，错误的是（ ）
A．经蛋白质工程改造后的抗体可以降低诱发免疫反应的强度
B．通过蛋白质工程改造的胰岛素类似物能抑制胰岛素的聚合
C．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素不属于蛋白质工程
D．通过蛋白质工程制造出了一种能降解石油的“超级细菌”
【变式7-2】研究发现，天然胰岛素制剂进入血液循环后容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后需要经历一个解离为单体的过程，这延缓了疗效。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，有效抑制了胰岛素的聚合，提高了胰岛素的作用效果。下列有关叙述错误的是（ ）
A．蛋白质工程的实质是在DNA分子水平上进行设计和改造
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否聚合的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质工程难度很大，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构
【变式7-3】干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。现采用以下方法对干扰素进行改造。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．预期新的干扰素的功能以干扰素基因的结构和功能的关系为基础
B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换
C．新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达
D．以上过程属于蛋白质工程，实质是改造干扰素基因的结构
08 发酵工程综合
【例8】苹果醋富含果胶、维生素以及多种矿物质等营养成分，具有开胃护肝、排毒养颜、减肥降脂等多种功效，是近年来的流行饮品。图甲和图乙分别表示苹果醋的基本制作流程和简易制作装置，请分析回答
(1)酵母菌是制作苹果酒的重要发酵菌种，从代谢类型看，酵母菌属于 生物；酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖进行酒精发酵的反应式是 。酵母菌与醋酸菌细胞结构的主要区别是 。
(2)先用图乙所示装置制作苹果酒，加入鲜苹果汁总量不要超过发酵瓶体积的 。在果酒发酵过程中，气阀a、b应保持的状态分别是 、 。（填“定期开放”或“关闭”）
(3)继续用图乙所示装置制作苹果醋，除打开气阀a、b以外，还需要从气阀 处不断通入无菌空气，并将发酵温度适当 （填“升高”或“降低”）。
(4)图丙表示果酒发酵过程中，发酵液的糖度和酒精度随时间变化的关系曲线图。发酵的前24小时酒精度较低，原因是此阶段酵母菌主要进行 呼吸，大量繁殖；96小时后酒精度基本维持稳定的原因有 消耗殆尽，高浓度酒精和代谢废物会 酵母菌的代谢而影响发酵。
【变式8-1】某生态研究小组为了从纤维素分解菌中获取纤维素酶，以便将农作物秸秆作为酿酒工业的原料，设计了如下操作流程分离提取较纯的纤维素分解菌。请分析回答问题：
①土壤取样→②选择培养→③梯度稀释→④将样品接种到鉴别（加入刚果红）纤维素分解菌的培养基上→⑤挑选菌落
(1)纤维素分解菌选择培养的培养基该如何设计 。
(2)在培养基中还要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 。
(3)图甲所示接种方法常用的接种工具是接种环，对其通常用 法灭菌。
(4)若选择培养后预估锥形瓶中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在鉴别平板上涂布0.1ml稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落不超过200个，则至少应将锥形瓶中的菌液稀释 倍。在鉴别培养基中含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用是： （写两点）。
(5)图乙中出现的无透明带的菌落，其代谢类型（同化作用类型）最可能是 。
(6)流程图中步骤⑤的操作中，应挑选产生了 的菌落。
【变式8-2】蒽（C14H10）是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题，因此从土壤中分离和筛选出蒽降解菌有非常重要的意义。研究人员进行如下图实验，成功地从环境样品中分离得到蒽降解菌。已知蒽在水中溶解度低，含过量蒽的固体培养基不透明。请分析回答：
(1)蒽降解菌富集培养基含有K2HPO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、FeC3、MnSO4、水等，需再加入 作为唯一碳源，该培养基属于 （填“固体”或“液体”）培养基。
(2)配制培养基时，应在灭菌 （填“前”或“后”）调pH，对配制好的培养基应采用 法进行灭菌处理。
(3)上图所示的分离、纯化、计数蒽降解菌的方法是 ，使用该方法计算得到的细菌数量与待测样品中实际的细菌数量相比往往偏 （填“多”或“少”），其主要原因是一个菌落可以来源于 个细胞。
(4)实验中若在每个平板上涂布0.1mL稀释了105倍后的菌液，且每个平板上长出的菌落数约为150个，则初步估测A中细菌细胞数为 个/mL。
(5)研究人员为了进一步筛选出高降解能力的菌种，对上图得到的菌株再次进行纯化培养，测量不同菌株形成的菌落及透明圈直径，结果见下表：
编号 菌落直径（C，mm） 透明圈直径（H，mm） H/C
菌株I 8.1 13.0 1.6
菌株Ⅱ 5.1 11.2 2.2
菌株Ⅲ 9.5 17.1 1.8
根据表中数据，可推断其中降解蒽能力最高的菌株是 。
【变式8-3】北京传统小吃“豆汁”是一种以绿豆为原料，经过一系列制作工艺流程（如下图）得到的一种以酸味为主、掺杂着些许臭味的糊状流体食品。混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程实际属于乳酸发酵，其主要产酸微生物为乳酸菌。回答下列问题：
(1)混合浆发酵时所需乳酸菌主要来自 。乳酸是由乳酸菌在 氧条件下产生的，其产生量是影响豆汁风味的重要因素之一。乳酸发酵过程中，能为乳酸菌同时提供碳源和能源的物质主要是 。
(2)欲测定混合浆中乳酸菌的含量多少，研究小组可采用的接种方法是 （填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”），该方法测得的结果通常比实际值 （填“更高”、“更低”或“相同”），原因是 。
(3)为了筛选出产酸能力强的乳酸菌菌种，研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体（添加 ）培养基（添加质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，培养基常用的灭菌方法是 法，此外，实验室灭菌方法还有 。在适宜条件下培养一段时间后，应挑取 （“有”或“没有”）透明圈的菌落，进行进一步纯化。
09 基因工程综合
【例9】结球甘蓝是我国重要的蔬菜品种，危害甘蓝生长的主要是菜青虫等鳞翅目害虫。为使结球甘蓝获得抗虫性状，科研人员将苏云金芽孢杆菌中的BT毒蛋白基因导入结球甘蓝。回答下列问题：
(1)转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入叶绿体。为构建BT 毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因（见图1），需用限制酶 处理相关的DNA片段，再用 连接。
图1
注： El、 E2、 E3、E4为限制酶。
(2)构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的 区。用Ca2+处理农杆菌后，使细胞处于一种 的生理状态，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（注：GUS基因表达产物经染色能由无色变成蓝色）
(3)鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可以用分子水平检测中的 等技术，还可以通过肉眼观察选择 的愈伤组织，以确定目的基因是否 。
(4)为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还需要进行个体生物学水平的签定。请设计实验方案 。
【变式9-1】毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。
(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。
(2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是 、 。
(3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。
(4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，获得的重组DNA的长度为 。
(5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。
【变式9-2】T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。科研人员借助PCR技术对T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐热型的T4溶菌酶，改造后的T4溶菌酶基因如图所示，其中①～④表示引物。回答下列问题：
(1)为了使扩增后的T4溶菌酶基因中含有改造后的序列，要选择的图中的引物组合最好是 。
(2)PCR扩增时需要使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶的作用是 ；同时需要通过控制温度使DNA复制在体外反复进行，图中两种引物能够与两条单链DNA结合的温度是 ℃左右。
(3)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与下图中的质粒A正确连接，设计引物时需要在两种引物的 （填“3'”或“5'”）端连接上限制酶 识别和切割的序列。
(4)将重组质粒A导入大肠杆菌之前一般要先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。初步筛选含有重组质粒A的大肠杆菌的方法是 。
【变式9-3】人胰岛素原基因（insulin）在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体，增加了胰岛素的生产成本。以NusA蛋白作为N端标签时可提高融合蛋白的可溶性。若让大肠杆菌表达出带有NusA蛋白标签的人胰岛素原融合蛋白（His—NusA—insulin），再经蛋白酶酶切，即得到可溶性人胰岛素原，为降低胰岛素生产成本提供基础。下图为构建重组质粒pHis—NusA—insulin的基本流程，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。Taq为四环素抗性基因，几种限制酶的酶切位点已在图中标注。人胰岛素原基因中不含这几种限制酶的识别序列，实验所用大肠杆菌对氨苄青霉素和四环素均敏感。回答下列问题：
(1)经过程①，即PCR可大量扩增人胰岛素原基因，该过程中除了需要向反应体系内添加引物1、2和人胰岛素原基因外，还要添加 （答两点）等，图中引物1、2的 （填“3'”或“5'”）端应分别添加 的识别序列。除限制解外，过程②还需要用到 酶。
(2)先将重组载体1导入经 处理后的大肠杆菌，为便于筛选，该大肠杆菌培养基中应添加 。
(3)重组载体1和2在构成表达调控元件上的区别在于前者 。欲获得重组载体2，则载体2的 （填“A”“B”或“A和B”）区域应具有EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列。含有重组载体2的大肠杆菌，在含有四环素的培养基中 （填“能”或“不能”）生存并大量增殖。
(4)若要从个体水平鉴定合成的胰岛素是否具有生物活性，则实验组的操作是 。
