【2024真题分类汇编】 27基因工程
文档属性
| 名称 | 【2024真题分类汇编】 27基因工程 |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 3.7MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-08-12 10:38:21 | ||
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文档简介
27基因工程
1.（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制酶失活，更换新的限制酶
B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.（2024·山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④
3.（2024·吉林卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
4.（2024·湖北高考）人的前胰岛素原是由110个氨基酸组成的单链多肽。前胰岛素原经一系列加工后转变为由51个氨基酸组成的活性胰岛素，才具有降血糖的作用。该实例体现了生物学中“结构与功能相适应”的观念。下列叙述与上述观念不相符合的是（ ）
A. 热带雨林生态系统中分解者丰富多样，其物质循环的速率快
B. 高温处理后的抗体，失去了与抗原结合的能力
C. 硝化细菌没有中心体，因而不能进行细胞分裂
D. 草履虫具有纤毛结构，有利于其运动
5.（2024·湖南卷）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧原苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
6.（2024·6月浙江卷）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A. 1号和6号
B. 2号和4号
C. 3号和5号
D. 1号、2号、4号和6号
7.（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
8.（2024·全国甲卷）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
9.（2024·河南理综）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。
10．（2024·1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。
回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔 端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的 距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
11.（2024·河北高考）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。
（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
12.（2024·吉林卷）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
13．（2024·甘肃卷）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是___________________。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_________________________。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是______（答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
14.（2024·广东卷）)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT (仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：
15.（2024·湖南卷）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
（1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_______（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
（2）单倍体育种。常用________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是________。
（3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基国pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码CUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究腐原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用_______酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导人烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路________。
答案解析
1.（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制酶失活，更换新的限制酶
B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【解析】
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。
【选项解读】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶。A正确
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用。B错误
C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒。C正确
D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。D正确
故选B。
2.（2024·山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④
【答案】D
【解析】
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【选项解读】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。
故选D。
3.（2024·吉林卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【选项解读】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果。A正确
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳。B错误
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。C错误
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。D错误
故选A。
4.（2024·湖北高考）人的前胰岛素原是由110个氨基酸组成的单链多肽。前胰岛素原经一系列加工后转变为由51个氨基酸组成的活性胰岛素，才具有降血糖的作用。该实例体现了生物学中“结构与功能相适应”的观念。下列叙述与上述观念不相符合的是（ ）
A. 热带雨林生态系统中分解者丰富多样，其物质循环的速率快
B. 高温处理后的抗体，失去了与抗原结合的能力
C. 硝化细菌没有中心体，因而不能进行细胞分裂
D. 草履虫具有纤毛结构，有利于其运动
【答案】C
【解析】
【分析】蛋白质的功能：（1）免疫功能：抗体的本质是免疫球蛋白，会与抗原结合形成沉淀团，被吞噬细胞消化分解。（2）结构功能：有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动物的肌肉、毛发。（3）催化功能：绝大多数酶都是蛋白质，具有催化功能。（4）运输功能：有些蛋白质具有运输载体的功能，如血红蛋白运输氧气。（5）调节功能：有些蛋白质有信息传递功能，能够调节机体的生命活动，如胰岛素可以调节血糖。
【选项解读】A、生态系统的结构包括组成成分和营养结构，其中分解者属于组成成分，其以动植物残体、排泄物中的有机物质为生命活动能源，并把复杂的有机物逐步分解为简单的无机物，所以其重要功能是维持生态系统物质循环的正常进行，以保证生态系统结构和功能的稳定，因此热带雨林生态系统中分解者丰富多样，该生态系统物质循环速率会加快。A错误
B、抗体的本质是免疫球蛋白，会与抗原结合形成沉淀团，被吞噬细胞消化分解，高温会破坏抗体（免疫球蛋白）的空间结构，使抗体失去生物活性（即生物学功能），所以无法与抗原结合。B错误
C、硝化细菌是原核生物，只含核糖体这一种细胞器，其分裂时，DNA分子附着在细胞膜上并复制为二，然后随着细胞膜的延长，复制而成的两个DNA分子彼此分开；同时细胞中部的细胞膜和细胞壁向内生长，形成隔膜，将细胞质分成两半，形成两个子细胞，该过程即二分裂，依赖于细胞膜和细胞壁。C正确
D、草履虫的纤毛会辅助运动，草履虫靠纤毛的摆动在水中旋转前进，还可帮助口沟摄食。D错误
故选C。
5.（2024·湖南卷）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧原苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
【答案】AC
【解析】
【分析】◆PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
◆双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。
【选项解读】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物。A正确
B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误
C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'。C正确
D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T。D错误
故选AC。
6.（2024·6月浙江卷）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A. 1号和6号
B. 2号和4号
C. 3号和5号
D. 1号、2号、4号和6号
【答案】19. D 20. B
【解析】
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
【小问（1）详解】
A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段。A正确
B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段。B正确
C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用。C正确
D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带。D错误
故选D。
【小问（2）详解】
根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号。B正确，ACD错误
故选B。
7.（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】（1） ① 低 ② 256 ③ GTTT ④ AAAC
（2） ① 卡那霉素 ② Sac Ⅰ ③ ④
（3）1/4
【解析】
【分析】基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。
【小问详解】
（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-AAAC-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测呢却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
8.（2024·全国甲卷）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
【答案】（1） ① 变性 ② 氢键
（2） ① 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 ② T4DNA连接酶
（3） ① 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ② 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【解析】
【分析】基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
（2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。
（3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
9.（2024·河南理综）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。
【答案】（1） ① 磷酸二酯键 ② 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
（2）C-G、A-T、U-A
（3） ① N基因的两条链 ② 不能扩增出目的基因
（4）不污染环境、增加土壤养分
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【小问详解】
（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常发表达。
（2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。
（3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
10．（2024·1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。
回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔 端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的 距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】（1)根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2)DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
(3)划线分离 振荡培养
（4）梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多
【小问详解】
（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成CDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含由磷酸基团而带负电荷,所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移不同分子量的DNA分子在电泳凝胶上的距离逐渐变长。
(2)内切酶处理后的质粒和目的基因,用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡,有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
(4)由题意可知,菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知,锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌,为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多说明N转运Zn2+能力更强。
11.（2024·河北高考）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。
（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
【答案】（1） ① 在胚乳中特异性表达的 ② 终止转录 ③ HindIII ④ EcoRI
（2） ① 农杆菌转化 ② r2HNmRNA ③ 抗原抗体杂交
（3） ① 1/4 ② 纯合体自交后代不发现性状分离
（4） ① 体液 ② 细胞
（5）不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
【解析】
【分析】基因工程是一项体外DNA重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
12.（2024·吉林卷）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1） ① 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ② 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
（2） ① PCR技术扩增 ② 人工合成
（3） ① RNA聚合酶识别并结合的部位 ② 调控目的基因的表达
（4）HygBR （5） ①. F3 ②. R2 （6）D
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
（2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是调控目的基因的表达。
（4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。
（6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC不符合题意，D符合题意。
故选D。
13．（2024·甘肃卷）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是___________________。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_________________________。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是______（答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
【答案】(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖菌落产生的纤维素酶的活性和量有关
(2)耐高温的DNA聚合酶
(3)基因表达载体的构建限制酶、DNA连接酶
(4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等能吸收周围环境中DNA分子
（5)降解时的温度不同、降解时的pH不同据图可知，①②是利用选择培养基筛选出高产纤维
素酶菌株X，③是提取菌株X基因组，④为基因工程操作程序中“目的基因的筛选和获取”，⑤为“基因表达载体的构建”，⑥为“将目的基因导入受体细胞”，⑦为从培养体系中分离得到重组酶。
【小问详解】
(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成,培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA车接酶。
(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
(5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。
14.（2024·广东卷）)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT (仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：
【答案】(1)碳源、氨源基因2和3正常表达无
（2）PT7、PBAD和PBAD活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
（3）抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤:(1)目的基因的获取。(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因1、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴
【小问详解】(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2)题图二a分析可知，蓝光照射下,T7RNAPN端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的
T7RNAP变成有活性的T7RNAP,结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
（4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
（5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
15.（2024·湖南卷）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
（1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_______（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
（2）单倍体育种。常用________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是________。
（3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基国pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码CUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究腐原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用_______酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导人烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路________。
【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶 ② 生长素和细胞分裂素
（2） ① 花药离体培养 ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
（3） ① HindⅢ、BamHⅠ ② 交链格孢 ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
【解析】
【分析】植物体细胞杂交的基本过程是：首先用酶解法获得原生质体，然后通过一定的技术手段如电刺激、离心、振荡、聚乙二醇等诱导，实现原生质体的融合。只要将水解酶去除，融合的原生质体经培养后，能很快再生出新的细胞壁，形成杂种细胞。杂种细胞具有全能性，经过培养能进一步分裂、分化，进而发育成完整的植株。
【小问详解】
（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
（2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。
（3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
1.（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制酶失活，更换新的限制酶
B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.（2024·山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④
3.（2024·吉林卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
4.（2024·湖北高考）人的前胰岛素原是由110个氨基酸组成的单链多肽。前胰岛素原经一系列加工后转变为由51个氨基酸组成的活性胰岛素，才具有降血糖的作用。该实例体现了生物学中“结构与功能相适应”的观念。下列叙述与上述观念不相符合的是（ ）
A. 热带雨林生态系统中分解者丰富多样，其物质循环的速率快
B. 高温处理后的抗体，失去了与抗原结合的能力
C. 硝化细菌没有中心体，因而不能进行细胞分裂
D. 草履虫具有纤毛结构，有利于其运动
5.（2024·湖南卷）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧原苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
6.（2024·6月浙江卷）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A. 1号和6号
B. 2号和4号
C. 3号和5号
D. 1号、2号、4号和6号
7.（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
8.（2024·全国甲卷）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
9.（2024·河南理综）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。
10．（2024·1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。
回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔 端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的 距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
11.（2024·河北高考）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。
（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
12.（2024·吉林卷）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
13．（2024·甘肃卷）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是___________________。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_________________________。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是______（答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
14.（2024·广东卷）)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT (仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：
15.（2024·湖南卷）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
（1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_______（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
（2）单倍体育种。常用________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是________。
（3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基国pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码CUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究腐原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用_______酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导人烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路________。
答案解析
1.（2024·湖南卷）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A. 限制酶失活，更换新的限制酶
B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
【答案】B
【解析】
【分析】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数是蛋白质，少部分是RNA，酶具有特异性、高效性、易受环境因素影响等特点。限制酶特异性识别并切割DNA上的特定位点。
【选项解读】A、限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶。A正确
B、酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用。B错误
C、质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒。C正确
D、质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。D正确
故选B。
2.（2024·山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A. ①② B. ②③ C. ①④ D. ③④
【答案】D
【解析】
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【选项解读】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。
故选D。
3.（2024·吉林卷）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】A
【解析】
【分析】琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的原理主要基于DNA分子在电场作用下的迁移行为以及琼脂糖凝胶的特性。
【选项解读】A、琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果。A正确
B、 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳。B错误
C、在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。C错误
D、琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。D错误
故选A。
4.（2024·湖北高考）人的前胰岛素原是由110个氨基酸组成的单链多肽。前胰岛素原经一系列加工后转变为由51个氨基酸组成的活性胰岛素，才具有降血糖的作用。该实例体现了生物学中“结构与功能相适应”的观念。下列叙述与上述观念不相符合的是（ ）
A. 热带雨林生态系统中分解者丰富多样，其物质循环的速率快
B. 高温处理后的抗体，失去了与抗原结合的能力
C. 硝化细菌没有中心体，因而不能进行细胞分裂
D. 草履虫具有纤毛结构，有利于其运动
【答案】C
【解析】
【分析】蛋白质的功能：（1）免疫功能：抗体的本质是免疫球蛋白，会与抗原结合形成沉淀团，被吞噬细胞消化分解。（2）结构功能：有些蛋白质是构成细胞和生物体的重要物质，如人和动物的肌肉、毛发。（3）催化功能：绝大多数酶都是蛋白质，具有催化功能。（4）运输功能：有些蛋白质具有运输载体的功能，如血红蛋白运输氧气。（5）调节功能：有些蛋白质有信息传递功能，能够调节机体的生命活动，如胰岛素可以调节血糖。
【选项解读】A、生态系统的结构包括组成成分和营养结构，其中分解者属于组成成分，其以动植物残体、排泄物中的有机物质为生命活动能源，并把复杂的有机物逐步分解为简单的无机物，所以其重要功能是维持生态系统物质循环的正常进行，以保证生态系统结构和功能的稳定，因此热带雨林生态系统中分解者丰富多样，该生态系统物质循环速率会加快。A错误
B、抗体的本质是免疫球蛋白，会与抗原结合形成沉淀团，被吞噬细胞消化分解，高温会破坏抗体（免疫球蛋白）的空间结构，使抗体失去生物活性（即生物学功能），所以无法与抗原结合。B错误
C、硝化细菌是原核生物，只含核糖体这一种细胞器，其分裂时，DNA分子附着在细胞膜上并复制为二，然后随着细胞膜的延长，复制而成的两个DNA分子彼此分开；同时细胞中部的细胞膜和细胞壁向内生长，形成隔膜，将细胞质分成两半，形成两个子细胞，该过程即二分裂，依赖于细胞膜和细胞壁。C正确
D、草履虫的纤毛会辅助运动，草履虫靠纤毛的摆动在水中旋转前进，还可帮助口沟摄食。D错误
故选C。
5.（2024·湖南卷）（多选）最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补酸对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧原苷三磷酸（dATP），继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A. 上述PCR反应体系中只加入一种引物
B. 电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C. 5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D. 患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
【答案】AC
【解析】
【分析】◆PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
◆双脱氧测序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸（dNTP）存在的情况下，如果在四管反应系统中再分别加入四种双脱氧核苷三磷酸（ ddNTP），DNA链合成反应过程中 ddNTP与dNTP处于一种竞争状态，即新合成DNA链既可能掺入正常dNTP，也可能掺入ddNTP并使新合成链终止延伸。这样在每个反应系统中形成的产物是一系列长度不等的多核苷酸片段，这些片段具有相同的起点，即引物的5'端，但有不同的ddNTP终端。 在结束反应后，用四个泳道进行电泳，分别分离各组反应体系中不同长度的DNA 片段，检测DNA片段终止末端位置的碱基种类，从自显影图谱中直接读取到与模板相匹配的新的链序。
【选项解读】A、利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物。A正确
B、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢。B错误
C、依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'。C正确
D、对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T。D错误
故选AC。
6.（2024·6月浙江卷）阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。
研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
（1）下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（ ）
A. F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B. F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C. F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D. R2引物可用于特异性地扩增目的片段
（2）为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（ ）
A. 1号和6号
B. 2号和4号
C. 3号和5号
D. 1号、2号、4号和6号
【答案】19. D 20. B
【解析】
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
【小问（1）详解】
A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段。A正确
B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段。B正确
C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用。C正确
D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带。D错误
故选D。
【小问（2）详解】
根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号。B正确，ACD错误
故选B。
7.（2024·山东卷）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-______-3'和5'-______-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素______筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】（1） ① 低 ② 256 ③ GTTT ④ AAAC
（2） ① 卡那霉素 ② Sac Ⅰ ③ ④
（3）1/4
【解析】
【分析】基因工程的基本操作程序包括目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用PCR可以快速的获取和扩增目的基因。
【小问详解】
（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-AAAC-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测呢却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
8.（2024·全国甲卷）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________（答出两点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
【答案】（1） ① 变性 ② 氢键
（2） ① 避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 ② T4DNA连接酶
（3） ① 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ② 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
【解析】
【分析】基因工程基本工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
（2）构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。
（3）大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
9.（2024·河南理综）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（I～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________（答出2点即可）。
【答案】（1） ① 磷酸二酯键 ② 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
（2）C-G、A-T、U-A
（3） ① N基因的两条链 ② 不能扩增出目的基因
（4）不污染环境、增加土壤养分
【解析】
【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【小问详解】
（1）限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常发表达。
（2）RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G-C和C-G、A-T、U-A。
（3）用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
10．（2024·1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。
回答下列问题：
（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔 端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的 距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】（1)根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2)DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
(3)划线分离 振荡培养
（4）梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多
【小问详解】
（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成CDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含由磷酸基团而带负电荷,所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移不同分子量的DNA分子在电泳凝胶上的距离逐渐变长。
(2)内切酶处理后的质粒和目的基因,用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存酵母菌可直接在固体培养基上涂布或平板划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡,有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
(4)由题意可知,菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知,锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌,为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多说明N转运Zn2+能力更强。
11.（2024·河北高考）新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________。
（4）制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的细胞（细胞毒性T细胞）水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
（5）利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________________。（答出两点即可）
【答案】（1） ① 在胚乳中特异性表达的 ② 终止转录 ③ HindIII ④ EcoRI
（2） ① 农杆菌转化 ② r2HNmRNA ③ 抗原抗体杂交
（3） ① 1/4 ② 纯合体自交后代不发现性状分离
（4） ① 体液 ② 细胞
（5）不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
【解析】
【分析】基因工程是一项体外DNA重组技术，需要借助限制酶、 DNA 连接酶和载体等工具才能进行。它的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，在胚乳中特异性表达的启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnI破坏了启动子序列不能选用，SacI位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindIII和EcoRI对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
（2）获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
（3）获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
（4）据图可知，实验组的抗体水平和CD8+T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
（5）通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
12.（2024·吉林卷）将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒（辅助T-DNA转移）和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左边界；T-DNA-RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是______。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是______。
（2）本操作中获取目的基因的方法是______和______。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是______，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是______。
（4）根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用______基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
（6）本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A. 通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B 将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C. 将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D. 用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】（1） ① 水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 ② 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
（2） ① PCR技术扩增 ② 人工合成
（3） ① RNA聚合酶识别并结合的部位 ② 调控目的基因的表达
（4）HygBR （5） ①. F3 ②. R2 （6）D
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【小问详解】
（1）从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
（2）本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。
（3）穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是调控目的基因的表达。
（4）结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
（5）为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。
（6）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。
ABC不符合题意，D符合题意。
故选D。
13．（2024·甘肃卷）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
（1）过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是___________________。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_________________________。
（2）过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是______。
（3）过程⑤在基因工程中称为______，该过程需要的主要酶有______。
（4）过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有______。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种______的生理状态。
（5）课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是______（答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
【答案】(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖菌落产生的纤维素酶的活性和量有关
(2)耐高温的DNA聚合酶
(3)基因表达载体的构建限制酶、DNA连接酶
(4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等能吸收周围环境中DNA分子
（5)降解时的温度不同、降解时的pH不同据图可知，①②是利用选择培养基筛选出高产纤维
素酶菌株X，③是提取菌株X基因组，④为基因工程操作程序中“目的基因的筛选和获取”，⑤为“基因表达载体的构建”，⑥为“将目的基因导入受体细胞”，⑦为从培养体系中分离得到重组酶。
【小问详解】
(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成,培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。
(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA车接酶。
(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
(5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响。
14.（2024·广东卷）)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT (仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：
【答案】(1)碳源、氨源基因2和3正常表达无
（2）PT7、PBAD和PBAD活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
（3）抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤:(1)目的基因的获取。(2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因1、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法;将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴
【小问详解】(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2)题图二a分析可知，蓝光照射下,T7RNAPN端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的
T7RNAP变成有活性的T7RNAP,结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
（4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
（5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
15.（2024·湖南卷）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
（1）体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用_______（填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
（2）单倍体育种。常用________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是________。
（3）基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基国pL，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码CUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究腐原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用_______酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导人烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路________。
【答案】（1）① 纤维素酶和果胶酶 ② 生长素和细胞分裂素
（2） ① 花药离体培养 ② 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
（3） ① HindⅢ、BamHⅠ ② 交链格孢 ③ 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
【解析】
【分析】植物体细胞杂交的基本过程是：首先用酶解法获得原生质体，然后通过一定的技术手段如电刺激、离心、振荡、聚乙二醇等诱导，实现原生质体的融合。只要将水解酶去除，融合的原生质体经培养后，能很快再生出新的细胞壁，形成杂种细胞。杂种细胞具有全能性，经过培养能进一步分裂、分化，进而发育成完整的植株。
【小问详解】
（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。
（2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。
（3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
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