高考生物真题演练&模拟精选：专题22 基因工程（含答案）

专题22　基因工程
五年高考
1.(2022北京,13,2分)下列高中生物学实验中,对实验结果不要求精确定量的是(B)
A.探究光照强度对光合作用强度的影响
B.DNA的粗提取与鉴定
C.探索生长素类调节剂促进插条生根的最适浓度
D.模拟生物体维持pH的稳定
2.(2021北京,13,2分)关于物质提取、分离或鉴定的高中生物学实验,叙述错误的是(C)
A.研磨肝脏以破碎细胞用于获取含过氧化氢酶的粗提液
B.利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA
C.依据吸收光谱的差异对光合色素进行纸层析分离
D.利用与双缩脲试剂发生颜色变化的反应来鉴定蛋白质
3.(2020北京,12,2分)为了对重金属污染的土壤进行生物修复,研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,同时避免内源HMA3基因的干扰,在进行PCR扩增时,应选择的引物组合是(B)
A.①+③　　B.①+②　　
C.③+②　　D.③+④
4.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是(D)
图1　酶切位点图 图2　电泳结果示意图
A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B.图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C.泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA
5.(2022北京,21,11分)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E物质)污染会导致鱼类雌性化等异常,并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼,其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体,且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼,建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是　显微注射　。
(2)为监测E物质,研究者设计了如图所示的两种方案制备转基因斑马鱼,其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子,分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活,启动下游基因表达。
方案1
方案2
与方案1相比,方案2的主要优势是　监测灵敏度更高　,因而被用于制备监测鱼(MO)。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM,用于实际监测。SM需经MO和另一亲本(X)杂交获得。欲获得X,需从以下选项中选择启动子和基因,构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵,经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
　②　——　D　——终止子
Ⅰ.启动子:
①ERE　②UAS　③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P生)　④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P肌)
Ⅱ.基因:
A.GFP　B.Gal4　C.雌激素受体基因(ER)　D.仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM不育的原因是:成体SM自身产生雌激素,与受体结合后　激活ERE诱导Gal4表达,Gal4结合UAS诱导dg表达,生殖细胞凋亡　造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是　避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题　。
6.(2020北京,17,12分)枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株(B菌),从中克隆得到了一种纤维素酶(C1酶)基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体(HT质粒)连接,再导入B菌,以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
(1)纤维素属于　多　糖,因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖,该单糖是　葡萄糖　。
(2)对克隆到的C1酶基因测序,与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同,但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同,这是因为　编码同一种氨基酸的密码子可以有多个　。
(3)C1酶基因以B链为转录模板链,转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接,克隆C1酶基因时在其两端添加了SmaⅠ和BamH Ⅰ的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是　BamHⅠ、SmaⅠ　。
图1
(4)将纤维素含量为20%的培养基分为三组,一组接种工程菌,对照组1不进行处理,对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时,检测培养基中纤维素的含量。结果(图2)说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为　接种(等量)B菌　。
图2
(5)预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用。(举一例)
处理绿化废弃物/处理农作物秸秆。
全真全练
考点1　重组DNA技术的基本工具
1.(2023新课标,6,6分)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(C)
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coli DNA连接酶连接
2.(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(B)
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
考点2　基因工程的基本操作程序及应用
3.(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(D)
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
4.(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(C)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
5.(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(D)
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
6.(2023浙江6月选考,19,2分)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是(B)
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
7.(2023全国乙,38,15分)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体,并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常,基因文库是指　将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因　。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体,其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为　终止子　;②为　启动子　,其作用是　识别和结合RNA聚合酶,驱动基因的转录　;图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因,其作用是　将含有目的基因的细胞筛选出来　。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是　密码子的简并性　(答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是　获取YFP基因并构建表达载体,导入真核细胞,检验其能否发出黄色荧光　。
8.(2023海南,20,13分)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一,我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽Cut-Dip-Budding,简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1)图1中,从外植体转变成愈伤组织的过程属于　脱分化　;从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和　细胞分裂素　,该过程还需要光照,其作用是　诱导叶绿素的形成,使幼苗能够进行光合作用　。
(2)图1中的愈伤组织,若不经过共培养环节,直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的　遗传特性　。图1中,含有外源基因的转化植株A若用于生产种子,其包装需标注　转基因种子　。
(3)图1与图2中,农杆菌侵染植物细胞时,可将外源基因递送到植物细胞中的原因是　农杆菌细胞内含Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上　。
(4)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因),利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B,长出毛状根,成功获得转化植株B。据此分析,从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是　检测毛状根段是否有绿色荧光　,图2中,鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是　植物PDS中靶区域测序(或根据PDS基因的碱基序列设计引物进行PCR扩增)　,依据是　若导入幼苗的基因编辑载体成功发挥作用,则PDS基因被敲除,靶区域的测序就会出现序列缺失,(或PCR无法扩增出条带)　。
(5)与常规转化法相比,采用CDB法进行基因递送的优点是　不需要无菌操作、不需要进行植物组织培养、操作简便　(答出2点即可)。
9.(2023河北,22,15分)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体,转入硅藻细胞,以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题:
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　溶解度　差异获得硅藻粗提DNA,PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　启动子　和　终止子(答案“启动子”和“终止子”不分顺序)　等。本研究中目的基因为　苹果酸酶基因(或“ME基因”)　。
(3)PCR扩增时引物通过　碱基互补配对　原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物,对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测,扩增产物电泳结果见图2。其中,样品1为本实验的　对照　组,样品2有特异性扩增产物,结果表明　引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中(或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”)　。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析,相对于品系A,品系B的胞内脂质含量平均水平明显　增加　。同时,还需测定　细胞数量　以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析,ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高,　有氧呼吸生成的ATP增多　,最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)　。(答出两点即可)
10.(2023天津,17)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择　纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素寡糖纤维二糖葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞　外　(内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法　同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为　P1和P6　(从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择　URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用　不含尿嘧啶　的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式　2　排列才能通过同源重组达到上述目的。
　
此后,需要将菌株1在　含有5-氟乳清酸和尿嘧啶(只答含有5-氟乳清酸给2分)　的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建　综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图　4　的排布方式。
　　　
　　　
11.(2023山东,25,10分)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示。其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　RNA聚合酶　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有　标记基因、复制原点(或限制性酶切位点)　(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　F2和R1(或“F1和R2”)　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　a链　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　J-V5融合蛋白　,条带2所检出的蛋白　不是　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
12.(2023广东,20,14分)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与　野生型　植株的种子大小相近。
(2)用PCR扩增DA1基因,用限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)对PCR产物和　基因表达载体(或质粒,或载体)　进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　启动子、终止子　。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
图1
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　T-DNA片段(或DA1基因,或目的基因)　。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约　75　%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株　自交　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　100　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
　　为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶(限制性内切核酸酶)X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在电泳图3中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
图2
图3
答案　
13.(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有　模板和引物　,扩增程序中最主要的不同是　退火温度　。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用　CD　。
图2
A.ATGGTG------CAACCA　　　C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT　　　D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有　限制性内切核酸酶、DNA连接酶　。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有　ABC　。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
图3
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有　P3、P4　。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是　电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度,不能呈现碱基序列　。
考点3　蛋白质工程
14.(2023辽宁,25,11分)天然β-淀粉酶大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因,并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题:
(1)上述过程属于　蛋白质　工程。
(2)PCR中使用的聚合酶属于　③　(填写编号)。
①以DNA为模板的RNA聚合酶
②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶
④以RNA为模板的DNA聚合酶
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成,研究发现,将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺,耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中,含已替换碱基的引物是
　①或④　(填写编号)。
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达,由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外,基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和　标记基因　。
(5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位点)全长为1.5 kb,将其插入BamHⅠ位点。用EcoRⅠ酶切来自不同大肠杆菌菌落的质粒DNA,经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度,这一操作的目的是　通过电泳鉴定目的基因是否插入质粒中　。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为　5.7　kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录,根据中心法则,可通过　逆转录　反应获得PCR的模板。
三年模拟
综合基础练
选择题(每小题只有一个选项符合题意)
1.(2024东城一模,14)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。下列叙述与我国政府相关法规或主张不符的是(A)
A.禁止人的生殖性克隆和治疗性克隆 B.禁止非医学需要的胎儿性别鉴定
C.销售转基因农产品应有明确标注 D.全面禁止和彻底销毁生物武器
2.(2024朝阳期末,13)毕赤酵母是一种高效的分泌蛋白表达系统,能用于大量生产外源蛋白质。以下说法正确的是(D)
A.毕赤酵母属于基因工程常用的载体
B.可用显微注射法将目的基因导入毕赤酵母
C.可用DNA分子杂交技术检测目的基因是否成功表达
D.用毕赤酵母表达系统生产外源蛋白质可不必裂解酵母菌
3.(2024海淀期末,13)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S(箭头表示转录方向)插入图中载体P区,构建表达载体,转入大肠杆菌,获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。下列叙述不正确的是(A)
A.PCR扩增启动子S时,图中引物Ⅰ、Ⅱ分别加入BamHⅠ、XhoⅠ识别序列
B.用Ca2+处理大肠杆菌以便于转入构建好的表达载体
C.使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入载体的菌株
D.可通过转基因大肠杆菌的荧光情况判断水中是否含毒物
4.(2024石景山一模,14)蛛丝蛋白是一种特殊纤维蛋白,具有强度高、韧性大等特点,在人工肌腱等医学领域有着诱人的前景。某研究小组提取一种丝绒蜘蛛中的蛛丝蛋白基因,将其导入大肠杆菌生产蛛丝蛋白。下列叙述正确的是(D)
A.构建蛛丝蛋白基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
B.可通过显微注射的方法将蛛丝蛋白基因导入大肠杆菌
C.基因表达载体上的复制原点可调控蛛丝蛋白基因的表达
D.可通过蛋白质工程设计与改造蛛丝蛋白的结构以增强其韧性
5.(2023西城二模,13)科学家从转基因羊的羊奶中提取到治疗血栓性疾病的特效药——组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。获得转基因羊的过程中,以下操作非必要的是(C)
A.将t-PA基因与羊乳腺特异表达启动子重组
B.将表达载体显微注射到羊受精卵中
C.将羊受精卵的核注入去核的卵母细胞中
D.将体外培养的胚胎移植到羊的子宫内
综合拔高练1
一、选择题(每小题只有一个选项符合题意)
1.(2024东城二模,13)为更有效地处理含重金属的废水,研究人员将植物的金属结合蛋白基因导入大肠杆菌构建工程菌。由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端,且无合适的限制酶识别序列,需借助中间载体P将目的基因接入载体E。下图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(C)
A.不直接选择P构建表达载体是因为它不含起始密码子和终止密码子
B.将目的基因插入载体P时,应选择SmaⅠ进行酶切,再用DNA连接酶连接
C.构建表达载体时,应选择XhoⅠ和PstⅠ酶切载体E和含目的基因的载体P
D.基因表达载体构建完成后,需利用农杆菌转化法导入受体细胞
2.(2024西城一模,12)图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(C)
A.PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B.在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织,选择呈现蓝色的组织进行培养
D.启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费
二、非选择题
3.(2024西城二模,20)科研人员获得了携带两种抗稻瘟病的抗性基因Pib和Pikm的水稻品系——川抗30,以及携带螟虫抗性基因CryIC的水稻品系——昌恢。为获得同时携带抗螟虫基因和两种抗稻瘟病基因的改良株系,开展了相关研究。
(1)水稻的稻瘟病抗性与敏感为一对　相对性状　。利用川抗30品系与野生型稻瘟病敏感水稻杂交,F1表现为稻瘟病抗性,F1与野生型杂交,子代性状及分离比为　稻瘟病抗性∶敏感=3∶1　,证明Pib和Pikm位于非同源染色体上。
(2)昌恢品系水稻在品质和产量上明显优于川抗30,科研人员结合分子标记技术筛选目标基因进行杂交育种,以获得改良优质水稻。请写出制备优质、高产的纯合双抗(抗螟虫和抗稻瘟病)水稻的杂交育种技术路线(总体思路)。
川抗30与昌恢杂交获得F1,F1与昌恢回交获得F2,利用分子标记技术筛选含有Pib和Pikm基因的植株继续回交昌恢,重复筛选和回交步骤,将Fn所得植株自交,筛选Pib和Pikm纯合的植株。
(3)研究者利用PCR技术检测改良优质水稻中是否含有Pib基因。
①下表为利用PCR进行检测的反应体系的配方,请将表格补充完整。
PCR反应体系
组分 总体积/10 μL
10倍浓缩的扩增缓冲液 1 μL
ⅰ　改良优质水稻的DNA　 1.5 μL
4种脱氧核苷酸等量混合液(2.5 mmol·L-1) 0.5 μL
引物Ⅰ/Ⅱ(5.0 μmol·L-1) 1/1 μL
Taq DNA聚合酶 0.20 μL
H2O ⅱ　4.8 μL　
②如图为Pib基因的部分序列。
根据图1可知,选择　AB　作为引物对Pib基因进行扩增。(多选)　
A.5'-…AATGCCC…-3'
B.5'-…TCCACAT…-3'
C.5'-…TTACGGG…-3'
D.5'-…ATGTGGA…-3'
研究者最终确定改良优质水稻具备了相关抗性基因,成功培育出优质、高产的双抗水稻。
(4)检测发现本研究获得的优质双抗水稻的部分性状与昌恢品系相比出现株高上升、千粒重下降的现象,但是利用基因定点编辑技术获得的纯合抗性突变株系,其他性状未发生改变,原因可能是　与稻瘟病抗性基因在同一条染色体上的基因也被保留下来　。请从育种的角度对这两种技术进行评价。
杂交育种技术简单,但育种周期长;基因编辑技术育种周期短,可定向改变生物的性状,但是技术难度高,存在“脱靶”等潜在风险(合理即可)。
4.(2024东城二模,21)乳酸是一种需求量较大的工业原料,科研人员欲对酿酒酵母进行改造以进行乳酸生产。
(1)培养基中的葡萄糖可作为　碳源　为酿酒酵母提供营养。如图1,酿酒酵母导入乳酸脱氢酶基因后,无氧条件下发酵产物为　乳酸、乙醇　,通过敲除丙酮酸脱羧酶基因获取高产乳酸的工程菌。该菌在有氧和无氧条件下均可产乳酸。
(2)为实现对菌体代谢的动态调控,研究人员设计了光感应系统,并导入绿色荧光蛋白(GFP)基因以检测光感应系统的调控能力。
①如图2,系统1在酵母中表达由V、L和H组成的融合蛋白。光照下,融合蛋白空间结构改变,　结合启动子PC120　后启动下游基因表达;在黑暗状态下,融合蛋白自发恢复到失活状态。
　图3
②分别检测黑暗和光照下系统1的荧光强度,结果如图3。对照组能持续激活GFP表达。实验结果显示　系统1在黑暗中荧光强度极低,光照后荧光强度升高但显著低于对照组　,可知系统1实现了光调控基因表达,但表达量较低。推测可能由于菌体密度高导致透光性差,不利于V-L-H对光照的响应。进一步优化设计出系统2(如图2),同等光照强度下,系统2荧光强度显著高于系统1,分析原因是　系统2中光直接调节GAL4的表达,GAL4进一步调控GFP表达,分级调节具有放大效应　。
③实验中发现黑暗条件下系统2的GFP基因有明显表达,为解决此问题,对系统2增加如图4所示组分,ⅰ、ⅱ、ⅲ依次为　ADF(或AFD)　(填字母序号)。
A.持续表达型启动子　B.PC120　C.PGAL　D.G80基因(G80蛋白可结合并抑制GAL4)　E.GAL4基因(GAL4蛋白可结合并激活PGAL)　F.PSD基因(含有PSD的融合蛋白在光下降解)　
(3)将优化后的系统2中GFP基因替换为乳酸脱氢酶基因,应用于酵母菌合成乳酸的发酵生产。发现在“先黑暗—后光照”的模式下乳酸产量显著高于全程光照的模式,请推测“先黑暗—后光照”模式下乳酸产量高的原因。
发酵早期处于黑暗中,酵母菌不合成乳酸,物质和能量主要用于菌体生长繁殖,当菌体达到一定数量后,照光启动乳酸合成,因此乳酸总产量高。全程光照时,持续合成乳酸,消耗物质和能量较多,影响酵母菌生长繁殖,乳酸总产量低。
5.(2024东城一模,20)东方果蝇会对水果造成严重影响,田间雌蝇数量与经济损失直接相关。
(1)研究发现,东方果蝇中dsx基因　转录　出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制。利用这一特性研发雌性特异性致死基因系统。
(2)蓖麻毒素A(RTA)可通过破坏核糖体导致细胞死亡。研究者获得如图1所示的融合基因1,进而得到转基因果蝇。
①根据图1,扩增dsx内含子应选择的引物是　ad　(选填字母)。
②由于存在性别选择性剪接机制,雌雄转基因果蝇dsx基因前体RNA保留或剪切内含子和剪切识别序列情况不同,产生了不同版本的成熟mRNA,导致雌蝇特异性致死。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为　C　(填字母序号)。转基因的雄性个体不会致死的原因是　在雄性个体中,融合基因1的成熟mRNA含有dsx内含子的对应序列,无法表达完整的RTA蛋白,不会导致细胞死亡　。
(3)研究发现,RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应(cs),即当温度由29 ℃变为18 ℃时,可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白,推测对应的基因碱基序列,经定点突变获得融合基因2(如图2所示)。请在方框中画出可继续延伸的复性结果,要求标明每条链的5'端和3'端。
答案　
②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作:
ⅰ:在29 ℃收集雄性果蝇(G0)。
ⅱ:G0与野生型果蝇杂交,筛选出转基因受精卵(G1)。
ⅲ:将每对亲本的受精卵(G1)均分为两组,分别在18 ℃和29 ℃孵化培养,统计两组中雄性个体所占比例,若　18 ℃组雄性个体所占比例小于29 ℃组　,则说明G1具有cs效应。
ⅳ:在　18　℃继续培养具有cs效应的G1,使之连续多代自交,得到转基因纯合子。
综合拔高练2
一、选择题(每小题只有一个选项符合题意)
1.(2024海淀一模,14)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了如图所示的表达载体,以检测双向启动子的作用效果。下列分析不正确的是(B)
A.可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞
D.可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
2.(2023海淀一模,15)为利用链霉菌生产药物A,研究者构建重组DNA并导入链霉菌。重组DNA含启动子P、药物A基因和Neo基因(卡那霉素抗性基因)。培养和筛选过程如下图所示。
下列叙述不正确的是(D)
A.导入成功的链霉菌细胞内可能发生基因重组
B.诱变处理使培养液中的链霉菌产生不同突变
C.卡那霉素抗性强弱可反映药物A基因的表达量
D.生产药物A最适合选用培养基b上的菌株
二、非选择题
3.(2024海淀二模,21)葡萄糖二酸(GA)可作为原料应用于食品、能源和医药等领域,科研人员通过改造工程菌以实现GA的大量生产。
(1)M酶和U酶是GA合成途径中的两个关键酶,科研人员将图1所示质粒1导入　Ca2+　处理的大肠杆菌,改造后的大肠杆菌可合成GA。
(2)为实现对工程菌合成GA的实时监测,科研人员设计了质粒2,并进行下表所示两种检测方案。
方 案 一 质粒1和2共同导入大肠杆菌菌株E中 在液体培养基中培养一段时间　 菌液分为5组 每组上清液加入适量GA,检测荧光强度
方 案 二 质粒1和2分别导入大肠杆菌菌株E和菌株S中 将E菌液与S菌液混合,混合菌液培养一段时间后分为5组
①据图1分析检测方案的原理为　菌株E可产生GA,GA与C蛋白结合激活GFP基因转录,通过荧光强度反映GA含量　。
②检测结果如图2,据图对比两种方案,并结合两种质粒适用范围,选择其中一种更优方案并说明理由:　方案二更优。理由:与方案一相比,方案二单位菌体密度的荧光强度更高,检测GA更灵敏,且还可检测真核生物合成GA的量　。
(3)进一步发现由于产物GA呈酸性影响了大肠杆菌合成GA的能力,因而科研人员尝试以酵母菌为受体细胞导入质粒1,改造后的酵母菌以葡萄糖为原料合成并分泌GA的途径如图3。但M酶的活性远小于U酶,限制了GA产量。为改进M酶的催化效率,将含不同突变的M酶基因分别导入酵母菌,利用上述所选方案菌株监测不同酵母菌的GA产量,操作为:　将不同酵母菌培养液上清液分别与S菌液混合并培养　,取等量培养液,测定其荧光值和吸光度(反应菌体浑浊程度),　荧光值与吸光度比值　高的菌株即为GA高产菌株。
(4)据图3分析还可以通过　提高I酶和N酶的表达量(合理即可)　等方法改造酵母菌以提高GA的产量。
4.(2024海淀一模,20)温度是影响微生物生长的重要因素,科研人员应用基因工程以实现通过温度控制工程菌合成所需物质。
(1)大肠杆菌是一种常见的微生物,常被改造为基因工程菌,其原因包括　遗传背景清晰、转基因操作简单、繁殖速度快、易于培养等　(写出2点)。
(2)为实现温度控制蛋白质合成,科研人员设计了方案1,构建表达载体(见图1),将其导入大肠杆菌,获得转基因工程菌。大肠杆菌在30 ℃和37 ℃均可生长和繁殖,当培养温度为30 ℃时,C基因编码的C蛋白形成二聚体,　抑制启动子R,F蛋白不表达,解除F蛋白对启动子N的抑制　,因而大肠杆菌表达　绿色　荧光蛋白。
(3)为更精准调控荧光蛋白表达,将上述表达载体改造为方案2中的载体(见图2)。与方案1相比,方案2的主要优势是　30 ℃条件下减弱红色荧光蛋白表达带来的荧光干扰,且降低对绿色荧光蛋白表达的抑制　。
(4)为检测方案2,科研人员将该方案中的工程菌稀释涂布在固体培养基上,形成单菌落,培养温度周期控制见图3,依据方案2,每个菌落生长2天后可出现4个不同的荧光环带,请预测图4所示菌落每个环带的工程菌中荧光蛋白表达情况,在表1中按时间顺序,依次写出所表达荧光蛋白的颜色。
　　
菌落环带 1 2 3 4
所表达荧光 蛋白的颜色 红、绿、 红、绿 绿、红、 绿 红、 绿 绿
表1
(5)聚羟基脂肪酸酯(PHA)常用于制备可降解的塑料包装材料。PHA是一种生物大分子,可由单体分子3HB和4HB随机聚合,或通过分段聚合形成嵌段共聚物(见图5),其中嵌段共聚物性能更优。共聚物的合成过程如图5。请完善表2,通过改造方案2以实现应用工程菌大规模生产优质PHA(不考虑各种酶在不同温度下的活性差异)。
操作 目的
对方案2表达载体的改造为:　将GFP基因替换为A、B酶基因,RFP基因替换为D、E酶基因,加入持续表达启动子连接的X酶基因　。 将构建好的表达载体导入大肠杆菌,获得工程菌 获得可以合成PHA的工程菌
以葡萄糖为原料配置培养基,灭菌后加入上述工程菌 配置培养基、接种
控制发酵条件:　30 ℃发酵12小时,随后切换至37 ℃发酵36小时　 发酵48小时,获得3HB比例为25%的嵌段共聚物
表2
5.(2024丰台一模,17)研究人员利用水稻突变体对相关基因进行研究。
(1)将水稻“中花11”的叶片愈伤组织与农杆菌共培养,外源T-DNA(含bar标记基因)会整合到水稻基因组,获得水稻突变体库。该突变体库中包含株高、叶色、叶型、育性、分蘖数等明显性状改变,构建该突变体库的过程中,引起性状改变的原因可能有　ABCD　。(多选)
A.实验操作中其他微生物的污染
B.实验过程中偶然接触紫外线或化学药品
C.DNA复制过程中的DNA序列变化
D.外源T-DNA的插入导致DNA序列变化
E.组织培养过程中染色体的互换
(2)对突变体库进行自交和表型筛选获得纯合的早衰突变体。为研究早衰突变与T-DNA整合之间的关系,将纯合的早衰突变体与“中花11”回交之后,分析F2的性状分离情况和对bar基因的PCR检测结果:
①若F2的正常植株∶早衰植株=3∶1,则突变体的早衰性状是由　隐性单基因　控制的;
②若F2的所有植株中含bar基因与不含bar基因之比为3∶1,则T-DNA是单个插入;
③若F2的　早衰突变体全部具有bar基因　,则该突变为T-DNA插入引起。
经检验,实验结果与预期相符。请在图1中标出bar基因(用表示)可能的位置。
答案　
(3)为获得该衰老相关基因,研究人员设计了外源接头介导的PCR进行扩增,主要过程见图2。外源接头包括长单链接头和短单链接头,二者部分互补。以长单链接头的部分序列为引物a和b,根据T-DNA已知序列设计引物c、d、e、f。
实验的主要流程为:用限制酶切割基因组DNA产生多种片段→分别连接上外源接头→以d为引物合成一条子链,再以　a　为引物合成互补链,得到PCR产物1→为减少非特异性扩增,以　bc　为引物进行PCR得到产物3(同理得到产物2和产物4)→对产物3和产物4进行序列分析和功能鉴定。
(4)引起衰老的主要因素有环境因素、植物激素的调节和　基因的表达　等。该研究为延缓水稻衰老、提高水稻产量提供了理论依据。
(
第
27
页 共
27
页
)