2025届高三生物一轮复习课件：基因工程(共139张PPT)
文档属性
| 名称 | 2025届高三生物一轮复习课件：基因工程(共139张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 28.5MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-10-25 09:59:03 | ||
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文档简介
(共139张PPT)
第35讲 基因工程
重组DNA技术的基本工具
基因工程的应用
基因工程的基本操作程序
蛋白质工程的原理和应用
重组DNA技术的基本工具
基因工程发展历程及概念
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
基因工程的发展历程及概念
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
I 科技探索之路 I
基因工程的发展历程及概念
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
1.操作环境：
2.原理：
3.操作对象：
4.操作水平：
5.结果：
体外环境
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
6.意义：
基因工程概念
基因工程的发展历程及概念
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.所有生物几乎共用一套遗传密码
复制
基因工程理论基础
从社会中来（教材P70）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
重组DNA技术的基本工具
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
来源：主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
功能：识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
EcoR I 限制酶：
黏性末端
黏性末端
只能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开,产生粘性末端。
产生了几个游离的磷酸基团
产生几个末端？
2
2
原核生物
（特异性）
作用的化学键：
磷酸二酯键
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
Sma I 限制酶：
只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开，产生平末端。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
①大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶的名字的由来 P72
6
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
大肠杆菌R型菌株分离出来的第一种限制酶
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
限制酶所识别的序列有什么特点？
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线对称排列。
读：5’→ 3’
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
例：限制性EcoRI的识别序列和切点是－G↓AATCC－，补充完整切割过程图：
限制性SmaI的识别序列和切点是－GGG↓CCC－，补充完整切割过程图：
—G
—CTTAA
AATTC—
G—
—GAATTC—
—CTTAAG—
EcoRI
—GGG
—CCC
CCC—
GGG—
—GGGCCC—
—CCCGGG—
Sma I
黏性末端
平末端
两种末端的正确书写
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1、写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcoR Ⅰ: Hind Ⅲ: Bgl Ⅱ:
_______________________________________________________
－GATC－
－AATT－
－AGCT－
－GATC－
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
【现学现用】
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
2、要想从一个DNA分子中获得某个特定的基因需要有几个酶切位点？
产生几个末端？
2
4
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AAT TCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
使用EcoRⅠ酶剪切目的基因
识别序列GAATTC
在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性内切核酸酶切割，会产生4个末端。
【现学现用】
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
旁栏思考 P71
细菌
细菌
细菌
限制酶
2、推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
1、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
想一想：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1. 作用：
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
2. 种类：
类型 来源 作用
相同点 差别
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端(效率较低)
DNA连接酶
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
3、E·coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接粘性末端
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的“缝隙”“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
4、T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将游离的单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA酶
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②⑤
a：磷酸二酯键；b：氢键
【现学现用】
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1、作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2、种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
最常用的载体——质粒:
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核DNA
质粒
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
大肠杆菌及质粒结构模式图
载体
思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.载体需具备的条件：
质粒
→供目的基因插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
⑵有一个至多个限制酶切割位点
⑶具有标记基因
⑷对受体细胞无害、易分离
——便于鉴定和筛选
⑴能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
能进入受体细胞并在受体细胞内复制和表达；
选择酶切位点的原则：
1.选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2.所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
普通培养基
不含抗生素
选择培养基50 g/ml四环素
标记基因的筛选原理
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
【现学现用】
思考·讨论（教材P73）
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
实验原理：
1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液
补充：在0.14mol/LNaCl溶液溶解度最低
3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取
基础知识：
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
溶解DNA：
用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
析出DNA：
用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等都可以作为实验材料，但提取DNA的方法可能稍有不同
不能，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
1、实验材料：
思考：能否选取牛、羊、猪等哺乳动物成熟的红细胞作为DNA提取的材料？
材料选择：
2、选取原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是，选用DNA含量相对较高
的组织，成功的可能性更大。
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
实验试剂：
研磨液
试剂 中文名称 作用
Tris 三羟甲基氨基甲烷 维持缓冲液pH值
EDTA 乙二胺四乙酸 抑制DNA水解酶，防止DNA被水解
SDS 十二烷基硫酸钠 使蛋白质变形，与DNA发生分离
Hcl 盐酸，浓度：2mol/l 将溶液调节pH至8
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
1、研磨
实验步骤：
2、过滤
3、析出
4、鉴定
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
方法二：可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中
1、研磨
2、过滤
①低温抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出
问题一：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质
问题二：低温放置几分钟的作用是什么？
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
注意：搅拌时应轻缓、并沿一个方向，减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
3、析出
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
实验组
对照组
水浴加热
4、鉴定
对照组：2mol/L的NaCl溶液5mL+4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min
—（现象）—试管内溶液呈无色
实验组：2mol/L的NaCl溶液5mL+丝状物或沉淀物+4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min
—（现象）—试管内溶液呈蓝色
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
①观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多
②二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。
结果分析与评价：
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
DNA片段的扩增及电泳鉴定
从社会中来（教材P76）
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
培育转基因抗虫棉的简要过程：
基因工程的基本操作程序
获：目的基因的筛选与获取
构：基因表达载体的构建
导：将目的基因导入受体细胞
检：目的基因的检测和鉴定
(核心)
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因
实例：
基因结构：
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
原核细胞基因结构
终止子
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
终止转录
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
间隔的、不连续的
内含子
外显子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
真核细胞基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？
启动子
终止子
内含子
外显子
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
第一步：目的基因的筛选与获取——筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
测序技术
序列数据库
(如GenBank)
序列比对工具
(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
（1）从基因文库中获取；（2）人工合成； （3）利用PCR技术扩增；
基因文库类型
基因组文库
cDNA文库
（包含一种生物的所有基因）
（包含一种生物的一部分基因）
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知：
目的基因的核苷酸序列已知
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
提取某种生物的全部DNA
一定大小的DNA片段
导入受体菌中储存
用适当的限制酶切
将DNA片段与载体连接
基因组文库
基因组文库的构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
成熟mRNA
成熟mRNA
cDNA文库
成熟mRNA
部分基因文库构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
基因组文库和 cDNA 基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
通过DNA合成仪直接人工合成
（1）前提：
（2）方法：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction )的缩写
DNA半保留复制的原理。
是一项在体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
利用PCR获取和扩增目的基因
原理：
PCR:
DNA复
制
的
基
本
条
件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外-高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
PCR所需要的条件
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
什么是引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键
-5 ′
3 ′ -
引物
5 ′ -
-3 ′
5 ′ -
-3 ′
引物
3 ′ -
-5 ′
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
参与的组分 在PCR的作用
目的基因DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
缓冲液
Mg2+
高温
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
维持反应体系的pH
激活DNA聚合酶的活性
PCR所需要的条件及其作用
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
PCR过程
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第1步：变性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
当温度超过90℃时，
双链DNA解旋为单链。
95℃
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5′-
-3′
3′-
5’
3′-
-5′
5′-
-3′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
PCR过程归纳总结
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列
结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
耐高温的DNA聚合酶
引物的3 ′端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
变性：加热至90℃以上，___________________;
复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；
延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行
互补链的合成。如此重复循环多次。
双链DNA解聚为单链
50
耐高温的DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因条件
①____：DNA的两条链。
②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
③原料：A、T、G、C四种__________。
④酶： 酶。
⑤其他条件：需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。
模板
引物
脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合
缓冲
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，
因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，
即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
思考:用PCR可以扩增mRNA吗？
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
扩增产物的鉴定
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
第一次扩增
引物A
引物B
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
第二次扩增
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
第三次扩增
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
第四次扩增
中长链-短链DNA____个
6
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
15
15
短链-短链DNA______个
8
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
第一步：目的基因的筛选与获取——DNA复制与PCR比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作
第二步：基因表达载体的构建
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建过程
1.用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端.
2.用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
3.将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
思考
第二步：基因表达载体的构建
①单酶切
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
第二步：基因表达载体的构建
②双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
第二步：基因表达载体的构建
【现学现用】
请结合下图，回答问题：
构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
第二步：基因表达载体的构建
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
第二步：基因表达载体的构建
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
第三步：将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
方法
植物细胞：
动物细胞：
微生物细胞：
花粉管通道法、农杆菌转化法（最多）
显微注射技术
Ca2+处理法(感受态细胞法)
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法。
①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
第三步：将目的基因导入受体细胞
花粉管通法的优点
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进
入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的
DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株
的全套人工培养过程。
受体细胞：
受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法
①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。
采用最多
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
受体细胞
稳定
表达
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
方法
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为_______
体细胞
受体细胞为_______
受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
将目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒
重组Ti质粒转入__________
转化植物细胞
目的基因插入植物细胞中的________________上
目的基因在植物细胞中稳定存在并__________
表达
目的基因
T-DNA
农杆菌
染色体DNA
第三步：将目的基因导入受体细胞
①两次拼接
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体
细胞染色体的DNA上。
第三步：将目的基因导入受体细胞
②两次导入
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
将目的基因导入动物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
常用法：
常用菌：
微生物作受体细胞原因：
Ca2+处理法（感受态细胞法）
受体细胞：
Ca2+
感受态细胞
吸收
将目的基因导入微生物细胞
大肠杆菌
原核细胞
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ca2+
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
感受态细胞
吸收
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
表达载体
缓冲液
溶于
吸收DNA，完成转化
Ca2+处理法
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
第四步：目的基因的检测与鉴定
检测
鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插
入了目的基因
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
1.分子水平的检测
①检测目的基因是否导入
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
是否扩增出目的基因
PCR操作
电泳操作
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
Marker
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
方法2： DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
酶切
转膜
标记的DNA/RNA探针
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
提取RNA
转膜
标记的DNA/RNA探针
RNA
②检测目的基因是否转录
方法1： RT-PCR扩增
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
PCR操作
电泳
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
方法2： 分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
③检测目的基因是否翻译
方法：抗原— 抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
第四步：目的基因的检测与鉴定——个体水平的检测
2.个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等
棉铃虫
棉铃虫（死亡）
第四步：目的基因的检测与鉴定——个体水平的检测
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐碱植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
一定浓度的盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
第四步：目的基因的检测与鉴定
课堂小结
目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞-关键
花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物);
目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
1.试剂：
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
2.用具：
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
电泳装置
PCR仪
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
1.PCR加样
材料 用量
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
方法步骤
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
2.离心：
3.扩增：
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
DNA片段的扩增
加样
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
5.制备凝胶
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，
以形成加样孔。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
方法步骤
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
4.配制琼脂糖溶液：
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
6.电泳加样
凝胶载样缓冲液类似层析液
7.电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
注意事项
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
结果分析与评价
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，
请分析产生这个结果的可能原因。
基因工程的应用
基因工程在农牧业方面的应用
03
基因工程在医药卫生方面的应用
基因工程在食品工业方面的应用
从社会中来（教材P87）
胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。传统生产胰岛素的方法是从猪、牛等动物的胰腺中获取。曾经生产供一位糖尿病病人使用一年的胰岛素需要上千头牛，生产的成本非常高。
1978年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。
我国拥有自主知识产权的基因工程物——重组人胰岛素已经研制成功并得到广泛应用。
除了生产胰岛素，基因工程还有那些应用呢？
基因工程在农牧业方面的应用——
植物方面
1、转基因抗虫植物
转基因抗虫水稻（绿）与对照（黄）
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。
例如：
转基因抗虫棉、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2、转基因抗病植物
转基因抗病毒甜椒
科学家将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。
例如：
抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等
基因工程在农牧业方面的应用——
植物方面
3、转基因抗除草剂植物
大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。
将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。
例如：
已获得转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等
4、改良作物品质
利用转基因技术改良植物的营养价值、观赏价值等。
例如：
我国科学家将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高观赏价值。
呈现自然界没有的颜色变异，提升观赏价值
含大量维生素的转基因玉米
基因工程在农牧业方面的应用——
动物方面
1、提升动物的生长速率
转入外源生长激素基因的“超级小鼠”
由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率
例如：
转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%~115%
2、改善畜产品的品质
有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受
低乳糖奶牛
例如：
将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，其他营养成分不受影响。
基因工程应用——
医药卫生领域
对微生物或动植物细胞进行基因改造，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。
包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，可用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。
我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
基因工程的应用——
医药卫生领域
通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—40mg干扰素
干扰素是一种具有干扰素病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病
传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，300L血才提取1mg！
基因工程的应用——
医药卫生领域
1、利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物，如乳腺生物反应器
将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控原件重组。获得转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
目前，科学家已在牛、山羊等乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α -抗胰蛋白酶等重要医药产品。
人治疗性抗体转基因奶牛
基因工程的应用——
医药卫生领域
乳 腺 生 物 反 应 器 的 操 作 过 程
获取目的基因
构建基因表达载体
导入哺乳动物受精卵
培养成早期胚胎
将胚胎送入母体动物
发育成转基因动物
(如药用蛋白基因、人生长素基因等)
药用蛋白质基因前端加上乳腺蛋白基因启动子等调控元件
利用显微注射法
通过分泌乳汁来生产所需的药物
基因工程的应用——
医药卫生领域
思考
成果：
目前，科学家已在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和ɑ-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。
优点：
产量高、质量好、成本低、易提取
膀胱生物反应器和乳腺生物反应器一样吗？
膀胱生物反应器是外源基因在膀胱上皮细胞中表达的转基因动物。
收集蛋白比较容易，不对动物造成伤害。可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否处于生殖期，从动物的尿液中提取产物比从乳汁中提取更方便
基因工程的应用——
医药卫生领域
2、用转基因的动物作器官移植的供体
选择猪的器官作人体移植器官替代品的原因？
① 猪内脏的构造、大小、血管分布等与人极为相似
② 猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物
免疫排斥反应
最大障碍：
对猪器官的改造方法：
向器官供体基因组导入某种调节因子，抑制或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官
基因工程的应用——
食品工业方面
利用基因工程菌除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
基因工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
例如：
②奶酪生产需要凝乳酶固化奶中蛋白质，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
③加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
①阿巴斯甜——一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。
基因工程在其他方面的应用
基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。
利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。
基因工程将能分解三种烃类的假单孢杆菌的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌”。
环境监测和净化
课堂小结
一、基因工程在农牧业方面的应用
基因工程的应用
1.转基因抗虫植物
2.转基因抗病植物
3.转基因抗除草剂植物
4.改良植物的品质
5.提高动物的生长速率
6.改善畜产品的品质
二、基因工程在医药卫生领域的应用
三、基因工程在食品工业方面的应用
1.对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能
够生产药物。
2.利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物，
如乳腺生物反应器。
3.用转基因动物作器官移植的供体等。
蛋白质工程的原理和应用
04
蛋白质工程崛起的缘由
蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程的应用
从社会中来（教材P93）
用细菌 “画”的画
你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。
那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
蛋白质工程
蛋白质工程
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
基 础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
途 径
改造或合成基因
目 的
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
对 象
基因
蛋白质工程——蛋白质工程崛起的缘由
基因工程的实质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
基因工程的不足
只能生产自然界已存在的蛋白质
天然蛋白质的不足
天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
蛋白质工程的目的
生产符合人类生产和生活的需要的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程崛起的缘由
玉米中赖氨酸的含量较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶-----天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大。
赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高
玉米中赖氨酸含量比较低
天冬氨酸激酶
（352位的苏氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）
天冬氨酸激酶
（异亮氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶
（异亮氨酸）
玉米中赖氨酸含量提高数倍
改造
改造
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
目 标
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
原 理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
天然蛋白质合成的过程：
基因 表达（转录和翻译） 形成具有特定氨基酸序列的多肽链
形成具有高级结构的蛋白质 行使生物功能
蛋白质工程是怎样的呢？
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
蛋白质
（三维结构）
预期功能
生物功能
翻译
折叠
行使
转录
设计
推测
改造或合成
mRNA
目的基因
从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因 获得所需要的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
思考
蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程的不同点？
基因工程是遵循中心法则，DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，
基本上是生产出自然界已有的蛋白质。
蛋白质工程的思路：
确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，创造出自然界不存在的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？
是否合成新的基因
蛋白质工程
是否对原有基因进行改造
是
否
是
否
蛋白质工程
基因工程
看蛋白质
看基因
是否为天然蛋白质
是
否
蛋白质工程
基因工程
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
确定基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
基因定点诱变技术的示意图
适应范围：
空间结构完全清楚的蛋白质
操作方法：
PCR法
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期结构
改 造
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
转录
mRNA
折
叠
预期功能
行使功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20-29位氨基酸组成
推测序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
1、研发速效胰岛素类似物已经在临床上广泛应用
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
2.医药卫生方面——延长干扰素体外保存时间
天然干扰素不易保存
预期结构
改 造
一个半胱氨酸变成丝氨酸
新干扰素基因
转录
mRNA
折
叠
预期功能
行使功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
推测序列
翻译
多肽链
在-70℃下可以保存半年
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
通过__________，将小鼠抗体上___________的区域（即_______）“嫁接”到_________（即________）上，经过这样改造的抗体 __________________________。
改造基因
结合抗原
可变区
人的抗体
恒定区
诱发免疫反应的强度就会降低很多
①改进酶的性能或开发新的工业用酶。
②尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加
粮食的产量。
③改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
4.其他
3.降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因是：
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
5.蛋白质工程现状
思考
为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质。
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。
课堂小结
蛋白质工程概述
蛋白质工程的原理和应用
蛋白质工程崛起的缘由
蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程的应用
第35讲 基因工程
重组DNA技术的基本工具
基因工程的应用
基因工程的基本操作程序
蛋白质工程的原理和应用
重组DNA技术的基本工具
基因工程发展历程及概念
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
基因工程的发展历程及概念
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
I 科技探索之路 I
基因工程的发展历程及概念
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
1.操作环境：
2.原理：
3.操作对象：
4.操作水平：
5.结果：
体外环境
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
6.意义：
基因工程概念
基因工程的发展历程及概念
理论基础
1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)
2.都遵循碱基互补配对原则
3.DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
理论基础
1.基因是控制生物性状的结构与功能单位
2.遗传信息传递都遵循中心法则
3.所有生物几乎共用一套遗传密码
复制
基因工程理论基础
从社会中来（教材P70）
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒侵染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
转基因番木瓜
DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
重组DNA技术的基本工具
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
来源：主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
功能：识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
EcoR I 限制酶：
黏性末端
黏性末端
只能识别GAATTC序列,并在G和A之间切开,产生粘性末端。
产生了几个游离的磷酸基团
产生几个末端？
2
2
原核生物
（特异性）
作用的化学键：
磷酸二酯键
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
Sma I 限制酶：
只能识别CCCGGG序列,并在C和G之间切开，产生平末端。
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
①大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
②限制酶的名字的由来 P72
6
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
大肠杆菌R型菌株分离出来的第一种限制酶
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
限制酶所识别的序列有什么特点？
EcoRⅠ
5’…G-A-A-T-T-C…3’
3’…C-T-T-A-A-G…5’
SmaⅠ
5’…C-C-C-G-G-G…3’
3’…G-G-G-C-C-C…5’
TaqⅠ
5’……T-C-G-A……3’
3’……A-G-C-T……5’
能被限制性酶特异性识别的序列一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线对称排列。
读：5’→ 3’
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
例：限制性EcoRI的识别序列和切点是－G↓AATCC－，补充完整切割过程图：
限制性SmaI的识别序列和切点是－GGG↓CCC－，补充完整切割过程图：
—G
—CTTAA
AATTC—
G—
—GAATTC—
—CTTAAG—
EcoRI
—GGG
—CCC
CCC—
GGG—
—GGGCCC—
—CCCGGG—
Sma I
黏性末端
平末端
两种末端的正确书写
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
1、写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamH Ⅰ: EcoR Ⅰ: Hind Ⅲ: Bgl Ⅱ:
_______________________________________________________
－GATC－
－AATT－
－AGCT－
－GATC－
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
【现学现用】
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
2、要想从一个DNA分子中获得某个特定的基因需要有几个酶切位点？
产生几个末端？
2
4
CT TCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGAT T
GGCATCTTAA
AAT TCCGTAG
GGCATCTTAA
AATTCCGTAG
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
CTTCATG AATTCCCTAA
GAAGTACTTAA GGGATT
使用EcoRⅠ酶剪切目的基因
识别序列GAATTC
在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性内切核酸酶切割，会产生4个末端。
【现学现用】
一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
旁栏思考 P71
细菌
细菌
细菌
限制酶
2、推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
1、为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
想一想：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
缺口怎么办？
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
1. 作用：
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
2. 种类：
类型 来源 作用
相同点 差别
E.coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端(效率较低)
DNA连接酶
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
3、E·coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接粘性末端
两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来
可把黏性末端之间的“缝隙”“缝合”起来，
注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
4、T4 DNA连接酶可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，效率低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同点 作用实质
化学本质
不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将游离的单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
与DNA相关的几种酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用 部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用 对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA
作用 结果 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA酶
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②⑤
a：磷酸二酯键；b：氢键
【现学现用】
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1、作用：将外源基因送入受体细胞&在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2、种类：质粒、噬菌体和动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
最常用的载体——质粒:
一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核DNA
质粒
氨苄青霉素抗性基因
目的基因插入位点
复制原点
大肠杆菌及质粒结构模式图
载体
思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
3.载体需具备的条件：
质粒
→供目的基因插入其中
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
⑵有一个至多个限制酶切割位点
⑶具有标记基因
⑷对受体细胞无害、易分离
——便于鉴定和筛选
⑴能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
能进入受体细胞并在受体细胞内复制和表达；
选择酶切位点的原则：
1.选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；
2.所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
普通培养基
不含抗生素
选择培养基50 g/ml四环素
标记基因的筛选原理
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
例：选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌筛选出来。
（1）在培养细菌的培养基中添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。
（2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。
①或②
①
【现学现用】
思考·讨论（教材P73）
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
实验原理：
1、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
2、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液
补充：在0.14mol/LNaCl溶液溶解度最低
3、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取
基础知识：
0
0.14
NaCI浓度（mol/L）
DNA溶解度
溶解DNA：
用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
析出DNA：
用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等都可以作为实验材料，但提取DNA的方法可能稍有不同
不能，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
1、实验材料：
思考：能否选取牛、羊、猪等哺乳动物成熟的红细胞作为DNA提取的材料？
材料选择：
2、选取原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是，选用DNA含量相对较高
的组织，成功的可能性更大。
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
①研磨液
②体积分数为95%的酒精
③2mol/L 的NaCl溶液
④二苯胺试剂
⑤蒸馏水
含有EDTA、SDS、Tris和HCl
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
实验试剂：
研磨液
试剂 中文名称 作用
Tris 三羟甲基氨基甲烷 维持缓冲液pH值
EDTA 乙二胺四乙酸 抑制DNA水解酶，防止DNA被水解
SDS 十二烷基硫酸钠 使蛋白质变形，与DNA发生分离
Hcl 盐酸，浓度：2mol/l 将溶液调节pH至8
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
1、研磨
实验步骤：
2、过滤
3、析出
4、鉴定
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液
方法二：可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中
1、研磨
2、过滤
①低温抑制DNA水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
②抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出
问题一：上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖、RNA等杂质
问题二：低温放置几分钟的作用是什么？
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
注意：搅拌时应轻缓、并沿一个方向，减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
3、析出
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA
方法一：用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分
方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干
实验组
对照组
水浴加热
4、鉴定
对照组：2mol/L的NaCl溶液5mL+4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min
—（现象）—试管内溶液呈无色
实验组：2mol/L的NaCl溶液5mL+丝状物或沉淀物+4mL的二苯胺试剂，沸水中加热5min
—（现象）—试管内溶液呈蓝色
[探究·实践]DNA的粗提取与鉴定
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
①观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多
②二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。
结果分析与评价：
基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
DNA片段的扩增及电泳鉴定
从社会中来（教材P76）
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
培育转基因抗虫棉的简要过程：
基因工程的基本操作程序
获：目的基因的筛选与获取
构：基因表达载体的构建
导：将目的基因导入受体细胞
检：目的基因的检测和鉴定
(核心)
第一步：目的基因的筛选与获取
目的基因：
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要指的是编码蛋白质的基因
实例：
基因结构：
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。
非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。
基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
连续的、不间隔的
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
本质：
位置：
作用：
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
原核细胞基因结构
终止子
本质：
位置：
作用：
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
终止转录
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
终止子
间隔的、不连续的
内含子
外显子
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。
能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列。
真核细胞基因结构
第一步：目的基因的筛选与获取——基因结构
真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？
启动子
终止子
内含子
外显子
转录
初级RNA
成熟mRNA
剪切、拼接
第一步：目的基因的筛选与获取——筛选合适的目的基因
从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一。
认识基因结构和功能的技术方法
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
测序技术
序列数据库
(如GenBank)
序列比对工具
(如BLAST)
测定核酸和蛋白质序列
以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库
把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
（1）从基因文库中获取；（2）人工合成； （3）利用PCR技术扩增；
基因文库类型
基因组文库
cDNA文库
（包含一种生物的所有基因）
（包含一种生物的一部分基因）
从基因文库中寻找
聚合酶链式反应（PCR）扩增
化学合成法
目的基因的核苷酸序列未知：
目的基因的核苷酸序列已知
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
提取某种生物的全部DNA
一定大小的DNA片段
导入受体菌中储存
用适当的限制酶切
将DNA片段与载体连接
基因组文库
基因组文库的构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
成熟mRNA
成熟mRNA
cDNA文库
成熟mRNA
部分基因文库构建模式图
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
基因组文库和 cDNA 基因文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子
基因中内含子
基因多少
物种间基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
第一步：目的基因的筛选与获取——目的基因的获取方法
通过DNA合成仪直接人工合成
（1）前提：
（2）方法：
基因比较小、核苷酸序列已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
聚合酶链式反应( Polymerase Chain Reaction )的缩写
DNA半保留复制的原理。
是一项在体外对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
利用PCR获取和扩增目的基因
原理：
PCR:
DNA复
制
的
基
本
条
件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（体外-高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
DNA模板
引物（2种）
稳定的缓冲溶液
（一般添加Mg2+）
四种脱氧核苷酸(dNTP)
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
PCR所需要的条件
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。
什么是引物
子链延伸
子链延伸
引物是决定PCR特异性的关键
-5 ′
3 ′ -
引物
5 ′ -
-3 ′
5 ′ -
-3 ′
引物
3 ′ -
-5 ′
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
参与的组分 在PCR的作用
目的基因DNA
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
引物
缓冲液
Mg2+
高温
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
维持反应体系的pH
激活DNA聚合酶的活性
PCR所需要的条件及其作用
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
DNA解链为单链
高温(95℃)变性
低温(50℃)复性
中温(72℃)延伸
引物结合到互补DNA链
Taq酶从引物起始进行子链的合成
PCR过程可以在PCR扩增(PCR仪)中自动完成。
PCR过程
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第1步：变性
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
当温度超过90℃时，
双链DNA解旋为单链。
95℃
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
5 ′-
3 ′-
-3 ′
-5 ′
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第2步：复性
当温度下降到50℃左右时，
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
50℃
长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
第3步：延伸
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
5 ′-
-3 ′
-5 ′
3 ′-
当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
72℃
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。
5′-
-3′
3′-
5’
3′-
-5′
5′-
-3′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
5′-
-3′
3′-
-5′
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
PCR过程归纳总结
目的基因DNA________后________，____与单链相应互补序列
结合；然后以_________为模板在 作用下进行_____，即将4种___________加到___________，如此重复循环多次。
受热变性
解为单链
引物
延伸
单链DNA
耐高温的DNA聚合酶
引物的3 ′端
脱氧核苷酸
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
变性
复性
延伸
变性：加热至90℃以上，___________________;
复性：冷却至 ℃左右，引物与单链DNA结合；
延伸：加热至72℃左右， 从引物起始进行
互补链的合成。如此重复循环多次。
双链DNA解聚为单链
50
耐高温的DNA聚合酶
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因条件
①____：DNA的两条链。
②____：分别与模板DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段。
③原料：A、T、G、C四种__________。
④酶： 酶。
⑤其他条件：需要一定的 溶液和能严格控制温度的温控设备。
模板
引物
脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合
缓冲
由于延伸后得到的_____又可以作为下一个循环的_____，
因而每一次循环后目的基因的量可以增加_____，
即呈_____形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
产物
模板
一倍
指数
思考:用PCR可以扩增mRNA吗？
第一步：目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因
扩增产物的鉴定
琼脂糖凝胶电泳
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
1
1
第一次扩增
引物A
引物B
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
中长链-短链DNA____个
2
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
3
3
第二次扩增
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
第三次扩增
中长链-短链DNA____个
4
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
7
7
短链-短链DNA______个
2
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
第四次扩增
中长链-短链DNA____个
6
长链-中长链DNA____个
含有引物A的DNA____个
含有引物B的DNA____个
2
15
15
短链-短链DNA______个
8
第一步：目的基因的筛选与获取——PCR相关计算
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次
DNA总数 21 22 23 24 2n
长链-中长链DNA
中长链-短链DNA
短链-短链 DNA
含引物A(或B) 的DNA
2
0
0
2
2
2
4
0
2
2
6
8
2
2(n-1)
2n-2n
1
3
7
15
2n-1
第一步：目的基因的筛选与获取——DNA复制与PCR比较
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋
场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）
温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行
结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因
联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP） ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建是基因工程的核心工作
第二步：基因表达载体的构建
质粒
标记基因
复制原点
启动子
终止子
限制酶切位点
位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。
位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。
供目的基因插入载体中
便于重组DNA的筛选
能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上
第二步：基因表达载体的构建
基因表达载体的构建过程
1.用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口，露出黏性末端.
2.用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
3.将切下的目的基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。
用DNA连接酶处理后会出现几种产物？
思考
第二步：基因表达载体的构建
①单酶切
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
第二步：基因表达载体的构建
②双酶切的优点:
防止质粒重新环化
防止质粒与目的基因反向连接
防止目的基因自身环化
第二步：基因表达载体的构建
【现学现用】
请结合下图，回答问题：
构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？
不能
因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。
质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
第二步：基因表达载体的构建
【核心归纳】图解限制酶的选择原则
（1）不破坏目的基因原则：
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
第二步：基因表达载体的构建
（3）确保出现相同黏性末端原则：
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？
可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
第三步：将目的基因导入受体细胞
常用的受体细胞：
有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。
方法
植物细胞：
动物细胞：
微生物细胞：
花粉管通道法、农杆菌转化法（最多）
显微注射技术
Ca2+处理法(感受态细胞法)
由于受体细胞有植物、动物、微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建也会有差别。
第三步：将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
我国科学家独创的一种方法。
①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
第三步：将目的基因导入受体细胞
花粉管通法的优点
①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进
入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的
DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。
②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株
的全套人工培养过程。
受体细胞：
受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.农杆菌转化法
①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。
采用最多
第三步：将目的基因导入受体细胞
转化
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程。
受体细胞
稳定
表达
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。
方法
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为_______
体细胞
受体细胞为_______
受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ti质粒
目的基因
构建表达载体
含目的基因的重组Ti质粒
转入
农杆菌
含重组Ti质粒的农杆菌
导入植物细胞
表现出新性状的植物
将目的基因插入染色体DNA中
植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
__________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒
重组Ti质粒转入__________
转化植物细胞
目的基因插入植物细胞中的________________上
目的基因在植物细胞中稳定存在并__________
表达
目的基因
T-DNA
农杆菌
染色体DNA
第三步：将目的基因导入受体细胞
①两次拼接
第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；
第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体
细胞染色体的DNA上。
第三步：将目的基因导入受体细胞
②两次导入
第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；
第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
第三步：将目的基因导入受体细胞
（1）方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
将目的基因导入动物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
常用法：
常用菌：
微生物作受体细胞原因：
Ca2+处理法（感受态细胞法）
受体细胞：
Ca2+
感受态细胞
吸收
将目的基因导入微生物细胞
大肠杆菌
原核细胞
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
第三步：将目的基因导入受体细胞
Ca2+
用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。
感受态细胞
吸收
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
表达载体
缓冲液
溶于
吸收DNA，完成转化
Ca2+处理法
使大肠杆菌处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态
第三步：将目的基因导入受体细胞
受体细胞 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法、花粉管通道法 显微注射技术 感受态细胞法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 以农杆菌转化法为例： 将目的基因插入Ti质粒的T DNA上 ↓ 转入农杆菌中 ↓ 导入植物细胞 ↓ 整合到受体细胞的DNA上 提纯含目的基 因的表达载体 ↓ 显微注射 ↓ 受精卵发育 ↓ 具有新性 状的个体 Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
第四步：目的基因的检测与鉴定
检测
鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插
入了目的基因
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
1.分子水平的检测
①检测目的基因是否导入
方法1：PCR扩增
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
是否扩增出目的基因
PCR操作
电泳操作
非转基因棉花
转基因抗虫棉
阴性对照
Marker
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
方法2： DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理：
酶切
转膜
标记的DNA/RNA探针
DNA分子杂交（Southern-blot)流程图
原因：带标记的基因探针，与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
提取RNA
转膜
标记的DNA/RNA探针
RNA
②检测目的基因是否转录
方法1： RT-PCR扩增
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
PCR操作
电泳
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
方法2： 分子杂交技术
RNA分子杂交(Northern Blot)流程图
第四步：目的基因的检测与鉴定——分子水平的检测
③检测目的基因是否翻译
方法：抗原— 抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
第四步：目的基因的检测与鉴定——个体水平的检测
2.个体水平的检测
检测目的基因是否表现出相应的性状
方法：抗虫鉴定、抗病鉴定等
棉铃虫
棉铃虫（死亡）
第四步：目的基因的检测与鉴定——个体水平的检测
个体生物学水平的鉴定具体方法举例
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐碱植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
一定浓度的盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
第四步：目的基因的检测与鉴定
课堂小结
目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
将目的基因导入受体细胞-关键
花粉管通道法(植物)、农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、感受态细胞转化法(微生物);
目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。
1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：
（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理：
（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。
（3）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
1.试剂：
（1）无菌水、琼脂糖；
（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；
（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）；
（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。
2.用具：
（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
电泳装置
PCR仪
微量离心管
推动杆
调节旋钮
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
枪头
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
1.PCR加样
材料 用量
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
方法步骤
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
2.离心：
3.扩增：
将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的扩增
DNA片段的扩增
加样
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
②凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
5.制备凝胶
③将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
——加样孔侧连电极负极。
①将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，
以形成加样孔。
电泳缓冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。
方法步骤
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
4.配制琼脂糖溶液：
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
6.电泳加样
凝胶载样缓冲液类似层析液
7.电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定——DNA片段的电泳鉴定
配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
制备凝胶
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
注意事项
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
结果分析与评价
[探究·实践] DNA片段的扩增及电泳鉴定
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，
请分析产生这个结果的可能原因。
基因工程的应用
基因工程在农牧业方面的应用
03
基因工程在医药卫生方面的应用
基因工程在食品工业方面的应用
从社会中来（教材P87）
胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。传统生产胰岛素的方法是从猪、牛等动物的胰腺中获取。曾经生产供一位糖尿病病人使用一年的胰岛素需要上千头牛，生产的成本非常高。
1978年，科学家将编码人胰岛素的基因导入大肠杆菌细胞中，使大肠杆菌表达重组人胰岛素。
我国拥有自主知识产权的基因工程物——重组人胰岛素已经研制成功并得到广泛应用。
除了生产胰岛素，基因工程还有那些应用呢？
基因工程在农牧业方面的应用——
植物方面
1、转基因抗虫植物
转基因抗虫水稻（绿）与对照（黄）
从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物，是目前防治作物虫害的一种发展趋势。
例如：
转基因抗虫棉、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2、转基因抗病植物
转基因抗病毒甜椒
科学家将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。
例如：
抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等
基因工程在农牧业方面的应用——
植物方面
3、转基因抗除草剂植物
大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。
将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。
例如：
已获得转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等
4、改良作物品质
利用转基因技术改良植物的营养价值、观赏价值等。
例如：
我国科学家将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高观赏价值。
呈现自然界没有的颜色变异，提升观赏价值
含大量维生素的转基因玉米
基因工程在农牧业方面的应用——
动物方面
1、提升动物的生长速率
转入外源生长激素基因的“超级小鼠”
由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率
例如：
转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%~115%
2、改善畜产品的品质
有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受
低乳糖奶牛
例如：
将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，其他营养成分不受影响。
基因工程应用——
医药卫生领域
对微生物或动植物细胞进行基因改造，使它们能够生产药物，是目前基因工程取得实际应用成果非常多的领域。
包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，可用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。
我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
基因工程的应用——
医药卫生领域
通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—40mg干扰素
干扰素是一种具有干扰素病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病
传统生产干扰素的方法是从人血液中的白细胞内提取，300L血才提取1mg！
基因工程的应用——
医药卫生领域
1、利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物，如乳腺生物反应器
将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控原件重组。获得转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可通过分泌乳汁来生产所需要的药品，称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
目前，科学家已在牛、山羊等乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α -抗胰蛋白酶等重要医药产品。
人治疗性抗体转基因奶牛
基因工程的应用——
医药卫生领域
乳 腺 生 物 反 应 器 的 操 作 过 程
获取目的基因
构建基因表达载体
导入哺乳动物受精卵
培养成早期胚胎
将胚胎送入母体动物
发育成转基因动物
(如药用蛋白基因、人生长素基因等)
药用蛋白质基因前端加上乳腺蛋白基因启动子等调控元件
利用显微注射法
通过分泌乳汁来生产所需的药物
基因工程的应用——
医药卫生领域
思考
成果：
目前，科学家已在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和ɑ-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。
优点：
产量高、质量好、成本低、易提取
膀胱生物反应器和乳腺生物反应器一样吗？
膀胱生物反应器是外源基因在膀胱上皮细胞中表达的转基因动物。
收集蛋白比较容易，不对动物造成伤害。可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否处于生殖期，从动物的尿液中提取产物比从乳汁中提取更方便
基因工程的应用——
医药卫生领域
2、用转基因的动物作器官移植的供体
选择猪的器官作人体移植器官替代品的原因？
① 猪内脏的构造、大小、血管分布等与人极为相似
② 猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远远少于灵长类动物
免疫排斥反应
最大障碍：
对猪器官的改造方法：
向器官供体基因组导入某种调节因子，抑制或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官
基因工程的应用——
食品工业方面
利用基因工程菌除了可以生产药物，还能生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
基因工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类。
例如：
②奶酪生产需要凝乳酶固化奶中蛋白质，科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。
③加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品用到的脂酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
①阿巴斯甜——一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可通过基因工程实现大规模生产。
基因工程在其他方面的应用
基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。
利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。
基因工程将能分解三种烃类的假单孢杆菌的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌”。
环境监测和净化
课堂小结
一、基因工程在农牧业方面的应用
基因工程的应用
1.转基因抗虫植物
2.转基因抗病植物
3.转基因抗除草剂植物
4.改良植物的品质
5.提高动物的生长速率
6.改善畜产品的品质
二、基因工程在医药卫生领域的应用
三、基因工程在食品工业方面的应用
1.对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能
够生产药物。
2.利用基因工程技术，可以让哺乳动物批量生产药物，
如乳腺生物反应器。
3.用转基因动物作器官移植的供体等。
蛋白质工程的原理和应用
04
蛋白质工程崛起的缘由
蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程的应用
从社会中来（教材P93）
用细菌 “画”的画
你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画"的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为在它们的体内导入了荧光蛋白的基因。
最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。
那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？
蛋白质工程
蛋白质工程
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
基 础
蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
途 径
改造或合成基因
目 的
改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
对 象
基因
蛋白质工程——蛋白质工程崛起的缘由
基因工程的实质
将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。
基因工程的不足
只能生产自然界已存在的蛋白质
天然蛋白质的不足
天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
蛋白质工程的目的
生产符合人类生产和生活的需要的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程崛起的缘由
玉米中赖氨酸的含量较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶-----天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大。
赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高
玉米中赖氨酸含量比较低
天冬氨酸激酶
（352位的苏氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）
天冬氨酸激酶
（异亮氨酸）
二氢吡啶二羧酸合成酶
（异亮氨酸）
玉米中赖氨酸含量提高数倍
改造
改造
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
目 标
根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。
原 理
由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成。
天然蛋白质合成的过程：
基因 表达（转录和翻译） 形成具有特定氨基酸序列的多肽链
形成具有高级结构的蛋白质 行使生物功能
蛋白质工程是怎样的呢？
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
蛋白质
（三维结构）
预期功能
生物功能
翻译
折叠
行使
转录
设计
推测
改造或合成
mRNA
目的基因
从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因 获得所需要的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
思考
蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程的不同点？
基因工程是遵循中心法则，DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，
基本上是生产出自然界已有的蛋白质。
蛋白质工程的思路：
确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，创造出自然界不存在的蛋白质
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
如何辨别一个操作是基因工程还是蛋白质工程？
是否合成新的基因
蛋白质工程
是否对原有基因进行改造
是
否
是
否
蛋白质工程
基因工程
看蛋白质
看基因
是否为天然蛋白质
是
否
蛋白质工程
基因工程
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
确定基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
蛋白质工程——蛋白质工程的原理
基因定点诱变技术的示意图
适应范围：
空间结构完全清楚的蛋白质
操作方法：
PCR法
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
天然蛋白质易形成二聚体或六聚体
预期结构
改 造
B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置
新胰岛素基因
转录
mRNA
折
叠
预期功能
行使功能
降低胰岛素的聚合作用
设计结构
改变B链第20-29位氨基酸组成
推测序列
翻译
多肽链
有效抑制胰岛素的聚合
1、研发速效胰岛素类似物已经在临床上广泛应用
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
2.医药卫生方面——延长干扰素体外保存时间
天然干扰素不易保存
预期结构
改 造
一个半胱氨酸变成丝氨酸
新干扰素基因
转录
mRNA
折
叠
预期功能
行使功能
延长保存时间
设计结构
氨基酸替换
推测序列
翻译
多肽链
在-70℃下可以保存半年
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
通过__________，将小鼠抗体上___________的区域（即_______）“嫁接”到_________（即________）上，经过这样改造的抗体 __________________________。
改造基因
结合抗原
可变区
人的抗体
恒定区
诱发免疫反应的强度就会降低很多
①改进酶的性能或开发新的工业用酶。
②尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加
粮食的产量。
③改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。
4.其他
3.降低人对小鼠单克隆抗体的免疫反应
蛋白质工程——蛋白质工程的应用
蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要原因是：
蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
5.蛋白质工程现状
思考
为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？
①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。
②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质。
③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。
课堂小结
蛋白质工程概述
蛋白质工程的原理和应用
蛋白质工程崛起的缘由
蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程的应用
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