考点25发酵工程（含解析）——五年（2020—2024年）高考生物学真题专项分类汇编1

考点25 发酵工程
——五年（2020—2024年）高考生物学真题专项分类汇编
一、单选题
1．【2024·山东卷】在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是（ ）
A.相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
2．【2022·湖北卷】废水、废料经加工可变废为宝。某工厂利用果糖生产废水和沼气池废料生产蛋白质的技术路线如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.该生产过程中，一定有气体生成
B.微生物生长所需碳源主要来源于沼气池废料
C.该生产工艺利用微生物厌氧发酵技术生产蛋白质
D.沼气池废料和果糖生产废水在加入反应器之前需要灭菌处理
3．【2023·重庆卷】垃圾分类有利于变废为宝，减少环境污染。如图为分类后餐厨垃圾资源化处理的流程设计。下列叙述错误的是（ ）
A.压榨出的油水混合物可再加工，生产出多种产品
B.添加的木屑有利于堆肥体通气，还可作为某些微生物的碳源
C.X中需要添加合适的菌种，才能产生沼气
D.为保证堆肥体中微生物的活性，不宜对堆肥体进行翻动
4．【2024·江西卷】井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（ ）
A.JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B.JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C.提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D.稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
5．【2023·浙江卷】某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是（ ）
A.培养基pH需偏碱性 B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C.需在无氧条件下培养 D.分离得到的微生物均为乳酸菌
6．【2021·山东卷】葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是（ ）
A.无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖
B.自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生型酵母菌
C.葡萄酒的颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的
D.制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加
7．【2023·辽宁卷】细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m3）。下列叙述错误的是（ ）
A. 采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B. 细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C. 同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D. 稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
8．【2022·辽宁卷】为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ）
A.航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B.细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C.在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D.采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
9．【2023·山东卷】以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是（ ）
A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
10．【2021·江苏卷】某同学选用新鲜成熟的葡萄制作果酒和果醋，下列相关叙述正确的是（ ）
A.果酒发酵时，每日放气需迅速，避免空气回流入发酵容器
B.果酒发酵时，用斐林试剂检测葡萄汁中还原糖含量变化，砖红色沉淀逐日增多
C.果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时
D.果醋发酵时，用重铬酸钾测定醋酸含量变化时，溶液灰绿色逐日加深
11．【2022·山东卷】青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是（ ）
A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖
B.可用深层通气液体发酵技术提高产量
C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中
D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
二、多选题
12．【2022·山东卷】啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。下列说法正确的是（ ）
A.用赤霉素处理大麦，可使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶
B.焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌
C.糖浆经蒸煮、冷却后需接种酵母菌进行发酵
D.通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期
13．【2021·江苏卷】为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是（ ）
A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率
B.涂布用的菌浓度应控制在30～300个/Ml
C.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间
D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析
14．【2022·江苏卷】在制作发酵食品的学生实践中，控制发酵条件至关重要。下列相关叙述错误的有（ ）
A.泡菜发酵后期，尽管乳酸菌占优势，但仍有产气菌繁殖，需开盖放气
B.制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，制作泡菜的盐水要淹没全部菜料
C.葡萄果皮上有酵母菌和醋酸菌，制作好葡萄酒后，可直接通入无菌空气制作葡萄醋
D.果酒与果醋发酵时温度宜控制在18~25℃，泡菜发酵时温度宜控制在30~35℃
三、填空题
15．【2021·河北卷】葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣（皮渣）。目前这些皮渣主要用作饲料或肥料，同时研究者也采取多种措施拓展其利用价值。
回答下列问题：
（1）皮渣中含有较多的天然食用色素花色苷，可用萃取法提取。萃取前将原料干燥、粉碎的目的分别是________，萃取效率主要取决于萃取剂的________。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷________。研究发现，萃取时辅以纤维素酶、果胶酶处理可提高花色苷的提取率，原因是________。
（2）为了解皮渣中微生物的数量，取10 g皮渣加入90 mL无菌水，混匀、静置后取上清液，用稀释涂布平板法将0.1 mL稀释液接种于培养基上。104倍稀释对应的三个平板中菌落数量分别为78、91和95，则每克皮渣中微生物数量为_________个。
（3）皮渣堆积会积累醋酸菌，可从中筛选优良菌株。制备醋酸菌初筛平板时，需要将培养基的pH调至_______性，灭菌后须在未凝固的培养基中加入无菌碳酸钙粉末、充分混匀后倒平板，加入碳酸钙的目的是________。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中可加入乙醇作为________。
（4）皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。（简要写出实验步骤和预期结果）
四、读图填空题
16．【2021·广东卷】中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为_____，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用_____的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有_____等。（答出两种方法即可）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是_____。（答出两点即可）
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中_____可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌_____。
五、实验探究题
17．【2023·北京卷】自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
（1）用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供___________和维生素等。
（2）A菌通常被用做溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊（如图），表明______________________。
（3）为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样___________后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现___________。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
（4）为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
18．【2022·重庆卷】研究发现柑橘精油可抑制大肠杆菌的生长。某兴趣小组采用水蒸气蒸馏法和压榨法提取了某种橘皮的精油（分别简称为HDO和CPO），并研究其抑菌效果的差异。
（1）为便于精油的提取，压榨前需用______浸泡橘皮一段时间。在两种方法收集的油水混合物中均加入NaCl，其作用是_______；为除去油层中的水分，需加入_______。
（2）无菌条件下，该小组制备了两个大肠杆菌平板，用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸取HDO和CPO贴于含菌平板上，37℃培养24h，抑菌效果见如图。有同学提出该实验存在明显不足：①未设置对照，设置本实验对照的做法是_______，其作用是________；②不足之处还有_________（答两点）。
（3）若HDO的抑菌效果低于CPO，从提取方法的角度分析，主要原因是_______。
参考答案
1．答案：D
解析：发酵工程在氧气充足的条件下，黑曲霉可以利用糖类发酵产生柠檬酸，在相同菌体密度下，菌球体越大，越不容易获得氧气，柠檬酸产生速率越慢，A正确。由题目所给信息“菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制”可推出发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量，B正确。大部分细菌适合在中性或弱碱性环境中生存，发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长，正确。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。柠檬酸属于代谢物，故D错误。
2．答案：A
解析：A、据图可知，该生产过程中有酿酒酵母的参与，酵母菌呼吸作用会产生二氧化碳，故该生产过程中，一定有气体生成，A正确；B、糖类是主要的能源物质，微生物生长所需的碳源主要来源于果糖生产废水，B错误；C、分析图示可知，该技术中有连续搅拌反应器的过程，该操作的可以增加微生物与营养物质的接触面积，此外也可增大溶解氧含量，故据此推测该生产工艺利用微生物的有氧发酵技术生产蛋白质，C错误；D、沼气生产利用的是厌氧微生物，在连续搅拌反应器中厌氧微生物会被抑制，因此沼气池废料无需灭菌，D错误。故选A。
3．答案：D
解析：A、压榨出的油水混合物可再加工，生产出多种产品，有利于实现物质的循环再生和能量的多级利用，A正确；B、添加的木屑有利于堆肥体通气，木屑也可作为某些微生物的碳源，B正确；C、X中需要添加合适的菌种，通过分解有机物才能产生沼气，C正确；D、为保证堆肥体中微生物的活性，可以对堆肥体进行翻动，D错误。故选D。
4．答案：D
解析：A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；
B.JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；
C.在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
D.JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
故选D。
5．答案：C
解析：培养乳酸菌的培养基应偏酸性，A项错误；划线接种时，泡菜汁无需进行多次稀释，B项错误；乳酸菌是厌氧菌，需在无氧条件下培养，C项正确；泡菜汁中还有酵母菌等，因此分离得到的微生物不只有乳酸菌，D项错误。
6．答案：D
解析：酵母菌是兼性厌氧型生物，有氧和无氧条件下都能存活，但是有氧呼吸释放的能量多，酵母菌繁殖速度快，无氧呼吸释放能量少，酵母菌不能大量繁殖，A正确；自然发酵制作葡萄酒时，菌种主要来自葡萄皮上的野生型酵母菌，B正确；葡萄酒的颜色是发酵过程中葡萄皮中的色素进入发酵液形成的，C正确；葡萄酒制作利用的原理是酵母菌的无氧呼吸，前期氧气充足，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，后期缺乏氧气，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，细胞呼吸以葡萄糖为底物，因此随着发酵的进行，发酵液中的糖含量减少，D错误。
7．答案：D
解析：为防止杂菌污染，采样前需要对空气微生物采样器进行灭菌，A正确；细菌气溶胶样品恒温培养时，为防止冷凝水滴落造成污染和水分大量蒸发，应将培养皿倒置，B正确；对微生物计数时，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，C正确；使用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计的数值往往比实际值低，原因是当两个或多个菌体连在一起时在平板上观察到的只是一个茵落，D错误。
8．答案：D
解析：A、航天器处于外太空等极端环境中，其上可能存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；B、细菌形成菌膜可粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，故需要洁净的组装车间，B正确；C、在组装车间地面和设备表面可采集环境微生物样品，C正确；D、航天器及洁净的组装车间微生物很少，不需要用到平板划线法分离微生物，D错误。
故选：D。
9．答案：C
解析：A、沸盐水冷却后再倒入坛中主要是为了防止乳酸菌被杀死，A错误；B、盐水需要浸没全部菜料主要目的是创造一个无氧的环境，有利于乳酸菌的发酵，B错误；C、盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水目的是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入，保证坛内处于无氧环境，C正确；D、泡菜腌制过程中，亚硝酸盐含量先升高，后降低，D错误。故选：C。
10．答案：C
解析：A、酒精发酵是利用酵母菌的无氧呼吸，随着果酒发酵的进行，装置内会产生气体（二氧化碳），容器内压强大于外界，所以空气不会回流，A错误；
B.果酒发酵时，发酵液中的葡萄糖不断被消耗，因此用斐林试剂检测葡萄汁中还原糖含量
变化，砖红色沉淀逐日减少，B错误；C、以酒精为底物进行醋酸发酵，酒精与氧气发生反应产生醋酸和水，几乎没有气泡产生，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时，C正确；
D.重铬酸钾用于检测酒精，不能用于测定醋酸含量，D错误。
11．答案：D
解析：本题考查发酵工程的有关知识。因青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，故碳源不宜使用葡萄糖，不利于青霉素的产生，A项正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术，保证其有氧呼吸，提高产量，B项正确；选育出的高产菌株数量较少，故需经扩大培养纯化后才可接种到发酵罐中，C项正确；为了防止细菌、真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍然需严格灭菌，D项错误。
12．答案：ACD
解析：本题考查发酵工程的有关知识及植物激素的作用、基因工程的应用等。赤霉素能促进种子萌发，故用赤霉素处理大麦，可诱导α-淀粉酶相关基因的表达，促进α-淀粉酶的合成，使大麦种子无须发芽就能产生α-淀粉酶，A项正确；焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并保持酶的活性，不是为了灭菌，B项错误；糖浆经蒸煮、冷却后再接种酵母菌进行发酵，防止高温杀死菌种，C项正确；双乙酰是啤酒发酵过程中酵母菌自身代谢出的副产物，是啤酒成熟的限制性指标，过高会导致啤酒变质，通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期，D项正确。
13．答案：AB
解析：A、培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A符合题意；
B.涂布用的菌浓度应控制在106倍，以避免菌种重叠而不能得到单菌落，B符合题意；
C.辐射剂量和诱变时间都是正式实验的无关变量，可通过预实验确定，C不符合题意；
D.石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，给纯化
后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D不符合题意。
14．答案：ACD
解析：乳酸菌属于厌氧菌，开盖放气会影响乳酸菌发酵，因此不能开盖放气，A错误。制作果酒的葡萄汁不宜超过发酵瓶体积的2/3，以防止发酵过程中发酵液溢出；制作泡菜的盐水要淹没全部菜料，防止菜料与空气接触，B正确。醋酸发酵的温度高于果酒发酵的温度，因此制作好葡萄酒后，除需通入无菌空气外，还需要适当提高发酵装置的温度，C错误。果醋发酵时温度宜控制在30~35℃，D错误。
15．答案：（1）降低含水量、使原料与萃取剂充分接触，提高溶解度；性质和使用量；分解；纤维素酶和果胶酶可破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率
（2）8.8×106
（3）中性或微碱；使醋酸菌菌落周围出现透明圈，根据透明圈来筛选优良菌株；碳源
（4）实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小。
预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为兼性厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落。
解析：本题考查发酵工程的相关知识。
（1）萃取前将原料干燥的目的是降低含水量，粉碎的目的是使原料与萃取剂充分接触，提高溶解度，萃取效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。萃取过程需要在适宜温度下进行，温度过高会导致花色苷分解。纤维素酶和果胶酶会催化纤维素和果胶水解，破坏细胞壁，有利于提高花色苷的提取率。
（2）平板上菌落数平均为（78+91+95）/3=88，每克皮渣中微生物数量为88/0.1×104=8.8×106。
（3）醋酸菌属于细菌，故制备醋酸菌初筛平板时，需将培养基的pH调至中性或微碱性。碳酸钙能够与醋酸反应，使醋酸菌菌落周围出现透明圈，在平板上可根据碳酸钙透明圈来筛选优良菌株，碳酸钙透明圈越大，说明菌株产生醋酸的能力越强。培养筛选得到的醋酸菌时，在缺少糖源的液体培养基中，乙醇可作为碳源。
（4）乳酸菌属于兼性厌氧型，醋酸菌属于需氧型，故可将平板置于无氧环境中继续培养，观察平板上形成的菌落。
16.
（1）答案：唯一碳源；稀释涂布平板（或血细胞计数）；诱变育种、基因工程育种
解析：蔗糖可作为微生物培养的唯一碳源，活细胞计数的方法主要采取稀释涂布平板法，通过统计平板中的菌落来计算样品中的菌落数。常见育种方法有杂交育种、诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、转基因育种，对于优良菌株的选育还能采取诱变育种、杂交育种和转基因育种的方法。
（2）答案：盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
解析：由题意可知，该发酵系统的环境为高浓度盐和高pH，在盐浓度为60 g/L的条件下，其他杂菌因失水过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制，因此不需要灭菌。
（3）答案：氧气的浓度
解析：根据题干中“产生少量乙醇”可知，发酵过程中氧气不充足，细胞进行了无氧呼吸产生乙醇。
（4）答案：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
解析：菌株H可分解含有蛋白质、淀粉、油脂等餐厨的垃圾，因此可推测菌株H能分泌水解其相应的酶，即蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶
17．答案：（1）氮源、碳源
（2）A菌能在培养平板中生长繁殖
（3）稀释；溶菌圈
（4）假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
解析：（1）蛋白胨主要为细菌提供氮源、碳源和维生素等。
（2）将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。
（3）将含菌量较高的湖泊水样稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
（4）略。
18．答案：（1）石灰水；增加盐的浓度，促进油水分层；无水Na2SO4
（2）选用相同大小的无菌滤纸蘸取蒸馏水贴于含菌平板上，相同条件下一起培养；排除滤纸纸片影响大肠杆菌生长的干扰；a.实验平板数目数据过少，具有偶然性；b.滤纸分别蘸取HDO和CPO，无法保证HDO和CPO的含量相等
（3）HDO是采用水蒸气蒸馏法，高温可能破坏HDO的结构，影响其生理作用，导致其抑菌效果低
解析：（1）为了提高出油率以及防止压榨时滑脱，压榨前需用石灰水浸泡橘皮一段时间。水蒸气蒸馏法和压榨法收集的油水混合物中均加入NaCl，其作用是增加盐的浓度，促进油水分层，最后在除去油层中的水分时，需要加入无水Na2SO4进行吸水。
（2）该实验设计中，未设置对照组，实验组的处理是用两片大小相同的无菌滤纸分别蘸取HDO和CPO贴于含菌平板上，37℃培养24h，则对照组的设计应该遵循单一变量原则，使用相同大小的无菌滤纸滴加等量蒸馏水贴于含菌平板上，相同条件下一起培养，其目的是排除滤纸纸片对大肠杆菌生长的干扰；实验中存在的不足之处在于使用的平板数目较少，应该多设计几组实验，避免出现偶然误差，并且蘸取HDO和CPO于滤纸上无法确保两种液体含量一致，应用移液管在两张滤纸上分别滴加相同体积的HDO和CPO。
（3）HDO是采用水蒸气蒸馏法，CPO采用的是压榨法，高温可能破坏HDO的结构，影响其生理作用，导致其抑菌效果低。