1.2 发酵工程的无菌技术 第1课时(共37张PPT) 2024-2025学年苏教版（2019）高中生物学选择性必修3

(共37张PPT)
1.2 发酵工程的无菌技术第1课时
19世纪中期以前，人们普遍相信生命现象是自然发生的。19世纪60年代，法国科学家巴斯德通过实验证明了微生物不是自然发生的。
煮沸肉汤，杀灭其中的细菌
肉汤仍澄清，没有细菌繁殖
打断瓶颈
肉汤变混浊，细菌在肉汤中繁殖
积极思维：肉汤腐败与微生物有什么关系？
日常生活中，我们会用碘伏消毒液擦拭受伤破损的皮肤，从而杀灭伤口部位的部分微生物。那么，在发酵工程实践中无菌操作是如何开展的呢？
巴斯德在实验
1.无菌技术
泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
获得纯净的微生物培养物的关键
一、发酵工程的灭菌方法及灭菌设备
2.无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
消毒和灭菌工作的两个方面：
（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。
（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
3.消毒
（1）概念：
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
（2）常用的消毒方法
①煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30 min或80～90℃处理30s～1min，适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
③化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
思考：利用酒精消毒时，酒精浓度是不是越高越好？
高浓度酒精能将细菌表面的蛋白质凝固，并形成一层保护膜，阻止酒精进入细菌体内，因而不能将细菌彻底杀死。酒精浓度低于70%，虽可进入细菌体内，但不能将细菌彻底杀死。
4.灭菌
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
（1）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
①射线灭菌法
概念：利用 等产生的 进行灭菌的方法。
实例：波长为 的紫外线、 射线和γ射线等都具有较好的灭菌作用。
对象：紫外线的穿透能力 ，一般用于 的灭菌。
紫外线
高能粒子
200～300 nm
X
弱
表面和空气
（2）常用灭菌的方法：
②干热灭菌
器具：电热鼓风干燥箱（干热灭菌箱）
条件：140－160℃ 下加热 2－3h
原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质
变性和原生质干燥等
对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿 (如试管、
培养皿、移液管、注射器)、金属器具 (如针头、 镊子、
剪刀等)的灭菌。
③灼烧灭菌
器具：酒精灯
条件：酒精灯外焰灼烧
效果：最彻底
原理：使微生物燃烧
对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位
④湿热灭菌（效果最好：高压蒸汽灭菌）
器具：高压蒸汽灭菌锅
条件：100kPa、121 ℃下维持15-20min
原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等
结构使其变性
优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有
的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。
基本保持培养基的营养成分不被破坏。
对象：培养基、多种器材、物品等
加水 → 装锅 → 加热排气 → 保温保压 → 出锅
不要装得过满
使冷空气彻底排出
然后将排气阀关闭
103kPa；121℃；保持压力，维持15—20min
压力表中指针降至“0”点、温度降至60℃以下，打开排气阀，开盖，取出物品
水位标记线
排气阀
冷空气
103 kPa
121
“0”
温度
概念：通过滤膜过滤阻留微生物从而达到除菌目的的方法。
器具：空气除菌设备
对象：空气、料液，及在高温下不稳定的物质（大于滤膜孔径
的细菌等微生物颗粒阻留）
应用：
a.在工业生产上制备无菌空气，用于好氧微生物的发酵；
b.在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料液，以获得无菌产品。
⑤过滤除菌法
(1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
(2)对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？
分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学药物消毒、紫外线消毒、巴氏消毒。
(3)无菌技术主要包括消毒和灭菌，请说出消毒和灭菌的主要区别是什么？
消毒是使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物；灭菌是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物(包括芽孢和孢子)。
核心探讨1
1.培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
2.如何制备一瓶无菌水？
对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。
3.某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？
未将锅内冷空气排尽。
核心探讨2
4.某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。
1.下列关于灭菌和消毒的说法，错误的是 (　　)
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
2．下列操作能达到灭菌目的的是 (　　)
A．用免洗酒精凝胶擦手
B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
B
C
①接种：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。
②常用接种器具包括玻璃涂布器、接种针、接种环等。
③应用：玻璃涂布器常用于平板稀释涂布接种，接种针用于穿刺接种，接种环用于斜面接种或在平板培养基上划线接种。
二、发酵工程的无菌操作器具
1. 接种器具
平板划线接种
①移液管的应用：一般用于转移部分液体
培养物、系列稀释微生物或分装化学试剂。
②刻度移液管：具有刻度的直形玻璃管，
在需要控制试剂加入量时使用。
2. 转移器具
操作步骤
液面
1 cm
下端外壁
垂直
缓缓
下端
顺壁
③微量取液器
取液量很少时
(如0.1mL)使用。
①概念：超净工作台是一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备。
②净化原理：是利用工作台内紫外线灯的杀菌作用，并通过空气过滤器过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
3. 超净工作台
3.微生物的实验室培养，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。下列无菌操作中，正确的是（ ）
A.对实验用的培养基，常采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌
B.对培养皿、接种环和移液管等，用干热灭菌法进行灭菌
C.对操作者的双手、衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒
D.对试管口、锥形瓶口等部位，通过火焰灼烧进行灭菌
ABD
三、微生物接种和传代的无菌技术
1.菌种保存的重要条件：低温、干燥、真空（隔绝空气）。
2.菌种保存的方法
（1）临时保存（4℃左右冰箱保存，每隔2～3个月重新接种）
①穿刺接种：保存厌氧微生物
②斜面接种：常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法
培养酵母菌
培养酵母菌
【核心归纳】
斜面接种和培养酵母菌的操作步骤及其目的或分析说明
顺序 接种操作步骤 目的或分析说明
① 将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次 将接种环灭菌，避免污染菌种
② 迅速将试管口通过火焰2～3次 灼烧灭菌，防止试管口上的微生物污染培养基
③ 将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位 使接种环冷却，避免杀死菌种
④ 抽出接种环时，带菌部位不要触及管壁或通过火焰 防止菌种沾于管壁；防止菌种被杀死
⑤ 在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，但不要将培养基的表面划破 初步接种。划破培养基不利于后续的继续划线，长出的菌落不标准
⑥ 将试管口与试管塞分别通过火焰2～3次，迅速塞紧试管 防止杂菌污染
⑦ 将接种过菌种的试管，放在恒温箱(28 ℃)中培养24 h 培养酵母菌，观察接种和培养的结果
1．接种是在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程，这一过程常用的操作器具有哪些？它们适用于哪些接种方法？
常用的接种器具包括玻璃涂布器、接种针、接种环等。玻璃涂布器用于平板涂布接种，接种针用于穿刺接种，接种环用于斜面接种或在平板培养基上划线接种。
2．准确移取一定体积的溶液或分装化学试剂选用的转移器具是什么？
常用移液管，当移取液量很少时，常采用微量取液器。
3．斜面接种酵母菌的操作过程中，什么操作情况下接种环经过酒精灯火焰灼烧？什么操作则不能通过酒精灯火焰？
在接种前和接种完成后，接种环要经过酒精灯火焰灼烧灭菌。当挑取菌种进行接种时接种环则不能通过酒精灯火焰。
核心探讨3
（2）长期保存：甘油管藏（一般可保存2～4年）
－20℃以下的甘油管在冷冻箱中保藏
4．下列关于无菌操作的叙述，正确的是(　　)
A．接种时超净台内同时打开紫外灯和过滤风
B．斜面接种时，含菌种的试管口和不含菌种的试管口都要通过酒精灯火
焰灭菌
C．用脱脂棉制成的棉塞塞住试管口，用牛皮纸包扎，放入灭菌锅内灭菌
D．接种环灭菌后迅速挑取少量菌种进行接种
B
5.下列关于微生物接种和传代的无菌技术的叙述，错误的是（　　）
A.菌种的传代和保存要考虑菌种的生理、生化特性
B.低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和代谢
的作用
C.破伤风芽孢杆菌可在培养基深处的厌氧环境下生长
D.在培养基斜面上接种时应由上部向底部轻轻划“Z”型折线
D