四、（2025松江一模）染料废水的生物处理（26分）
活性黑5是一种低毒性、难褪色的含氮染料。欲利用生物酶处理染料废水中的活性黑5，具体操作流程如图6。从染料废水堆积池的污泥中获得优势菌群，采用浓度梯度驯化法，进一步培养获得具备强分解活性黑5能力的假单胞杆菌，并进行基因表达分析。
图6
24.（2分）培养基I中，除了活性黑5以外，还需添加的成分是 。（多选）
A.葡萄糖 B.抗生素 C.水 D.琼脂
25.（2分）培养基I从用途上属于 。（编号选填）
①固体培养基 ②液体培养基 ③通用培养基
④选择培养基 ⑤鉴别培养基
26.（2分）将细菌从培养基I转移到培养基II的目的是 。
27.（2分）浓度梯度驯化过程中，培养液中可能出现的变化有 。（多选）
A.假单胞杆菌中BVU5蛋白的含量 B.假单胞杆菌对活性黑5的分解速率
C.假单胞杆菌的菌落数目 D.假单胞杆菌中BVU5蛋白的空间结构
28.（2分）假单胞杆菌中，BVU5蛋白分解活性黑5的场所最可能为_______。（单选）
A.拟核 B.细胞质基质 C.溶酶体 D.核糖体
29.（2分）据图6和所学知识推测，驯化后的假单胞杆菌增强了BVU5基因的_____。（多选）
A.复制 B.转录 C.翻译 D.逆转录
科研人员为了实现在大肠杆菌中大量表达外源BVU5蛋白，首先需要利用PCR技术获得BVU5编码基因。该基因编码链首尾处各20个核苷酸的序列及相关信息如图7。
图7
30.（2分）已知BVU5基因编码链总长为1098个核苷酸，据图7及所学知识分析该基因编码的BVU5蛋白的氨基酸数目为_______。（编号选填）
①365 ②366 ③1095 ④1098 ⑤3285 ⑥3294
31.（4分）若要在基因的前后位置，分别添加NcoI及SalI限制性内切核酸酶识别序列，并大量扩增出BVU5基因，则PCR实验中所需的引物序列为______________________________。（按5’→3’方向填空，引物长度应为26个核苷酸）
32.（3分）在利用基因工程表达BVU5蛋白的过程中，PCR实验后应进行的步骤依次是_______。（选择编号并排序）
①筛选和鉴定含BVU5基因的大肠杆菌 ②从细菌中提取DNA
③DNA连接酶拼接DNA片段 ④限制性内切核酸酶切割
⑤PCR产物的凝胶电泳鉴定 ⑥BVU5基因导入受体细胞
33.（2分）若想进一步改良BVU5蛋白，但其结构未知，欲通过蛋白质工程迅速获得BVU5蛋白突变株，应选用的策略是_______。（单选）
A.定点突变直接改变氨基酸序列 B.定点突变直接改变基因序列
C.随机突变直接改变氨基酸序列 D.随机突变直接改变基因序列
34.（3分）设计体外实验，验证BVU5蛋白催化反应需要还原型辅酶、而非氧化型辅酶的辅助。请选择正确的编号补充表3信息。（编号选填）
表3
组别 处理方式 实验结果（脱色率）
对照组 (1)_____ -
实验组1 (2)_____ -
实验组2 (3)_____ ++++
注：“-”代表脱色率低，“+”代表脱色率高
①最适温度、pH ②适宜浓度的BVU5蛋白
③活性黑5溶液 ④生理盐水
⑤NADH或NADPH ⑥NAD+或NADP+
四、印染废水的生物处理（26分）
24. （2分）ACD 25. （2分）④ 26. （2分）进一步分离纯化细菌
27. （2分）ABD 28. （2分）B 29. （2分）BC 30. （2分）①
31. （4分）引物1：5’-CCATGGATGTCGAGCAACTTCCTCAA-3’
引物2：5’-GTCGACTTAGTAGTCGATGACCACGT-3’
32. （3分）⑤④③⑥① 33. （2分）D 34. （3分）①②③；①②③⑥；①②③⑤
四、（2025青浦一模）人鼠嵌合抗体的设计（25分）
人原癌基因 erbB2编码的p185蛋白可存在于肿瘤细胞膜上，erbB2的过量表达与肿瘤细胞侵袭、转移密切相关，该过程中人体自身免疫系统通常不会产生相应抗体。科研人员利用动物细胞融合技术获得相应的鼠源单克隆抗体（图7），以期治疗肿瘤。
22．（2分）为获得高度均一的抗体，需要先向小鼠体内注射______。（单选）
A.erbB2基因 B.p185蛋白
C.人肿瘤细胞 D.鼠骨髓瘤细胞
23.（3分）为获得鼠源单克隆抗体，请选择正确的操作并排序__________。
①促融 ②筛选 ③分离脾脏细胞
④细胞核移植 ⑤克隆培养
鼠源抗体的恒定区易被人体免疫系统识别而失去作用，科研人员研制人鼠嵌合抗体以期降低免疫排斥，过程如图8。图中引物已按照退火时与模板链结合位置画出，折线部分表示不与融合基因序列互补配对；转录时a链为编码链。
24.（3分）根据以上信息和图7推测融合基因应包含______。（多选）
A.人抗体可变区基因 B.鼠抗体可变区基因 C.人抗体恒定区基因 D.鼠抗体恒定区基因
25.（2分）下图9为PCR扩增融合基因时的参数设定。步骤丁称为_____；步骤戊应设定跳转到步骤____。
26.（4分）为使融合基因正确连接到pBCⅠ载体，图8步骤①应选用的限制酶为________；引物1折线部分为_______的识别序列。（编号选填）
①MboI ②XbaI ③ScaI
27.（2分）图8步骤②常用的物理转化方法为__________。加入四环素后选用发_____荧光的受精卵用于后续操作。
28.（3分）关于图8步骤③的相关叙述错误的有________。（多选）
A.步骤③含体外受精、胚胎移植等操作
B.代孕母鼠需注射激素使之超数排卵
C.代孕母鼠子宫内早期胚胎1为桑椹胚
D.对早期胚胎2进行胚胎分割，可提高转基因小鼠数量
29.（2分）人鼠嵌合抗体的设计属于__________。（编号选填）
①第二代基因工程 ②定点突变蛋白质 ③定向进化蛋白质 ④设计制造全新蛋白
30.（4分）检测小鼠乳汁中的人鼠嵌合抗体水平，发现其含量较低，结合图8和所学知识推测可能原因。（至少两点）
四、人鼠嵌合抗体的设计（25分）
22.B（2分） 23.③→①→②→⑤（3分） 24.BC（3分）
25.聚合（1分）；乙（1分）
26.②③（2分） ②（2分） 27.显微注射法（1分）红色（1分）
28.ABD（3分） 29.①④（2分）
30.①山羊乳腺特异性表达启动子在小鼠乳腺细胞中作用效果不理想，抗体表达量低；②融合基因表达正常，但小鼠乳腺细胞无高效的针对其运输及分泌机制；③融合基因被某些化学基团修饰，阻碍转录的发生；④融合基因正常转录，但融合基因mRNA因RNA干扰而被切割（每点2分，其他合理答案酌情给分）
五、（2025宝山一模）小麦白粉病与生物工程（18分）
小麦白粉病是由白粉菌寄生引起的病害，为开展小麦抗白粉病研究，一般用离体叶片接种法培养并保存白粉菌，包括配制培养基、消毒离体叶片、接种白粉菌、适宜条件培养等步骤。
29.（2分）据题意可知，配制的培养基应是直接为 （离体叶片/白粉菌）提供营养物质。
30.（3分）为确保获得纯种的白粉菌，需无菌操作的步骤有 。（多选）
A. 配制培养基
B. 消毒离体叶片
C. 接种白粉菌
D. 适宜条件培养
31.（2分）若要探究适宜的培养条件，现设三种光照条件：无光照、光照12小时、光照16小时，四种温度条件：4℃、8℃、16℃、32℃，则实验分组数为 。（单选）
A. 3组 B. 4组
C. 7组 D. 12组
小麦因存在M基因易感白粉菌。gRNA和Cas9蛋白可以共同作用于DNA特定序列，对其进行剪切和修复，其中gRNA识别和剪切DNA；Cas9蛋白修复切口。科研人员将gRNA和Cas9蛋白的基因导入到小麦中，对M基因进行改造，使其无法发挥作用。表达载体的构建及可能用到的限制性内切核酸酶识别序列如图9所示，启动子是基因表达所必需。
32.（4分）据题意推测，gRNA、Cas9蛋白功能分别类似于 、 。（编号选填）
① RNA聚合酶
② DNA连接酶
③ DNA聚合酶
④ 限制性内切核酸酶
33.（5分）在由载体1、载体2构建最终载体时，所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列，最有可能是图9右侧中的 （图9中编号选填），在最终载体上保留下来的酶切位点有 （编号选填）。
① 5个 ② 4个
③ 3个 ④ 2个
34.（2分）若要检测M基因是否改造成功，可行的操作是 。（单选）
A. 用一定浓度的潮霉素溶液浇灌小麦
B. 检测小麦细胞中是否有Cas9蛋白
C. 用白粉菌感染小麦植株
D. 检测小麦细胞中是否有启动子1、2的序列
五、小麦白粉病与生物工程（18分）
29.（2分）离体叶片
30.（3分）ABCD
31.（2分）D
32.（4分）④ ②
33.（5分）①③ ③
34.（2分）C
五、（2025虹口一模）CAR-T细胞疗法（19分）
肿瘤严重危害人类健康。为提高T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤力，研究人员利用转基因技术在T淋巴细胞表面嵌合抗原受体（CAR），成功获得CAR-T细胞，部分相关过程如图所示。其中，图（b）中“ ”表示促进作用，“ ”表示抑制作用；BCR为B淋巴细胞表面的抗原受体，TCR为T淋巴细胞表面的抗原受体。
29.（3分）据图及已学知识判断，能发挥细胞免疫功能的是______。（多选）
A. 巨噬细胞 B. B淋巴细胞
C. CAR-T细胞 D. T淋巴细胞
30.（3分）CAR-T细胞表面的CAR主要由跨膜区、胞外区等部分组成，据图推测，与天然的T淋巴细胞相比，CAR-T细胞能高效杀灭肿瘤细胞的原因是它______。（多选）
A. 无需抗原呈递细胞激活 B. 能释放免疫活性物质
C. 能大量分泌特异性抗体 D. 能直接识别肿瘤抗原
31.（3分）肿瘤细胞会通过“免疫逃逸”机制，避开免疫系统的“监视”，据图及已学知识推测，该机制可能包括肿瘤细胞的______。（多选）
A. MHC表达量下降 B. PD-1的数量增加
C. 肿瘤抗原数量增加 D. PD-L1的数量增加
临床研究发现，快速增殖的肿瘤细胞会导致肾上腺素异常增多，抑制CAR-T细胞的功能。2024年，研究人员利用RNA干扰（RNAi）技术影响CAR-T细胞表面肾上腺素受体相关基因的表达，获得改造后的CAR-T细胞.检测相关细胞的指标，如表所示。
组别 每个细胞表面CFSE荧光强度 分泌颗粒酶的细胞占比 葡萄糖转运蛋白的相对表达量 含PD-1的细胞占比
Day0 Day8
天然的T淋巴细胞组 1.00a 0.015a 0.21c 1.10c 0.12c
未改造CAR-T细胞组 0.98a 0.016a 0.43b 155b 0.50a
改造后的CAR-T细胞组 0.97a 0.018a 0.72a 211a 0.18b
注：上述实验仅在Day0加入等量CFSE；CFSE为活细胞荧光染料，可与质膜表面蛋白结合，是判断细胞分裂能力的指标之一；数字后小写字母不同表示各组间的数据差异显著。
32.（2分）据题干信息推测，肿瘤细胞快速增殖可能对人体造成的影响有______。（多选）
A. 心律失常 B. 体温降低 C. 血糖偏高 D. 体重增加
33.（3分）据表、图推测，与未改造的CAR-T细胞相比，改造后的CAR-T细胞具有的优势可能有______。（编号选填）
①细胞分裂速率慢 ②NF-κB的功能强 ③细胞凋亡水平低 ④PI3K磷酸化水平低
34.（5分）据表及相关信息，对CAR-T细胞治疗肿瘤的效果进行估测，阐述分析过程____。
五、CAR-T细胞疗法（19分）
29. ACD 30. AD 31. AD 32. AC 33. ②③
34. 无论是未改造还是改造的CAR-T,与天然T淋巴细胞相比,细胞分裂不受影响,分泌颗粒酶细胞占比大,加大攻击肿瘤细胞的力度;葡萄糖转运蛋白的数量增加,能为T细胞提供更多能量来杀伤肿瘤细胞,且改造后的CAR-T细胞的上述优势不仅均比未改造的CAR-T细胞强,而且两种 CAR-T细胞均提高了含 PD-1的细胞占比,提高肿瘤逃逸的风险但改造后的 CAR-T细胞肿瘤逃逸的风险降低。
二、（2025杨浦一模）细胞器进化理论指导光合酵母构建（24分）
内共生学说认为，叶绿体的祖先可能是蓝细菌，蓝细菌被原始真核细胞摄入后在细胞质内繁殖，并在共生过程中逐渐演化为叶绿体。光合酵母的成功构建为这一学说提供了支持。
8.（2分）大量证据表明，内共生现象普遍存在。下列观察中，可作为支持叶绿体内共生证据的有______。（多选）
A. 叶绿体和蓝细菌都含有生物膜
B. 叶绿体内的DNA为环状分子，与原核生物相似
C. 叶绿体内膜与细菌质膜的蛋白质与脂质比值相似
D. 叶绿体的蛋白质合成机制更类似于细菌，而非真核生物
9.（2分）叶绿体已失去了其祖先蓝细菌某些功能特性。基于进化理论分析，蓝细菌的基因组在共生后发生的变化是______。（编号选填）
①淘汰全部不利于共生的基因
②有利于共生的基因频率不断提高
③朝着有利于共生的方向发生基因突变
为支持内共生学说，研究者在酵母细胞内构建了光合蓝细菌内共生体。首先，基于ZS质粒构建工程蓝细菌——SynJEC菌株，过程如图所示。重组ZS质粒进入蓝细菌后，其内的整合区域会以一定的频率插入蓝细菌拟核DNA中，并随着蓝细菌DNA的复制而复制。
10.（2分）在使用黏性末端各异的限制酶将目的基因1和目的基因2先后插入ZS质粒时，下列限制酶选用方案中最佳的是______。（编号选填）
11.（2分）在上图中的“涂布平板”阶段，正确的无菌操作流程是______。（编号排序）
①灼烧涂布棒 ②在酒精灯火焰旁涂布 ③培养基高压蒸汽灭菌 ④置于超净工作台操作
⑤在酒精灯火焰旁倒平板
12.（2分）已知ZS质粒不能在蓝细菌内复制。据题干和图3信息推断，研究者选用ZS质粒而非其它载体的主要原因是______。
A. ZS质粒含有多种标记基因
B. ZS质粒可通过转化操作进入蓝细菌
C. 在克隆中消除质粒上无关的DNA区域
D. 能减轻质粒复制给受体细胞造成的负担
13.（3分）根据题意和研究人员的设计思路，在使用选择培养基筛选克隆菌株时，形成菌落的蓝细菌______。
A. 仅抗链霉素 B. 仅抗壮观霉素
C. 既抗链霉素又抗壮观霉素 D. 对链霉素和壮观霉素均敏感
14.（2分）为进一步检测SynJEC菌株构建是否成功，需对目标DNA片段进行PCR扩增和凝胶电泳鉴定，PCR扩增应选择下列引物中的______。
随后，研究者再借助细胞融合技术构建光合酵母，后者的工作原理如下图所示。已知蓝细菌光合作用的主要产物是蔗糖，且留在细胞内；野生酵母几乎不能利用蔗糖作为碳源。
15.（2分）据研究人员的设计意图分析，ZS质粒上携带的目的基因1和目的基因2应是______。（编号选填）
①蔗糖分解酶基因②蔗糖转运蛋白基因③光合作用相关基因④糖酵解相关酶基因⑤葡萄糖转运蛋白基因
16.（4分）在判断光合酵母是否构建成功时，设计培养基配方时应考虑______；在检测构建成功的光合酵母的增殖速度时，设计培养基配方时应考虑______。（编号选填）
①不加琼脂②不添加有机碳源③提高氮源的占比④增加生长因子的占比
17.（3分）检测发现，构建的光合酵母生长速度比野生酵母慢。研究人员试图提升关键酶单个分子的活性以解决这一问题，为此下列策略合理的是______。
A. 导入关键酶的编码基因
B. 强化关键酶编码基因的转录
C. 对关键酶编码基因进行定向进化
D. 提高关键酶编码mRNA的翻译速率
二、细胞器进化理论指导光合酵母构建（24分）
8. BCD 9. ②
10. ②④ 11. ③④⑤①②或③④⑤④①② 12. C 13. A
14. ①④或②⑤ 15. ①⑤
16. ② ①② 17. C
五、（2025闵行一模）肠道工程益生菌的构建
HT1是一种因FAH酶缺陷引起的酪氨酸代谢异常产生有毒物质引发肝损的疾病。研究团队试图基于益生大肠杆菌（EcN）设计一种能高效代谢酪氨酸的肠道工程益生菌（EcN-HT）用于治疗HTl模型小鼠，如图所示。其中，酪氨酸转运蛋白TyrP的基因TyrP和酪氨酸高效代谢重要酶HpaBC的基因HpaBC均为目的基因。
26. EcN的H1型鞭毛通过单个菌之间的相互作用在肠道上皮形成紧密的网络结构，像一层防护网，可以抑制病原菌对肠道上皮细胞的侵袭，这种防御属于机体的_______。（编号选填）
①第一道防线 ②第二道防线 ③第三道防线 ④特异性免疫 ⑤非特异性免疫
27. 图中，TyrP需要表达在EcN-HT的质膜上，以促进对酪氨酸的吸收。则EcN-HT中参与TyrP的合成到定位的结构有_______。（编号选填）
①内质网 ②核糖体 ③质膜 ④高尔基体 ⑤线粒体
研究人员以质粒pUC57-pfnr为载体，构建pUC57-pfnr-T和pUC57-pfnr-H两种重组质粒。下图表示了质粒pUC57-pfnr及相关限制性内切核酸酶的识别序列和切割位点。
28. 采用“2种重组质粒分别构建→pUC57-pfnr-T导入EcN并筛选得EcN-T→pUC57-pfnr-H导入EcN-T并筛选得EcN-HT”的方法时，为实现高效构建和筛选，从①-⑩中合理选择编号填入表1.
①BamHⅠ②HindⅢ③Bgl Ⅱ④EcoRⅠ⑤MboⅠ⑥SmaⅠ⑦卡那霉素⑧氯霉素⑨X-gal⑩琼脂
目的基因 选择限制性内切核酸酶 构建的重组质粒 重组质粒导入情况 筛选时培养基应加物质 筛选得受体细胞
TyrP ④⑥ pUC57-pfnr-T 导入EcN （1）_______ EcN-T
HpaBC （2）_______ pUC57-pfnr-H 导入EcN-T （3）_______ EcN-HT
29. 目的基因TyrP存在于E.coliK12菌株中。根据表1方案，需在该目的基因两侧添加相应的限制性内切核酸酶识别序列后才能与质粒成功连接。下图显示了该目的基因两端的序列，PCR时设计的引物应是_______。（单选）
A. 5'-GAATTC AAGGCA-3'和5'-CCCGGG CATTGT-3'
B. 5'-AAGGCA CCCGGG-3'和5'-CATTGT GAATTC-3'
C. 5'-AAGGCA CCCGGG-3'和5'-TGTTAC GAATTC-3'
D. 5'-CCCGGG AAGGCA-3'和5'-GAATTC TGTTAC-3'
30. 下列属于分子水平检测EcN-HT是否构建成功有_______。（编号选填）
①PCR后利用凝胶电泳鉴定HpaBC和TyrP是否存在于EcN-HT工程菌中
②检测EcN-HT工程菌中是否存在HpaBC和TyrP转录出mRNA
③检测EcN-HT工程菌中是否存在HpaBC和TyrP蛋白
④检测EcN-HT工程菌是否同时具有抗氨苄青霉素和氯霉素的能力
⑤检测EcN-HT工程菌是否有更强的代谢酪氨酸的能力
31. 经体外和HTl模型小鼠的体内检测实验，EcN-HT均表现出优异的酪氨酸代谢能力。若要将该菌用于临床治疗人类HT1，应考虑哪些因素_______？（答1方面即可）
五、肠道工程益生菌的构建
26. ①⑤ 27. ②③
28. ①. ⑦⑨⑩ ②. ③④ ③. （⑦）⑧⑨⑩ 29. A
30. ①②③ 31. 是否会破坏肠道菌群的稳定/是否会在人群中传播从而导致健康人酪氨酸缺乏/是否会转移到其他器官导致其他器官致病/不能将实验室HTI模型鼠的研究成果直接用于人类患者的治疗，而需要经过多个复杂过程，以确保药物的安全性和有效性。合理即可。
四、（2025浦东一模）转基因斑马鱼（19分）
水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图14所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图15所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图15中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光； Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶，→表示转录方向。
24.（2分）为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶__________切割Luc基因载体可降低“空载”概率。（编号选填）
①BamH Ⅰ ②EcoR Ⅰ ③Hind Ⅲ ④BsrG Ⅰ
25.（3分）通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图14、图15信息，推测引物1包含的碱基序列为_______。（单选）
A.5’ -AACTAT-3 ’ B. 5’ -GAATTCAACTAT-3 ’
C.5’ -TTGATA-3 ’ D. 5’ -AAGCTTAACTAT-3 ’
26.（4分）将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含________的培养基中（编号选填）；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加____________进行检测。（编号选填）
①氨苄青霉素 ②雌激素 ③荧光素 ④卵黄蛋白原 ⑤荧光素酶
27.（3分）Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图16所示，下列对P2A序列描述合理的是____________（多选）
A.能与vtg基因、Luc基因一起转录
B.产生的2A肽能剪切P2A核酸序列
C.产生的2A肽能破坏蛋白1和蛋白2的结构
D.有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质
进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子中的特定序列结合，启动该基因的表达。
28.（2分）E蛋白与启动子结合后，启动转录过程还需要的酶是___________。（单选）
A.RNA聚合酶 B.DNA聚合酶 C.DNA连接酶 D.限制性内切核酸酶
29.（5分）已知vtg基因启动子长度约为1000碱基对，为了找到 E蛋白在启动子上的结合位点，请运用本题研究成果提出设计思路并阐述基本操作步骤。
____________________________________________________________________________
四、转基因斑马鱼（19分）
24.（2分）②③
25.（3分）B（选D得2分，选A得1分）
26.（4分）① ②③
27.（3分）AD
28.（2分）A
29.（5分）用限制酶将启动子切割成多个长度的DNA片段，将酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点在Luc基因的上游（或ori与P2A序列之间），形成多种重组载体。将每种重组载体分别导入斑马鱼受精卵，待发育成熟后添加雌激素和荧光素后进行检测，能发出荧光的说明导入的酶切片段中含有能与E蛋白结合的序列。将该片段继续切割成多个长度，重复上述操作，可进一步缩小该特定序列的位点区域。
（2025静安一模）转基因水稻（21分）
培育抗虫耐除草剂转基因水稻是应对病虫草害导致水稻减产的一种防治方式，Cry1Ab蛋白和Vip3Af2蛋白分别对水稻螟蛾科害虫和夜蛾科害虫有较强的杀伤效果，科研人员构建了cry1Ab-vip3Af2抗虫融合基因（简称c-v基因），并从某种细菌中分离得到了对常用除草剂草甘膦有高度耐受能力的cp4基因，培育了一种新型抗虫耐除草剂转基因水稻。
以下为主要研究过程：
Ⅰ： 利用工具酶、目的基因等构建表达载体；
Ⅱ： 将构建的表达载体导入农杆菌，将此农杆菌接种到1号培养基；
Ⅲ： 从1号培养基选取合适的单菌落接种到2号培养基扩大培养；
Ⅳ：将利用水稻种子形成的愈伤组织与第Ⅲ步获得的菌种共同培养；
Ⅴ： 将第Ⅳ步获得的愈伤组织转移到3号培养基促进愈伤组织的生长；
Ⅵ：将第Ⅴ步获得的愈伤组织转移到4号培养基，诱导芽的形成；
Ⅶ：将第Ⅵ步获得的幼体转移培养，获得第1代转基因水稻（T1），经筛选获得两株抗虫耐除草剂转基因水稻s6和s8；
Ⅷ：s6和s8分别自交，分别收集种子，萌发培养后获得第2代转基因水稻（T2），重复该过程获得第3代转基因水稻（T3）。
（3分）第Ⅰ步构建的表达载体中，包含的基因或序列有______。（多选）
A．c-v基因 B．标记基因
C．cp4基因 D．启动子
（3分）下列对1号和2号培养基的分析中，正确的是______。（多选）
A．1号培养基一般使用选择培养基
B．2号培养基一般使用天然培养基
C．1号培养基一般采用稀释涂布法接种
D．2号培养基一般采用平板划线法接种
（2分）下列关于3号和4号培养基区别的分析中，正确的是______。（单选）
A．琼脂的浓度不同 B．生长素和细胞分裂素的浓度不同
C．抗生素的种类不同 D．赤霉素和细胞分裂素的浓度不同
目的基因进入受体细胞后，有的可以整
合到水稻基因组中（图5a），有的不会发生
整合（图5b），只有整合到水稻基因组中的
目的基因才能随染色体遗传到下一代。
为评估c-v基因是否稳定整合到水稻基
因组中，科研人员设计了特异性引物，利用
PCR对s6和s8株系T1~T3的所有个体进行检测分析，结果见表2。
表2
株系 世代 s6 s8
检测到c-v基因 未检测到c-v基因 检测到c-v基因 未检测到c-v基因
T1 100% 0 100% 0
T2 75% 25% 1% 99%
T3 62.5% 37.5% 0 100%
（2分）利用PCR检测c-v基因需要合适的引物，根据图6可知需要选择引物______和引物______。
（4分）在s6的T2中，有25%没有检测到c-v基因，而s8的T2中，有99%没有检测到c-v基因，产生该结果的原因可能是：s6中，c-v基因______；s8中，c-v基因______。（编号选填）
①没有整合到基因组中
②整合到一条染色体中
③整合到一对同源染色体中
国家口岸常需快速检测进出口产品是否为转基因产品。为检测出含耐草甘膦基因的转基因产品，科研人员利用图7所示的流程制备了单克隆抗体。甲表示细胞，a~e表示过程。
（2分）图7中过程a注入小鼠体内的是______。（单选）
A．c-v基因 B．cp4基因
C．Cry1Ab蛋白和Vip3Af2蛋白 D．cp4蛋白
（2分）图7中细胞甲一般选用______。（单选）
A．人骨髓瘤细胞 B．水稻体细胞原生质体
C．小鼠骨髓瘤细胞 D．水稻愈伤组织原生质体
（3分）下列关于图7中过程b~e的分析中，正确的是______。（多选）
A．过程b表示细胞融合 B．过程c是筛选抗体分泌阳性的细胞
C．过程d是筛选杂合细胞 D．过程e必须在严格无菌环境下进行
ABCD
AC
B
4 5
②（2分） ①（2分）
D
C
AD
五、（2025黄浦区一模）噬菌体展示技术（21分）
2018年诺贝尔化学奖授予在噬菌体展示技术领域作出卓越贡献的科学家。这项技术的主要原理是：将外源基因整合到噬菌体基因组中，表达“展示蛋白”并在噬菌体表面展示，最终快速发现与其特异性结合的多肽。图10为大肠杆菌噬菌体，罗马数字代表编码外壳蛋白的基因，例如基因Ⅲ负责编码pⅢ蛋白。
图10
30．（3分）外源基因表达出“展示蛋白”需要大肠杆菌提供_____。（编号选填）
①核糖体 ②细菌DNA ③转运RNA ④核糖核苷三磷酸
⑤氨基酸 ⑥ATP ⑦脱氧核糖核苷三磷酸
31．（2分）图11为基因Ⅲ的结构，编码的信号肽引导pⅢ蛋白转移至噬菌体的组装部位，在组装过程中会被宿主的蛋白酶切除，CT结构负责将pⅢ蛋白锚定于噬菌体上。据此可知，欲得到图10展示结果，应将外源基因插入到图11所示①~④中的_____处。（单选）
图11
A．① B．② C．③ D． ④
32．（1分）欲将“展示蛋白”展示在图10噬菌体的★处，应将外源基因与基因_____整合。
图12为噬菌体展示库的构建及目标蛋白的筛选流程，其中噬菌粒是一种人工改造的特殊载体，而辅助噬菌体为子代噬菌体的复制和组装提供必要条件。
图12
33．（3分）据以上信息可知，噬菌粒上包含的功能元件或序列至少有_____。（编号选填）
①限制性内切核酸酶识别序列 ②复制起始位点
③启动子 ④筛选标记基因
⑤信号肽编码序列 ⑥外壳蛋白基因
34．（3分）噬菌体表面展示蛋白的数量或密度称为“展示价”。图10噬菌体的5个pⅢ外壳蛋白上都展示了展示蛋白，为“多价展示”，图12建的展示库为“单价展示”，你认为哪种展示方式对特异性多肽的筛选更有优势？理由是_____。
鲍曼不动杆菌（Ab菌）是医院重症监护室的主要感染源，因其对多种药物具有抗性而被视为全球性的头号“超级细菌”。研究人员运用噬菌体展示技术，研发出抗Ab菌的多肽P92，并对其药效进行了评估，部分实验结果见图13（A549细胞为一种人体细胞）。
图13
35．（2分）研究人员构建了含大量随机多肽的噬菌体展示库，通过多轮“孵育→洗脱→侵染”，筛选到了新型多肽P92。该蛋白质工程策略属于_____。（单选）
A．定点突变 B．定向进化 C．物理诱变 D．全新设计
36．（3分）实验过程中，使用含一定浓度庆大霉素（一种抗生素）的DMEM培养基培养A549细胞。下列有关该培养基及培养过程的说法，正确的是_____。（多选）
A．使用庆大霉素抑制Ab菌 B．DMEM属于液体培养基
C．通入CO2以调节PH D．该过程属于传代培养
37．（4分）研究人员认为“P92是一种具有潜力的新型抗Ab菌候选药物”，请结合图13和题意，分析得出这一结论的依据：_____。
30.(3分)①③④⑤⑥
31.(2分)B
32.(1分)VIII
33.(3分)①②③④⑤⑥
34.(3分)单价展示,单价展示在一定程度上降低了噬菌体总亲和力(1分),便于洗脱弱亲和力多肽,保留强亲和力多肽,增强了筛选的特异性(2分)。
或:多价展示,较高的展示价可以增加噬菌体与靶标的结合机会,提高了筛选效率(2分)
35.(2分)B
36.(3分)BCD
37.(4分)据图可知,P92能显著提高 Ab菌感染的A549 细胞活性(1分),且对细胞本身无明显毒害作用,说明P92能有效降低Ab菌的毒力(1分)。同时,P92并不直接抑制 Ab菌的生长,避免给其施加进化压力,降低了产生高耐药性的风险(2分)
五、（2025奉贤一模）t-PA蛋白的改良（20分）
t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血栓溶解的特异性不高。经研究发现，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可获得改良的t-PA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图为改造t-PA蛋白基因及构建表达载体的过程。
27.（3分）下列关于体内DNA复制与PCR技术的叙述正确的是______。（多选）
A. 都需要DNA聚合酶 B. 都需要破坏氢键
C. 都遵循碱基互补配对原则 D. 都是边解旋边复制
28.（4分）t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是______。以下关于图中引物描述正确的是______。（编号选填）（注：丝氨酸的密码子是UCU）
①引物b与t-PA基因编码链互补 ②引物a和引物d为正常引物
③DNA聚合酶都是从引物的端开始延伸DNA链
29.（2分）据图和已学知识分析，为保证质粒pCLY11与t-PA蛋白改良基因高效连接，选用的限制酶是______。
A XmaⅠ和NheⅠ B. SmaⅠ和Bg1Ⅱ
C. Bg1Ⅱ和NheⅠ D. XmaⅠ和Bg1Ⅱ
30.（3分）据图分析，若以大肠杆菌作为受体细胞，经过培养、筛选获得工程菌株，以下关于该过程的描述正确的是______。（多选）
A. 培养基中应加入伊红美蓝，便于筛选出大肠杆菌
B. 培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈白色
C. 培养基中应加入新霉素，所选的工程菌菌落应呈蓝色
D. 培养基需要经过高压蒸汽灭菌，操作过程需要符合无菌技术要求
31.（3分）成功获取工程菌株后，可利用发酵罐大量生产t-PA改良蛋白。发酵过程中需控制的参数是______。（编号选填）
①温度和pH ②溶解氧 ③营养物质浓度 ④搅拌转速
32.（2分）上述改良t-PA蛋白的操作策略属于蛋白质工程中的______（定向进化/定点突变）。
研究发现，运用动物细胞工程可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图所示。
33.（3分）据图和已学知识分析，下列描述正确的是______。（多选）
A 过程①运用了动物细胞核移植技术
B. 过程②通常使用的方法是显微注射
C. 过程④运用了胚胎移植技术，此过程前需进行性别鉴定
D. 为获得更多的卵母细胞，可对母牛注射促性腺激素刺激其超数排卵
五、t-PA蛋白的改良（20分）
27.(3分)ABC(全部选对得3分,漏选1个得2分,其余情况不得分)
28.(4分)G(2分)(写AGA得1分)②(2分)(全部选对得2分;漏选1个得1分;其余情况不得分)
29.(2分)D
30.(3分)BD(全部选对得3分,其余情况不得分)
31.(3分)①②③④(选对 3-4个得3分,选对2个得2分,只选1个得1分)
32.(2分)定点突变
33.(3分)BCD(全部选对得3分,漏选1个得2分,其余情况不得分)
五、（2025崇明一模）微藻助力碳中和(15分)
为减缓全球变暖趋势，世界各国制定了“碳中和”目标，即人类活动所产生并排放的二氧化碳与通过自然或人工方式吸收的二氧化碳量维持平衡。
31.(4分)下列生命现象或人类活动会导致大气中CO2含量增加的有______;有利于减少大气中CO2含量的有_______。(编号选填)
①卡尔文循环 ②三羧酸循环 ③家畜消化道中微生物的发酵活动
④化石燃料的燃烧 ⑤森林砍伐 ⑥生物遗骸在土壤中沉积，并转变为泥炭
微藻能将 CO2转化为生物燃料。然而工业废气中极高的 CO2浓度会导致微藻细胞内酸化(即 H+浓度更高)，不仅造成细胞的损伤、且使 CO2转化效率下降。为解决这一问题，研究人员向微藻细胞内转入 PMA4基因，该基因编码的膜蛋白可水解 ATP 并将 H+运往质膜外侧。
32.(2分)微藻细胞中能够产生H+的生理活动还有_______。(单选)
A.水的光解 B.NADPH的合成 C. CO2的固定 D.ATP的水解
图 12(a)示在模拟工业废气的高CO2环境中非转基因(WT)和转 PMA4基因微藻部分基因的相对表达水平，其中微藻自身的 CAHI基因可促进细胞高效吸收环境中的CO2。图 12(b)示高CO2环境中两种微藻的生物燃料产量比较。
33.(3分)综合信息，对图12的分析正确的有________(多选)
A.WT微藻的CAHI基因表达水平可能受负反馈机制调节
B.CO2的供应可能是WT微藻生物燃料产量的限制因素
C. 转基因微藻内酶的最适pH小于 WT微藻
D. 转基因微藻细胞通过主动运输将H+运出细胞可减少细胞损伤程度
34. (2分)在第1至7天的培养过程中，培养液中转基因微藻的种群数量和生物燃料产量均表现出“S”型增长的特征，造成第7天微藻种群数量和生物燃料产量增速减缓的可能原因有______。(编号选填)
①微藻个体间对无机盐、空间等资源的竞争加强
②培养液中H和代谢废物积累，对微藻生长有抑制作用
③微藻的繁殖速度下降，死亡率逐渐升高
某公司设计了一台用于培养微藻并转化工业废气中 CO2的生物反应器，其结构如图 13所示。
35.(4分)从持续高效将CO2转化为生物燃料的角度，为上述装置提供改进建议。
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五、微藻助力碳中和(15分)
31(4分)②③④⑤ (漏选得1分)①⑥(漏选得1分)
32.(2分)A
33.(3分)ABD(漏选得2分)
(2分)①②③ (漏选得1分)34.
35.(4分)
评分标准:①指出缺乏光照条件下微藻无法完成CO,向生物燃料转化得1分。写出容器使用透明材质以便透光，或在容器内安装人工光源，各得1分，若写到自然光源与人工补光相结合，得2分。
②)写出加装 pH检测与调控装置，为微藻代谢与繁殖创造最适环境，得1分③写出工业废气管道口安装空气过滤器，以便维持容器内的无菌条件，得1分④其它合理答案酌情给分，上限为4分。
