PCR扩增及电泳图
(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物____________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(1)基因表达载体中启动子是为了启动下游基因的表达，表达首先需要转录，因此与启动子结合的酶是RNA聚合酶。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗生素抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含质粒和J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。转录时mRNA的合成方向为5′→3′，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧为3′端，右侧为5′端；PCR扩增时引物F1与模板链3′端的碱基进行互补配对，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
答案：(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(2个即可) (2)F2与R1或F1与R2 a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
·任务一 PCR扩增技术的分析
(1)当选择引物F2和R2时，能否通过有无扩增产物判断J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。
提示：不能。F2和R2分别与质粒DNA的序列互补配对，未插入J基因，也可得到扩增产物，不能确定J基因是否连接到质粒中。
(2)选择引物F1和R1，得到扩增产物，能否说明J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。
提示：不能。F1和R1均与J基因配对，得到扩增产物，只能说明细胞中有J基因，无法判断插入方向是否正确。
(3)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，应选择什么引物？
提示：F1与R2或F2与R1。
(4)PCR反应时，引物延伸的方向是什么？
提示：引物延伸的方向是从引物的5′→3′。
(5)基因转录时，转录的方向如何判定？
提示：从启动子位置开始，沿着模板链的3′→5′。
(6)判断a链启动子一侧到终止子一侧的方向。
提示：5′→3′。
(7)与F1配对的是基因的哪条链？
提示：b链。
·任务二 电泳条带分析
(1)J-V5融合蛋白能与哪种抗体发生特异性结合？
提示：抗J蛋白抗体，抗V5抗体。
(2)重组质粒上的J基因表达的J蛋白是否含有V5？说明理由。
提示：含有。与质粒连接的是J基因与V5基因的融合基因。
(3)用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是什么蛋白？
提示：J-V5融合蛋白。
(4)抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，能否说明条带2不是重组质粒上的J基因表达？说明理由。
提示：能。重组质粒上的J基因表达出的蛋白应是J-V5融合蛋白，该融合蛋白既能与抗J蛋白抗体结合，又能与抗V5抗体结合，而条带2所检出的蛋白只能与抗J蛋白抗体结合，所以说明条带2不是重组质粒上的J基因表达。
模型一 设计引物的原则
(1)引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合；
(2)引物与靶序列间的Tm值不应过低；
(3)引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列；
(4)2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补碱基；
(5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
模型二 引物的特点
(1)引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合；
(2)2种引物之间不能互补配对；
(3)某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；
(4)需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；
(5)引物不能太短。
(2024·济宁一模)为快速有效地检测汞污染，科研人员利用启动子J109和PmerT、汞响应蛋白(MerR)、绿色荧光蛋白(GFP)构建了非耦合双启动子汞全细胞生物传感器，其原理如图1所示。J109为组成型启动子，在不同细胞发挥作用的效果基本一致；PmerT为诱导型启动子，需要特定信号刺激后发挥作用。相关碱基序列和基因表达方向如表1所示。
表1
启动子/结构基因 序列
J109 5′-TTTACAGCTA……CTGTGCTAGC-3′ 3′-AAATGTCGAT……GACACGATCG-5
PmerT 5′-TTCCATATCG……TATCCAATCC-3′ 3′-AAGGTATAGC……ATAGGTTAGG-5′
MerR基因 5′-ATGGAAAATA……TATGCCTTAG-3′ 3′-TACCTTTTAT……ATACGGAATC-5′
GFP基因 5′-ATGAGTAAAG……ATACAAATAA-3′ 3′-TACTCATTTC……TATGTTTATT-5′
注：基因表达方向“→”。
表2
引物组 序列
甲 5′-TTTACAGCTA-3′ 5′-CTAAGGCATA-3′
乙 5′-CTAGCATGGA-3′ 5′-TCCATCCTAG-3′
丙 5′-TTCCATATCG-3′ 5′-TTATTTGTAT-3′
丁 5′-AATCCATGAG-3′ 5′-CTCATGGATT-3′
(1)获取MerR基因时，利用PCR技术对模板DNA进行了30个“95 ℃变性→50 ℃复性→72 ℃延伸”的循环处理，对其产物电泳，出现图2所示结果。PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是 ，图2中③实验结果出现的原因可能是 。
(2)图1启动子b应选择____________________________________________，其作用是_______________________________。为确保MerR基因、GFP基因分别与相应启动子正确连接，科研人员应选择表2中 组引物对重组 DNA 进行扩增，并作进一步验证。
(3)研究发现，若全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量偏高，则传感器灵敏度低。提出改造重组质粒以提高灵敏度的两条措施：___________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是激活耐高温DNA聚合酶；获取MerR 基因时，利用 PCR 技术对模板 DNA进行了30个“95 ℃变性→50 ℃复性→72 ℃延伸”的循环处理。对其产物电泳，由图2可知，③号泳道实验组的DNA片段数量多于②号泳道纯目的基因对照组，说明③号泳道实验组中除了有目的基因外，还有其他的基因片段，造成该实验结果出现的原因可能是引物较短，特异性低，除了能作为目的基因的引物外，还能作为其他基因的引物。(2)由题意可知，J109为组成型启动子，在不同细胞发挥作用的效果基本一致，而PmerT为诱导型启动子，需要特定信号刺激后发挥作用。由图1可知，启动子a与GFP基因相连，启动子a的作用是启动GFP基因转录出mRNA，但启动子a作用的发挥与MerR蛋白有关，所以启动子a为诱导型启动子，应选择PmerT；启动子b与MerR基因相连，启动子b的作用是启动MerR基因转录出mRNA，但启动子b作用的发挥不需要特定信号刺激，所以启动子b为组成型启动子，应选择J109。在反应体系中加入引物的作用是与目的基因的模板链配对，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链。由前面的分析可知，MerR基因的启动子是组成型启动子J109，GFP基因的启动子是诱导型启动子PmerT，由表1和表2可知，启动子J109和MerR基因的碱基序列可与甲组引物进行互补配对，启动子PmerT和GFP的碱基序列可与丙组引物进行互补配对，所以为确保MerR基因、GFP基因分别与相应启动子正确连接，应选择表2中甲、丙组引物对重组 DNA 进行扩增，并作进一步验证。(3)由图1可知，全细胞生物传感器在有Hg2＋状态下，启动子a才能启动GFP基因转录，最终生成GFP，表现出绿色荧光；在无Hg2＋状态下，启动子a不能启动GFP基因转录，不能表现出绿色荧光。如果全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量偏高，传感器灵敏度低，根据图1中全细胞生物传感器的原理可推测出其原因可能是MerR对启动子a的抑制作用减弱或启动子a对GFP基因转录的启动作用增强。因此为了使全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量正常，提高传感器灵敏度，需要对重组质粒进行改造，具体措施有增强MerR与启动子a的结合、修改启动子b以增强MerR的表达、增加重组质粒中MerR基因的数量(拷贝数)、修改启动子a以降低GFP基因的表达量。
答案：(1)激活耐高温的DNA聚合酶 引物较短，特异性低 (2)J109 启动MerR基因转录出mRNA 甲、丙 (3)增强MerR与启动子a的结合、修改启动子b以增强MerR 的表达、增加重组质粒中MerR 基因的数量(拷贝数)、修改启动子a以降低 GFP基因的表达量(答出两条即可)
基因工程的操作程序
(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有__________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′- -3′和5′- -3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 (填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
解析：(1)引物越短，特异性越低。限制酶切开 DNA 双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，BsaⅠ切割大豆基因组DNA后露出的是四个N，而N代表任一碱基，所以黏性末端可以有44种。由图甲、图丙可知，BsaⅠ的识别位置是，切开后的黏性末端为 5′-GTTT-3′、5′-CAAT-3′。(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，会将T-DNA片段插入大豆细胞染色体 DNA上，T-DNA上有卡那霉素抗性基因，因而可以用卡那霉素筛选。目标序列上有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，突变序列有BamHⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ酶切位点，根据电泳结果，②只有一个条带，说明没有被酶切，所以用的酶是SacⅠ，且②为目标序列，因为目标序列没有SacⅠ酶切位点，酶切后④有两个不同于②的条带说明④是突变纯合子。(3)基因L突变的纯合植株基因型记为LL，T-DNA上有卡那霉素的抗性基因，体细胞中只有1条染色体有T-DNA，说明只有一个抗性基因。若T-DNA 不在L基因所在的染色体上，用A表示抗性基因，则关于抗性的基因型记为AO，植株基因型为LLAO，两对基因遗传时遵循自由组合定律，LLAO自交，其后代突变基因纯合且抗生素敏感的植株(LLOO)所占比例为1/4。若该基因在L基因所在的染色体上植株基因型记为LL′，LL′自交其后代突变基因纯合且抗生素敏感的植株(LL)占 1/4。
答案：(1)低 44 GTTT CAAT (2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
·任务一 启动子的相关分析
(1)引物通过什么键与模板的结合？是否遵循碱基互补配对原则？
提示：氢键，是。
(2)引物越短，DNA上与之配对的序列越少，对特异性有何影响？
提示：特异性越低。
·任务二 糯性分析
(1)用BsaⅠ酶切大豆基因组的DNA序列，从其识别序列与切割位点可知，切出的黏性末端有多少个碱基？理论上可产生的黏性末端最多有多少种？
提示：4,44(256)。
(2)载体有上、下游两个BsaⅠ酶切位点，酶切后，载体上留下的黏性末端，左侧末端是什么？右侧末端是什么？
提示：5′-CAAT-3′，5′-GTTT-3′。
·任务三 因果推理与论证
提示：限制酶只能识别差异序列中的一种序列 SacⅠ ①③ ② ④
·任务四 建构概念模型
提示：AA纯合子 突变位点纯合子AA Bb杂合子 1/4 1/4
模型一 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ限制酶，而不选择SmaⅠ限制酶。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ限制酶。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ限制酶；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
模型二 基因表达载体的构建模型
(2024·青岛一模)CRISPR-Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，该系统主要包含crRNA 和Cas12a蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切 DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a系统对宫颈癌细胞中的 KIFC1基因进行敲除，来探讨 KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌 HeLa细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含 种核苷酸；细菌细胞中的 也能起到类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来，需要设计 种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中P1的碱基序列为5′- -3′(写出前9个碱基)。采用PCR技术对一个DNA 进行扩增时，第n次循环共需要引物______________个。
(3)在目的基因与PX458质粒连接时，可用 (填“E.coli DNA 连接酶”或“T4 DNA 连接酶”)进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞，与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达最如图乙所示，细胞数目的变化如图丙所示，由此可得出的结论是______________________________________________________，判断依据是___________________________________________________________。
解析：(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，在结合区域有DNA和RNA，组成DNA的核苷酸为4种脱氧核苷酸，组成RNA的核苷酸为4种核糖核苷酸，所以结合区域最多含8种核苷酸。由题意可知，在CRISPR-Cas12a系统中，Cas12a蛋白的作用是在 crRNA的引导下，到相应位置剪切DNA。细菌细胞中的限制酶也能剪切DNA，与Cas12a蛋白的作用类似。因为要将KIFC1基因从目标 DNA上剪切下来，需要两个切口，每个切口都需要crRNA特异性识别并结合特定的 DNA 序列，两个切口处的DNA序列又不同，所以需要设计2种crRNA。(2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，由图甲可知，PX458质粒有3种限制酶切割位点，其中KpnⅠ有2个切割位点，其中的一个切割位点在Cas12a基因上，所以不能选择限制酶KpnⅠ，为避免目的基因与PX458质粒在切割后的环化及保证目的基因与PX458质粒正确连接，应选择PvitⅡ和EcoR Ⅰ这两种不同的限制酶切割质粒和含有目的基因的 DNA片段，PvitⅡ的识别序列为5′-CAG↓CTG-3′，切割后为平末端，EcoRⅠ的识别序列为5′-G↓AATTC-3′，切割后为黏性末端，PvitⅡ的识别序列离启动子U6近，EcoRⅠ的识别序列离启动子U6远，目的基因的A链为转录的模板链，引物P1与A链互补配对，所以转录应从 A链的3′端开始，引物P1上应加入限制酶PvitⅡ的识别序列，由P1的箭头方向可知，P1的前9个碱基序列为5′-CAGCTGCTC-3′。采用PCR 技术对一个 DNA 进行扩增时，第n－1次循环后，共生成了2n－1个 DNA分子，在进行第n次循环时，每个 DNA 分子都需要2个引物，所以n次循环共需要引物2×2n－1＝2n个。(3)因为目的基因和PX458质粒在用限制酶PvitⅡ和EcoRⅠ切割时，分别形成了平末端和黏性末端，E.coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，所以在目的基因与PX458质粒连接时，可用 T4 DNA 连接酶进行连接。(4)由题意可知，该实验的目的是探究 KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈HeLa细胞增殖的影响，对照组为含有 KIFC1 基因的 HeLa 细胞，实验组为敲除了 KIFC1 基因的 HeLa细胞，由图乙可知，与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功，由图丙可知，KIFC1敲除组细胞数目显著低于对照组，表明 KIFC1敲除可使HeLa 细胞增殖能力下降，由此可得出的结论是 KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。
答案：(1)8 限制酶(限制性内切核酸酶) 2 (2)CAGCTGCTC 2n (3)T4 DNA 连接酶 (4)KIFC1基因可以促进 HeLa细胞的增殖 实验组细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使 HeLa细胞增殖能力下降(共44张PPT)
命题区5 基因工程
(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5 融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
题型一 PCR扩增及电泳图
(1)与图甲中启动子结合的酶是________________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________ ______________________________(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的__________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了___________________________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(1)基因表达载体中启动子是为了启动下游基因的表达，表达首先需要转录，因此与启动子结合的酶是RNA聚合酶。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗生素抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含质粒和J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测
时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。转录时mRNA的合成方向为5′→3′，又知J基因转录的模板链位于b链，所以b链左侧为3′端，右侧为5′端；PCR扩增时引物F1与模板链3′端的碱基进行互补配对，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
答案：(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等(2个即可) (2)F2与R1或F1与R2 a链 (3)J-V5融合蛋白 不是
·任务一 PCR扩增技术的分析
(1)当选择引物F2和R2时，能否通过有无扩增产物判断J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。
提示：不能。F2和R2分别与质粒DNA的序列互补配对，未插入J基因，也可得到扩增产物，不能确定J基因是否连接到质粒中。
(2)选择引物F1和R1，得到扩增产物，能否说明J基因连接到质粒中且插入方向正确？说明理由。
提示：不能。F1和R1均与J基因配对，得到扩增产物，只能说明细胞中有J基因，无法判断插入方向是否正确。
(3)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，应选择什么引物？
提示：F1与R2或F2与R1。
(4)PCR反应时，引物延伸的方向是什么？
提示：引物延伸的方向是从引物的5′→3′。
(5)基因转录时，转录的方向如何判定？
提示：从启动子位置开始，沿着模板链的3′→5′。
(6)判断a链启动子一侧到终止子一侧的方向。
提示：5′→3′。
(7)与F1配对的是基因的哪条链？
提示：b链。
·任务二 电泳条带分析
(1)J-V5融合蛋白能与哪种抗体发生特异性结合？
提示：抗J蛋白抗体，抗V5抗体。
(2)重组质粒上的J基因表达的J蛋白是否含有V5？说明理由。
提示：含有。与质粒连接的是J基因与V5基因的融合基因。
(3)用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是什么蛋白？
提示：J-V5融合蛋白。
(4)抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，能否说明条带2不是重组质粒上的J基因表达？说明理由。
提示：能。重组质粒上的J基因表达出的蛋白应是J-V5融合蛋白，该融合蛋白既能与抗J蛋白抗体结合，又能与抗V5抗体结合，而条带2所检出的蛋白只能与抗J蛋白抗体结合，所以说明条带2不是重组质粒上的J基因表达。
模型一 设计引物的原则
(1)引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合；
(2)引物与靶序列间的Tm值不应过低；
(3)引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列；
(4)2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列，在3′端不应有任何互补碱基；
(5)引物中碱基的分布尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
模型二 引物的特点
(1)引物能与DNA模板通过碱基互补配对结合；
(2)2种引物之间不能互补配对；
(3)某一引物不能自身折叠出现局部碱基互补配对；
(4)需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列；
(5)引物不能太短。
(2024·济宁一模)为快速有效地检测汞污染，科研人员利用启动子J109和PmerT、汞响应蛋白(MerR)、绿色荧光蛋白(GFP)构建了非耦合双启动子汞全细胞生物传感器，其原理如图1所示。J109为组成型启动子，在不同细胞发挥作用的效果基本一致；PmerT为诱导型启动子，需要特定信号刺激后发挥作用。相关碱基序列和基因表达方向如表1所示。
表1
注：基因表达方向“→”。
启动子/结构基因 序列
J109 5′-TTTACAGCTA……CTGTGCTAGC-3′
3′-AAATGTCGAT……GACACGATCG-5
PmerT 5′-TTCCATATCG……TATCCAATCC-3′
3′-AAGGTATAGC……ATAGGTTAGG-5′
MerR基因 5′-ATGGAAAATA……TATGCCTTAG-3′
3′-TACCTTTTAT……ATACGGAATC-5′
GFP基因 5′-ATGAGTAAAG……ATACAAATAA-3′
3′-TACTCATTTC……TATGTTTATT-5′
表2
引物组 序列
甲 5′-TTTACAGCTA-3′
5′-CTAAGGCATA-3′
乙 5′-CTAGCATGGA-3′
5′-TCCATCCTAG-3′
丙 5′-TTCCATATCG-3′
5′-TTATTTGTAT-3′
丁 5′-AATCCATGAG-3′
5′-CTCATGGATT-3′
(1)获取MerR基因时，利用PCR技术对模板DNA进行了30个“95 ℃变性→50 ℃复性→72 ℃延伸”的循环处理，对其产物电泳，出现图2所示结果。PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是___________ _________________________________，图2中③实验结果出现的原因可能是_____________________________。
(2)图1启动子b应选择______________________________________，其作用是___________________________________。为确保MerR基因、GFP基因分别与相应启动子正确连接，科研人员应选择表2中____________________________组引物对重组 DNA 进行扩增，并作进一步验证。
(3)研究发现，若全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量偏高，则传感器灵敏度低。提出改造重组质粒以提高灵敏度的两条措施：____________________________________。
解析：(1)PCR反应缓冲液中加入Mg2＋的作用是激活耐高温DNA聚合酶；获取MerR 基因时，利用 PCR 技术对模板 DNA进行了30个“95 ℃变性→50 ℃复性→72 ℃延伸”的循环处理。对其产物电泳，由图2可知，③号泳道实验组的DNA片段数量多于②号泳道纯目的基因对照组，说明③号泳道实验组中除了有目的基因外，还有其他的基因片段，造成该实验结果出现的原因可能是引物较短，特异性低，除了能作为目的基因的引物外，还能作为其他基因的引物。(2)由题意可知，J109为组成型启动子，在不同细胞发挥作用的效果基本一致，而PmerT为诱导型启动子，需要特定信号刺激后发挥作用。
由图1可知，启动子a与GFP基因相连，启动子a的作用是启动GFP基因转录出mRNA，但启动子a作用的发挥与MerR蛋白有关，所以启动子a为诱导型启动子，应选择PmerT；启动子b与MerR基因相连，启动子b的作用是启动MerR基因转录出mRNA，但启动子b作用的发挥不需要特定信号刺激，所以启动子b为组成型启动子，应选择J109。在反应体系中加入引物的作用是与目的基因的模板链配对，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，延伸子链。由前面的分析可知，MerR基因的启动子是组成型启动子J109，GFP基因的启动子是诱导型启动子PmerT，由表1和表2可知，启动子J109
和MerR基因的碱基序列可与甲组引物进行互补配对，启动子PmerT和GFP的碱基序列可与丙组引物进行互补配对，所以为确保MerR基因、GFP基因分别与相应启动子正确连接，应选择表2中甲、丙组引物对重组 DNA 进行扩增，并作进一步验证。(3)由图1可知，全细胞生物传感器在有Hg2＋状态下，启动子a才能启动GFP基因转录，最终生成GFP，表现出绿色荧光；在无Hg2＋状态下，启动子a不能启动GFP基因转录，不能表现出绿色荧光。如果全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量偏高，传感器灵敏度低，根据图1中全细胞生物传感器的原理可推测出其原因可能是MerR对启动子
a的抑制作用减弱或启动子a对GFP基因转录的启动作用增强。因此为了使全细胞生物传感器在无Hg2＋状态下GFP基因的表达量正常，提高传感器灵敏度，需要对重组质粒进行改造，具体措施有增强MerR与启动子a的结合、修改启动子b以增强MerR的表达、增加重组质粒中MerR基因的数量(拷贝数)、修改启动子a以降低GFP基因的表达量。
答案：(1)激活耐高温的DNA聚合酶 引物较短，特异性低
(2)J109 启动MerR基因转录出mRNA 甲、丙 (3)增强MerR与启动子a的结合、修改启动子b以增强MerR 的表达、增加重组质粒中MerR 基因的数量(拷贝数)、修改启动子a以降低 GFP基因的表达量(答出两条即可)
(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
题型二 基因工程的操作程序
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越__________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有__________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-________________-3′和5′-__________-3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_____________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是___________，其中纯合的突变植株是_________(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，会将T-DNA片段插入大豆细胞染色体 DNA上，T-DNA上有卡那霉素抗性基因，因而可以用卡那霉素筛选。目标序列上有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，突变序列有BamHⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ酶切位点，根据电泳结果，②只有一个条带，说明没有被酶切，所以用的酶是SacⅠ，且②为目标序列，因为目标序列没有SacⅠ酶切位点，酶切后④有两个不同于②的条带说明④是突变纯合子。(3)基因L突变的纯合植株基因型记为LL，T-DNA上有卡那霉素的抗性基因，体细胞中只有1条染色体有T-DNA，说明只有一个抗性基因。若T-DNA 不在L基因所在的染色体
上，用A表示抗性基因，则关于抗性的基因型记为AO，植株基因型为LLAO，两对基因遗传时遵循自由组合定律，LLAO自交，其后代突变基因纯合且抗生素敏感的植株(LLOO)所占比例为1/4。若该基因在L基因所在的染色体上植株基因型记为LL′，LL′自交其后代突变基因纯合且抗生素敏感的植株(LL)占 1/4。
答案：(1)低 44 GTTT CAAT
(2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
·任务一 启动子的相关分析
(1)引物通过什么键与模板的结合？是否遵循碱基互补配对原则？
提示：氢键，是。
(2)引物越短，DNA上与之配对的序列越少，对特异性有何影响？
提示：特异性越低。
·任务二 糯性分析
(1)用BsaⅠ酶切大豆基因组的DNA序列，从其识别序列与切割位点可知，切出的黏性末端有多少个碱基？理论上可产生的黏性末端最多有多少种？
提示：4,44(256)。
(2)载体有上、下游两个BsaⅠ酶切位点，酶切后，载体上留下的黏性末端，左侧末端是什么？右侧末端是什么？
提示：5′-CAAT-3′，5′-GTTT-3′。
·任务三 因果推理与论证
提示：限制酶只能识别差异序列中的一种序列 SacⅠ ①③ ② ④
·任务四 建构概念模型
提示：AA纯合子 突变位点纯合子AA Bb杂合子 1/4 1/4
模型一 图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ限制酶，而不选择SmaⅠ限制酶。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ限制酶。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ限制酶；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
模型二 基因表达载体的构建模型
(2024·青岛一模)CRISPR-Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas 系统，该系统主要包含crRNA 和Cas12a蛋白两部分，crRNA 能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切 DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a系统对宫颈癌细胞中的 KIFC1基因进行敲除，来探讨 KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌 HeLa细胞增殖的影响。
(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含_____________种核苷酸；细菌细胞中的___________________________________也能起到类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来，需要设计_________________种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中P1的碱基序列为5′-___________-3′(写出前9个碱基)。采用PCR技术对一个DNA 进行扩增时，第n次循环共需要引物_______个。
(3)在目的基因与PX458质粒连接时，可用_____________(填“E.coli DNA 连接酶”或“T4 DNA 连接酶”)进行连接。
(4)将crRNA-Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞，与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达最如图乙所示，细胞数目的变化如图丙所示，由此可得出的结论是______________________________，判断依据是__________________________________。
解析：(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，在结合区域有DNA和RNA，组成DNA的核苷酸为4种脱氧核苷酸，组成RNA的核苷酸为4种核糖核苷酸，所以结合区域最多含8种核苷酸。由题意可知，在CRISPR-Cas12a系统中，Cas12a蛋白的作用是在 crRNA的引导下，到相应位置剪切DNA。细菌细胞中的限制酶也能剪切DNA，与Cas12a蛋白的作用类似。因为要将KIFC1基因从目标 DNA上剪切下来，需要两个切口，每个切口都需要crRNA特异性识别并结合特定的 DNA 序列，两个切口处的DNA序列又不同，所以需要设计2种crRNA。(2)为保证目的基因
与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，由图甲可知，PX458质粒有3种限制酶切割位点，其中KpnⅠ有2个切割位点，其中的一个切割位点在Cas12a基因上，所以不能选择限制酶KpnⅠ，为避免目的基因与PX458质粒在切割后的环化及保证目的基因与PX458质粒正确连接，应选择PvitⅡ和EcoR Ⅰ这两种不同的限制酶切割质粒和含有目的基因的 DNA片段，PvitⅡ的识别序列为5′-CAG↓CTG-3′，切割后为平末端，EcoRⅠ的识别序列为5′-G↓AATTC-3′，切割后为黏性末端，PvitⅡ的识别序列离启动子U6近，EcoRⅠ的识别序列离启动子U6
远，目的基因的A链为转录的模板链，引物P1与A链互补配对，所以转录应从 A链的3′端开始，引物P1上应加入限制酶PvitⅡ的识别序列，由P1的箭头方向可知，P1的前9个碱基序列为5′-CAGCTGCTC-3′。采用PCR 技术对一个 DNA 进行扩增时，第n－1次循环后，共生成了2n－1个 DNA分子，在进行第n次循环时，每个 DNA 分子都需要2个引物，所以n次循环共需要引物2×2n－1＝2n个。(3)因为目的基因和PX458质粒在用限制酶PvitⅡ和EcoRⅠ切割时，分别形成了平末端和黏性末端，E.coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，所以在目的基因与PX458质粒连接时，可用 T4 DNA 连接酶进行连接。
(4)由题意可知，该实验的目的是探究 KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈HeLa细胞增殖的影响，对照组为含有 KIFC1 基因的 HeLa 细胞，实验组为敲除了 KIFC1 基因的 HeLa细胞，由图乙可知，与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功，由图丙可知，KIFC1敲除组细胞数目显著低于对照组，表明 KIFC1敲除可使HeLa 细胞增殖能力下降，由此可得出的结论是 KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。
答案：(1)8 限制酶(限制性内切核酸酶) 2 (2)CAGCTGCTC 2n
(3)T4 DNA 连接酶 (4)KIFC1基因可以促进 HeLa细胞的增殖 实验组细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1 敲除可使 HeLa细胞增殖能力下降
