2026全国版高考生物一轮基础知识专题练--第24章　基因工程（含答案）

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2026全国版高考生物一轮
专题过关检测练
题组一
1.草鱼是我国养殖产量最大的水产品种之一,武汉高泽霞教授团队找到并敲除控制草鱼肌间刺产生的关键基因B,成功培育出“无刺”草鱼,实验过程如图。下列说法错误的是(　　)
A.可从鱼刺中提取mRNA进行逆转录获得cDNA,从中找到与鱼刺发育有关的基因
B.PCR扩增时反应体系中需加入模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶、Mg2+等
C.利用基因编辑技术获得一条敲除基因B的杂合体少刺草鱼,通过一代杂交可获得遗传性状稳定的无刺鱼
D.养殖遗传性状稳定的无刺鱼时,应避免与野生鱼杂交,否则可能会造成生态威胁
2.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端,且无合适的限制酶识别序列,需借助中间载体P将目的基因接入载体E。如图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　　)
A.构建重组载体P时,应选择EcoRⅤ进行酶切,再用T4 DNA连接酶连接
B.为了便于该目的基因接入载体E,可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C.载体P不能作为基因表达载体,是因为它不含起始密码子和终止密码子
D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状,表明重组载体成功导入受体细胞
3.(不定项)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A.构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ
B.在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D.为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
4.(不定项)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒,得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是(　　)
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
5.(不定项)为了获得未知序列的碱基序列,可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增,再对其扩增产物进行测序,其过程如图。下列说法正确的是(　　)
A.图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B.环化阶段,可选用E.coliDNA连接酶或T4 DNA连接酶
C.以环化的DNA为模板进行PCR时,应选择引物2和引物3
D.若1个DNA分子用PCR技术扩增n次,则需要2n+1-2个引物
6.(不定项)ω-3多不饱和脂肪酸(ω-PUFAs)有预防心血管疾病的作用,但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术(将外源DNA转入受体细胞的技术)将ω-PUFAs-合成酶基因(fat-1基因,含1 229 bp)导入小鼠受精卵中,培育出转基因小鼠,基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后,利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后的电泳结果。下列说法错误的是(　　)
A.采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B.PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4
C.由图乙可知,只有2组转染成功
D.若fat-1基因单点插入,则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成ω-PUFAs
7.(不定项)丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗,某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图,进而构建出融合基因表达载体,其中LTB是一种免疫增强剂基因,R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是(　　)
A.PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶
B.若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因,可选择引物P2和引物P3继续进行PCR
C.融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等
D.若利用转基因植物生产该疫苗,需用到基因工程、植物组织培养和抗原—抗体杂交技术
9.(不定项)科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功,将重组质粒用NcoⅠ和SacⅠ双酶切处理后电泳,结果如图,其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法正确的是(　　)
A.PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列
B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bp
C.泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近
D.从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性
10.科学家利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素有两种方法:“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素;“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因,利用工程菌获得胰岛素。两种方法使用同一种质粒作为载体。
(1)“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列,原因是　　　　　　　　
　　　　　　　　。上述两种方法获取的目的基因中,不含人胰岛素基因启动子的方法是　　　　　　　　　。
(2)对人工合成的胰岛素基因进行测序,发现其两端附近无限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点。已知胰岛素基因表达时以①链为模板,如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理的图1所示质粒上,且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录,则应在配对到②链的引物5'端添加6个碱基,序列为5'-　　　　　　　　-3'。PCR扩增过程中,最早经过　　轮循环后,便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。
(3)若使用一种限制酶切割目的基因和载体后,会存在目的基因的正向或反向两种连接产物,　　　　(填“可以”或“不可以”)通过电泳来区分两种产物,在凝胶中DNA分子的迁移速率与　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点)等有关。
11.L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体),而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量,在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中,以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列,图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点,其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。
图2
(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。要将L-天冬酰胺酶基因导入pET22b质粒中,需使用的两种限制酶是　　　　　　。
(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列,则获取目的基因时设计B端的引物序列是　　　　　　　　　(只写出16个碱基即可)。
(3)科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上,以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒,导入重组质粒的菌落呈现　　　色,这些菌落　　　　　(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
②若使用(1)中的限制酶处理,则菌落呈　　色的为符合要求的宿主菌,理由是　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的,如果选择大肠杆菌作为受体菌,只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链,不能得到有活性的L-天冬酰胺酶,原因是　　　　　　　　　　　　　 　　 　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
12.研究人员拟培育转fat1基因和fat2基因的转双基因猪,为避免fat1蛋白和fat2蛋白相互融合影响功能,利用重叠延伸PCR技术在fat1基因和fat2基因之间插入具有自剪切功能的2A连接肽基因,构建fat1-2A-fat2融合基因。2A基因的转录产物可通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸(G)和脯氨酸(P)之间的肽键,将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段,F1~F4、R1~R4表示引物。
(1)利用PCR技术可实现在体外快速大量扩增DNA,其与细胞内DNA复制的共同点是　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点)。若图乙中融合基因的b链为模板链,则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物　　　　的绝大部分序列相同。
(2)PCR1和PCR2需要分开单独进行,原因是　　　　　　　　 　　　　　。PCR3不需要引物,高温加热后fat1-2A和2A-fat2的双链解开,其中能正常延伸形成融合基因的是　　　(填序号)形成的杂交链。
(3)图乙构建的重组质粒中未标注出的必需元件还有　　　　　　　　。为确定fat1基因连接到重组质粒中且插入2A序列的上游,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图乙中的引物　　　　。所融合基因经图丙中的过程表达产生fat1和fat2两种蛋白,经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白较正常fat1蛋白的相对分子质量大,据该融合基因的结构和表达原理推测,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
题组二
1.酒精是生物实验室中常见的试剂,许多生物学实验都需要用到。下列有关叙述正确的是(　　)
A.在色素的提取和分离实验中,利用不同色素在无水乙醇中溶解度不同而实现色素分离
B.在低温诱导植物细胞染色体数目变化的实验中,两次用到酒精的目的是一致的
C.检测和观察细胞中的脂肪颗粒需要用到体积分数50%的酒精洗去浮色
D.在DNA粗提取与鉴定实验中,利用体积分数为95%的酒精提取DNA
2.当苹果削好皮或切开后放置一会儿,切口面的颜色就会由浅变深,最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物,即发生变色反应变成黄色,随着反应的量的增加颜色就逐渐加深,最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程,下列叙述不正确的是(　　)
A.要想获得抗褐变的转基因苹果,目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B.实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果,可与导入含pBI121质粒的植株作对照
3.(不定项)像BclⅠ(-T↓GATCA-)、BglⅡ(-A↓GATCT-)、MboⅠ(-↓GATC-)这样,识别序列不同,但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割,并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(　　)
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和 BglⅡ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和 BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化,切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开,但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化,切割后的目的基因也可以自我环化
4.HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内,参与构成鸡蛋清的蛋白质。如图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下,下列叙述正确的是(　　)
A.①为逆转录过程,该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分
B.目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列,拼接前载体用MfeⅠ和HindⅢ切割
C.利用PCR扩增目的基因时,反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定
D.利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋白可以大规模用于禽流感疫苗的制备
5.CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分,其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列,当病毒入侵后,某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR,Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方,该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用,CRISPR-Cas系统的组成如图所示,现在CRISPR-Cas9(由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成)已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是(　　)
A.CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用
B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化
C.内切核酸酶Cas9具有专一性
D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割
6.(不定项)自然界中很少出现蓝色的花,天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图,PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶),通过农杆菌转化法导入白玫瑰中,在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法不正确的是(　　)
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中需转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表达时分别以T-DNA的不同链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰细胞质基因组中防止基因扩散
7.同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
(1)酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为　　　　(从P1~P6中选),选择的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作　　　　　以筛选目的菌。另外,URA3编码的蛋白还可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用　　　　　的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以下图　　　　　　　　(填“方式1”或“方式2”)排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在　　　　　　的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
8.某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可与蛋白P结合,使其被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建基因表达载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
图甲
(1)α链的3'端在　　　　(填写“左侧”或“右侧”),A、B、C、D四个短核苷酸链,可作为PCR复制过程中的引物对的是　　　　。
(2)PCR扩增得到的P基因(PCR时已在引物两端添加限制酶识别序列)经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图乙所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列,ATG对应其正常转录mRNA中的AUG(起始密码子)。
图乙
①PCR扩增P基因时需将限制酶的识别序列添加在引物的　　　　(填“3'端”“5'端”或“3'端或5'端”)。
②将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,P基因对应的氨基酸序列与蛋白P不同,据图分析,解决这一问题可采取的方法是 　。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和蛋白UBC按照图丙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质,用蛋白UBC抗体检测,检测结果如图丁所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC。
图丙
图丁
通过　　　　组的结果,可以分析缺失序列Δ的作用,该序列缺失造成的影响是　　　　　　　　　　　　　　　　　;由实验结果可知,药物A的作用机理是　　　　　　　　　　　　　。
9.乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量;酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列,ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是(　　)
A.引物2的3'端序列应包含XbaⅠ的识别序列
B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C.进行PCR时,缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
D.引物1的5'端序列应考虑将GTG改为ATG
10.研究发现,若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA),则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示,箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽,过程如图2所示,其中Ⅰ为转录模板链,引物上的“”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合为(　　)
图1
图2
　　　　　　　　　　　　　　　
A.引物1和引物4　　　　B.引物2和引物6
C.引物2和引物4　　　　D.引物3和引物5
11.γ-氨基丁酸是人体大脑皮层主要的抑制性递质。γ-氨基丁酸的摄入可以维持大脑稳定的神经传递,此外γ-氨基丁酸还具有降低血压、减轻焦虑和抑制糖尿病等功能,因此被用作食品添加剂或膳食补充剂。利用微生物法制备γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点,具有广阔的应用前景。
(1)γ-氨基丁酸由突触前膜释放,与后膜上受体结合后使后膜对离子的通透性发生改变,此时突触后膜膜两侧的电位为　　　　。
(2)γ-氨基丁酸是以L-谷氨酸作为前体物质,在谷氨酸脱羧酶催化下合成的。研究人员尝试通过加强谷氨酸脱羧酶的过量表达来实现γ-氨基丁酸的高效生产。具体操作过程如下:
Ⅰ.获取谷氨酸脱羧酶基因并进行PCR扩增。PCR扩增时需要　　　　　酶,每次循环一般可以分为　　　　　　　　三步。
Ⅱ.重组质粒的构建和鉴定。将谷氨酸脱羧酶基因和质粒分别用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ进行双酶切,混合后使用DNA连接酶连接,得到构建的重组质粒,如图1。然后通过酶切法对构建的重组质粒进行鉴定,结果如图2所示。
图2中泳道1、2分别是用限制性内切核酸酶KpnⅠ酶切质粒、重组质粒的结果。若已知目的基因片段已整合到质粒上,请在下图泳道3中绘制出用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ双酶处理重组质粒所得的电泳结果。
注:M1、M2表示标准参照
Ⅲ.重组质粒的转化、鉴定与表达。将鉴定后的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有　　　　　　　的抗性平板上,培养得到阳性转化菌落。将转化后的大肠杆菌细胞接种至培养液中,在适宜条件培养。培养液中需要加入碳源、氮源等营养成分,氮源的主要作用是　　　　 (答出1点即可)。
IV.菌株产γ-氨基丁酸能力的比较。一段时间后检测发酵液中γ-氨基丁酸的含量。若要证明加强谷氨酸脱羧酶的过量表达能实现γ-氨基丁酸的高效生产,则实验结果应该是　　　　　　　　　　　　　　　　。
12.猪大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB和ST1是猪源大肠杆菌肠毒素基因。研究人员通过重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因,其表达产物LTB-ST1融合蛋白可有效预防仔猪黄痢,该融合基因构建过程如图所示。请回答下列问题:
(1)重组PCR技术依据的生物学原理是　　　　　　　　　　　。
(2)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的,两个反应体系中加入的物质中不同的是　　　　　。PCR1和PCR2的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　,从而有利于LTB基因和ST1基因融合。
(3)在②过程中,PCR1和PCR2产物的作用是作为　　　　　　。
(4)引物的作用是 　。
(5)定点突变是指使基因特定位点发生碱基对的增添、缺失或者替换。重组PCR技术不仅可用于构建融合基因,还可用于基因定点突变。请结合下图,说明利用重组PCR技术进行基因内部定点突变的方法: 　。
13.新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
图1
(2)利用　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　,通过　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的　　　　　细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　免疫和　　　　　免疫。
图2
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)
8.天然T4溶菌酶由164个氨基酸构成,大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造T4溶菌酶基因,并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的T4溶菌酶。回答下列问题:
(1)科学家希望利用蛋白质工程技术,对T4溶菌酶进行改造,基本思路是从　　　　　　　　出发→设计预期的T4溶菌酶结构→　　　　　　　　　→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的T4溶菌酶。
(2)研究发现T4溶菌酶的第3位异亮氨酸(密码子为AUU、AUC、AUA)变为半胱氨酸(密码子为UGU、UGC),该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用PCR定点突变技术对T4溶菌酶基因的编码序列进行改造(如图1),要选择的图中的引物组合最好是　　　　。
(3)科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU),耐热性提升幅度更大。可运用大引物PCR进行定点突变,相关原理如图2所示。进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是　　　　　　　　　　　　　　　,至少需要　　　　次循环,才能获得相应的大引物。用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR,要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达载体的改良基因,引物应选用大引物两条链中的　　　　(填“①”或“②”)。
(4)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与图3中的质粒A正确连接,设计引物时需要在两种引物的　　　　(填“3'”或“5'”)端连接上限制酶　　　　　　　识别和切割的序列。
图3
专题过关检测练
题组一
1.草鱼是我国养殖产量最大的水产品种之一,武汉高泽霞教授团队找到并敲除控制草鱼肌间刺产生的关键基因B,成功培育出“无刺”草鱼,实验过程如图。下列说法错误的是(　　)
A.可从鱼刺中提取mRNA进行逆转录获得cDNA,从中找到与鱼刺发育有关的基因
B.PCR扩增时反应体系中需加入模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶、Mg2+等
C.利用基因编辑技术获得一条敲除基因B的杂合体少刺草鱼,通过一代杂交可获得遗传性状稳定的无刺鱼
D.养殖遗传性状稳定的无刺鱼时,应避免与野生鱼杂交,否则可能会造成生态威胁
答案　C　
2.由于PCR扩增出的目的基因末端为平末端,且无合适的限制酶识别序列,需借助中间载体P将目的基因接入载体E。如图为两种载体的结构和相关限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　　)
A.构建重组载体P时,应选择EcoRⅤ进行酶切,再用T4 DNA连接酶连接
B.为了便于该目的基因接入载体E,可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P
C.载体P不能作为基因表达载体,是因为它不含起始密码子和终止密码子
D.若受体细胞表现出抗性基因的相应性状,表明重组载体成功导入受体细胞
答案　A　
3.(不定项)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A.构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ
B.在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D.为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
答案　AC　
4.(不定项)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒,得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是(　　)
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
答案　D　
5.(不定项)为了获得未知序列的碱基序列,可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增,再对其扩增产物进行测序,其过程如图。下列说法正确的是(　　)
A.图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B.环化阶段,可选用E.coliDNA连接酶或T4 DNA连接酶
C.以环化的DNA为模板进行PCR时,应选择引物2和引物3
D.若1个DNA分子用PCR技术扩增n次,则需要2n+1-2个引物
答案　ABD　
6.(不定项)ω-3多不饱和脂肪酸(ω-PUFAs)有预防心血管疾病的作用,但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术(将外源DNA转入受体细胞的技术)将ω-PUFAs-合成酶基因(fat-1基因,含1 229 bp)导入小鼠受精卵中,培育出转基因小鼠,基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后,利用fat-1基因的引物进行PCR扩增后的电泳结果。下列说法错误的是(　　)
A.采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B.PCR扩增3轮后,只含一种引物的DNA分子的比例为1/4
C.由图乙可知,只有2组转染成功
D.若fat-1基因单点插入,则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成ω-PUFAs
答案　A　
7.(不定项)丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗,某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图,进而构建出融合基因表达载体,其中LTB是一种免疫增强剂基因,R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是(　　)
A.PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶
B.若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因,可选择引物P2和引物P3继续进行PCR
C.融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等
D.若利用转基因植物生产该疫苗,需用到基因工程、植物组织培养和抗原—抗体杂交技术
答案　AD　
9.(不定项)科学家将某病毒抗原蛋白的部分编码序列(RBD)拼接成融合基因2RBD和3RBD,探究RBD的二聚体蛋白和三聚体蛋白能否模拟RBD的天然构象并获得高效免疫原性。为鉴定重组质粒是否构建成功,将重组质粒用NcoⅠ和SacⅠ双酶切处理后电泳,结果如图,其中泳道1为双酶切pNZ8149-2RBD,两个条带大小分别为2 507 bp和2 020 bp。将构建好的重组质粒分别导入工程菌中进行表达产物的检测。下列说法正确的是(　　)
A.PCR扩增融合基因时,在引物的3'端添加相应限制酶的识别序列
B.据图可知,融合基因3RBD的长度为2 686 bp
C.泳道2呈现一个条带的原因是酶切pNZ8149-3RBD后产生的两个片段大小相近
D.从工程菌细胞表面提取蛋白质进行检测,从而进一步比较两者的免疫原性
答案　BCD　
10.科学家利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素有两种方法:“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段,利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素;“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因,利用工程菌获得胰岛素。两种方法使用同一种质粒作为载体。
(1)“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列,原因是　　　　　　　　
　　　　　　　　。上述两种方法获取的目的基因中,不含人胰岛素基因启动子的方法是　　　　　　　　　。
(2)对人工合成的胰岛素基因进行测序,发现其两端附近无限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点。已知胰岛素基因表达时以①链为模板,如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
为保证人胰岛素基因能正确连接到用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理的图1所示质粒上,且利用表达载体上的启动子在受体菌中以①链为模板进行转录,则应在配对到②链的引物5'端添加6个碱基,序列为5'-　　　　　　　　-3'。PCR扩增过程中,最早经过　　轮循环后,便可获得两端均携带限制酶识别序列的所需双链目的基因。
(3)若使用一种限制酶切割目的基因和载体后,会存在目的基因的正向或反向两种连接产物,　　　　(填“可以”或“不可以”)通过电泳来区分两种产物,在凝胶中DNA分子的迁移速率与　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点)等有关。
答案　(1)绝大多数氨基酸都有几个密码子(或密码子具有简并性/一种氨基酸可能对应多种密码子)　AB和BCA　(2)GGATCC　3(或三)　(3)不可以　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
11.L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体),而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量,在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中,以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列,图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点,其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。
图2
(1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。要将L-天冬酰胺酶基因导入pET22b质粒中,需使用的两种限制酶是　　　　　　。
(2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列,则获取目的基因时设计B端的引物序列是　　　　　　　　　(只写出16个碱基即可)。
(3)科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上,以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。
①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒,导入重组质粒的菌落呈现　　　色,这些菌落　　　　　(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
②若使用(1)中的限制酶处理,则菌落呈　　色的为符合要求的宿主菌,理由是　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的,如果选择大肠杆菌作为受体菌,只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链,不能得到有活性的L-天冬酰胺酶,原因是　　　　　　　　　　　　　 　　 　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　KpnⅠ、EcoRⅠ　(2)3'-TAAGTTGTCTCTTAAG-5'　(3)①白　不一定能　只使用EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同,构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成的,目的基因无法正常表达　②白　重组质粒由于LacZ基因被切断,无法合成半乳糖苷酶以分解X-gal,因此菌落呈白色　(4)大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器,不能对多肽链进行加工
12.研究人员拟培育转fat1基因和fat2基因的转双基因猪,为避免fat1蛋白和fat2蛋白相互融合影响功能,利用重叠延伸PCR技术在fat1基因和fat2基因之间插入具有自剪切功能的2A连接肽基因,构建fat1-2A-fat2融合基因。2A基因的转录产物可通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸(G)和脯氨酸(P)之间的肽键,将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段,F1~F4、R1~R4表示引物。
(1)利用PCR技术可实现在体外快速大量扩增DNA,其与细胞内DNA复制的共同点是　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点)。若图乙中融合基因的b链为模板链,则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物　　　　的绝大部分序列相同。
(2)PCR1和PCR2需要分开单独进行,原因是　　　　　　　　 　　　　　。PCR3不需要引物,高温加热后fat1-2A和2A-fat2的双链解开,其中能正常延伸形成融合基因的是　　　(填序号)形成的杂交链。
(3)图乙构建的重组质粒中未标注出的必需元件还有　　　　　　　　。为确定fat1基因连接到重组质粒中且插入2A序列的上游,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图乙中的引物　　　　。所融合基因经图丙中的过程表达产生fat1和fat2两种蛋白,经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白较正常fat1蛋白的相对分子质量大,据该融合基因的结构和表达原理推测,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)都需要模板、引物、DNA聚合酶,原料都是脱氧核苷酸　R4　(2)引物甲和引物丁部分碱基互补配对,影响子链的合成　①、④　(3)复制原点、标记基因　F1、R3　fat1基因后面连接了2A序列,使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分片段
题组二
1.酒精是生物实验室中常见的试剂,许多生物学实验都需要用到。下列有关叙述正确的是(　　)
A.在色素的提取和分离实验中,利用不同色素在无水乙醇中溶解度不同而实现色素分离
B.在低温诱导植物细胞染色体数目变化的实验中,两次用到酒精的目的是一致的
C.检测和观察细胞中的脂肪颗粒需要用到体积分数50%的酒精洗去浮色
D.在DNA粗提取与鉴定实验中,利用体积分数为95%的酒精提取DNA
答案　C　
2.当苹果削好皮或切开后放置一会儿,切口面的颜色就会由浅变深,最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物,即发生变色反应变成黄色,随着反应的量的增加颜色就逐渐加深,最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程,下列叙述不正确的是(　　)
A.要想获得抗褐变的转基因苹果,目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B.实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C.步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D.为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果,可与导入含pBI121质粒的植株作对照
答案　B　
3.(不定项)像BclⅠ(-T↓GATCA-)、BglⅡ(-A↓GATCT-)、MboⅠ(-↓GATC-)这样,识别序列不同,但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割,并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(　　)
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和 BglⅡ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和 BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化,切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和 BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开,但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化,切割后的目的基因也可以自我环化
答案　B　
4.HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内,参与构成鸡蛋清的蛋白质。如图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下,下列叙述正确的是(　　)
A.①为逆转录过程,该过程需要逆转录酶、4种游离的核糖核苷酸等组分
B.目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列,拼接前载体用MfeⅠ和HindⅢ切割
C.利用PCR扩增目的基因时,反应缓冲溶液中一般要加入Mg2+的目的是维持渗透压稳定
D.利用鸡输卵管生物反应器生产HA蛋白可以大规模用于禽流感疫苗的制备
答案　D　
5.CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分,其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列,当病毒入侵后,某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR,Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方,该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用,CRISPR-Cas系统的组成如图所示,现在CRISPR-Cas9(由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成)已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是(　　)
A.CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用
B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化
C.内切核酸酶Cas9具有专一性
D.CRISPR基因经过转录翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割
答案　D　
6.(不定项)自然界中很少出现蓝色的花,天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图,PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶),通过农杆菌转化法导入白玫瑰中,在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法不正确的是(　　)
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中需转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表达时分别以T-DNA的不同链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰细胞质基因组中防止基因扩散
答案　ABD　
7.同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
(1)酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为　　　　(从P1~P6中选),选择的理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作　　　　　以筛选目的菌。另外,URA3编码的蛋白还可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用　　　　　的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以下图　　　　　　　　(填“方式1”或“方式2”)排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在　　　　　　的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
答案　(1)P1和P6　为保证目的(外源)基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同　(2)标记基因　①不含尿嘧啶　②方式2　含有5-氟乳清酸和尿嘧啶
8.某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可与蛋白P结合,使其被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建基因表达载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或PΔ的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或PΔ的功能。
图甲
(1)α链的3'端在　　　　(填写“左侧”或“右侧”),A、B、C、D四个短核苷酸链,可作为PCR复制过程中的引物对的是　　　　。
(2)PCR扩增得到的P基因(PCR时已在引物两端添加限制酶识别序列)经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图乙所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列,ATG对应其正常转录mRNA中的AUG(起始密码子)。
图乙
①PCR扩增P基因时需将限制酶的识别序列添加在引物的　　　　(填“3'端”“5'端”或“3'端或5'端”)。
②将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,P基因对应的氨基酸序列与蛋白P不同,据图分析,解决这一问题可采取的方法是 　。
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-PΔ、药物A和蛋白UBC按照图丙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质,用蛋白UBC抗体检测,检测结果如图丁所示。已知FLAG-P和FLAG-PΔ不能降解UBC。
图丙
图丁
通过　　　　组的结果,可以分析缺失序列Δ的作用,该序列缺失造成的影响是　　　　　　　　　　　　　　　　　;由实验结果可知,药物A的作用机理是　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)右侧　B和C　(2)①5'端　②可在EcoRⅠ识别序列前或后增加1(或4等)个碱基　(3)②④(或③⑤或②④和③⑤)　蛋白P与UBC之间将无法结合　药物A促进了UBC与蛋白P的结合,从而促进蛋白P的降解
9.乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量;酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的起始密码子编码序列,ATG为真核生物偏好的起始密码子编码序列。下列说法正确的是(　　)
A.引物2的3'端序列应包含XbaⅠ的识别序列
B.重组质粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
C.进行PCR时,缓冲液中一般要添加Ca2+来激活相关酶
D.引物1的5'端序列应考虑将GTG改为ATG
答案　D　
10.研究发现,若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA),则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示,箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽,过程如图2所示,其中Ⅰ为转录模板链,引物上的“”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合为(　　)
图1
图2
　　　　　　　　　　　　　　　
A.引物1和引物4　　　　B.引物2和引物6
C.引物2和引物4　　　　D.引物3和引物5
答案　B　
11.γ-氨基丁酸是人体大脑皮层主要的抑制性递质。γ-氨基丁酸的摄入可以维持大脑稳定的神经传递,此外γ-氨基丁酸还具有降低血压、减轻焦虑和抑制糖尿病等功能,因此被用作食品添加剂或膳食补充剂。利用微生物法制备γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点,具有广阔的应用前景。
(1)γ-氨基丁酸由突触前膜释放,与后膜上受体结合后使后膜对离子的通透性发生改变,此时突触后膜膜两侧的电位为　　　　。
(2)γ-氨基丁酸是以L-谷氨酸作为前体物质,在谷氨酸脱羧酶催化下合成的。研究人员尝试通过加强谷氨酸脱羧酶的过量表达来实现γ-氨基丁酸的高效生产。具体操作过程如下:
Ⅰ.获取谷氨酸脱羧酶基因并进行PCR扩增。PCR扩增时需要　　　　　酶,每次循环一般可以分为　　　　　　　　三步。
Ⅱ.重组质粒的构建和鉴定。将谷氨酸脱羧酶基因和质粒分别用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ进行双酶切,混合后使用DNA连接酶连接,得到构建的重组质粒,如图1。然后通过酶切法对构建的重组质粒进行鉴定,结果如图2所示。
图2中泳道1、2分别是用限制性内切核酸酶KpnⅠ酶切质粒、重组质粒的结果。若已知目的基因片段已整合到质粒上,请在下图泳道3中绘制出用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ双酶处理重组质粒所得的电泳结果。
注:M1、M2表示标准参照
Ⅲ.重组质粒的转化、鉴定与表达。将鉴定后的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有　　　　　　　的抗性平板上,培养得到阳性转化菌落。将转化后的大肠杆菌细胞接种至培养液中,在适宜条件培养。培养液中需要加入碳源、氮源等营养成分,氮源的主要作用是　　　　 (答出1点即可)。
IV.菌株产γ-氨基丁酸能力的比较。一段时间后检测发酵液中γ-氨基丁酸的含量。若要证明加强谷氨酸脱羧酶的过量表达能实现γ-氨基丁酸的高效生产,则实验结果应该是　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)外正内负　(2)Ⅰ.耐高温的DNA聚合酶　变性、复性和延伸　
Ⅱ.
Ⅲ.氨苄青霉素　合成微生物细胞中的含氮物质(如核酸、蛋白质、磷脂等)的原料　Ⅳ.重组菌发酵液中的GABA含量远高于原始菌的发酵液
12.猪大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB和ST1是猪源大肠杆菌肠毒素基因。研究人员通过重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因,其表达产物LTB-ST1融合蛋白可有效预防仔猪黄痢,该融合基因构建过程如图所示。请回答下列问题:
(1)重组PCR技术依据的生物学原理是　　　　　　　　　　　。
(2)PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的,两个反应体系中加入的物质中不同的是　　　　　。PCR1和PCR2的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　,从而有利于LTB基因和ST1基因融合。
(3)在②过程中,PCR1和PCR2产物的作用是作为　　　　　　。
(4)引物的作用是 　。
(5)定点突变是指使基因特定位点发生碱基对的增添、缺失或者替换。重组PCR技术不仅可用于构建融合基因,还可用于基因定点突变。请结合下图,说明利用重组PCR技术进行基因内部定点突变的方法: 　。
答案　(1)DNA半保留复制　(2)模板、引物　扩增出末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1基因　(3)模板、引物　(4)使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　(5)根据突变位点的碱基序列设计引物b和引物c,进行重组PCR
13.新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为　　　　　启动子。Nos为终止子,其作用为　　　　　　　　　。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶　　　　和　　　　对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
图1
(2)利用　　　　　　方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测　　　　　　,通过　　　　　技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为　　　　　。选择纯合体进行后续研究的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的　　　　　细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的　　　　　免疫和　　　　　免疫。
图2
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)
答案　(1)水稻胚乳细胞　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ　(2)农杆菌转化　r2HN mRNA　抗原—抗体杂交　(3)1/4　纯合体自交后代不发生性状分离　(4)CD8+T　体液　细胞　(5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
8.天然T4溶菌酶由164个氨基酸构成,大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造T4溶菌酶基因,并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的T4溶菌酶。回答下列问题:
(1)科学家希望利用蛋白质工程技术,对T4溶菌酶进行改造,基本思路是从　　　　　　　　出发→设计预期的T4溶菌酶结构→　　　　　　　　　→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的T4溶菌酶。
(2)研究发现T4溶菌酶的第3位异亮氨酸(密码子为AUU、AUC、AUA)变为半胱氨酸(密码子为UGU、UGC),该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用PCR定点突变技术对T4溶菌酶基因的编码序列进行改造(如图1),要选择的图中的引物组合最好是　　　　。
(3)科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU),耐热性提升幅度更大。可运用大引物PCR进行定点突变,相关原理如图2所示。进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是　　　　　　　　　　　　　　　,至少需要　　　　次循环,才能获得相应的大引物。用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR,要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达载体的改良基因,引物应选用大引物两条链中的　　　　(填“①”或“②”)。
(4)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与图3中的质粒A正确连接,设计引物时需要在两种引物的　　　　(填“3'”或“5'”)端连接上限制酶　　　　　　　识别和切割的序列。
图3
答案　(1)预期的蛋白质功能　推测应有的氨基酸序列　(2)②③　(3)含有定点突变的碱基并能与DNA模板碱基互补配对　2　②　(4)5'　SamⅠ和BamHⅠ
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