2026全国版高考生物一轮基础知识练--第24章 基因工程（含答案）

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2026全国版高考生物一轮
第24章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
2.★★(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
3.★★★新思维·酶切失败的原因和解决方法分析(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
4.★★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
5.★★★[2022福建,21(一)]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是　　　　(填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
三年模拟
6.★★(2025届广东广州阶段考,3)研究人员将外源鲫鱼Mx基因(该基因产物能抵抗黏病毒)与质粒相连接构建基因表达载体,利用显微注射的方法将其导入草鱼体内,获得转基因抗病草鱼。下列叙述正确的是(　　)
A.获得抗黏病毒草鱼方法的原理是基因重组
B.重组载体的受体细胞一般是已分化的体细胞
C.转录Mx基因需要解旋酶和DNA连接酶
D.构建重组载体的质粒一般是天然质粒
7.★★(2025届四川成都石室中学月考,13)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”的相关描述,错误的是(　　)
A.洋葱中加入适量研磨液,充分研磨、过滤并弃去滤液可以获得DNA
B.向溶有DNA的NaCl溶液中加入适量二苯胺,沸水浴后溶液呈蓝色
C.提取DNA时加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
D.可以选择香蕉、猪肝、菠菜等作为实验材料提取DNA
8.★★★(2024届福建厦门三模,15)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5'-CCC↓GGG-3'。如图表示某DNA片段的部分碱基序列,已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　　)
A.若用SmaⅠ完全切割该DNA,则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
B.若虚线方框内的碱基对被T—A替换,则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段
C.若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA,可形成相同的黏性末端
D.用SmaⅠ切割DNA产生的片段,优选E.coli DNA连接酶重新将其连接
9.★★★★(2024届山东德州三模,15)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒,得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是(　　)
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
第2节　PCR与电泳
考法　PCR引物的特点与选择　5、9、10
五年高考
1.★★(2024河北,13,2分)下列相关实验操作正确的是(　　)
A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板
D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落
2.★★新教材·琼脂糖凝胶电泳的操作等(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
4.★★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
5.★★★★新思维·DNA探针的制作(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④
6.★★★(2023河北,22,15分)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体,转入硅藻细胞,以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题:
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　　　　差异获得硅藻粗提DNA,PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　　　　和　　　　等。本研究中目的基因为　　　　　　　。
(3)PCR扩增时引物通过　　　　　　原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物,对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测,扩增产物电泳结果见图2。其中,样品1为本实验的　　　组,样品2有特异性扩增产物,结果表明　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析,相对于品系A,品系B的胞内脂质含量平均水平明显　　。同时,还需测定　　　　以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析,ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高,　　　　　　　　　　　　　　,最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)
7.★★★★(2024贵州,21,12分)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 + + +
野生型 - - -
突变体 + - -
转基因菌株 + + +
回答下列问题:
(1)据表可推测　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　。检测NV酶活性时,需测定的指标是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与　　　　(选填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　(选填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
三年模拟
8.★★(2025届江苏镇江期初考,15)下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)
A.将洋葱研磨液离心后保留沉淀物并加入冷酒精静置后,可收集到DNA
B.将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后,溶液即可变为蓝色
C.在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
9.★★★★(2025届安徽浙江发展共同体联考,14)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
B.设计的引物中GC碱基含量越高,变性的温度越高
C.PCR产物是包含未知序列的链状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
10.★★★(2025届重庆西南大学附中、育才中学联考,20)瘦素是一种由脂肪组织分泌的肽类激素,参与脂肪代谢的调节。科研人员在P载体上插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因,并进一步构建瘦素基因真核表达载体,检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况,为肥胖患者的治疗提供新思路。瘦素基因及P载体的结构如图所示,在P载体上瘦素基因与GFP基因共用启动子和终止子,GFP基因能在真核细胞中表达,且能根据荧光的强弱来判断瘦素基因在细胞内的表达强度。HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ表示3种限制酶且切割DNA产生的黏性末端不同。据此回答下列问题:
(1)运用PCR技术扩增瘦素基因时,需要的原料是　　　　　　　　　　　　　　　。若瘦素基因两端没有合适的限制酶酶切位点,为使瘦素基因能正确插入P载体中,应在图中引物1和2的　　　(填“3'”或“5'”)端分别添加　　　　　　　　　(从“HindⅢ”“BamHⅠ”“XhoⅠ”中选)的识别序列。
(2)启动子可以被　　　　　　酶识别和结合,从而启动转录。结合题图分析,瘦素基因真核表达载体进行表达时,先合成　　　(填“瘦素“或“GFP”)。
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因,在真核细胞中的表达具有新霉素抗性,而在原核细胞中的表达则具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答一点即可)。
(4)为检测瘦素基因是否在受体细胞中成功表达出瘦素,除了根据荧光的强度来进行判断,还可用的鉴定方法是　　　　　　　　(从分子水平作答)。
11.★★★★(2025届湖南师大附中阶段练习,21)γ-氨基丁酸是人体大脑皮层主要的抑制性神经递质。γ-氨基丁酸的摄入可以维持大脑稳定的神经传递,此外γ-氨基丁酸还具有降低血压、减轻焦虑和抑制糖尿病等功能,因此被用作食品添加剂或膳食补充剂。利用微生物法制备γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点,具有广阔的应用前景。
(1)γ-氨基丁酸由突触前膜释放,与后膜上受体结合后使后膜对离子的通透性发生改变,此时突触后膜膜两侧的电位为　　　　　。
(2)γ-氨基丁酸是以L-谷氨酸作为前体物质,在谷氨酸脱羧酶催化下合成γ-氨基丁酸。研究人员尝试通过使谷氨酸脱羧酶的过量表达来实现γ-氨基丁酸的高效生产。具体操作过程如下:
Ⅰ.获取谷氨酸脱羧酶基因并进行PCR扩增。PCR扩增时需要　　　　　　　　　　　　酶,每次循环一般可以分为　　　　　　　　　　三步。
Ⅱ.重组质粒的构建和鉴定。将谷氨酸脱羧酶基因和质粒分别用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ进行双酶切,混合后使用DNA连接酶连接,得到构建的重组质粒,如图1。然后通过酶切法对构建的重组质粒进行鉴定,结果如图2所示。
图2中泳道1、2分别是用限制性内切核酸酶KpnⅠ酶切质粒、重组质粒的结果。若已知目的基因片段已整合到质粒上,请在图2泳道3中绘制出用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ双酶处理重组质粒所得的电泳结果。
注:M1、M2表示标准参照
Ⅲ.重组质粒的转化、鉴定与表达。将鉴定后的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有　　　　　　的抗性平板上,培养得到阳性转化菌落。将转化后的大肠杆菌细胞接种至培养液中,在适宜条件培养。培养液中需要加入碳源、氮源等营养成分,氮源的主要作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
Ⅳ.菌株产γ-氨基丁酸能力的比较。一段时间后检测发酵液中γ-氨基丁酸的含量。若要证明谷氨酸脱羧酶的过量表达能实现γ-氨基丁酸的高效生产,则实验结果应该是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
第3节　基因工程和蛋白质工程
考法1　限制酶的选择　3、6、8、9 考法2　转基因“受体细胞”的筛选　2、5、8
五年高考
1.★★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　)
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
2.★★★(2024全国甲,38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是　　　　。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是　　　　　。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是　　　　　　　　　　。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
氨基酸 密码子 氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG 亮氨酸 CUG
精氨酸 AGA 甘氨酸 GGC
丝氨酸 AGC GGG
脯氨酸 CCA 终止 UGA
CCC
3.★★★★(2024湖南,21,13分)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用　　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用　　　　　　　　　(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用　　　　　的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用　　　　　　　酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中　　　　的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
4.★★★★(2024新课标,35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是　　　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　　　　　。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　　　　　　　　　　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。
5.新情境·基因工程中转化效率与翻译效率的提高★★★★(2024黑、吉、辽,25,12分)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
注:F1~F3,R1~R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是　　　　。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　　　　　　　　　　　　　。
(2)本操作中获取目的基因的方法是　　　和　　　　。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　和　　　　。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是　　　(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1~1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
三年模拟
6.★★★(2025届陕西学业考,21)透明质酸(HA)是一种糖胺聚糖,主要存在于皮肤、眼睛和关节等组织,有保湿、润滑作用,被广泛应用于医药、化妆品领域。HA可通过动物组织提取和微生物发酵获得,利用生物工程技术对微生物改造是提高HA产率的一条重要途径。回答下列问题:
(1)透明质酸合成酶HAS3基因长度为1 662 bp,用PCR技术扩增该基因并插入图(a)所示的质粒,目的基因插入质粒不宜同时选用的限制酶是　　　　　　　　,因为　　　　　　　　　　　　　　。
(2)三个不同实验小组的PCR产物电泳检测结果如图(b),泳道　　　　的电泳条带不含目的基因HAS3序列扩增产物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)科研人员在前期研究的基础上,通过在谷氨酸棒状杆菌中导入不同来源的HA合成酶基因,构建了三株不同工程菌(分别记为A、B、C),基于HA产量初步筛选后并进行了放大发酵,结果如下。
①不同菌株合成HA产量及菌体数量如图(c)所示,其中菌株　　　　合成HA效果最好。
②选出菌株后进行放大发酵如图(d)。菌体数量变化规律为　　　　　　　　,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。以HA产量为目标,结束发酵的最佳时间为　　　　。
7.★★★(2025届江西红色十校联考,20)人乳铁蛋白是母乳中的重要抗菌蛋白。科研人员利用基因工程技术构建含人乳铁蛋白基因的重组质粒,如图为质粒和人乳铁蛋白基因示意图,Tetr表示四环素抗性基因,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,BamHⅠ、BclⅠ、NotⅠ、Sau3AⅠ表示不同的限制酶,对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点(不考虑其他未知的酶切位点)。请回答下列问题:
(1)为了获取更多人乳铁蛋白基因,可利用PCR技术对其进行扩增。为保证扩增效率等,至少需加入　　　　种引物,合成引物时需要已知　　　　　　　　　　　　。
(2)构建重组质粒时,技术人员仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶以及　　　　　　酶即实现了人乳铁蛋白基因与质粒的重新连接,说明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为构建含人乳铁蛋白基因的重组质粒,可以用　　　　处理大肠杆菌,使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,并在含　　　　　　(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基中培养大肠杆菌,判断重组质粒是否导入成功。
(4)人乳铁蛋白是一种分泌蛋白,通过转基因大肠杆菌不能生产有活性的人乳铁蛋白,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
8.★★★(2025届云南昆明一中月考,24)如图为利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色;否则菌落为白色。
回答下列问题:
(1)不能选用限制酶　　　　　　　　　　切割目的基因和质粒。
(2)为使目的基因与载体正确连接,在设计PCR引物时可在引物1上添加限制酶　　　　的识别序列,在引物2上添加限制酶　　　　的识别序列。已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'-CCTTTCAGCTCA-3',则引物1设计的序列是5'-　　　　　　　　　　-3'。
(3)构建好的基因表达载体导入大肠杆菌后,将大肠杆菌放在添加了氨苄青霉素、X-gal等成分的固体培养基上培养,直到形成菌落。添加氨苄青霉素可筛选出　　　　　　　　　　　　的大肠杆菌,培养基上　　　　(填“白”或“蓝”)色菌落的大肠杆菌即为目的菌,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
9.★★★★(2025届湖北宜昌等四地联考,22)番茄不耐寒,冬季容易冻坏,难以储藏。我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtCOR15a,经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种,操作流程如图1。回答下列问题:
(1)用PCR技术扩增AtCOR15a基因时需要添加引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)如果要将AtCOR15a基因与质粒构建重组DNA分子,一般采用双酶切法,据图1分析选用的两种限制酶组合是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)图1中是采用　　　　　　　法将目的基因转移到番茄细胞中,并将其整合到该细胞的　　　　　　上的。
(4)为了提高AtCOR15a基因的表达能力,可将AtCOR15a基因与外源强启动子连接,如图2所示。
利用PCR检测上述连接是否正确,可选择的引物组合是　　　　(填字母),该PCR反应体系中需加入　　　　　　酶。
A.①+②　B.①+③　C.②+③　D.③+④
(5)为了进一步提高番茄的储藏时间,可从该植物体内提取ErsI基因(乙烯受体基因),按照如图3所示流程将ErsI基因重新导回该植物,使转录产物与植物体内原有ErsI基因的mRNA互补配对,致使该植物原有ErsI基因翻译受抑制。已知限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ、BamHⅠ切割后露出的黏性末端碱基序列不同,据图3分析,提取的目的基因A、B两端需分别添加　　　　　　的识别序列。推测该方法提高番茄储藏时间的机理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
第24章　基因工程
第1节　重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024山东,13,2分)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是(　　)
A.整个提取过程中可以不使用离心机
B.研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
C.鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D.仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案　A　
2.★★(2023广东,11,2分)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案　D　
3.★★★新思维·酶切失败的原因和解决方法分析(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案　B　
4.★★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
答案　B　
5.★★★[2022福建,21(一)]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是　　　　(填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案　(1)5'→3'　(2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
三年模拟
6.★★(2025届广东广州阶段考,3)研究人员将外源鲫鱼Mx基因(该基因产物能抵抗黏病毒)与质粒相连接构建基因表达载体,利用显微注射的方法将其导入草鱼体内,获得转基因抗病草鱼。下列叙述正确的是(　　)
A.获得抗黏病毒草鱼方法的原理是基因重组
B.重组载体的受体细胞一般是已分化的体细胞
C.转录Mx基因需要解旋酶和DNA连接酶
D.构建重组载体的质粒一般是天然质粒
答案　A　
7.★★(2025届四川成都石室中学月考,13)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”的相关描述,错误的是(　　)
A.洋葱中加入适量研磨液,充分研磨、过滤并弃去滤液可以获得DNA
B.向溶有DNA的NaCl溶液中加入适量二苯胺,沸水浴后溶液呈蓝色
C.提取DNA时加入酒精,使溶于酒精的蛋白质等物质溶解
D.可以选择香蕉、猪肝、菠菜等作为实验材料提取DNA
答案　A　
8.★★★(2024届福建厦门三模,15)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5'-G↓GATCC-3'、5'↓GATC-3'、5'-CCC↓GGG-3'。如图表示某DNA片段的部分碱基序列,已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　　)
A.若用SmaⅠ完全切割该DNA,则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
B.若虚线方框内的碱基对被T—A替换,则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段
C.若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA,可形成相同的黏性末端
D.用SmaⅠ切割DNA产生的片段,优选E.coli DNA连接酶重新将其连接
答案　C　
9.★★★★(2024届山东德州三模,15)研究人员用酶M和酶N两种限制酶同时处理某DNA分子和质粒,得到的DNA片段如图所示。图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类,其他碱基的种类未注明。下列叙述错误的是(　　)
A.该DNA分子和质粒上均含有酶M的一个切割位点和酶N的一个切割位点
B.根据图示信息不能确定图中形成的不同黏性末端与这两种限制酶的对应关系
C.用T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶均可以将片段乙和片段丁连接起来
D.片段乙、片段丁、片段戊可依次连接形成一个环状DNA分子
答案　D　
第2节　PCR与电泳
考法　PCR引物的特点与选择　5、9、10
五年高考
1.★★(2024河北,13,2分)下列相关实验操作正确的是(　　)
A.配制PCR反应体系时,加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B.利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后,在紫外灯下观察结果
C.将配制的酵母培养基煮沸并冷却后,在酒精灯火焰旁倒平板
D.将接种环烧红,迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养,获得单菌落
答案　B　
2.★★新教材·琼脂糖凝胶电泳的操作等(2024黑、吉、辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是(　　)
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案　A　
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是(　　)
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案　C　
4.★★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案　B　
5.★★★★新思维·DNA探针的制作(2024山东,5,2分)制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有(　　)
A.①②　　B.②③　　C.①④　　D.③④
答案　D　
6.★★★(2023河北,22,15分)单细胞硅藻具有生产生物柴油的潜在价值。研究者将硅藻脂质合成相关的苹果酸酶(ME)基因构建到超表达载体,转入硅藻细胞,以期获得高产生物柴油的硅藻品系。
回答下列问题:
(1)根据DNA和蛋白质在特定浓度乙醇溶液中的　　　　差异获得硅藻粗提DNA,PCR扩增得到目的基因。
(2)超表达载体的基本组件包括复制原点、目的基因、标记基因、　　　　和　　　　等。本研究中目的基因为　　　　　　　。
(3)PCR扩增时引物通过　　　　　　原则与模板特异性结合。根据表达载体序列设计了图1所示的两条引物,对非转基因硅藻品系A和转ME基因硅藻候选品系B进行PCR检测,扩增产物电泳结果见图2。其中,样品1为本实验的　　　组,样品2有特异性扩增产物,结果表明　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)利用单细胞硅藻生产生物柴油的影响因素包括胞内脂质含量和繁殖速率等。图3为硅藻胞内脂质含量检测结果。据图分析,相对于品系A,品系B的胞内脂质含量平均水平明显　　。同时,还需测定　　　　以比较在相同发酵条件下品系A与B的繁殖速率。
(5)胞内脂质合成需要大量ATP。ME催化苹果酸氧化脱羧反应产生NADH。研究表明,品系B线粒体中ME含量显著高于品系A。据此分析,ME基因超表达使线粒体中NADH水平升高,　　　　　　　　　　　　　　,最终促进胞内脂质合成。
(6)相对于大豆和油菜等油料作物,利用海生硅藻进行生物柴油生产的优势之处为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(答出两点即可)
答案　(1)溶解度　(2)启动子　终止子(答案“启动子”和“终止子”不分顺序)　苹果酸酶基因(或“ME基因”)　(3)碱基互补配对　对照　引物间的载体序列整合到硅藻细胞基因组中(或“ME基因序列整合到硅藻细胞基因组中”)　(4)增加　细胞数量　(5)有氧呼吸生成的ATP增多　(6)节约土地资源、不受季节和气候限制(或“节约粮食资源”或“节约淡水”或“能够通过发酵大量生产”)
7.★★★★(2024贵州,21,12分)研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基,培养真菌A的野生型(含NV基因)、突变体(NV基因突变)和转基因菌株(转入NV基因),检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量,结果如表所示(表中“+”表示有,“-”表示无)。
检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖(培养液中)
野生型 + + +
野生型 - - -
突变体 + - -
转基因菌株 + + +
回答下列问题:
(1)据表可推测　　　　诱导了NV基因表达。NV酶的作用是　　　　　　　　　。检测NV酶活性时,需测定的指标是　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
(2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板,用与　　　　(选填“T-DNA”或“NV基因”)配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度　　　(选填“>”“=”或“<”)野生型扩增片段长度,则表明突变体构建成功,从基因序列分析其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为进一步验证NV基因的功能,表中的转基因菌株是将NV基因导入　　　　细胞获得的。在构建NV基因表达载体时,需要添加新的标记基因,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)蔗糖　催化蔗糖转化成葡萄糖　单位时间单位体积的培养液中葡萄糖的增加量(或者蔗糖的减少量)　(2)NV基因　>　与野生型相比,突变体是由T-DNA插入NV基因中,使NV基因发生了碱基对的增添而引起的,因此突变体相应基因的序列更长　(3)突变体　突变体的T-DNA上会存在相应的标记基因,干扰NV基因表达载体导入成功与否的检测
三年模拟
8.★★(2025届江苏镇江期初考,15)下列有关“DNA粗提取与鉴定”“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述,正确的是(　　)
A.将洋葱研磨液离心后保留沉淀物并加入冷酒精静置后,可收集到DNA
B.将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后,溶液即可变为蓝色
C.在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化前需将适量的核酸染料加入并进行混匀
D.待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时需停止电泳并取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
答案　D　
9.★★★★(2025届安徽浙江发展共同体联考,14)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
B.设计的引物中GC碱基含量越高,变性的温度越高
C.PCR产物是包含未知序列的链状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
答案　C　
10.★★★(2025届重庆西南大学附中、育才中学联考,20)瘦素是一种由脂肪组织分泌的肽类激素,参与脂肪代谢的调节。科研人员在P载体上插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因,并进一步构建瘦素基因真核表达载体,检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况,为肥胖患者的治疗提供新思路。瘦素基因及P载体的结构如图所示,在P载体上瘦素基因与GFP基因共用启动子和终止子,GFP基因能在真核细胞中表达,且能根据荧光的强弱来判断瘦素基因在细胞内的表达强度。HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ表示3种限制酶且切割DNA产生的黏性末端不同。据此回答下列问题:
(1)运用PCR技术扩增瘦素基因时,需要的原料是　　　　　　　　　　　　　　　。若瘦素基因两端没有合适的限制酶酶切位点,为使瘦素基因能正确插入P载体中,应在图中引物1和2的　　　(填“3'”或“5'”)端分别添加　　　　　　　　　(从“HindⅢ”“BamHⅠ”“XhoⅠ”中选)的识别序列。
(2)启动子可以被　　　　　　酶识别和结合,从而启动转录。结合题图分析,瘦素基因真核表达载体进行表达时,先合成　　　(填“瘦素“或“GFP”)。
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因,在真核细胞中的表达具有新霉素抗性,而在原核细胞中的表达则具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答一点即可)。
(4)为检测瘦素基因是否在受体细胞中成功表达出瘦素,除了根据荧光的强度来进行判断,还可用的鉴定方法是　　　　　　　　(从分子水平作答)。
答案　(1)4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)/4种脱氧核苷酸　5'　HindⅢ、BamHⅠ　(2)RNA聚合　瘦素　(3)转录后的加工不同或翻译后的加工不同　(4)抗原—抗体杂交
11.★★★★(2025届湖南师大附中阶段练习,21)γ-氨基丁酸是人体大脑皮层主要的抑制性神经递质。γ-氨基丁酸的摄入可以维持大脑稳定的神经传递,此外γ-氨基丁酸还具有降低血压、减轻焦虑和抑制糖尿病等功能,因此被用作食品添加剂或膳食补充剂。利用微生物法制备γ-氨基丁酸具有安全和高效的优点,具有广阔的应用前景。
(1)γ-氨基丁酸由突触前膜释放,与后膜上受体结合后使后膜对离子的通透性发生改变,此时突触后膜膜两侧的电位为　　　　　。
(2)γ-氨基丁酸是以L-谷氨酸作为前体物质,在谷氨酸脱羧酶催化下合成γ-氨基丁酸。研究人员尝试通过使谷氨酸脱羧酶的过量表达来实现γ-氨基丁酸的高效生产。具体操作过程如下:
Ⅰ.获取谷氨酸脱羧酶基因并进行PCR扩增。PCR扩增时需要　　　　　　　　　　　　酶,每次循环一般可以分为　　　　　　　　　　三步。
Ⅱ.重组质粒的构建和鉴定。将谷氨酸脱羧酶基因和质粒分别用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ进行双酶切,混合后使用DNA连接酶连接,得到构建的重组质粒,如图1。然后通过酶切法对构建的重组质粒进行鉴定,结果如图2所示。
图2中泳道1、2分别是用限制性内切核酸酶KpnⅠ酶切质粒、重组质粒的结果。若已知目的基因片段已整合到质粒上,请在图2泳道3中绘制出用限制性内切核酸酶NcoⅠ和KpnⅠ双酶处理重组质粒所得的电泳结果。
注:M1、M2表示标准参照
Ⅲ.重组质粒的转化、鉴定与表达。将鉴定后的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中。将转化后的细胞涂布于含有　　　　　　的抗性平板上,培养得到阳性转化菌落。将转化后的大肠杆菌细胞接种至培养液中,在适宜条件培养。培养液中需要加入碳源、氮源等营养成分,氮源的主要作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
Ⅳ.菌株产γ-氨基丁酸能力的比较。一段时间后检测发酵液中γ-氨基丁酸的含量。若要证明谷氨酸脱羧酶的过量表达能实现γ-氨基丁酸的高效生产,则实验结果应该是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)外正内负　(2)Ⅰ.耐高温的DNA聚合　变性、复性和延伸
Ⅱ.
Ⅲ.氨苄青霉素　合成微生物细胞中的含氮物质(如核酸、蛋白质、磷脂等)的原料　培养重组菌发酵液中的γ-氨基丁酸含量远高于原始菌的发酵液
第3节　基因工程和蛋白质工程
考法1　限制酶的选择　3、6、8、9 考法2　转基因“受体细胞”的筛选　2、5、8
五年高考
1.★★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　)
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案　B　
2.★★★(2024全国甲,38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是　　　　。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可);使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是　　　　　。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是　　　　　　　　　　。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
氨基酸 密码子 氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG 亮氨酸 CUG
精氨酸 AGA 甘氨酸 GGC
丝氨酸 AGC GGG
脯氨酸 CCA 终止 UGA
CCC
答案　(1)变性　(2)避免载体自连,保证目的基因连接方向正确　T4 DNA连接酶　(3)易于吸收外源DNA分子　提取质粒,用特异性引物进行PCR,电泳出现目的条带　(4)甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸
3.★★★★(2024湖南,21,13分)百合具有观赏、食用和药用等多种价值,科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题:
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前,先用　　　　　　　　去除细胞壁获得原生质体,使原生质体融合,得到杂种细胞后,继续培养,常用　　　　　　　　　(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化,获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用　　　　　的方法来获得单倍体植株,鉴定百合单倍体植株的方法是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L,首先选用　　　　　　　酶切,将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接,再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图c。由此可知:三种病原微生物都能诱导pL的活性增强,其中　　　　的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,简要写出实验思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)纤维素酶和果胶酶　生长素和细胞分裂素　(2)花药离体培养　利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目　(3)①HindⅢ和BamHⅠ　交链格孢　②利用转基因技术将百合B中L的启动子替换为野生百合中L的启动子pL
4.★★★★(2024新课标,35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是　　　　　　。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和　　　　　　　　。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是　　　　　　　　　　　　　　;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。
答案　(1)磷酸二酯键　片段甲含有启动子和终止子　(2)U—A、A—T　(3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物　(4)实现废物利用,减少环境污染
5.新情境·基因工程中转化效率与翻译效率的提高★★★★(2024黑、吉、辽,25,12分)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
注:F1~F3,R1~R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是　　　　。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是　　　　　　　　　　　　　。
(2)本操作中获取目的基因的方法是　　　和　　　　。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用　　　　　　基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是　　　　和　　　　。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是　　　(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1~1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1~1 362合成基因序列和1 363~1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
答案　(1)使蛋白质水解　使蛋白质等溶解在酒精中,DNA不溶于酒精而析出　(2)PCR　人工合成　(3)RNA聚合酶识别并结合的部位　使目的基因在植物细胞中高效表达(保证目的基因的高水平表达)　(4)潮霉素B抗性　(5)F3　R2　(6)D
三年模拟
6.★★★(2025届陕西学业考,21)透明质酸(HA)是一种糖胺聚糖,主要存在于皮肤、眼睛和关节等组织,有保湿、润滑作用,被广泛应用于医药、化妆品领域。HA可通过动物组织提取和微生物发酵获得,利用生物工程技术对微生物改造是提高HA产率的一条重要途径。回答下列问题:
(1)透明质酸合成酶HAS3基因长度为1 662 bp,用PCR技术扩增该基因并插入图(a)所示的质粒,目的基因插入质粒不宜同时选用的限制酶是　　　　　　　　,因为　　　　　　　　　　　　　　。
(2)三个不同实验小组的PCR产物电泳检测结果如图(b),泳道　　　　的电泳条带不含目的基因HAS3序列扩增产物,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)科研人员在前期研究的基础上,通过在谷氨酸棒状杆菌中导入不同来源的HA合成酶基因,构建了三株不同工程菌(分别记为A、B、C),基于HA产量初步筛选后并进行了放大发酵,结果如下。
①不同菌株合成HA产量及菌体数量如图(c)所示,其中菌株　　　　合成HA效果最好。
②选出菌株后进行放大发酵如图(d)。菌体数量变化规律为　　　　　　　　,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。以HA产量为目标,结束发酵的最佳时间为　　　　。
答案　(1)SpeⅠ和XbaⅠ　酶切后产生的黏性末端相同　(2)3　产物条带位于1 000 bp附近,而目的基因长度为1 662 bp　(3)①C　②先升高再降低　前期营养物质充裕,后期营养物质不足、空间受限、代谢产物积累　40 h
7.★★★(2025届江西红色十校联考,20)人乳铁蛋白是母乳中的重要抗菌蛋白。科研人员利用基因工程技术构建含人乳铁蛋白基因的重组质粒,如图为质粒和人乳铁蛋白基因示意图,Tetr表示四环素抗性基因,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,BamHⅠ、BclⅠ、NotⅠ、Sau3AⅠ表示不同的限制酶,对应箭头指向位置为相应限制酶的切割位点(不考虑其他未知的酶切位点)。请回答下列问题:
(1)为了获取更多人乳铁蛋白基因,可利用PCR技术对其进行扩增。为保证扩增效率等,至少需加入　　　　种引物,合成引物时需要已知　　　　　　　　　　　　。
(2)构建重组质粒时,技术人员仅使用了Sau3AⅠ一种限制酶以及　　　　　　酶即实现了人乳铁蛋白基因与质粒的重新连接,说明　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)为构建含人乳铁蛋白基因的重组质粒,可以用　　　　处理大肠杆菌,使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,并在含　　　　　　(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基中培养大肠杆菌,判断重组质粒是否导入成功。
(4)人乳铁蛋白是一种分泌蛋白,通过转基因大肠杆菌不能生产有活性的人乳铁蛋白,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)2/二/两　(人乳铁蛋白)基因的相应碱基序列　(2)DNA连接　Sau3AⅠ可以识别BamHⅠ、BclⅠ的切割位点并切割产生相同的黏性末端　(3)Ca2+　氨苄青霉素　(4)大肠杆菌为原核生物,没有内质网和高尔基体,缺乏加工人乳铁蛋白的能力
8.★★★(2025届云南昆明一中月考,24)如图为利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
注:LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈现蓝色;否则菌落为白色。
回答下列问题:
(1)不能选用限制酶　　　　　　　　　　切割目的基因和质粒。
(2)为使目的基因与载体正确连接,在设计PCR引物时可在引物1上添加限制酶　　　　的识别序列,在引物2上添加限制酶　　　　的识别序列。已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为5'-CCTTTCAGCTCA-3',则引物1设计的序列是5'-　　　　　　　　　　-3'。
(3)构建好的基因表达载体导入大肠杆菌后,将大肠杆菌放在添加了氨苄青霉素、X-gal等成分的固体培养基上培养,直到形成菌落。添加氨苄青霉素可筛选出　　　　　　　　　　　　的大肠杆菌,培养基上　　　　(填“白”或“蓝”)色菌落的大肠杆菌即为目的菌,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)SalⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ　(2)XhoⅠ　MunⅠ　CTCGAGCCTTTCAGCTCA　(3)含(空)质粒和含重组质粒　白　目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构,使其不能正常表达并形成β-半乳糖苷酶,底物X-gal也就不会被分解
9.★★★★(2025届湖北宜昌等四地联考,22)番茄不耐寒,冬季容易冻坏,难以储藏。我国科研人员从某植物中提取了一种抗冻基因AtCOR15a,经过一系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种,操作流程如图1。回答下列问题:
(1)用PCR技术扩增AtCOR15a基因时需要添加引物,引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)如果要将AtCOR15a基因与质粒构建重组DNA分子,一般采用双酶切法,据图1分析选用的两种限制酶组合是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)图1中是采用　　　　　　　法将目的基因转移到番茄细胞中,并将其整合到该细胞的　　　　　　上的。
(4)为了提高AtCOR15a基因的表达能力,可将AtCOR15a基因与外源强启动子连接,如图2所示。
利用PCR检测上述连接是否正确,可选择的引物组合是　　　　(填字母),该PCR反应体系中需加入　　　　　　酶。
A.①+②　B.①+③　C.②+③　D.③+④
(5)为了进一步提高番茄的储藏时间,可从该植物体内提取ErsI基因(乙烯受体基因),按照如图3所示流程将ErsI基因重新导回该植物,使转录产物与植物体内原有ErsI基因的mRNA互补配对,致使该植物原有ErsI基因翻译受抑制。已知限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ、BamHⅠ切割后露出的黏性末端碱基序列不同,据图3分析,提取的目的基因A、B两端需分别添加　　　　　　的识别序列。推测该方法提高番茄储藏时间的机理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
答案　(1)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸　(2)HindⅢ和BamHⅠ　(3)农杆菌转化　染色体DNA　(4)B　Taq DNA聚合(耐高温的DNA聚合)　(5)XhoⅠ和EcoRⅠ　抑制乙烯受体基因的表达(翻译),从而无法正常识别乙烯信号,进而延缓成熟
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