易错点15 生物技术与生物工程易错总结
目 录
01 易错陷阱（4大陷阱）
02 举一反三
【易错点提醒一】消毒和灭菌不相同
【易错点提醒二】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交目地不同
【易错点提醒三】克隆动物绝大部分基因来自供体动物
【易错点提醒四】目的基因导入的受体细胞不同
03 易错题通关
易错陷阱1：消毒和灭菌的比较
【陷阱分析】消毒和灭菌的区别与联系
(1)作用原理都是借助理化因素，通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物。
(2)两者最根本的区别是芽孢和孢子是否灭活，灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
【链接知识】1．消毒
概念 常用方法 应用范围
使用较为温和的物理、化学或生物方法杀死物体表面或内部一部分微生物，不包括芽孢和孢子 煮沸消毒法(100℃煮沸5～6min) 日常用品
巴氏消毒法(62～65℃消毒30mim 或80～90℃处理30s～1min) 不耐高温的液体(牛奶、果汁等)
化学药物消毒法 用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法(紫外线照射30min) 接种室、接种箱或超净工作台
2．灭菌
概念 常用方法 应用范围
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法(用酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧)。 涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，试管口或瓶口等
干热灭菌(干热灭菌箱，160~170℃，2~3h) 耐高温、需保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿等)和金属用具等
湿热灭菌中的高压蒸汽灭菌法(高压蒸汽灭菌锅，100kPa，121℃，15~30min) 培养基、部分塑料制品(枪头、试管等)
易错陷阱2：植物体细胞杂交与动物体细胞杂交的异同
【陷阱分析】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交的异同
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
概念 将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性
融合前处理方法 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
诱导方法 物理法：电融合法、离心法等；化学法：聚乙二醇(PEG)融合法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
【链接知识】1．归纳比较植物组织培养与动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
理论基础 植物细胞全能性 细胞增殖
培 养 基 类型 固体或半固体培养基 液体培养基
成分 水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、动物血清等
取材 植物幼嫩部位或花药等 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
关键环节 细胞的脱分化和再分化 细胞增殖和癌变
结果 新的组织或植株个体，可以体现全能性 新的细胞系或细胞株，不形成个体，不体现全能性
应用 ①植株快速繁殖 ②脱毒植株的培育 ③制备人工种子 ④生产药物、杀虫剂等 ⑤转基因植物的培育 ①蛋白质生物制品的生产 ②皮肤移植材料的培育 ③检测有毒物质 ④生理、病理、药理学研究
相同点 ①两技术手段培养过程中细胞都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂 ②均为无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
易错陷阱3：误认为克隆动物的基因全部来自于提供细胞核的供体动物
【陷阱分析】核移植中供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状(由线粒体DNA控制的性状)与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
【链接知识】1．核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本可能不同的原因：
(1)克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本，与植物组织培养不同(来自一个亲本)，即克隆动物遗传物质来自两个亲本。
(2)在发育过程中可能发生基因突变、染色体变异导致性状改变。
(3)外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。
2．细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
3．克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
易错陷阱4：不能确定目的基因导入的受体细胞是体细胞和受精卵
【陷阱分析】将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。大肠杆菌经常用作原核细胞的受体细胞，酵母菌经常用作真核细胞的受体细胞。
【链接知识】1．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同。
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射技术 Ca2+处理法(CaCl2)
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞
转化过程 农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞感受态细胞→将重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子
【易错点提醒一】消毒和灭菌不相同
[例1]获取纯净微生物的关键在于无菌技术，主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌技术的叙述正确的是( )
A．牛奶一般通过100℃煮沸5~6min来消毒
B．紫外线照射30min可以杀死物体表面的微生物
C．吸管和培养皿通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D．接种环、试管口、棉塞通过灼烧灭菌法进行灭菌
规避陷阱：消毒和灭菌最根本的区别是芽孢和孢子是否灭活，灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
【答案】B
【解析】A、牛奶不耐高温，牛奶的消毒应采用巴氏消毒法，即在62-65℃条件下消毒30分钟或在80-90℃条件下处理30s～1分钟，A错误；
B、接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可用紫外线照射30min进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，B正确；
C、吸管和培养皿通常采用干热灭菌法进行，C错误；
D、接种环、试管口等实验中频繁使用的常使用灼烧灭菌法，棉塞不能使用灼烧灭菌法，D错误。
故选B。
[变式1-1]无菌技术涉及消毒和灭菌。下列相关叙述正确的是( )
A．煮沸消毒法可以杀死微生物的营养细胞和全部的芽孢
B．可以对培养皿、培养基和接种环进行干热灭菌
C．常用的灭菌方法主要包括干热灭菌、湿热灭菌、灼烧灭菌等
D．在超净工作台进行微生物接种时，可以不在酒精灯火焰旁进行
【答案】C
【解析】A、煮沸消毒法可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，不能杀死全部芽孢和孢子，A错误；
B、培养基含有水分，需要用湿热灭菌法进行灭菌，B错误；
C、灭菌能杀死物体内外所用的微生物(包括芽孢和孢子)，常用的灭菌方法主要包括干热灭菌、湿热灭菌、灼烧灭菌等，C正确；
D、为避免周围环境中微生物的污染，接种操作可在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行，D错误。
故选C。
[变式1-2]无菌技术是微生物培养获得成功的关键，下列有关说法正确的是( )
①微生物培养时，关键是避免杂菌的入侵，对无菌操作的要求非常严格；②培养基应先调pH值再进行灭菌处理；③对实验空间及操作者的双手进行表面消毒时要考虑药剂的消毒效果及实验者的安全；④不同器械、不同用具区别对待，采用不同灭菌方法⑤对目的菌及培养基可用高压蒸汽灭菌；⑥如果不小心导致污染，将可能造成培养工作前功尽弃
A．①②③④⑥ B．①②③④ C．①②③④⑤ D．①②③④⑤⑥
【答案】A
【解析】①获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，实验中对无菌操作的要求非常严格，①正确；
②制备培养基时，顺序是计算→称量→溶解→调pH→灭菌→倒平板，所以是先调节pH再灭菌，②正确；
③因为不同材料对药剂耐受力不同，故对实验空间及操作者的双手进行表面消毒时要考虑药剂的消毒效果及实验者的安全，如对操作者的双手采用酒精进行消毒 ，衣着以及操作空间等，采用紫外线进行消毒，③正确；
④不同器械、不同用具区别对待，采用不同灭菌方法，如实验过程中频繁使用的接种工具可灼烧灭菌，而培养皿常采用干热灭菌，④正确；
⑤对目的菌不能用高压蒸汽灭菌，否则菌体将全部死亡，⑤错误；
⑥如果不小心引起污染，将可能造成培养工作前功尽弃，导致整个技术的失败，⑥正确。
综上分析，A正确，BCD错误。
故选A。
【易错点提醒二】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交目地不同
[例2]如图为植物体细胞杂交技术的流程图，其中①~⑤表示不同过程，下列关于植物休细胞杂交和动物细胞融合技术的叙述，正确的是( )
A．两种技术都打破了生殖隔离，都利用了细胞膜流动性
B．两种技术分别体现了植物细胞、动物细胞的全能性
C．图中②过程可用灭活的病毒诱导，而动物细胞膜合技术常用PEG 诱导
D．动物细胞融合技术无需进行①③过程是其与植物体细胞杂交技术的唯一区别
规避陷阱：植物体细胞杂交需获得完整植株，动物细胞融合技术得到的是杂交细胞。
【答案】A
【解析】A、两种技术突破了有性杂交方法的局限，克服远缘杂交不亲和的障碍，使远缘杂交成为可能，A正确；
B、动物细胞融合技术是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，未体现动物细胞的全能性，B错误；
C、灭活的病毒常用于诱导动物细胞融合，图中②是植物细胞原生质体融合，不能用灭活的病毒诱导，C错误；
D、还有区别是：植物体细胞杂交需获得完整植株，动物细胞融合技术得到的是杂交细胞，D错误。
故选A。
[变式2-1]科研人员用抗病、抗寒的二倍体阿宽蕉和三倍体无籽龙牙蕉进行体细胞杂交，培育出抗病、抗寒的无籽新品种，拓宽了香蕉种植区域。相关叙述正确的是( )
A．体细胞杂交技术无法获得含双亲优良细胞质基因的个体
B．②过程可用灭活病毒诱导法、PEG融合法等方法实施诱导
C．③过程成功的原因是杂种细胞含个体发育的整套遗传信息
D．抗病、抗寒无籽新品种自交，可获得抗病、抗寒无籽后代
【答案】C
【解析】A、体细胞杂交技术是促进双亲细胞融合，也融合了双亲优良细胞质基因，A错误；
B、诱导原生质体融合的方法不能用灭活病毒诱导法，B错误；
C、③过程是杂种细胞发育成一个新个体，体现了植物细胞的全能性，全能性的表现说明了该植物细胞含有个体发育的整套遗传信息，C正确；
D、抗病、抗寒无籽新品种是抗病、抗寒的二倍体阿宽蕉和三倍体无籽龙牙蕉进行体细胞杂交获得，属于异源五倍体，细胞内联会紊乱，是不育的，D错误。
故选C。
[变式2-2]下列关于动物细胞工程和植物细胞工程的叙述，正确的是( )
A．植物组织培养和动物细胞培养均使用固体培养基
B．促进动物细胞融合的方法均可用于诱导植物细胞融合
C．植物体细胞杂交和动物细胞融合均可打破生殖隔离，培育新品种
D．愈伤组织和iPS 细胞的诱导形成均发生了基因的选择性表达
【答案】D
【解析】A、 植物组织培养使用固体培养基，而动物细胞培养使用液体培养基，A错误；
B、 促进动物细胞融合的方法有物理法(如电刺激)、化学法(如聚乙二醇)、生物法(如灭活的病毒)，其中灭活的病毒诱导法是动物细胞融合特有的方法，不能用于植物细胞融合，B错误；
C、 植物体细胞杂交可打破生殖隔离，培育新品种；动物细胞融合可制备单克隆抗体等，但动物细胞融合不能培育新品种，C错误；
D、 愈伤组织是植物细胞脱分化形成的，iPS细胞(诱导多能干细胞)是诱导分化形成的，它们的诱导形成均发生了基因的选择性表达，D正确。
故选D。
【易错点提醒三】克隆动物绝大部分基因来自供体动物
[例3]细胞核移植技术的研究和发展对优良物种的产生和培育具有重要的意义。下列有关核移植的叙述，错误的是( )
A．动物细胞核移植技术能够成功的基础是动物细胞核具有全能性
B．操作中受体细胞一般选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞
C．操作时去核是为了保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞
D．重构胚在形成后，应立即转移至代孕个体体内进行下一步的发育
规避陷阱：克隆动物核基因全部来自供体细胞，质基因来自提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
【答案】D
【解析】A、将动物细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞中获得重组细胞，重组细胞可以发育成完整个体，该项技术成功的基础是动物细胞核具有全能性，A正确；
B、选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞，不仅仅因为其体积大便于操作，还因为卵母细胞的细胞质中存在激发细胞核全能性表达的物质，B正确；
C、去核是为了保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞，常用去核方法有显微操作、紫外线短时照射等，C正确；
D、重构胚在形成后，还需进行激活操作并完成一定的细胞分裂或发育，D错误。
故选D。
[变式3-1]2024年2月25日，世界首例体细胞克隆顶级种用藏羊“青青”在青海省诞生。研究人员采集种羊耳缘组织培养成耳纤维细胞作为核供体细胞，通过体细胞核移植获得种羊克隆胚胎。下列叙述正确的是( )
A．在核移植前应去除MⅡ期卵母细胞的纺锤体——染色体复合物
B．在培养耳纤维细胞时可使用胃蛋白酶处理种羊耳缘组织
C．克隆动物与试管动物的生殖方式均为无性生殖
D．重组细胞会依次经历囊胚、桑葚胚、原肠胚等发育阶段
【答案】A
【解析】A、在移植时使用的是去核卵母细胞，因此在核移植前应去除MⅡ期卵母细胞的纺锤体——染色体复合物，A正确；
B、使用无菌的胰蛋白酶消化耳缘组织间的胶原纤维，可使羊耳缘组织分散成单个细胞，B错误；
C、克隆动物未经过精卵细胞的结合是无性生殖，而试管动物的生殖方式经过精卵细胞的结合是有性生殖，C错误；
D、重组细胞会依次经历桑椹胚、囊胚、原肠胚等发育阶段，D错误。
故选A。
[变式3-2]生物技术的安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是( )
A．生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等
B．治疗性克隆是为了获得治疗所用的克隆个体，且需要严格的监管
C．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”的主要区别在于前者需要在植入前对胚胎进行遗传学诊断
D．转基因植物进入自然生态系统后可能因具有较强的“选择优势”而影响生物多样性
【答案】B
【解析】A、生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等，它可以直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布，经由呼吸道、消化道和皮肤等侵入人、畜体内，造成大规模伤亡，A正确；
B、治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的，需要在严格的监管下进行，B错误；
C、“设计试管婴儿”与“试管婴儿”的主要区别在于前者在植入前需要对胚胎进行遗传学诊断，C正确；
D、转基因植物进入自然生态系统后可能因其具有较强的“选择优势”而占有较多的环境资源，使得其他物种的生存受到影响，从而严重影响生物多样性，D正确。
故选B。
【易错点提醒四】目的基因导入的受体细胞不同
[例4]下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是( )
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
【答案】A
【解析】A、由于农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上，故将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，A正确；
B、原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性，B错误；
C、将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术，C错误；
D、植物病毒只侵染植物细胞，不侵染大肠杆菌，D错误。
故选A。
1．下图表示胚胎工程在动物优良品种培育中的应用，下列说法正确的是( )
A．②过程中，胚胎移植能充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，移植前应对供体母牛进行超数排卵处理
B．③过程中，应将目的基因导入去核的受精卵以定向改变生物性状
C．①②③过程使用了无性繁殖技术
D．对早期胚胎进行DNA分析和性别鉴定时，应选择桑葚胚的滋养层细胞
【答案】A
【解析】A、试管动物培育过程中，胚胎移植能充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，移植前应对供体母牛进行超数排卵处理，A正确；
B、转基因动物培育过程中，如果受体细胞是受精卵，应将目的基因导入到受精卵，不需要去核，B错误；
C、②过程使用了有性繁殖技术，C错误；
D、欲对早期胚胎进行DNA分析和性别鉴定，应取样囊胚的滋养层细胞，D错误。
故选A。
2．多环芳烃(PAHs)是一种不溶于水的有机物，在培养基中以微小的颗粒状存在，PAHs在土壤中的降解速率很慢，并具有致癌和致畸作用。科研人员欲从被PAHs污染的土壤中分离出高效降解PAHs的菌株，进行如图所示的实验(培养基乙中PAHs被降解后会形成透明圈)。回答下列问题：
(1)从培养功能角度分析，培养基甲属于 ；培养基通常需要提前在121℃下进行 。
(2)将培养基甲中的目的菌接种到培养基乙中的方法是 ，该方法不仅适用于筛选某种菌株，还可用于 。
(3)筛选PAHs降解菌实验时，过程③所需要的实验工具有 (答出两种)。过程④挑选的单菌落应该是透明圈直径与菌落直径比值 (填“最小”或“最大”)的。
(4)在5个平板上各接种稀释倍数为103的菌液样品0.1 mL，培养一段时间后，平板上的菌落数分别为48、50、54、56、52，则每升原菌液样品中细菌数为 个。如果用显微镜直接计数法对细菌进行计数，所统计的细菌数通常会比上述方法统计数目偏 (填“大”或“小”)，原因是 。
【答案】(1) 选择培养基 高压蒸汽灭菌
(2) 稀释涂布平板法 微生物的计数
(3) 微量移液器、涂布器 最大
(4) 5.2×108 大 统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和
【解析】(1)该实验的目的是从被PAHs污染的土壤中分离出高效降解PAHs的菌株，所以从培养功能角度分析，培养基甲属于选择培养基；培养基通常需要提前在121℃下进行高压蒸汽灭菌。
(2)从培养基乙呈现的效果图可知：将培养基甲中的目的菌接种到培养基乙中的方法是稀释涂布平板法，该方法还可用于微生物的计数。
(3)筛选PAHs降解菌实验时，过程③采用稀释涂布平板法对目的菌进行接种，需要用微量移液器取0.1mL菌液，滴加到培养基表面，然后用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。培养基乙中PAHs被降解后会形成透明圈，透明圈直径与菌落直径比值越大，降解PAHs的效果越好，因此过程④挑选的单菌落应该是透明圈直径与菌落直径比值最大的。
(4)在5个平板上各接种稀释倍数为103的菌液样品0.1 mL，培养一段时间后，平板上的菌落数分别为48、50、54、56、52，则每升原菌液样品中细菌数为(48＋50＋54＋56＋52)÷5×103÷0.1 ×103＝5.2×108个。由于两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以稀释涂布平板法统计的细菌数通常会比实际数目偏小。如果用显微镜直接计数法对细菌进行计数，由于统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，所以统计的细菌数通常会比上述方法统计数目偏大。
3．牛和羊的瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。某研究小组欲从瘤胃内筛选出能高效降解尿素的细菌，设计了如下实验。请分析并回答下列问题：
实验步骤：
Ⅰ、取样：从刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先灭过菌的锥形瓶中。
Ⅱ、培养基的配制和灭菌：
配制全营养LB固体培养基。配方：水、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂糖(一种凝固剂)。配制尿素固体培养基。配方：水、葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、琼脂糖。
Ⅲ、制备瘤胃稀释液并接种，如下图1所示。
Ⅳ、在无氧条件下进行微生物的培养、观察与计数。
(1)全营养LB固体培养基和尿素固体培养基都含有微生物生长所需的基本营养物质，除水外还有 。(至少答两点)
(2)该小组采用 法对瘤胃中分解尿素的细菌进行分离和计数。在无菌条件下，利用该方法进行分离计数时，需要用到图2中的实验器材有 。
(3)为检测该培养基灭菌是否彻底，应采用的检测方法是 。为了判断尿素培养基是否具有选择作用，实验时还需要同时接种全营养平板，如果同一浓度梯度下，尿素培养基上的菌落数 (“大于”、“等于”或“小于”)全营养培养基上的菌落数，则说明尿素培养基具有选择作用。
(4)为了避免混淆，本实验中使用的平板需要在培养皿的 (“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在 (“18~25℃”或“25~30℃”或“30~37℃”)的恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果，其目的是 。
(5)若将最后一个试管中的稀释液分别涂布到3个尿素平板上培养，培养后平板上出现的菌落数如图1所示，则5mL瘤胃样品中含有目标活菌数约为 。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数 ，原因是 。
【答案】(1)碳源、氮源、无机盐
(2) (稀释)涂布平板 ①③④
(3) 将未接种的培养基放在恒温培养箱中培养，检验是否有菌落产生 小于
(4) 皿底 30~37℃ 为了防止培养时间不足导致菌落遗漏
(5) 3.5×1010个 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
【解析】(1)虽然各种培养基的配方不同，但是一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等微生物生长所需的基本营养物质。
(2)据图可知，接种后平板上培养出了菌落，且菌落可用于计数，故接种方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法操作时需要在酒精灯火焰旁边操作，故需要用到①酒精灯(③培养皿)④涂布器。
(3)将未接种的培养基(或空白培养基)放在恒温培养箱中保温1-2天，检验是否有菌落产生，用于检测该培养基灭菌是否彻底。若有菌落产生，说明灭菌不彻底，需要重新配置培养基。选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长，故同一浓度梯度下，尿素培养基上的菌落数小于全营养培养基上的菌落数，则说明尿素培养基具有选择作用。
(4)本实验使用的平板较多，为了避免混淆，最好使用前在培养皿上做好标记，由于培养基倒置培养，所以皿底上标记号组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。为了防止培养时间不足导致菌落遗漏，在恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果。一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。由于分离的菌是从牛的瘤胃中取样的，故培养箱的温度设定在30—37℃为宜。
(5)5号试管的稀释倍数为107，5mL瘤胃样品中含有目标活菌数=(68+75+67)÷3÷0.1×107×5=3.5×1010(个)。当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故使用稀释涂布平板法统计获得的菌落数比实际的活菌数偏少。
4．兴趣小组成员欲通过以下流程酿制苹果酒：选料→打浆→接种→发酵→过滤→贮存。回答下列问题
(1)选料：在苹果充分成熟、含糖量最高时进行采收，剔除残次果、腐烂果，保留高品质果实，其中剔除腐烂果的原因是 。
(2)打浆：将高品质苹果去皮后切块，再利用匀浆机打浆后，向匀浆中加入一定量的果胶酶，目的 ，以提高出汁率，增加匀浆的分散性，利于菌种对营养物质的利用，加快发酵进程。
(3)接种：将一定量的苹果匀浆转入经消毒的发酵瓶，然后转入一定量的酵母菌菌液和适量的焦亚硫酸钾，加入焦亚硫酸钾的目的是抑制 从而确保发酵时优势菌种。装瓶时能否将果汁装满，为什么？ 。
(4)发酵：将发酵瓶置于温度适宜的环境中，较长时间后，因酵母菌 产生的二氧化碳，导致发酵液表面形成大量泡沫。若迟迟不出现这样的现象，可向发酵液中加入一定量经 的酵母菌。当发酵液不再产生气泡时，表明发酵已结束。影响发酵时长的主要因素除了酵母菌接种数量和环境温度以外，还有 (答2点即可)等因素。
过滤、贮存：发酵液过滤后装瓶，密闭封存。
(5)为减少苹果酒酿制过程中产生的废弃物对环境造成的污染，可对步骤(2)中产生的苹果皮回收利用。苹果皮中富含果胶，可利用微生物法分离果胶，其原理是利用微生物分解果皮中的纤维素从而使果胶游离出来。
①为分离此类优良菌株可选用划线分离进行 ，该方法需要配制以 为唯一碳源的培养基。
②对初步筛选获得的菌株进行人工诱变等处理，获得 缺陷型菌株。若诱变育种无法获得相应的缺陷型菌株，则可通过 技术获得。
③这种对生产过程产生的废弃物的再利用，从生态工程角度分析，主要优点是 。
【答案】(1)防止腐烂果中的有害微生物污染发酵液影响苹果酒品质
(2)分解果胶
(3) 其他杂菌生长 不能，因为发酵产生二氧化碳，装满会使瓶内压力过大
(4) 无氧呼吸 活化 苹果匀浆中的含糖量、初始酸碱度
(5) 分离纯化 纤维素 纤维素 基因工程 减少废弃物排放，提高资源利用率
【解析】(1)腐烂果可能含有大量有害微生物(如细菌、霉菌等)，这些微生物在发酵过程中会与酿酒所需的酵母菌竞争营养物质，并且可能会产生对人体有害的物质，或者影响苹果酒的风味和品质，所以要剔除腐烂果。
(2)果胶酶可以分解果胶，果胶是植物细胞壁和胞间层的主要组成成分之一。分解果胶后能破坏植物细胞的细胞壁和胞间层，使得细胞中的汁液更容易流出，从而提高出汁率，也能增加匀浆的分散性，利于菌种对营养物质的利用，加快发酵进程。
(3)加入焦亚硫酸钾的目的是抑制其他杂菌(如细菌、霉菌等不需要的微生物)的生长，确保发酵时酵母菌为优势菌种。装瓶时不能将果汁装满，因为发酵过程中酵母菌会进行无氧呼吸产生二氧化碳气体，如果装满则会使发酵瓶内压力过大，可能导致发酵瓶破裂甚至发生危险。
(4)发酵时酵母菌进行无氧呼吸会产生酒精和二氧化碳，所以较长时间后，因酵母菌无氧呼吸产生的二氧化碳，导致发酵液表面形成大量泡沫。若迟迟不出现这样的现象，可能是酵母菌数量不足或者活性不够，可向发酵液中加入一定量经活化(使酵母菌从休眠状态恢复活性的过程)的酵母菌。影响发酵时长的主要因素除了酵母菌接种数量和环境温度以外，还有苹果匀浆中的含糖量(含糖量高，可供酵母菌利用的底物多，发酵可能更快完成)、初始酸碱度(不同的酵母菌适宜的酸碱度不同，会影响酵母菌的生长繁殖和发酵速度)等因素。
(5)①利用微生物分解果皮中的纤维素从而使果胶游离出来，为分离此类优良菌株可选用划线分离进行分离纯化，该方法需要配制以纤维素为唯一碳源的培养基，这样只有能够分解纤维素的微生物才能生长繁殖。
②对初步筛选获得的菌株进行人工诱变等处理，获得纤维素缺陷型菌株。若诱变育种无法获得相应的缺陷型菌株，则可通过基因工程技术获得。
③这种对生产过程产生的废弃物的再利用，从生态工程角度分析，主要优点是减少废弃物排放，提高了资源的利用率，减轻了对环境的压力，有利于生态系统的可持续发展。
5．灵芝是一种药用真菌，它的多糖和三萜类化合物是主要的活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生理功能。科研者通过多种育种方式的结合选育出具有优良性状的菌种，再利用液态深层发酵技术生产功能活性物质。
(1)育种
①获得原生质体：活化的原始菌种培养4-5天，对发酵液进行 操作，取菌体加入已灭菌的溶壁酶和较高渗透压的甘露醇溶液进行酶解获得原生质体，利用 (填仪器)对其进行显微镜观察计数。
②人工诱导变异：对原生质体进行化学诱导选育出高产多糖的菌种A和高产三萜类化合物的B，其育种原理是 。相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是 。
③诱导原生质体融合：对菌种A、B的原生质体加入聚乙二醇和 Ca 辅助诱导剂诱导融合，进一步 出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y。Ca 辅助诱导剂作用机理可能是 。
(2)深层液体发酵
基本过程：菌种Y→试管斜面培养→摇瓶种子培养→繁殖罐培养→发酵罐培养→发酵产品处理。
①菌种是发酵工业的关键，用于发酵生产的菌种Y除了高产多糖和三萜类化合物外，还应满足的条件有
A．菌种发酵产物易于分离
B．培养基来源充足且廉价，被转化的效率高
C．菌种遗传特性和生产能力稳定
D．菌种对环境没有明显危害
②摇瓶培养的目的是 。深层发酵技术相较于传统农业栽培具有 等方面的优势。
③优化培养条件是发酵生产高效顺利进行的重要措施。科研者以葡萄糖、蛋白胨、pH值三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，实验结果见表。
试验序号 A．葡萄糖浓度(%) B．蛋白胨(%) C． pH值 灵芝浸膏多糖含量(%) 菌丝干重(g/100mL)
1 1(2%) 1(0.2%) 1(pH5.0) 10.3 14.9
2 1(2%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 11.2 16.5
3 1(2%) 3(0.6%) 3(pH7.0) 10.8 15.2
4 2(3%) 1(0.2%) 3(pH7.0) 8.9 10.6
5 2(3%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 9.2 12.4
6 2(3%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 7.1 9.9
7 3(4%) 1(0.2%) 2(pH6.0) 8.1 10.2
8 3(4%) 2(0.4%) 3(pH7.0) 7.2 8.6
9 3(4%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 6.8 8.4
从表中可得，对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为 。当培养基组成为 为最优条件组合。
【答案】(1) 离心/沉淀 血细胞计数板 基因突变 原生质体无细胞壁对诱导剂更加敏感(防止细胞壁的存在，对诱导剂的作用效果有影响) 筛选 增加细胞膜的通透性/膜的流动性/膜成分的运动性
(2) ABCD 增加菌体和培养液及氧气的接触面积(或扩大培养) 缩短生产周期、提高产量及可控的产品质 葡萄糖浓度(A) AlB2C2
【解析】(1)要获得菌体，对发酵液应进行离心操作，使菌体沉淀下来，从而与发酵液中的其他成分分离；
对原生质体进行显微镜观察计数，常用血细胞计数板；
对原生质体进行化学诱导选育菌种，其育种原理是基因突变，化学诱导剂能使基因结构发生改变，从而产生新的性状；
相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是原生质体无细胞壁，对诱导剂更加敏感，诱导剂更容易进入细胞内部，从而更容易引起基因突变；
对融合后的原生质体要筛选出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y ；
Ca2+辅助诱导剂作用机理可能是增加细胞膜的通透性(或膜的流动性或膜成分的运动性)，促进原生质体的融合；
(2)①A、菌种发酵产物易于分离，这样便于后续的产品提取和纯化，若产物难以分离，会增加生产成本和工艺难度，A合理；
B、培养基来源充足且廉价，被转化的效率高，可降低生产成本，提高生产效益，是菌种应满足的条件之一，B合理；
C、菌种遗传特性和生产能力稳定，才能保证发酵生产的稳定性和可重复性，若菌种特性不稳定，会导致产品质量和产量波动较大，不利于工业化生产，C合理；
D、菌种对环境没有明显危害，这是从环保和安全角度考虑，避免对环境造成不良影响，也是菌种需要满足的条件，D合理。
故选ABCD；
②摇瓶培养的目的是增加菌体和培养液及氧气的接触面积(或扩大培养)，使其达到一定的浓度，为后续的繁殖罐培养和发酵罐培养提供充足的种子；深层发酵技术相较于传统农业栽培具有缩短生产周期、提高产量及可控的产品质等方面的优势；
③分析表格数据，当葡萄糖浓度从1(2%)变为2(3%)再变为3(4%)时，灵芝浸膏多糖含量有明显变化；蛋白胨从1(0.2%)变为2(0.4%)再变为3(0.6%)时，灵芝浸膏多糖含量变化相对较小；pH值从1(pH5.0)变为2(pH6.0)再变为3(pH7.0)时，灵芝浸膏多糖含量变化也不如葡萄糖浓度变化明显。所以对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为葡萄糖浓度(A)；从表格中可以看出，灵芝浸膏多糖含量最高的是试验序号2，其对应的培养基组成是葡萄糖浓度为1(2%)、蛋白胨浓度为2(0.4%)、pH值为2(pH6.0)，所以当培养基组成为葡萄糖浓度为2%、蛋白胨浓度为0.4%、pH值为6.0时为最优条件组合，即AlB2C2为最优条件组合。
6．糖尿病是危害全球人类健康的常见疾病，长期以来主要靠注射外源胰岛素进行治疗，严重影响患者的生活质量。我国科学家首次利用化学重编程多能干细胞(CiPSCs)分化而来的胰岛细胞自体移植到一名1型糖尿病(T1DM)患者体内，具体流程如图1所示。在一年跟踪随访中，该病例成功摆脱胰岛素依赖，各项诊断指标恢复至正常水平。
回答下列问题：
(1)T1DM主要是由于免疫系统攻击并破坏胰岛B细胞导致胰岛素分泌不足，引发高血糖症，因此属于 ，CiPSCs能够被诱导形成胰岛细胞依据的原理是 。
(2)研究人员从患者体内抽取脂肪组织，经 分散成单个细胞制备成细胞悬液，然后进行细胞培养分离出脂肪干细胞。在诱导形成CiPSCs的过程中，需精确控制培养基的各种成分，与普通动物细胞培养基相比，不能添加 等天然成分，以免影响细胞分化进程。
(3)利用CiPSCs制备胰岛细胞后，研究人员将糖尿病模型小鼠分为A、B组，A组进行手术但不移植胰岛细胞，B组体内移植胰岛细胞，然后两组均进行腹腔注射葡萄糖实验，结果如图2所示，该实验的目的是 。经过长时间科学论证后，研究人员将胰岛细胞移植回患者体内，一年内定期进行口服耐糖检测(见图3)，结果表明患者能摆脱胰岛素依赖，依据是 。(糖尿病的诊断阈值为血糖水平等于或高于200mg/dL)。
(4)传统诱导多能干细胞(iPSCs)常利用病毒等载体将4种转录因子的基因导入体细胞，其中的C-myc和Klf4是原癌基因。据此分析，化学分子诱导CiPSCs的优势是 。
【答案】(1) 自身免疫病 基因的选择性表达
(2) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 动物血清/血清
(3) 探究移植胰岛细胞能否降低糖尿病小鼠的血糖水平 移植75天后患者血糖调节恢复正常水平
(4)不会导致细胞异常分裂(避免致癌风险)
【解析】(1)自身免疫病是指自身免疫反应对组织和器官造成损伤并出现了症状，TIMD就是免疫系统攻击了胰岛B细胞，引起其损伤导致胰岛素分泌不足，故属于自身免疫病。CiPSCs能够诱导形成胰岛细胞说明发生了细胞分化，实质是特定基因的表达(基因的选择性表达)。
(2)动物细胞间隙有蛋白质起黏着作用，故需要用蛋白酶将其水解以达到将细胞分散的目的，而胰蛋白酶和胶原蛋白酶的适宜pH与脂肪组织细胞相近，故研究人员从患者体内抽取脂肪组织，经胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制备成细胞悬液，然后进行细胞培养分离出脂肪干细胞。一般普通的动物细胞培养会加入动物血清这样的天然成分来确保各种营养成分全面，同时还考虑到一些我们所不清楚的生长因子的作用，而为了避免生长因子可能起到诱导分化的作用就不添加动物血清。
(3)分析题干可知，自变量是是否移植胰岛细胞，题图图2可知，自变量用血糖浓度变化表示，可知实验目的为探究移植胰岛细胞能否降低糖尿病小鼠的血糖水平；分析图3可知，移植75天后患者血糖调节恢复正常水平，表明了患者能摆脱胰岛素依赖。
(4)传统制备法采用逆转录病毒为载体，将转录因子导入体细胞时，会发生随机整合，会有基因突变的风险，进而癌变；化学分子诱导CiPSCs的优势是不会导致细胞异常分裂(避免致癌风险)。
7．EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。抗原的选择和制备过程为：将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1、EV71外壳蛋白VP2和非EV71蛋白分别注射到4组小鼠体内，多次免疫后，取上述各组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，结果如下图所示。
(1)EV71免疫的小鼠血清抗体 (填“是”或“不是”)单一抗体，据图分析判断依据是 。
(2)制备抗EV71单克隆抗体时，选用 免疫的小鼠的B细胞效果最佳。单克隆抗体的制备流程图如下：
(3)相比较植物细胞，诱导动物细胞融合特有的方法是 。用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选的目的是获得 ．将其接种到96孔板，进行 培养和 ，目的是获得 。
(4)图中体外的扩大培养，是从 中获取大量的单克隆抗体。除此之外还可以使用的方法 ，该单克隆抗体具有的优点是 。
【答案】(1) 不是 用EV71免疫的小鼠血清的抗体与VP1和VP2抗原的结合强度都较高
(2)VP1
(3) 灭活病毒诱导法 杂交瘤细胞 克隆化 抗体检测 既能大量增殖又能产生大量特异性抗体的杂交瘤细胞
(4) 细胞培养液 注入小鼠腹腔培养(体内培养) 特异性强、灵敏度高、可大量制备(能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性识别，并且可大量制备)
【解析】(1)该实验的自变量血清中抗原和抗体的种类，因变量是抗原与抗体结合程度。以抗原为自变量，看第1组血清与其结合情况，第1组血清能结合多种抗原，因此EV71免疫的小鼠血清抗体不是单一抗体，依据是，用 EV71免疫的小鼠血清的抗体与 VP1和 VP2抗原的结合强度都较高。
(2)观察实验结果，第1、2组血清能结合EV71和VP1且强度接近，而第3组血清仅能结合VP2，对EV71没有作用。根据第一小问推测EV71刺激小鼠产生的抗体种类更多，为了减轻单克隆杂交瘤细胞筛选的工作量，选用VP1免疫小鼠效果最佳。
(3)相比较植物细胞，诱导融合动物细胞特有的方法是灭活病毒诱导法。用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选目的是获得杂交瘤细胞，在该种培养基上未融合、同种融合的细胞均不能存活。将其接种到96孔板，进行克隆化培养和抗体检测，目的是为了获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
(4)图中体外的扩大培养，是从细胞培养液中获取大量的单克隆抗体。除此之外还可以使用的方法是注入小鼠腹腔培养(体内培养)。单克隆抗体的优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备，所以该单克隆抗体具有的优点是：能准确识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性识别，并且可大量制备。
8．我国科学家突破了体细胞克隆猴的世界难题，成功培育出世界上首个体细胞克隆猴——“中中”和“华华”。这标志着我国将率先开启以猕猴作为实验动物模型的时代。如图为克隆猴的流程示意图。请回答下列问题：
(1)我国克隆猴利用的是猴胎儿成纤维细胞，该细胞是一种已分化的体细胞，从理论上分析，它具有细胞的全能性，这是因为 。
(2)克隆猴时需要进行“去核”操作，即去掉卵母细胞的细胞核。先在体外培养卵母细胞让其分裂，一般选择 的细胞进行去核操作；然后进行“核移植”，即将体细胞的细胞核移到去核卵母细胞中形成重组细胞；此时采用的技术是 ；得到的重组细胞再进行人工激活使其分裂形成胚胎。
(3)科学家将79枚克隆胚胎移植到21只代孕母猴中，最终只有两只母猴正常怀孕产下“中中”和“华华”，它俩的性别是否一致？ ；原因是 。
(4)克隆动物有很多优点：①可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；② 。
【答案】(1)成纤维细胞的细胞核中含有猴的全部核基因
(2) 减数第二次分裂中期(或MⅡ期) 显微注射技术
(3) 是 “中中”“华华”的细胞核中遗传物质一样，是经过有丝分裂形成的
(4)可以增加濒危物种的存活数量(或可以建立实验动物模型研究人类疾病)
【解析】(1)已分化的猴胎儿成纤维细胞的细胞核具有全能性，原因在于猴胎儿成纤维细胞的细胞核具有猴的全部核基因。
(2)体细胞核移植时常选用MⅡ期的去核卵母细胞做受体细胞，构建重组细胞时采用显微注射技术。
(3)体细胞核移植技术不涉及有性生殖，属于克隆技术，即经过有丝分裂形成的，因此“中中”和“华华”的细胞核中遗传物质一样，二者性状一致。
(4)克隆动物有很多优点，如促进了遗传学的发展，为“制造”能移植于人体的动物器官开辟了前景，克隆技术也可用于检测胎儿的遗传缺陷，克隆技术可用于治疗神经系统的损伤。
9．工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。下图是利用大肠杆菌生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
(1)启动子是 的识别和结合部位。图中胰岛素基因以 链作为模板进行转录。构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止 和 。
(2)为使胰岛素基因能够在大肠杆菌中表达出正确的蛋白质，获取目的基因时通常先 ，然后再通过逆转录得到胰岛素基因。
(3)PCR扩增胰岛素基因，为了使目的基因与载体能正确连接，需要在引物的 端添加限制酶 的识别序列；n次循环后，至少消耗引物 个。
(4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了 ① 的培养基上，若出现 ② (白色/蓝色)菌落，则该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
【答案】(1) RNA聚合酶 A 质粒或目的基因自身环化 目的基因与质粒反向连接
(2)提取胰岛B细胞中的mRNA
(3) 5' EcoRI和XhoI 2(n+1)-2
(4) X-gal、氨苄青霉素 白色
【解析】(1)启动子位于DNA上，是RNA聚合酶的识别和结合部位；分析题图可知，转录的方向为从左到右，且是从RNA的5’→3’，DNA链的-OH端为3’端，故胰岛素基因以A链作为模板进行转录；构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止质粒或目的基因自身环化及目的基因与质粒反向连接。
(2)逆转录是以mRNA为模板，合成DNA的过程，故为使胰岛素基因能够在大肠杆菌中表达出正确的蛋白质，获取目的基因时通常先提取胰岛B细胞中的mRNA，然后再通过逆转录得到胰岛素基因。
(3)PCR扩增胰岛素基因的前提是获得一段已知目的基因的序列，以用于特异性制备PCR扩增需要的引物，目的基因与质粒连接时，需要将目的基因连接到质粒的启动子和终止子之间，它们之间含有XhoI、Mun I、Sal I、Nhe I、EcoR I识别序列，但Sal I、Nhe I在目的基因中也含有识别序列，若用它们切割，会破坏目的基因，若选择Mun I则会破坏质粒上的标记基因，所以为使PCR产物与质粒正确连接，设计引物时可将限制酶EcoR I和Xho I的识别序列添加在对应引物的5'端(子链延伸方向是5'→3')；每合成一条新链会消耗一个引物，n次循环后一共有2(n+1)条链，其中有两条母链不需要消耗引物，故n次循环后，至少消耗引物2(n+1)-2个。
(4)由题意可知，β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色，将胰岛素基因与质粒连接后，重组质粒的lacZ(β-半乳糖苷酶基因)基因被破坏，氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，不能合成β-半乳糖苷酶，不能催化底物(X-gal)水解产生蓝色物质，故呈菌落白色，因此将大肠杆菌接种到添加了氨青霉素和X-gal的培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌种。
10．研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列(注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列)。
(1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%(PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值)，初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。
(2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。
(3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平(如图)。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
①对文中“增强子”的理解，错误的是
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．一个增强子只能作用于一个基本启动子
C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。
(4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。
【答案】(1) 使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。(或答提高模板DNA彻底变性的概率，为PCRDNA反应提供单链模板；或答确保模板完全解链) 10×(1.8)25
(2) EcoR I、BamH 1 5 -GAATTCGATTCG-3 5 -GGATCCGCATGG-3
(3) B 这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质
(4)PCR检测
【解析】(1)PCR过程包括变性、复性、延伸等过程，其中变性的目的是使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。PCR的本质是DNA的复制，原本1个DNA经复制1次后可得到2个DNA，由题意可知，PCR反应的扩增效率为80%，则1ngDNA经1次复制后可得到1.8ngDNA，所以10ngDNA经复25次循环，即25次复制后可得到10×1.825ngDNA。
(2)为了保证目的基因能正常表达，切割载体时，切割位点应选在启动子和终止子之间，结合图示可知，由于EcoR V切割所得的是平末端，不利于表达载体的构建，所以选择EcoR I、BamH I对载体进行切割。由题意可知，抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3'，5'-CCATGC-3'，为将目的基因与载体连接起来，应在目的基因两端加上对应的限制酶切割位点，所以引物的碱基序列从5'端到3'端依次5 -GAATTCGATTCG-3 ，5 -GGATCCGCATGG-3 。
(3)①AC、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知，增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AC正确；
B、由图可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，B错误；
D、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。
故选B。
②为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，若转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，说明该基因表达，否则该基因未表达。
(4)检测目的基因是否导入受体细胞，可通过利用表达载体上抗性基因(标记基因)对应的抗生素进行筛选，也可通过PCR检测，若PCR后可检测到相关条带，则说明导入成功。
11．为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签(能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合)形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。
注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 (填“5′→3′”或“3′→5′”)。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。
(3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。
(4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′
(2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
(3) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子、标记基因、复制原点
(4)IgG类抗体
【解析】(1)依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoI(S基因会被XhoI酶切)，应该有用Smal酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaI酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′→3′，故PCR时新合成链的延伸方向是5′→3′。
(2)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(3)依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。
(4)依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
12．巴斯德毕赤酵母是一种能够以“液态阳光”之一的甲醇作为唯一碳源的微生物，但它转化甲醇的速度慢，而且转化过程中容易积累一定的有毒物质。我国研究团队通过基因工程改造巴斯德毕赤酵母，将甲醇代谢与脂肪醇的合成途径偶联，如图1所示：
(1)通过一定的酶体系在细胞的 中对甲醇进行深度加工，既可以获得工业生产上广泛应用的脂肪醇，实现经济价值；也可以通过“液态阳光”利用CO 促进碳循环，获得生态效益。
(2)在大量培养巴斯德毕赤酵母的过程中，培养液中除添加碳源甲醇外，还需保证其他营养的充足以及 的供应。除基因工程外，还可以通过 获得高效转化的巴斯德毕赤酵母。
(3)巴斯德毕赤酵母已经成为生成多种外源蛋白的卓越表达系统，因为它含有的醇氧化酶1基因AOXI的启动子5'AOXI为强诱导型启动子。利用来源于AOXI的启动子序列5'AOXI和终止子序列3'AOXI(TT)对原质粒改装后形成的pPIC9K质粒如图2所示。
①在 的诱导下，RNA聚合酶识别并结合5'AOXI启动转录过程，直至3'AOXI(TT)处转录终止。
②HBsAg基因是乙肝病毒DNA上的一个基因，请简述利用pPIC9K质粒作载体的基因工程技术生产HBsAg蛋白质的过程： 。
【答案】(1)过氧化物酶体
(2) 氧气/O2 诱变育种和自然筛选
(3) ①甲醇 ②首先用限制酶从乙肝病毒DNA上剪切获取HBsAg基因，再用相同的限制酶切割pPIC9K质粒，通过DNA连接酶连接后形成重组质粒导入巴斯德毕赤酵母中，最后检测HBsAg蛋白质的产生
【解析】(1)通过一定的酶体系在细胞的过氧化物酶体中对甲醇进行深度加工，既可以实现经济价值，也可以获得生态效益。
(2)酵母菌的培养需要氧气条件，所以在大量培养巴斯德毕赤酵母的过程中，培养液中除添加碳源甲醇外，还需保证其他营养的充足以及氧气的供应。为了获得高效转化的巴斯德毕赤酵母，可以通过基因工程、诱变育种、自然筛选等方式获得。
(3)①依据题设可知，启动子5'AOXI为强诱导型启动子且来源于巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶1基因AOXI，因此它需要在甲醇的诱导下，使RNA聚合酶识别并结合5'AOXI后才能启动转录。
②HBsAg基因是乙肝病毒DNA上的一个基因，要利用pPIC9K质粒作载体的基因工程技术生产HBsAg蛋白质，则首先用限制酶从乙肝病毒DNA上剪切获取HBsAg基因，再用相同的限制酶切割pPIC9K质粒，通过DNA连接酶连接后形成重组质粒导入巴斯德毕赤酵母中，最后检测HBsAg蛋白质的产生。
13．大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。
(1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。
(2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。
(3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是
(4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。
【答案】(1) 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 非模板链 GGATCCATGTTC
(2)2
(3) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少
(4)Y蛋白(通过与S基因启动子序列结合)促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性
【解析】(1)在PCR扩增过程中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图甲所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoRI和BamHI的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRI的识别序列，Y基因的右端连接BamHI的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamHI的识别序列，再根据题干信息“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- GGATCCATGTTC -3'。
(2)将初步构建的Y GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y GFP融合蛋白。根据图乙的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y GFP融合蛋白。
(3)根据图丙的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组(加入Y蛋白)的条带相对于对照组(未加入Y蛋白)产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带(对照组)，b条带(实验组)放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。
(4)根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)易错点15 生物技术与生物工程易错总结
目 录
01 易错陷阱（4大陷阱）
02 举一反三
【易错点提醒一】消毒和灭菌不相同
【易错点提醒二】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交目地不同
【易错点提醒三】克隆动物绝大部分基因来自供体动物
【易错点提醒四】目的基因导入的受体细胞不同
03 易错题通关
易错陷阱1：消毒和灭菌的比较
【陷阱分析】消毒和灭菌的区别与联系
(1)作用原理都是借助理化因素，通过使蛋白质变性来抑制微生物的生命活动或杀死微生物。
(2)两者最根本的区别是芽孢和孢子是否灭活，灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
【链接知识】1．消毒
概念 常用方法 应用范围
使用较为温和的物理、化学或生物方法杀死物体表面或内部一部分微生物，不包括芽孢和孢子 煮沸消毒法(100℃煮沸5～6min) 日常用品
巴氏消毒法(62～65℃消毒30mim 或80～90℃处理30s～1min) 不耐高温的液体(牛奶、果汁等)
化学药物消毒法 用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法(紫外线照射30min) 接种室、接种箱或超净工作台
2．灭菌
概念 常用方法 应用范围
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌法(用酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧)。 涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，试管口或瓶口等
干热灭菌(干热灭菌箱，160~170℃，2~3h) 耐高温、需保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿等)和金属用具等
湿热灭菌中的高压蒸汽灭菌法(高压蒸汽灭菌锅，100kPa，121℃，15~30min) 培养基、部分塑料制品(枪头、试管等)
易错陷阱2：植物体细胞杂交与动物体细胞杂交的异同
【陷阱分析】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交的异同
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
概念 将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新植物体的技术 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术
原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性
融合前处理方法 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
诱导方法 物理法：电融合法、离心法等；化学法：聚乙二醇(PEG)融合法 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
意义 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种
【链接知识】1．归纳比较植物组织培养与动物细胞培养
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
理论基础 植物细胞全能性 细胞增殖
培 养 基 类型 固体或半固体培养基 液体培养基
成分 水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、动物血清等
取材 植物幼嫩部位或花药等 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织
关键环节 细胞的脱分化和再分化 细胞增殖和癌变
结果 新的组织或植株个体，可以体现全能性 新的细胞系或细胞株，不形成个体，不体现全能性
应用 ①植株快速繁殖 ②脱毒植株的培育 ③制备人工种子 ④生产药物、杀虫剂等 ⑤转基因植物的培育 ①蛋白质生物制品的生产 ②皮肤移植材料的培育 ③检测有毒物质 ④生理、病理、药理学研究
相同点 ①两技术手段培养过程中细胞都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂 ②均为无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件
易错陷阱3：误认为克隆动物的基因全部来自于提供细胞核的供体动物
【陷阱分析】核移植中供体动物、提供卵母细胞的动物、代孕动物和克隆动物之间的关系：克隆动物绝大部分性状与供体动物相同，少数性状(由线粒体DNA控制的性状)与提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
【链接知识】1．核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本可能不同的原因：
(1)克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本，与植物组织培养不同(来自一个亲本)，即克隆动物遗传物质来自两个亲本。
(2)在发育过程中可能发生基因突变、染色体变异导致性状改变。
(3)外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。
2．细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
3．克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
易错陷阱4：不能确定目的基因导入的受体细胞是体细胞和受精卵
【陷阱分析】将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。大肠杆菌经常用作原核细胞的受体细胞，酵母菌经常用作真核细胞的受体细胞。
【链接知识】1．将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和载体的类型不同，所采用的导入方法也不同。
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射技术 Ca2+处理法(CaCl2)
受体细胞 受精卵或体细胞 受精卵 常用原核细胞
转化过程 农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上转入农杆菌导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。操作过程：将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达 在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头；然后滴加DNA(含目的基因)至花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养后移入母体子宫或输卵管→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞感受态细胞→将重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收外源DNA分子
【易错点提醒一】消毒和灭菌不相同
[例1]获取纯净微生物的关键在于无菌技术，主要包括消毒和灭菌。下列关于无菌技术的叙述正确的是( )
A．牛奶一般通过100℃煮沸5~6min来消毒
B．紫外线照射30min可以杀死物体表面的微生物
C．吸管和培养皿通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D．接种环、试管口、棉塞通过灼烧灭菌法进行灭菌
规避陷阱：消毒和灭菌最根本的区别是芽孢和孢子是否灭活，灭菌能杀死芽孢和孢子，因而灭菌更彻底。
[变式1-1]无菌技术涉及消毒和灭菌。下列相关叙述正确的是( )
A．煮沸消毒法可以杀死微生物的营养细胞和全部的芽孢
B．可以对培养皿、培养基和接种环进行干热灭菌
C．常用的灭菌方法主要包括干热灭菌、湿热灭菌、灼烧灭菌等
D．在超净工作台进行微生物接种时，可以不在酒精灯火焰旁进行
[变式1-2]无菌技术是微生物培养获得成功的关键，下列有关说法正确的是( )
①微生物培养时，关键是避免杂菌的入侵，对无菌操作的要求非常严格；②培养基应先调pH值再进行灭菌处理；③对实验空间及操作者的双手进行表面消毒时要考虑药剂的消毒效果及实验者的安全；④不同器械、不同用具区别对待，采用不同灭菌方法⑤对目的菌及培养基可用高压蒸汽灭菌；⑥如果不小心导致污染，将可能造成培养工作前功尽弃
A．①②③④⑥ B．①②③④ C．①②③④⑤ D．①②③④⑤⑥
【易错点提醒二】植物体细胞杂交与动物体细胞杂交目地不同
[例2]如图为植物体细胞杂交技术的流程图，其中①~⑤表示不同过程，下列关于植物休细胞杂交和动物细胞融合技术的叙述，正确的是( )
A．两种技术都打破了生殖隔离，都利用了细胞膜流动性
B．两种技术分别体现了植物细胞、动物细胞的全能性
C．图中②过程可用灭活的病毒诱导，而动物细胞膜合技术常用PEG 诱导
D．动物细胞融合技术无需进行①③过程是其与植物体细胞杂交技术的唯一区别
规避陷阱：植物体细胞杂交需获得完整植株，动物细胞融合技术得到的是杂交细胞。
[变式2-1]科研人员用抗病、抗寒的二倍体阿宽蕉和三倍体无籽龙牙蕉进行体细胞杂交，培育出抗病、抗寒的无籽新品种，拓宽了香蕉种植区域。相关叙述正确的是( )
A．体细胞杂交技术无法获得含双亲优良细胞质基因的个体
B．②过程可用灭活病毒诱导法、PEG融合法等方法实施诱导
C．③过程成功的原因是杂种细胞含个体发育的整套遗传信息
D．抗病、抗寒无籽新品种自交，可获得抗病、抗寒无籽后代
[变式2-2]下列关于动物细胞工程和植物细胞工程的叙述，正确的是( )
A．植物组织培养和动物细胞培养均使用固体培养基
B．促进动物细胞融合的方法均可用于诱导植物细胞融合
C．植物体细胞杂交和动物细胞融合均可打破生殖隔离，培育新品种
D．愈伤组织和iPS 细胞的诱导形成均发生了基因的选择性表达
【易错点提醒三】克隆动物绝大部分基因来自供体动物
[例3]细胞核移植技术的研究和发展对优良物种的产生和培育具有重要的意义。下列有关核移植的叙述，错误的是( )
A．动物细胞核移植技术能够成功的基础是动物细胞核具有全能性
B．操作中受体细胞一般选择减数分裂Ⅱ中期的卵母细胞
C．操作时去核是为了保证克隆动物的核基因全部来自供体细胞
D．重构胚在形成后，应立即转移至代孕个体体内进行下一步的发育
规避陷阱：克隆动物核基因全部来自供体细胞，质基因来自提供卵母细胞的动物相同，与代孕动物的性状无遗传关系。
[变式3-1]2024年2月25日，世界首例体细胞克隆顶级种用藏羊“青青”在青海省诞生。研究人员采集种羊耳缘组织培养成耳纤维细胞作为核供体细胞，通过体细胞核移植获得种羊克隆胚胎。下列叙述正确的是( )
A．在核移植前应去除MⅡ期卵母细胞的纺锤体——染色体复合物
B．在培养耳纤维细胞时可使用胃蛋白酶处理种羊耳缘组织
C．克隆动物与试管动物的生殖方式均为无性生殖
D．重组细胞会依次经历囊胚、桑葚胚、原肠胚等发育阶段
[变式3-2]生物技术的安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是( )
A．生物武器包括致病菌类、病毒类和生化毒剂类等
B．治疗性克隆是为了获得治疗所用的克隆个体，且需要严格的监管
C．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”的主要区别在于前者需要在植入前对胚胎进行遗传学诊断
D．转基因植物进入自然生态系统后可能因具有较强的“选择优势”而影响生物多样性
【易错点提醒四】目的基因导入的受体细胞不同
[例4]下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是( )
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
1．下图表示胚胎工程在动物优良品种培育中的应用，下列说法正确的是( )
A．②过程中，胚胎移植能充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，移植前应对供体母牛进行超数排卵处理
B．③过程中，应将目的基因导入去核的受精卵以定向改变生物性状
C．①②③过程使用了无性繁殖技术
D．对早期胚胎进行DNA分析和性别鉴定时，应选择桑葚胚的滋养层细胞
2．多环芳烃(PAHs)是一种不溶于水的有机物，在培养基中以微小的颗粒状存在，PAHs在土壤中的降解速率很慢，并具有致癌和致畸作用。科研人员欲从被PAHs污染的土壤中分离出高效降解PAHs的菌株，进行如图所示的实验(培养基乙中PAHs被降解后会形成透明圈)。回答下列问题：
(1)从培养功能角度分析，培养基甲属于 ；培养基通常需要提前在121℃下进行 。
(2)将培养基甲中的目的菌接种到培养基乙中的方法是 ，该方法不仅适用于筛选某种菌株，还可用于 。
(3)筛选PAHs降解菌实验时，过程③所需要的实验工具有 (答出两种)。过程④挑选的单菌落应该是透明圈直径与菌落直径比值 (填“最小”或“最大”)的。
(4)在5个平板上各接种稀释倍数为103的菌液样品0.1 mL，培养一段时间后，平板上的菌落数分别为48、50、54、56、52，则每升原菌液样品中细菌数为 个。如果用显微镜直接计数法对细菌进行计数，所统计的细菌数通常会比上述方法统计数目偏 (填“大”或“小”)，原因是 。
3．牛和羊的瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。某研究小组欲从瘤胃内筛选出能高效降解尿素的细菌，设计了如下实验。请分析并回答下列问题：
实验步骤：
Ⅰ、取样：从刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装入事先灭过菌的锥形瓶中。
Ⅱ、培养基的配制和灭菌：
配制全营养LB固体培养基。配方：水、蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂糖(一种凝固剂)。配制尿素固体培养基。配方：水、葡萄糖、NaCl、K2HPO4、尿素、琼脂糖。
Ⅲ、制备瘤胃稀释液并接种，如下图1所示。
Ⅳ、在无氧条件下进行微生物的培养、观察与计数。
(1)全营养LB固体培养基和尿素固体培养基都含有微生物生长所需的基本营养物质，除水外还有 。(至少答两点)
(2)该小组采用 法对瘤胃中分解尿素的细菌进行分离和计数。在无菌条件下，利用该方法进行分离计数时，需要用到图2中的实验器材有 。
(3)为检测该培养基灭菌是否彻底，应采用的检测方法是 。为了判断尿素培养基是否具有选择作用，实验时还需要同时接种全营养平板，如果同一浓度梯度下，尿素培养基上的菌落数 (“大于”、“等于”或“小于”)全营养培养基上的菌落数，则说明尿素培养基具有选择作用。
(4)为了避免混淆，本实验中使用的平板需要在培养皿的 (“皿盖”或“皿底”)做好标记。然后在 (“18~25℃”或“25~30℃”或“30~37℃”)的恒温培养箱中需培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数目，选择菌落数目稳定时的记录作为结果，其目的是 。
(5)若将最后一个试管中的稀释液分别涂布到3个尿素平板上培养，培养后平板上出现的菌落数如图1所示，则5mL瘤胃样品中含有目标活菌数约为 。该方法统计获得的菌落数比实际的活菌数 ，原因是 。
4．兴趣小组成员欲通过以下流程酿制苹果酒：选料→打浆→接种→发酵→过滤→贮存。回答下列问题
(1)选料：在苹果充分成熟、含糖量最高时进行采收，剔除残次果、腐烂果，保留高品质果实，其中剔除腐烂果的原因是 。
(2)打浆：将高品质苹果去皮后切块，再利用匀浆机打浆后，向匀浆中加入一定量的果胶酶，目的 ，以提高出汁率，增加匀浆的分散性，利于菌种对营养物质的利用，加快发酵进程。
(3)接种：将一定量的苹果匀浆转入经消毒的发酵瓶，然后转入一定量的酵母菌菌液和适量的焦亚硫酸钾，加入焦亚硫酸钾的目的是抑制 从而确保发酵时优势菌种。装瓶时能否将果汁装满，为什么？ 。
(4)发酵：将发酵瓶置于温度适宜的环境中，较长时间后，因酵母菌 产生的二氧化碳，导致发酵液表面形成大量泡沫。若迟迟不出现这样的现象，可向发酵液中加入一定量经 的酵母菌。当发酵液不再产生气泡时，表明发酵已结束。影响发酵时长的主要因素除了酵母菌接种数量和环境温度以外，还有 (答2点即可)等因素。
过滤、贮存：发酵液过滤后装瓶，密闭封存。
(5)为减少苹果酒酿制过程中产生的废弃物对环境造成的污染，可对步骤(2)中产生的苹果皮回收利用。苹果皮中富含果胶，可利用微生物法分离果胶，其原理是利用微生物分解果皮中的纤维素从而使果胶游离出来。
①为分离此类优良菌株可选用划线分离进行 ，该方法需要配制以 为唯一碳源的培养基。
②对初步筛选获得的菌株进行人工诱变等处理，获得 缺陷型菌株。若诱变育种无法获得相应的缺陷型菌株，则可通过 技术获得。
③这种对生产过程产生的废弃物的再利用，从生态工程角度分析，主要优点是 。
5．灵芝是一种药用真菌，它的多糖和三萜类化合物是主要的活性物质，具有抗氧化、抗癌、抗衰老等多种生理功能。科研者通过多种育种方式的结合选育出具有优良性状的菌种，再利用液态深层发酵技术生产功能活性物质。
(1)育种
①获得原生质体：活化的原始菌种培养4-5天，对发酵液进行 操作，取菌体加入已灭菌的溶壁酶和较高渗透压的甘露醇溶液进行酶解获得原生质体，利用 (填仪器)对其进行显微镜观察计数。
②人工诱导变异：对原生质体进行化学诱导选育出高产多糖的菌种A和高产三萜类化合物的B，其育种原理是 。相对于整个细胞，诱导原生质体更容易达到目的，原因是 。
③诱导原生质体融合：对菌种A、B的原生质体加入聚乙二醇和 Ca 辅助诱导剂诱导融合，进一步 出具有同时高产多糖和三萜类化合物的新菌种Y。Ca 辅助诱导剂作用机理可能是 。
(2)深层液体发酵
基本过程：菌种Y→试管斜面培养→摇瓶种子培养→繁殖罐培养→发酵罐培养→发酵产品处理。
①菌种是发酵工业的关键，用于发酵生产的菌种Y除了高产多糖和三萜类化合物外，还应满足的条件有
A．菌种发酵产物易于分离
B．培养基来源充足且廉价，被转化的效率高
C．菌种遗传特性和生产能力稳定
D．菌种对环境没有明显危害
②摇瓶培养的目的是 。深层发酵技术相较于传统农业栽培具有 等方面的优势。
③优化培养条件是发酵生产高效顺利进行的重要措施。科研者以葡萄糖、蛋白胨、pH值三个因素为自变量，以获得较高灵芝浸膏多糖产量，实验结果见表。
试验序号 A．葡萄糖浓度(%) B．蛋白胨(%) C． pH值 灵芝浸膏多糖含量(%) 菌丝干重(g/100mL)
1 1(2%) 1(0.2%) 1(pH5.0) 10.3 14.9
2 1(2%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 11.2 16.5
3 1(2%) 3(0.6%) 3(pH7.0) 10.8 15.2
4 2(3%) 1(0.2%) 3(pH7.0) 8.9 10.6
5 2(3%) 2(0.4%) 2(pH6.0) 9.2 12.4
6 2(3%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 7.1 9.9
7 3(4%) 1(0.2%) 2(pH6.0) 8.1 10.2
8 3(4%) 2(0.4%) 3(pH7.0) 7.2 8.6
9 3(4%) 3(0.6%) 1(pH5.0) 6.8 8.4
从表中可得，对灵芝浸膏多糖含量影响最重要的因素为 。当培养基组成为 为最优条件组合。
6．糖尿病是危害全球人类健康的常见疾病，长期以来主要靠注射外源胰岛素进行治疗，严重影响患者的生活质量。我国科学家首次利用化学重编程多能干细胞(CiPSCs)分化而来的胰岛细胞自体移植到一名1型糖尿病(T1DM)患者体内，具体流程如图1所示。在一年跟踪随访中，该病例成功摆脱胰岛素依赖，各项诊断指标恢复至正常水平。
回答下列问题：
(1)T1DM主要是由于免疫系统攻击并破坏胰岛B细胞导致胰岛素分泌不足，引发高血糖症，因此属于 ，CiPSCs能够被诱导形成胰岛细胞依据的原理是 。
(2)研究人员从患者体内抽取脂肪组织，经 分散成单个细胞制备成细胞悬液，然后进行细胞培养分离出脂肪干细胞。在诱导形成CiPSCs的过程中，需精确控制培养基的各种成分，与普通动物细胞培养基相比，不能添加 等天然成分，以免影响细胞分化进程。
(3)利用CiPSCs制备胰岛细胞后，研究人员将糖尿病模型小鼠分为A、B组，A组进行手术但不移植胰岛细胞，B组体内移植胰岛细胞，然后两组均进行腹腔注射葡萄糖实验，结果如图2所示，该实验的目的是 。经过长时间科学论证后，研究人员将胰岛细胞移植回患者体内，一年内定期进行口服耐糖检测(见图3)，结果表明患者能摆脱胰岛素依赖，依据是 。(糖尿病的诊断阈值为血糖水平等于或高于200mg/dL)。
(4)传统诱导多能干细胞(iPSCs)常利用病毒等载体将4种转录因子的基因导入体细胞，其中的C-myc和Klf4是原癌基因。据此分析，化学分子诱导CiPSCs的优势是 。
7．EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。抗原的选择和制备过程为：将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1、EV71外壳蛋白VP2和非EV71蛋白分别注射到4组小鼠体内，多次免疫后，取上述各组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，结果如下图所示。
(1)EV71免疫的小鼠血清抗体 (填“是”或“不是”)单一抗体，据图分析判断依据是 。
(2)制备抗EV71单克隆抗体时，选用 免疫的小鼠的B细胞效果最佳。单克隆抗体的制备流程图如下：
(3)相比较植物细胞，诱导动物细胞融合特有的方法是 。用选择性培养基对融合后的细胞进行筛选的目的是获得 ．将其接种到96孔板，进行 培养和 ，目的是获得 。
(4)图中体外的扩大培养，是从 中获取大量的单克隆抗体。除此之外还可以使用的方法 ，该单克隆抗体具有的优点是 。
8．我国科学家突破了体细胞克隆猴的世界难题，成功培育出世界上首个体细胞克隆猴——“中中”和“华华”。这标志着我国将率先开启以猕猴作为实验动物模型的时代。如图为克隆猴的流程示意图。请回答下列问题：
(1)我国克隆猴利用的是猴胎儿成纤维细胞，该细胞是一种已分化的体细胞，从理论上分析，它具有细胞的全能性，这是因为 。
(2)克隆猴时需要进行“去核”操作，即去掉卵母细胞的细胞核。先在体外培养卵母细胞让其分裂，一般选择 的细胞进行去核操作；然后进行“核移植”，即将体细胞的细胞核移到去核卵母细胞中形成重组细胞；此时采用的技术是 ；得到的重组细胞再进行人工激活使其分裂形成胚胎。
(3)科学家将79枚克隆胚胎移植到21只代孕母猴中，最终只有两只母猴正常怀孕产下“中中”和“华华”，它俩的性别是否一致？ ；原因是 。
(4)克隆动物有很多优点：①可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；② 。
9．工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。下图是利用大肠杆菌生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。
(1)启动子是 的识别和结合部位。图中胰岛素基因以 链作为模板进行转录。构建基因表达载体时一般至少需要两种限制酶，以防止 和 。
(2)为使胰岛素基因能够在大肠杆菌中表达出正确的蛋白质，获取目的基因时通常先 ，然后再通过逆转录得到胰岛素基因。
(3)PCR扩增胰岛素基因，为了使目的基因与载体能正确连接，需要在引物的 端添加限制酶 的识别序列；n次循环后，至少消耗引物 个。
(4)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了 ① 的培养基上，若出现 ② (白色/蓝色)菌落，则该菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
10．研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列(注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列)。
(1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%(PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值)，初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。
(2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。
(3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平(如图)。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
①对文中“增强子”的理解，错误的是
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．一个增强子只能作用于一个基本启动子
C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。
(4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。
11．为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签(能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合)形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。
注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 (填“5′→3′”或“3′→5′”)。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。
(3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。
(4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
12．巴斯德毕赤酵母是一种能够以“液态阳光”之一的甲醇作为唯一碳源的微生物，但它转化甲醇的速度慢，而且转化过程中容易积累一定的有毒物质。我国研究团队通过基因工程改造巴斯德毕赤酵母，将甲醇代谢与脂肪醇的合成途径偶联，如图1所示：
(1)通过一定的酶体系在细胞的 中对甲醇进行深度加工，既可以获得工业生产上广泛应用的脂肪醇，实现经济价值；也可以通过“液态阳光”利用CO 促进碳循环，获得生态效益。
(2)在大量培养巴斯德毕赤酵母的过程中，培养液中除添加碳源甲醇外，还需保证其他营养的充足以及 的供应。除基因工程外，还可以通过 获得高效转化的巴斯德毕赤酵母。
(3)巴斯德毕赤酵母已经成为生成多种外源蛋白的卓越表达系统，因为它含有的醇氧化酶1基因AOXI的启动子5'AOXI为强诱导型启动子。利用来源于AOXI的启动子序列5'AOXI和终止子序列3'AOXI(TT)对原质粒改装后形成的pPIC9K质粒如图2所示。
①在 的诱导下，RNA聚合酶识别并结合5'AOXI启动转录过程，直至3'AOXI(TT)处转录终止。
②HBsAg基因是乙肝病毒DNA上的一个基因，请简述利用pPIC9K质粒作载体的基因工程技术生产HBsAg蛋白质的过程： 。
13．大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。
(1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。
(2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。
(3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是
(4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。
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