苏教版（2019）高中生物选择性必修三 1.2 发酵工程的无菌技术课件(共85张PPT)

(共85张PPT)
第二节 发酵工程的无菌技术
第一章 发酵工程
积极思维：肉汤腐败与微生物有什么关系？
19世纪中期以前，人们普遍相信生命现象是自然发生的。19世纪60年代，法国科学家巴斯德通过实验证明了微生物不是自然发生的。
煮沸肉汤，杀灭其中的细菌
肉汤仍澄清，没有细菌繁殖
打断瓶颈
肉汤变混浊，细菌在肉汤中繁殖
日常生活中，我们会用碘伏消毒液擦拭受伤破损的皮肤，从而杀灭伤口部位的部分微生物。那么，在发酵工程实践中无菌操作是如何开展的呢？
巴斯德在实验
一、发酵工程的灭菌方法和灭菌设备
1、无菌技术：
2、无菌技术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
注：
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；
是指在操作过程中，保持物品与操作区域无菌的状态并不被微生物污染的技术，其核心是灭菌；
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；
②用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行；
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；
（1）消毒
①概念：
②常用的消毒方法
a、煮沸消毒法：100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。
b、巴氏消毒法：
62～65℃下消毒30min或80～90℃处理30s～1min，适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。
指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
c、化学药剂消毒法：用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。
思考：利用酒精消毒时，酒精浓度是不是越高越好？
析：高浓度酒精能将细菌表面的蛋白质凝固，并形成一层保护膜，阻止酒精进入细菌体内，因而不能将细菌彻底杀死。酒精浓度低于70%，虽可进入细菌体内，但不能将细菌彻底杀死。
④紫外线消毒法：接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。
（2）灭菌
附：芽孢和孢子的相关知识
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。
①概念：
指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
②常用灭菌的方法：
a、干热灭菌法
耐高温，需保持干燥的物品，适用于
玻璃器皿 (如试管、培养皿、移液管、注射器)、金属器具 (如针头、 镊子、剪刀等)的灭菌；
器具：
电热鼓风干燥箱（干热灭菌箱）；
条件：
140~160℃下加热2~3h；
原理：
使微生物细胞质膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等；
对象：
使灭菌器皿保持干燥；
带有胶皮或塑料的物品、液体及固体培养基一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌；
优点：
缺点:
电热鼓风干燥箱：
采用电热鼓风干燥箱干热灭菌时，一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准。
b、灼烧灭菌法
接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位；
器具：
酒精灯；
条件：
酒精灯外焰灼烧；
效果：
最彻底；
原理：
使微生物燃烧；
对象：
c、湿热灭菌法：高压蒸汽灭菌
器具：
高压蒸汽灭菌锅
条件：
100kPa、121 ℃下维持15-20min；
原理：
高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性；
培养基、多种器材、物品等；
优点：
操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏；
对象：
高压蒸汽灭菌锅的使用：
加水→装锅→加热→排空冷空气→保温保压→出锅
加水：
水量达到水位标记线即可；
↓
装锅：
将待灭菌物品放在灭菌桶中，至少留1/3空间，盖好锅盖，对称旋紧锅盖四周的固定螺栓；
↓
加热：
出锅：
接通电源，打开开关，开始加热；
↓
排空冷空气：
打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。当压力表指针回降到“0”时，关闭气阀，继续加热；
高压蒸汽灭菌锅的使用：
锅内压力升至约103 kPa、温度达到121℃时控制热源，保持压力，维持15～20 min 后，再关闭电源；
当压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，取出灭菌物品
保温保压：
↓
↓
灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，保持灭菌锅内壁及内胆干燥，并盖好锅盖。
视频：高压蒸汽灭菌锅使用
思考：
高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到“0”时才能打开排气阀？
析：在同一温度下，湿热的灭菌能力比热大，在使用高压蒸汽灭菌时，灭菌锅内冷空气的排出是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
如果在压力未降到“0”时打开排气阀，会导致锅内压力突然下降，使器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾培养基而发生污染。
1、培养基灭菌为什么采用高压蒸汽灭菌而不采用干热灭菌？
析：干热灭菌箱内的高温会导致培养基的水分散失，而高压蒸汽锅内的湿度较大，不会导致培养基的水分散失。
2、如何制备一瓶无菌水？
析：对一瓶有菌水进行高压蒸汽灭菌处理。
3、某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是什么？
析：未将锅内冷空气排尽。
思考并回答：
4、某同学从高压蒸汽灭菌锅内拿出培养基后发现，培养基已经溅满了锥形瓶的瓶壁，最可能的原因是什么？
析：高压蒸汽灭菌锅的压力表指针还未降至“0”点，就提前打开了高压蒸汽灭菌锅。
在工业生产上制备无菌空气，用于好氧微生物的发酵；
在产品提取过程中，也可以利用过滤除菌法处理料液，以获得无菌产品。
d、过滤除菌法
概念：
通过滤膜过滤阻留微生物从而达到除菌目的的方法；
器具：
空气除菌设备；
对象：
空气、料液，及在高温下不稳定的物质（大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留）
应用：
空气除菌设备：
许多微生物产品是通过培养好氧微生物获得的。通常在空气中含有灰尘颗粒和各种杂菌， 在阴雨天气或环境污染比较严重的情况下，空气中会悬浮大量的微生物。这些微生物一旦进入营养丰富的培养基中，会很快繁殖，影响发酵过程。 让含菌空气通过无菌干燥的过滤介质，以阻截空气中所含微生物。空气除菌设备不是灭菌，而是滤除了空气中的各种杂菌。通过过滤除菌处理的空气可达到几乎无菌的程度，并有足够的压力和适宜的温度，以满足好氧微生物纯培养的需要。
二、发酵工程的无菌操作器具
1、接种器具
①接种：在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程；
②常用接种器具包括玻璃涂布器、接种针、接种环等；
③应用：玻璃涂布器常用于平板稀释涂布接种，接种针用于穿刺接种，接种环用于斜面接种或在平板培养基上划线接种；
平板划线接种
2、转移器具
①移液管的应用：一般用于转移部分液体培养物、系列稀释微生物或分装化学试剂；
②刻度移液管：具有刻度的直形玻璃管，在需要控制试剂加入量时使用。
视频：移液管的润洗及溶液的移取
③微量取液器：当取液量很少时（如0.1 mL），常采用微量取液器。微量取液器可分为固定容量的和可调容量的两种；
视频：微量移液器的使用
3、超净工作台
是利用工作台内紫外线灯的杀菌作用，并通过空气过滤器过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。
①概念：
超净工作台是一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备。
②净化原理：
三、微生物接种和传代的无菌技术
1、微生物保存的生理状态
在人工创造的条件下，降低细胞的代谢水平，使细胞基本处于休眠状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于死亡。
3、菌种保存的方法：
①厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用穿刺接种；
②斜面接种是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。
2、菌种保存的条件：
低温、干燥、真空；
穿刺接种示意图：
斜面接种和培养酵母菌：
准备
接种
接种环灭菌
试管口灭菌
挑取少量菌体
划线
接种
培养酵母菌
①点燃酒精灯，取两支盛有培养基的试管，其中一支内有菌种，另一支为无菌的斜面培养基；
（1）准备接种
②用一只手的拇指和其他四指夹住试管，使管口齐平，管内培养基斜面向上；
将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次，以达到迅速彻底灭菌的目的。
（2）接种环灭菌
在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，迅速将试管口通过火焰2~3次，以杀灭试管口上的微生物。
（3）试管口灭菌
“拔塞过火
”
将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体。
（4）挑取菌体
注：
在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰；
迅速将上述带菌的接种环伸入待接种的试管中， 在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，将菌种接种到培养基上。
（5）接种
注：
划线时注意不要将培养基的表面划破；
（6）培养
将试管口与试管塞分别通过火焰2~3次，迅速塞紧试管。多次灼烧接种环确保无菌，冷却后，放回原处。将接种过菌种的试管放在恒温箱中（温度调至28℃） 培养24 h。
视频：斜面培养基微生物接种
4、菌种保存的方法
挑选典型菌落
接种到斜面培养基，培养
4℃左右的冰箱保藏
2~3个月重新接种
①短期保存：
甘油管藏（一般可保存2~4年）
-20℃以下的甘油管在冷冻箱中保藏；
②长期保存：
(1)培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌 (　　)
(2)斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株 (　　)
(3)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理，培养过程中每隔一周观察一次 (　　)
(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(　　)
(5)穿刺接种可用于保藏厌氧菌种或研究微生物的运动 (　　)
(6)菌体蛋白质的变性温度与含水量相关，一般来说含水量越低，变性温度越高(　　)
(7)一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准(　　)
×
×
×
×
√
习题巩固：
√
√
(8)使用高压蒸汽灭菌锅时，为充分利用空间，装得越满越好(　　)
(9)当高压蒸汽灭菌锅的压力表指针降至“0”点时，即可出锅(　　)
(10)制备氨基酸、抗生素等的发酵过程，所需的微生物对空气无菌的要求较低(　　)
(11)将移液管移入准备接受溶液的容器时，为避免污染，移液管不能接触器壁(　　)
(12)低温、干燥、高氧是菌种保存的重要条件(　　)
(13)厌氧微生物常采用穿刺接种的方法将其保护在培养基中(　　)
(14)将含有新鲜菌种的试管放在－4 ℃的冰箱中保存有利于延长保存时间(　　)
×
×
×
×
×
√
×
2.下列关于灭菌和消毒的说法，错误的是
A．灭菌是指杀死环境中的所有微生物，包括芽孢和孢子
B．灭菌和消毒实质上是相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、湿热灭菌等
3．下列关于高压蒸汽灭菌锅的使用方法中，错误的是
A．使用高压蒸汽灭菌锅时，需等锅内的冷空气排尽后再关闭排气阀
B．培养基常用高压蒸汽灭菌法处理
C．灭菌结束后，需迅速将排气阀打开，等压力表降为“0”时再取出培养基
D．灭菌前一般需要将锥形瓶的棉塞用牛皮纸或报纸包扎好
B
C
4．下列操作能达到灭菌目的的是
A．用免洗酒精凝胶擦手
B．制作泡菜前用开水烫洗容器
C．在火焰上灼烧接种环
D．防疫期间用石炭酸喷洒教室
5．下列哪项不属于无菌技术？
A．将培养皿、接种工具和培养基进行灭菌
B．实验操作应在酒精灯火焰附近进行
C．避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触
D．操作者的衣着和手用纯净水洗干净
C
D
6．培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是
①化学消毒　②灼烧灭菌　③干热灭菌　
④紫外线消毒　⑤高压蒸汽灭菌　⑥巴氏消毒法
A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
A
7.高压蒸汽灭菌的操作顺序应该是
①加水　②排冷气　③装置灭菌物品　
④约103 kPa下灭菌　⑤加盖
⑥ 0 kPa下排气，打开灭菌锅
A.①③⑤②④⑥ B.②③⑤①⑥④
C.①②④⑤③⑥ D.②⑤①⑥④③
A
8.下列关于斜面接种和培养酵母菌的叙述，错误的是
A.接种环灭菌时，只需将其环端进行灭菌
B.接种时，应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线
C.挑取菌体时应先将接种环的环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的
培养基部位使其冷却
D.将菌种置于4 ℃左右的冰箱中保藏即有利于减缓培养基的水分蒸发，
又有利于延长保存时间
A
9.下列关于微生物接种和传代的无菌技术的叙述，错误的是
A.菌种的传代和保存要考虑菌种的生理、生化特性
B.低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物生长和代谢
的作用
C.破伤风芽孢杆菌可在培养基深处的厌氧环境下生长
D.在培养基斜面上接种时应由上部向底部轻轻划“Z”型折线
D
10．为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保存，下列有关叙述错误的是
A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保存的方法
B．甘油管藏法保存菌种时使用的甘油需灭菌
C．临时保藏菌种容易被污染或产生变异
D．对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4℃保藏的方法
D
11．将酵母菌菌种从菌种试管接种到另一支试管的操作，下列说法有误的一项是
A．整个接种过程都要在酒精灯的火焰附近进行
B．接种环放在酒精灯火焰上灼烧之后即可伸入菌种试管挑取少许菌种
C．菌种试管口和待接种的试管口接种前后都要通过酒精灯火焰2～3次
D．带菌的接种环应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线
B
12．下列关于无菌操作的叙述，正确的是
A．接种时超净台内同时打开紫外灯和过滤风
B．斜面接种时，含菌种的试管口和不含菌种的试管口都要通过酒精灯火焰灭菌
C．用脱脂棉制成的棉塞塞住试管口，用牛皮纸包扎，放入灭菌锅内灭菌
D．接种环灭菌后迅速挑取少量菌种进行接种
B
13．下列有关消毒和灭菌的说法，错误的是
A．水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒
B．使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是未将锅内冷空气排尽
C．玻璃和金属材质的实验器具不可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌
D．牛奶的消毒常采用巴氏消毒法，不仅可以达到消毒目的，同时营养物质损失较少
C
三、平板划线法分离和纯化微生物
1、平板划线法定义:
把含有多种微生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，从而获得单个菌落的方法。
将微生物样品在琼脂平板表面多次做“由点到线”的稀释划线，经过这样的操作可得到较多独立分布的单个微生物。经过平板培养后，会形成部分由单个微生物生长、繁殖而成的纯种菌落。
2、平板划线法的做法:
由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
3、微生物的纯培养：
酵母菌
①酵母菌是兼性厌氧型单细胞真菌，可以进行出芽生殖，也可以进孢子生殖；
②培养的最适pH为4.5～5.0，最适生长温度为28～30 ℃；
4、平板划线法获得纯化的酵母菌菌落（视频）
③可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需要通过固体培养基培养。
4、通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落
尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。
（1）实验目的
（2）实验原理
平板划线法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培养基平板上，采用无菌操作技术及平板划线法能够获得纯化的酵母菌菌落。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要，利用前面实验中配制的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制作平板。
酵母菌样本（菌种）；接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅；马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
（3）实验器材和试剂
（4）实验步骤
②培养基和培养皿灭菌
用牛皮纸包扎已配制的培养基
已包好的培养皿
高压蒸汽灭菌锅灭菌
①配制马铃薯葡糖糖琼脂培养基并调pH
＋
→
将灭好菌的培养基和培养皿取出，置于操作台上，待培养基冷却到50℃左右时（可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可），在酒精灯火焰附近倒平板。
③倒平板
倒平板操作步骤：
拔出锥形瓶的棉塞
将瓶口迅速通过火焰：转动瓶口，确保瓶口被灭菌；
倒培养基：在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10~20 mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖；
等培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置
注：
①平板冷凝后倒置的原因：
将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；
②如何确定所倒平板是否被杂菌污染：
将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底；
判断：倒平板时应该将皿盖打开放到一边，然后再倒培养基（ ）
×
④平板划线和培养（人教版）
将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红
在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌的棉塞
将试管口通过火焰
将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
将试管通过火焰，并塞上棉塞
左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连
将平板倒置放入28℃恒温培养箱中培养24～48h。
提醒：为什么要同时放入未接种的平板？
作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染
完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24-48 h。
分区划线法：
1
2
3
4
5
平板划线法注意事项:
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次；
②划线首尾不能相接；
③每次划线前接种环进行灭菌；
④划线后,培养皿倒置培养；
注：每次划线前后灼烧接种环的目的是什么？
灼烧时间 目的
第一次划线前
每次划线前
划线结束后
杀死接种环上可能存在的微生物，防止外来微生物干扰
杀死上一次划线结束后接种环残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端
杀死接种环上残存的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者
④平板划线和培养（苏教版）
在一个倒有培养基的培养皿的皿底外侧面中央用记号笔画一直线，再在此线中间处画一垂直线，将培养皿分成三个区域：第1区域、第2区域、第3区域，分别标上“1”“2”“3”字样。
1
2
3
接种划线时，将带有酵母菌样品的接种环，在培养皿内培养基的第1区域划线，然后再从第1区域划到第2区域，从第2区域划到第3区域（在第2次、第3次划线前，接种环需过火灭菌）。在固体培养基表面完成多次“由点到线”的逐步稀释。划完线后盖上皿盖，倒置培养。
接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行。
通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的菌落。
四、稀释涂布平板法分离和纯化微生物
1、稀释涂布平板法：
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，使其中的微生物充分分散，培养后在平板培养基表面形成多个单菌落。
2、稀释涂布平板法应用：
既可用于菌种的分离和纯化，也可以用于微生物的计数。
101
102
103
104
105
106
（1）将分别盛有9mL无菌水的试管灭菌并编号；
（2）用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀；
（3）从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复步骤2，直到第六支试管；
3、稀释涂布平板法的操作过程——系列稀释操作
4、稀释涂布平板法的操作过程——涂布平板操作
将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
取0.1mL菌液，滴加到培养基表面
将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养
选择30-300个菌落的平板进行计数；每个稀释度至少取3个平板取其平均值；
5、稀释涂布平板法计数原则:
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
稀释106倍
注：平板划线法不能对菌种进行计数；而稀释涂布平板法可以计数，但计数值会比实际值偏小，因为一个菌落有可能是由两个或者多个的菌体一起形成的；
①利用选择培养基可以筛选和分离某种微生物。
②在高度稀释的条件下，于固体培养基上培养该微生物，形成单个菌落。单个菌落即为纯化培养物，通过对菌落数量的统计，可以计算出样品中的含菌数。
6、实验：分离土壤中分解尿素的细菌并进行计数（视频）
（1）实验目的
（2）实验原理
①学会配制选择培养基，以分离出能分解尿素的细菌。
②学会采用稀释涂布平板法分离和培养分解尿素的细菌，并进行计数。
（3）实验器材和试剂
①土壤样品。
②灭菌处理过的各种工具。
③配制以尿素为氮源的1000mL选择培养基的试剂以及调节pH的相关试剂。
（4）实验步骤
铲取土壤，将样品装入纸袋中
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌；
1×10
90mL无菌水
10g
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀
取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释
1 mL
1×102
9mL无菌水
①制备土壤悬液
1×102
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
每个试管中均有9 mL 无菌水
②配置培养基及制作平板
设置一组不加氮源的平板，作为空白对照。
在大烧杯加入培养基的成分，并加琼脂煮沸溶解，定容，调节pH为7.2～7.4，装入锥形瓶，灭菌，冷却至50℃，倒平板。
③涂布
从浓度最低的土壤悬液开始，每个浓度设置3个重复。
④培养与观察
另设一组对照，用等体积无菌水代替土壤悬液，用来判断平板在实验前或实验过程中是否被污染。
倒置于37℃恒温箱中培养1~2d，每24h观察一次；
计算时，选取菌落数为30~300的一组为样本进行统计。
公式:每克土壤样品的细菌数=某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数÷涂布所用稀释液体积数
⑤计数菌落
稀释105倍
稀释106倍
稀释107倍
空白对照
例：
甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？
每克土壤中细菌数目＝
（90× 105 ）÷0.1=9 ×107个
解：
每个平板中平均菌落数＝（80+90+100）÷3＝90个
(1)倒平板后，待平板冷凝之后需将其倒置(　　)
(2)若皿盖和皿底之间溅上培养基，这个培养基不可再用(　　)
(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要挑取菌体(　　)
(4)培养微生物的温度因菌种不同而稍有差异(　　)
(5)倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整( )
(6)如果不能确定某菌落是否由单个细胞繁殖而来，可通过反复多次进行平板划线进行培养分离纯化 (　　)
(7)在平板3个区域划线时，要按照顺序不间断进行划线快速完成 (　　)
(8)经灭菌的培养基冷却到50 ℃左右进行倒平板并将平板倒置备用 (　　)
√
√
×
√
×
×
×
√
习题巩固：
(9)稀释涂布平板法可用于菌种的分离和纯化，还可以用于微生物计数(　　)
(10)测定不同微生物数量时，接种的土壤悬液的稀释度相同(　　)
(11)采用稀释涂布平板法培养和计算得到的微生物的数量一般比稀释液中实际微生物的数量要少(　　)
(12)分离土壤中分解尿素的细菌配制培养基时要用尿素作为唯一碳源 (　　)
√
×
√
×
2．平板划线法是微生物培养中常用的接种方法。下列叙述错误的
A．在酒精灯的火焰旁操作可以避免周围环境中微生物的污染
B．第二次及以后划线均要从上次划线末端开始以达到分离单菌落的目的
C．划线用力大小要适当防止划破培养基，最后一区域要与第一区域相连
D．接种后需将平板倒置培养，防止冷凝水落入培养基造成污染
C
3．下列关于平板划线法原理的叙述，错误的是
A．划线过程中，接种环上的菌液逐渐减少
B．划线最后部分的细菌间的距离加大
C．在适宜条件下，由多个细胞分裂繁殖产生的新细胞聚集成为单菌落
D．将单菌落接种到试管斜面上，培养后形成的菌群就是由一个细菌产生的后代
C
4.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是
A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
B
5．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图。下列有关叙述错误的是
A．甲中a区域为划线的起始位置
B．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌
C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
A
6．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
C．5号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为4号试管的10倍
D．该方法和平板划线法都可对微生物进行准确计数
B
7.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中得到以下几种统计结果，其中正确的是
A.涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B.涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C.涂布了3个平板，统计的菌落数分别是13、234和254，取平均值167
D.涂布了3个平板，统计的菌落数分别为210、240和250，取平均值233
D
8.下列关于稀释涂布平板法的叙述，错误的是
A．用移液管稀释菌液时，吹吸三次的目的是使菌液与水充分混匀
B．涂布时取菌液不超过1 mL，涂布均匀后在培养基表面都能形成单个的菌落
C．一般选择三个不同稀释度的菌液分别涂布到三组固体培养基的表面
D．在酒精灯火焰旁先将菌液进行系列梯度稀释，然后进行涂布平板操作
B
9．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．平板中的细菌数目是固定的
C．平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
C
10．下图所示为分离某种以尿素为氮源的细菌实验过程，下列叙述错误的是
A．土样从有哺乳动物尿液的地方取，获得目的菌种的几率很高
B．为验证尿素固体培养基具有选择作用，可用牛肉膏蛋白胨固体培养基做对照
C．将实验组和对照组37 ℃ 恒温培养24至48 h时，需将平板倒置
D．在尿素固体培养基上生长的细菌都是以尿素为氮源的细菌
D
11．下列关于稀释涂布平板法和平板划线法的操作过程的叙述，错误的是
A．稀释涂布平板法中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能蘸取菌液
B．为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布3个平板
C．采用平板划线法的培养皿中所得的菌落都符合要求
D．平板划线法中的连续划线的起点是上一次划线的末端
C
12．图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法的操作结果。下列叙述错误的是
A．图甲中在涂布前要将沾有少量酒精的涂布器引燃，冷却后才能涂布菌液
B．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养
C．图乙中培养皿所得的菌落不都符合要求
D．图乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
B