【备考2025】高考生物二轮复习考点突破专题九生物技术与工程课件(共57张PPT)

(共57张PPT)
专题九　生物技术与工程
角度一　PCR技术原理与条件
命题热点九　PCR技术
1．PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键。因此，双链DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
2．PCR过程中使用的耐高温的DNA聚合酶需要Mg2＋激活，因此PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
3．PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。
角度二　PCR产物的电泳鉴定
1.原理：脱氧核苷三磷酸(dNTP)3′－C上的－OH被－H替换后转化为双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。在PCR反应体系中加入待测DNA片段、4种dNTP、1种32P标记的ddNTP和1种引物及其他所需材料，经扩增后获得不同长度的DNA片段混合物。利用每种32P标记的ddNTP分别进行PCR后，将产物点样在变性凝胶上进行电泳分离，通过放射性自显影检测，就可以读出DNA的核苷酸序列。
2.实例：如图中DNA片段的待测碱基序列5′－TTGGCTGCAA－3′。
角度三　PCR技术的应用实例
1．扩增某DNA片段：将引物设计在DNA片段的两端。
2．从某一DNA分子上扩增其中一部分：将引物设计在要扩增的DNA片段两端。
3．定点突变：在引物的外侧(5′端)加上需要的序列(如限制酶 切割位点、特定的启动子或标记序列等)。
1. (2024·苏州模拟)RNA的检测可以采用实时荧光RT－PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法，RT－PCR的具体过程如图，下列叙述正确的是(　　)
A．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
B．过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n个引物B
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
【答案】　C
【解析】　PCR体系中需要的是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，A错误；过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时，可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度)，便于检测，C正确；PCR反应中温度呈现周期性变化，其中温度超过90 ℃的目的是双链DNA解聚为单链，然后冷却到50 ℃左右使引物与互补DNA链结合，继续加热到72 ℃左右，目的是在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸。所以PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，D错误。
2. (2024·广州模拟)由于原核细胞与真核细胞基因结构不同，植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法错误的是(　　)
A．进行PCR扩增的依据是DNA分子双链复制的原理
B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
【答案】　B
【解析】　PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理，A正确；进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)，但不需要解旋酶，B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C正确；通过与受体细胞的基因组序列比对，即可确定T－DNA的插入位置，D正确。
3. (2024·忻州模拟)阅读资料1、资料2，回答下列问题。
【资料1】　我国科学家把腺病毒中负责复制的关键基因剪切掉，但保留其侵染人体细胞的能力。随后，将其与逆转录获得的新型冠状病毒S蛋白(介导新型冠状病毒感染细胞的关键成分)基因整合，构建出了两种病毒的融合型病毒——重组腺病毒DNA疫苗。
【资料2】　新型冠状病毒核酸测序能够监测新变异毒株的出现，具体做法是先提取新型冠状病毒RNA，利用RT－PCR技术(即将病毒RNA逆转录后再进行PCR扩增)获取目标DNA区域；随后进行DNA测序，通常采用双脱氧核苷酸测序法，其原理是双脱氧核苷酸(ddNTP)的2′、3′碳原子都不含羟基，在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以中断DNA分子合成反应。在四个单独的PCR反应体系中，分别额外掺入ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP，使DNA复制随机终止，产生不同长度的DNA片段，然后进行凝胶电泳分离检测，从而分析获得目标DNA区域的碱基序列。
(1)资料1中，构建出两种病毒的融合型病毒这一步骤在基因工程中被称为__________________________________。融合型病毒入侵人体细胞后，S蛋白基因在人体细胞内的遗传信息传递过程为____________ __________________________________________(用文字和箭头表示)。
(2)接种重组腺病毒DNA疫苗后，人体长时间内仍可检测到重组腺病毒DNA。请由此推测重组腺病毒DNA疫苗只需注射一针即可起到长期免疫保护作用的原因是____________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________。
(3)资料2中，RT－PCR技术中使用的酶有____________________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________。
(4)下图为资料2中双脱氧核苷酸测序电泳结果，据此可分析出目标DNA区域X的碱基序列为________________________________(按5′→3′方向书写)。
(2)重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，可反复刺激机体免疫系统产生防御作用
(3)逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶　延伸　两种引物(通过碱基互补配对)与两条单链DNA结合(答出引物与模板链结合或互补配对即可)
(4)5′－CTGACTT－3′
中温延伸三个不同的步骤。①变性：加热使模板DNA在高温下双链间的氢键断裂而形成两条单链；②复性：使溶液温度降至50 ℃左右，模板DNA与引物按碱基互补配对原则结合；③延伸：溶液反应温度升至72 ℃左右，耐高温的DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸，按5′→3′方向复制出互补DNA。(4)由题意可知，双脱氧核苷酸测序法的原理是双脱氧核苷酸(ddNTP)的2′、3′碳原子都不含羟基，在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以中断DNA分子合成反应，DNA合成过程中子链沿3′端向下延伸，并且过程中遵循碱基互补配对原则，得到的结果如题图，可知目标DNA区域X的碱基序列应是5′－CTGACTT－3′。
4. (2024·衡水模拟)草甘膦是世界上使用最广泛的除草剂，转EPSPS基因抗除草剂水稻是中国科学院遗传与发育生物学研究所研发的水稻品种，靶标对象为草甘膦。回答下列问题：
(1)EPSPS基因一条链的两端序列如图1。采用PCR技术获取和扩增EPSPS基因，需要使用的引物序列为___________________________ _______________(标出5′和3′端)。若PCR过程经过4次循环，需要的引物的数量为________个。
(2)如表为操作过程中可能用到的限制酶，图2为经切割得到的目的基因及末端(除黏性末端序列外，其他碱基序列省略)，图3为要使用的质粒，其中的Tetr、Ampr为标记基因。
由图3可以看出，将EPSPS基因导入植物细胞的方法为____________________，作为表达载体，除图中结构，未标注的结构为________。对质粒进行切割时，选用的两种酶为__________________。
(3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的______________________的微量有机物，将导入EPSPS基因的细胞进行组织培养时，所用培养基中需要添加植物激素，若要探究生长素和细胞分裂素的比例(比值为1、比值大于1、比值小于1)对培养结果产生的影响。实验思路为______________________________________________ _______________________________________________________。
【答案】　(1)5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′　30
(2)农杆菌转化法　启动子　BclⅠ和SmaⅠ
(3)生长发育有显著影响　取4组已灭菌的装有MS培养基的锥形瓶，不同组别培养基的差异为不添加任何植物激素，生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1、比值大于1以及比值小于1，其他条件相同且适宜，观察外植体的生长发育情况
【解析】　(1)利用PCR扩增目的基因时，引物需要与模板的3′端(—OH端)结合，并遵循碱基互补配对原则，据图可知，采用PCR技术获取和扩增EPSPS基因，需要使用的引物序列为5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′；PCR技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2，因此若一个该DNA分子在PCR仪中经过4次循环，需要24＋1－2＝30个引物。(2)由图3可知，重组质粒中含有T－DNA，据此可知将EPSPS基因导入植物细胞的方法为农杆菌转化法；图示表达载体中含有目的基因、终止子、复制原点和标记基因等，故还缺少的是启动子；基因表达载体构建时，需要将目的
基因和载体切割出相同的末端，图示BamHⅠ会破坏目的基因，若对质粒进行切割时，选用的两种酶为BclⅠ和SmaⅠ。(3)植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微量有机物；分析题意，本实验目的是探究生长素和细胞分裂素的比例(比值为1、比值大于1、比值小于1)对培养结果产生的影响，则实验的自变量是两种激素的比例，因变量是培养结果，实验设计应遵循对照与单一变量原则，可设计实验如下：取4组已灭菌的装有MS培养基的锥形瓶，不同组别培养基的差异为不添加任何植物激素，生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1、比值大于1以及比值小于1，其他条件相同且适宜，观察外植体的生长发育情况。
5. (2024·烟台模拟)胸腺素β4(Tβ4)是肌动蛋白结合肽家族的一员，具有促进毛囊发育，加快毛发生长的作用。为了探究Tβ4基因对小鼠发育的作用，研究人员构建了特异性表达载体，并通过核注射技术转染小鼠单倍体ES细胞，培育出转Tβ4基因小鼠。回答下列问题：
(1)利用PCR技术可以获取和扩增目的基因。PCR中引物结合在模板链的__________端，子链的延伸方向是__________。
(2)利用引物2和引物3________(填“能”或“不能”)鉴定Tβ4基因插入位点。
(3)绿色荧光蛋白基因的作用是_______________________________ _______________________________________________。
为检测转Tβ4基因小鼠是否培育成功，从分子水平上，可采取的检测包括________________________________________________________ _________________________________________________________。
(4)为获得较多的小鼠卵母细胞，可采取的措施是____________ ___________。若需获得更多遗传性状相同的转基因小鼠，可在胚胎移植前对囊胚进行分割，分割时应注意________________________。
【答案】　(1)3′　5′→3′　(2)能
(3)作为标记基因，鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来(便于重组DNA分子的筛选)　通过DNA分子杂交技术检测小鼠染色体DNA上是否插入Tβ4基因；通过分子杂交技术检测Tβ4基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交法检测Tβ4基因是否翻译出Tβ4
(4)向雌鼠体内注射一定量的促性腺激素　将内细胞团均等分割
【解析】　(1)PCR中引物的5′端作为子链的起点结合在模板链的3′端，子链延伸方向是从5′端到3′端。(2)引物2和3可扩增一部分外源基因、一部分染色体DNA序列，可鉴定Tβ4基因插入位点。(3)绿色荧光蛋白基因作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来(便于重组DNA分子的筛选)。从分子水平上，可通过DNA分子杂交技术检测小鼠染色体DNA上是否插入Tβ4基因；通过分子杂交技术检测Tβ4基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交法检测Tβ4基因是否翻译出Tβ4。(4)用外源促性腺激素处理雌鼠，可获得数量较多的卵母细胞。在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，应注意将内细胞团均等分割，否则内细胞团少的部分发育会受阻或发育不良甚至不能发育。
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术可以精确地定位到基因组的某一位点上，在该位点上剪断靶标DNA片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。有些单基因突变导致的遗传疾病，目前也正在尝试用基因编辑技术进行治疗。让我们有机会通过编辑基因来救治基因问题所导致的遗传病患者，但是现在面临的挑战是如何把基因编辑工具传送到细胞或组织里面。所以，从这个角度考虑，血液疾病可能是用基因编辑工具治疗的首选，因为我们能把血细胞取出来，在体外进行基因修复后再送回体内。
命题新情境九　基因编辑技术
1.基因魔剪：CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。
当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板(由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成)，断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因锚入指定位点。
通过在Cas9基因中引入突变，可获得只能切割一条链的nCas9。将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，科学家开发出了单碱基编辑技术(图2)，能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T(G→A)或A→G(T→C)的碱基替换。
科学家通过对CRISPR/Cas系统的不断改造，使其还可激活或抑制基因的转录。虽然目前CRISPR/Cas技术还存在一些不足，如脱靶问题，但作为一种革命性的技术，其应用前景广阔。
2.基因定点突变技术——引物重叠PCR技术：
(1)该过程需要4种引物。
(2)PCR1的产物AB是引物a和引物b扩增的结果。
(3)PCR2的产物CD是引物c和引物d扩增的结果。
(4)产物AD的形成不需要另加引物，但需要耐高温的DNA聚合酶。
(5)需要改变的碱基位于引物b和引物c上。
(6)引物b和引物c之间应有部分碱基互补。
(7)PCR3中突变产物AD的扩增需要引物a和引物d。
1. (2024·苏州模拟)马里兰医学中心成功将猪心脏移植到一名57岁的心脏病患者身上，虽然这颗心脏仅仅存活了2个月，但仍然为异种器官移植的可行性提供了可观的数据。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪心脏进行了基因编辑。CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法错误的是(　　)
A．若要对一个基因进行编辑，则通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA与目标DNA的两条链进行配对
B．sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键
C．有时sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低
D．为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9技术敲除相关抗原蛋白基因
【答案】　C
【解析】　若要对一个基因进行编辑，由于基因含有两条互补的单链，因而通常至少需要设计两个序列不同的sgRNA 与目标DNA的两条链进行配对，A正确；由于DNA和RNA之间可进行碱基互补配对，因而sgRNA可以特异性识别目标DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯键，进而可以将目标基因剪切下来，B正确；sgRNA序列越短，DNA分子上与其互补的特定序列会越多，错误结合概率越高，脱靶率越高，C错误；为降低免疫排斥反应，可通过CRISPR/Cas9技术敲除相关抗原蛋白基因，进而可避免免疫排斥反应发生，为异体器官移植提供保障，D正确。
2. (2024·杭州模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　　)
A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核糖核苷酸、ATP、Taq DNA聚合酶等
B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/4
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于DNA聚合酶识别和结合
D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
【答案】　B
【解析】　在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等，但不需要加入ATP，A错误；在第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以比例为1/4，B正确；引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入载体，避免发生自身环化，C错误；第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。
3. (2024·邵通模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是(　　)
A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板
B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火温度
【答案】　B
【解析】　第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确；第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，C正确；为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，D正确。
4. (2024·兰州模拟)蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图示为这种定点诱变方法的实验流程。据图分析，下列叙述错误的是(　　)
A．待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增
B．用于突变的两条引物之间不能发生碱基互补配对
C．图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点
D．突变质粒缺口补齐依赖于大肠杆菌DNA连接酶的作用
【答案】　B
【解析】　甲基化修饰属于表观遗传的一种，只会影响基因的表达过程，不会影响基因的复制，而PCR扩增的实质就是DNA在体外进行复制，所以待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增，A正确；由图可以看出，用于突变的两条引物之间在第三、四幅图(从左往右)中都进行了碱基互补配对，B错误；由图可以看出，经限制酶切割后，被甲基化修饰的待突变质粒模板被切割(第四幅图虚线的环)，所以图中所示限制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点，C正确；由图可以看出，转入大肠杆菌后突变质粒的缺口被补齐，而大肠杆菌中有DNA连接酶，且DNA连接酶可以进行DNA片段之间的连接，所以突变质粒缺口补齐依赖于大肠杆菌DNA连接酶的作用，D正确。
5. (2024·绵阳模拟)随着CRISPR/Cas9技术的出现，科学家已能在极短时间内对基因进行编辑，更改生命密码，揭示生命的运作原理。科学家研究发现利用这一技术能在许多方面为人类服务，比如利用转基因蚊子达到消灭蚊子的目的。
(1)CRISPR/Cas9系统可以实现对双链DNA的精确切割，由三部分组成：crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白，如图1。crRNA与tracrRNA结合形成sgRNA，sgRNA依据______________________原则与靶向序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割，造成DNA双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发__________________。
(2)研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和同源重组修复技术提高蚊虫群体中雄蚊比例，以达到有效控制雌蚊叮咬人类传播多种传染病的可能。同源重组修复是一种高保真的DNA双链断裂、修复技术，原理如图2，其过程为CRISPR/Cas9基因编辑系统切割使DNA特定部位的________________键断裂后，启动同源修复，使得DNA上的靶向序列被替换成所需序列。通过________________技术将基因表达载体导入蚊子受精卵，该受精卵发育成雄性蚊虫。Cas9蛋白将对应的靶向序列进行切割，以基因表达载体中同源序列间的DNA为模板进行修复，最终实现子代都继承相应基因，使群体中雄蚊比例升高。
(3)除利用转基因灭蚊之外，还存在寄生菌灭蚊技术。当雄蚊被沃尔巴克菌感染后，精子会被细菌产生的毒素污染。健康雌蚊的卵细胞与这些“毒精子”相遇后，产生细胞质不相容效应，导致后代无法正常发育。相对于寄生菌灭蚊，利用转基因灭蚊的优势有_______________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________。(答出两点)
(4)目前我国尚不允许释放转基因蚊虫，请结合已学生物学知识解释原因：________________________________________________________ ________________________________________________________________________________。
【答案】　(1)碱基互补配对　基因突变　(2)磷酸二酯　显微注射
(3)避免引入致病菌，减少污染；能稳定遗传，释放少量蚊虫即可起到控制作用；能够持续起作用
(4)避免基因逃逸或转基因扩散引发的基因污染等问题
【解析】　CRISPR/Cas9基因编辑系统类似基因工程中的限制酶，切割DNA上特定片段后插入目的基因。基因工程中动物细胞一般选择受精卵细胞作为受体细胞。(1)图1中crRNA和tracrRNA结合形成sgRNA，sgRNA通过碱基互补配对原则与图2中的同源序列结合，引导Cas9蛋白对DNA进行切割。细胞在修复断裂的DNA 时会随机插入、删除或替换部分碱基，从而引发基因突变，造成基因结构的改变。(2)CRISPR/Cas9 基因编辑系统切割使 DNA 特定部位的磷酸二酯键断裂后，双链断裂，启动同源修复，使得DNA 上的靶向序列被替换成所需序列。将基因表
达载体导入动物细胞受精卵使用显微注射技术。(3)寄生菌灭蚊技术需要使用致病菌感染雄蚊，污染环境。相对于寄生菌灭蚊，利用转基因灭蚊可以避免引入致病菌，减少污染；能稳定遗传，无须代代操作，释放少量蚊虫即可起到控制作用；能够持续起作用。(4)转基因蚊虫有可能造成基因逃逸，扩散到自然界其他生物，导致基因污染等问题，故目前我国尚不允许释放转基因蚊虫。