专题九
专题练
基础达标测试
一、选择题
1．(2024·邯郸模拟)下列关于泡菜、面包、酸奶等发酵食品的叙述，正确的是( )
A．泡菜坛内的白色菌膜与果酒表面的菌膜中所含菌种相同
B．制作面包和馒头都用到酵母菌，酵母菌产生的酒精与食品松软有关
C．若出现泡菜发酸、面包长霉、酸奶胀袋等情况，则都不能再食用
D．若制作的泡菜咸而不酸，可能的原因是加入食盐过多，抑制了乳酸菌发酵
【答案】 D
【解析】 泡菜坛内的白色菌膜是酵母菌繁殖所致，果酒表面的菌膜是醋酸菌繁殖所致，A错误；制作面包和馒头都用到酵母菌，酵母菌产生的二氧化碳与食品松软有关，B错误；泡菜发酸属于正常现象，是乳酸菌产生的乳酸过多所致，能正常食用，C错误；若制作的泡菜咸而不酸，最可能的原因是大量的食盐抑制了乳酸菌的发酵过程，乳酸产生量减少，D正确。
2．(2024·三明模拟)米酒、酸奶、泡菜等都属于传统发酵制品，下列相关叙述正确的是( )
A．制作米酒时添加“酵头”的目的是接种酿酒酵母
B．米酒发酵液中冒出的“气泡”都来源于酵母菌无氧呼吸
C．酸奶和泡菜制作中均需要及时通氧，保证乳酸菌的有氧呼吸
D．为降低杂菌污染，发酵前需要对器具、原料等进行灭菌
【答案】 A
【解析】 利用酵母菌的无氧呼吸可制作米酒，制作米酒时添加“酵头”的目的是接种酿酒酵母，A正确；米酒发酵液中冒出的“气泡”既来源于酵母菌的无氧呼吸，也来源于酵母菌的有氧呼吸，B错误；酸奶和泡菜的制作利用的微生物是乳酸菌，而乳酸菌是厌氧细菌，因此酸奶和泡菜制作中不需要通氧，要保证乳酸菌的无氧呼吸，C错误；发酵前不能对原料进行灭菌，否则会杀死原料中的发酵菌种，D错误。
3．(2024·漯河模拟)为了检测冰淇淋中的大肠杆菌含量是否超标。下列有关做法正确的是( )
A．配制培养基，高压蒸汽灭菌后，调节pH到弱碱性
B．将冰淇淋溶化后，进行梯度稀释，再用平板划线法进行接种
C．置于37 ℃恒温箱中培养12 h，统计培养基中长出来的菌落数
D．该实验应设置未接种样品的空白对照，以检测培养基是否被污染
【答案】 D
【解析】 配制培养基时，应该先调节pH后灭菌，A错误；要检测冰淇淋中大肠杆菌含量是否超标，应该用稀释涂布平板法接种，B错误；应将培养基置于37 ℃恒温箱中培养24 h，C错误。
4．(2024·临沂模拟)一次性口罩的主要成分为聚丙烯纤维(PP)，某科研团队准备从土壤中筛选出高效降解一次性口罩的细菌。下列操作正确的是( )
A．培养基中应以PP作为唯一碳源
B．挖取的土壤和装土壤的纸袋都无需灭菌
C．只能使用平板划线法进行接种
D．培养时恒温箱的温度控制在50 ℃
【答案】 A
【解析】 实验目的是获得高效降解一次性口罩的细菌，而一次性口罩的主要成分为聚丙烯纤维(PP)，故应用以PP作为唯一碳源的选择培养基，A正确；为了防止杂菌污染，挖取土壤的铁铲和装土壤的纸袋都需灭菌，土壤不用灭菌，B错误；可以用稀释涂布平板法和平板划线法进行接种，C错误；培养时恒温箱的温度控制在30～37 ℃，可以每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，D错误。
5．(2024·廊坊模拟)下列有关细胞工程的叙述，正确的是( )
A．植物细胞工程中，融合叶肉细胞时，应先去除细胞膜，再制备原生质体
B．植物体细胞杂交培育出的新品种一定不是单倍体
C．植物细胞工程中，叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织
D．单克隆抗体制备过程，采用不经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而获得杂交瘤细胞
【答案】 B
【解析】 植物细胞工程中，融合叶肉细胞时，应先用酶解法(纤维素酶和果胶酶)去除细胞壁，再制备原生质体，A错误；单倍体是指含有本物种配子染色体数的个体，而植物体细胞杂交后染色体数目是两个细胞染色体数目之和，肯定不是单倍体，B正确；叶肉细胞经脱分化过程可形成愈伤组织，再分化形成胚状体，C错误；单克隆抗体制备过程中，采用经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而获得杂交瘤细胞，D错误。
6．(2024·襄阳模拟)培育甘蔗脱毒苗有两条途径，经②过程获得的脱毒苗效果更好。下列说法错误的是( )
A．不经过过程②能明显缩短育种年限且获得的脱毒苗都是纯合子
B．过程②能使组织中的病毒减少或减弱其侵染增殖的能力
C．图中脱毒苗的培育过程体现了植物细胞的全能性
D．从过程③到④需要调整所用培养基中某些成分的含量和比例
【答案】 A
【解析】 不经过过程②产生脱毒苗的速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但不能明显缩短育种年限，获得的脱毒苗基因型和原植物体相同，不一定是纯合子，A错误；52 ℃与38 ℃的温度处理使病毒失活或减弱其侵染增殖的能力，B正确；图中脱毒苗的培育过程采用了植物组织培养技术，其体现了植物细胞的全能性，C正确；过程③、④诱导分化形成的器官不同，所用培养基中生长素和细胞分裂素的含量和比例不同，故从过程③到④需要调整所用培养基中某些成分的含量和比例，D正确。
7．(2024·开封模拟)酸性土壤是pH小于7的土壤的总称。如图表示利用耐酸植株甲(4n)和高产植株乙(2n)培育高产耐酸杂种植株的过程(图中序号表示过程或处理手段)，下列相关叙述错误的是( )
A．图示过程中依据的原理主要有细胞膜的流动性、植物细胞的全能性等
B．过程①可将甲、乙植物细胞置于含纤维素酶和果胶酶的等渗溶液中处理
C．过程②可以用PEG诱导，过程③得到的杂种细胞中含有3个染色体组
D．过程④、⑤使用的培养基需加入生长素和细胞分裂素，但加入的比例不同
【答案】 C
【解析】 图示过程为植物体细胞杂交技术，该过程中原生质体融合利用的原理是细胞膜的流动性，植物组织培养利用的原理是植物细胞的全能性，A正确；图中①表示酶解法去除细胞壁获得原生质体的过程，由于原生质体失去了细胞壁的保护会发生失水皱缩或吸水涨破的现象，因此该过程需要在含纤维素酶和果胶酶的等渗溶液中进行，B正确；图中②表示诱导原生质体融合的过程，可以用PEG诱导，产生的杂种细胞中的染色体组数是两种原生质体中染色体组数之和，因此杂种细胞中应该含有6个染色体组，C错误；过程④、⑤表示脱分化和再分化的过程，两个过程的培养基中都需要加入生长素和细胞分裂素，但是这两个过程中两种植物激素的比例不同，D正确。
8．(2024·唐山模拟)利用人类多能干细胞培养的皮肤类器官在培养4～5个月后，形成了多层皮肤组织，包含毛囊、皮脂腺和神经元回路，是迄今最逼真的人皮肤类器官。下列相关叙述正确的是( )
A．多能干细胞形成多层皮肤组织的过程中，遗传物质通常会发生改变
B．多能干细胞培养形成多层皮肤组织，说明了动物的体细胞具有全能性
C．给烧伤病人移植自身多能干细胞培养成的皮肤类器官可减弱免疫排异反应
D．该项研究结果表明多能干细胞可以分化成为人体内所需的各种组织和器官
【答案】 C
【解析】 多能干细胞形成多层皮肤组织的过程中，基因进行了选择性表达，遗传物质并未发生改变，A错误；细胞全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性，多能干细胞形成多层皮肤组织不能体现全能性，B错误；自身多能干细胞培养成的皮肤类器官不会出现排异反应，C正确；研究结果表明多能干细胞能形成多层皮肤组织，包含毛囊、皮脂腺和神经元回路，但不能说明其能分化成各种组织和器官，D错误。
9．(2024·淄博模拟)第三代试管婴儿技术(PGD/PGS)是对早期胚胎细胞进行基因诊断和染色体检测后再进行胚胎移植，流程如图所示。图中检测包括PGD、PGS(PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测)。下列叙述正确的是( )
A．采集的卵子需培养至MⅡ期才能与获能的精子进行受精
B．PGD和PGS技术可分别用于筛选唐氏综合征和红绿色盲
C．进行胚胎移植前需要对夫妻双方进行免疫检查
D．“理想胚胎”需培养至原肠胚期才能植入子宫
【答案】 A
【解析】 体外受精时，需要将所采集到的卵母细胞在体外培养至MⅡ期，才可以与获能的精子完成受精作用，A正确。PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGD可用于筛选红绿色盲；PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测，PGS可用于筛选唐氏综合征，B错误。受体子宫对外来胚胎几乎不发生免疫反应，因此进行胚胎移植前不需要对夫妻双方进行免疫检查，C错误。“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚才能植入子宫，D错误。
10．(2024·佛山模拟)小鼠胚胎干细胞经定向诱导可获得多种具有不同功能的细胞，制备流程如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A．用胰蛋白酶处理a处的细胞后可获得分散的胚胎干细胞
B．欲提高胚胎的利用率，可用胚胎分割技术将a处细胞团均等分割
C．为获得更多的囊胚，采用促性腺激素注射促进雄鼠产生更多的精子
D．a处的细胞与b处的细胞的核基因相同，但mRNA有差异
【答案】 C
【解析】 用胰蛋白酶处理a内细胞团处的细胞后可获得分散的胚胎干细胞，A正确；欲提高胚胎的利用率，可用胚胎分割技术切割囊胚阶段的胚胎，要注意将内细胞团均等分割，B正确；为获得更多的囊胚，应采用激素(促性腺激素)注射促进雌鼠产生更多的卵母细胞(超数排卵)，C错误；a为内细胞团，b为滋养层，a处的细胞与b处的细胞都是由受精卵分裂产生的，含有的基因相同，不同类型的细胞是基因选择性表达的结果，它们的mRNA有差异，D正确。
10．(多选)(2024·佛山模拟)如图所示，科研人员利用诱变方式选育可高产β－胡萝卜素的三孢布拉霉负菌。未突变菌不能在含有β－紫罗酮的培养基上生长。随β－胡萝卜素含量增加，菌体颜色从黄色加深至橙红色。图甲为选育菌种及获得β－胡萝卜素的流程。下列说法正确的是( )
A．要得到图乙所示的菌落，可用稀释涂布平板法进行②过程，然后培养
B．经①过程紫外线照射的三孢布拉霉负菌有的不能在含β－紫罗酮培养基上生长
C．进行③过程时，应选择较小的橙红色菌落中的菌株继续接种培养
D．能在添加β－紫罗酮的乙上长成菌落的细菌，其遗传物质不一定发生改变
【答案】 AB
【解析】 图乙中的菌落均匀分布于平板，说明接种方法是稀释涂布平板法，A正确；①过程紫外线照射的作用是利用物理因素诱导发生基因突变，由于突变具有不定向性，因此被照射的三孢布拉霉负菌不可能都能在含β－紫罗酮的培养基上生长，B正确；橙红色的菌体为高产菌，进行③过程时，应选择较大的橙红色菌落中的菌株继续接种培养，C错误；能在添加了β－紫罗酮的乙上长成菌落的细菌是经过紫外线照射后的高产菌，其遗传物质都发生了改变，D错误。
11．(2024·广安模拟)棉花容易受棉铃虫的侵袭，当棉铃虫大量繁殖后，会使棉花产量大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了能抵御棉铃虫侵害的转基因棉花。图甲有三种限制酶及在目的基因上的切割位点，图乙有三种限制酶的切割位点和标记基因。下列关于限制酶的选择和基因表达载体构建的叙述，正确的是( )
A．选用限制酶SmaⅠ断开目的基因和质粒，构建的基因表达载体更容易成功
B．选用限制酶PstⅠ断开目的基因和质粒，构建的基因表达载体更容易成功
C．选用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ断开目的基因和质粒，构建的基因表达载体更容易成功
D．用一种限制酶或两种限制酶断开目的基因和质粒，构建的基因表达载体都一样成功
【答案】 C
【解析】 选择限制酶SmaⅠ会破坏目的基因和质粒上的标记基因，A错误；用限制酶PstⅠ断开目的基因和质粒，连接的时候容易出现目的基因和质粒的自身环化以及目的基因和质粒的反向连接，B错误；选用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ断开目的基因和质粒，能避免目的基因和质粒的自身环化和它们之间的反向连接，因而成功率更高，C正确；结合以上分析可知，用一种限制酶或两种限制酶断开目的基因和质粒，构建的基因表达载体的成功率是不同的，D错误。
11．(多选)(2024·南通模拟)如图是研究2,4－D对红色金钱柳悬浮细胞生长与花青素合成影响的实验结果。相关叙述正确的是( )
A．细胞悬浮培养的主要原理是愈伤组织细胞分裂旺盛
B．培养基应用葡萄糖、无机盐、激素等配制
C．本实验中2,4－D具有抑制细胞生长的作用
D．结果表明一定浓度的2,4－D会促进花青素的合成
【答案】 ACD
【解析】 愈伤组织是不定形的薄壁组织团块，愈伤组织细胞分裂旺盛，是细胞悬浮培养的主要原理，A正确；愈伤组织的培养基需要添加蔗糖，B错误；2,4－D是生长素类似物，由图可知，生物量随2,4－D浓度的增大而减小，说明本实验中2,4－D具有抑制细胞生长的作用，C正确；当2,4－D的浓度小于0.25 mg·L－1时，花青素的产量高于对照组，说明一定浓度的2,4－D会促进花青素的合成，D正确。
12．(2024·锦州模拟)PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是( )
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
【答案】 C
【解析】 DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，因此与细胞内DNA复制相比所需要的酶最适温度较高，B正确；PCR技术是在较高温度条件下将双链全部打开后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。
12．(多选)(2024·锦州模拟)乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌内催化乳酸生成的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的酵母工程菌株。下图为通过双酶切构建重组质粒的过程。GTG为原核生物偏好的编码起始密码子的序列，ATG为真核生物偏好的编码起始密码子的序列。相关叙述正确的是( )
A．引物1的5′端序列应包含BamHⅠ的识别序列
B．引物1的5′端序列应考虑将GTG改为ATG
C．重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体
D．酵母工程菌培育成功的标志是产生乳酸脱氢酶
【答案】 ABC
【解析】 设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHⅠ的识别序列，A、B正确。结合题意可知，本过程中重组质粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株为受体，然后在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用，C正确。结合题意可知，酵母工程菌培育成功的标志是产生乳酸，D错误。
二、非选择题
13．(2023·全国乙卷部分)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵(酒精发酵)。实验流程如图所示。
回答下列问题：
(1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是___________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________。
(2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是_____________________________ _________________________(答出1点即可)。
(3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是____________________。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是____________________。发酵液中的乙醇可用____________________溶液检测。
(4)本实验收集的淋洗液中的__________可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)菌T能够分泌纤维素酶
(2)为合成微生物细胞结构提供原料
(3)制造无氧环境 排出二氧化碳 酸性的重铬酸钾
(4)葡萄糖 节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广
【解析】 (1)菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解。(2)培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料。(3)果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳。酒精可用酸性重铬酸钾溶液来检测，该物质与酒精反应呈现灰绿色。(4)与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，利用作物秸秆为原料生产乙醇具有节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广等优点。
14．(2024·日照模拟)猕猴桃因貌似猕猴而得名，是一种品质鲜嫩、营养丰富的美味水果。我国研究人员利用“中华猕猴桃”和“美味猕猴桃”两个不同种培育出了更加优良的品种，其过程如图所示。请分析并回答下列问题：
(1)因“中华猕猴桃”和“美味猕猴桃”之间存在____________，所以用有性杂交方法很难得到可育后代，上述①～⑥培育优良品种H的过程所应用的技术是__________________________________技术。
(2)图中B、D是____________；G是____________；②过程需使用____________________酶进行处理，该过程受处理时间、________、________等条件的影响。
(3)过程③使用的化学法包括：聚乙二醇(PEG)融合法和__________________________等。
(4)过程③得到的两两融合的细胞有________种，因此需要进行筛选。已知用X射线处理会使染色体受影响而导致细胞失去分裂能力；用碘乙酰胺处理会使细胞内的酶失活而抑制生长。为了能筛选到杂种细胞F，若在①过程对“中华猕猴桃”用X射线处理，需对“美味猕猴桃”用____________处理，以便最终能获得优良杂种植株H。
【答案】 (1)生殖隔离 植物体细胞杂交和植物组织培养
(2)原生质体 愈伤组织 纤维素酶和果胶 温度 pH
(3)高Ca2＋—高pH融合法
(4)3 碘乙酰胺
【解析】 (1)“中华猕猴桃”和“美味猕猴桃”是两个不同种，它们之间存在生殖隔离，通过①～⑥培育优良品种H的过程所应用的技术是植物体细胞杂交技术和植物组织培养技术。(2)图中B、D是去除细胞壁的原生质体，G为愈伤组织；②过程去除植物细胞壁需使用纤维素酶和果胶酶，酶受到处理时间、温度、pH等因素的影响。(4)过程③将两个不同种的原生质体进行融合，其中两两融合的细胞包括“中华猕猴桃”自身融合和“美味猕猴桃”自身融合以及“中华猕猴桃”和“美味猕猴桃”融合的细胞共3种。X射线处理会使细胞失去分裂能力，碘乙酰胺处理会使细胞内的酶失活而抑制生长，已经对“中华猕猴桃”用X射线处理，需对“美味猕猴桃”用碘乙酰胺处理，它们自身融合的细胞无法生长，只有当两个不同种的原生质体融合时才能生长，从而筛选到杂种细胞F，以便最终能获得优良杂种植株H。
15．(2024·湖南卷)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用____________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用______________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是_____________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________。
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取L，首先选用________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路_______________________________________________ ________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素
(2)花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3)HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL
【解析】 (1)因植物细胞的细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。(3)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。
能力达标测试
一、选择题
1．(2024·盐城模拟)利用微生物发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业利用脱脂大豆、小麦等原料通过发酵装置制作酱油，罐装前经过了严格的灭菌质检。下列有关叙述正确的是( )
A．脱脂大豆中的蛋白质和小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供氮源
B．参与酱油酿造过程的米曲霉、酵母菌和乳酸菌都属于真核生物
C．发酵装置中添加的盐水及产生的酒精、乳酸等均可抑制杂菌生长
D．成品酱油中富含多种微生物，有助于人体对食物中营养物质的消化吸收
【答案】 C
【解析】 淀粉的元素组成是C、H、O，不含N元素，故小麦中的淀粉不能为米曲霉的生长提供氮源，A错误；参与酱油酿造过程的米曲霉、酵母菌都属于真核生物，但乳酸菌属于原核生物，B错误；发酵工程中应注意无菌操作，发酵装置中添加的盐水及产生的酒精、乳酸等均可抑制杂菌生长，C正确；成品酱油罐装前经过了严格的灭菌质检，故成品酱油中不含多种微生物，D错误。
2．(2024·临沧模拟)人们在研究、利用微生物时，需用无菌技术培养获取纯种微生物，并对其进行计数或保存。下列有关叙述正确的是( )
A．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际值低
B．培养基配制过程是计算、称量、溶化、调pH、定容、灭菌、倒平板
C．高压蒸汽灭菌后，打开排气阀，待压力表指针降至“0”后开盖取物
D．获得纯种微生物后，利用涂布平板法接种至斜面培养基上，进行低温保存
【答案】 A
【解析】 用稀释涂布平板法进行微生物计数时，由于两个或多个细菌连在一起常形成一个菌落，因此统计结果往往比实际值低，A正确；培养基配制过程先定容，后调pH，B错误；灭菌后，等压力表指针降至“0”时，打开排气阀排气，打开锅盖，取出灭菌物品，C错误；获得纯种微生物后，利用划线分离法接种至斜面培养基上，进行低温保存，D错误。
3．(2024·洛阳模拟)为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将四个大小相同的分别含有相同浓度抗生素Ⅰ～Ⅳ的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是( )
A．为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中的器材①②③
B．图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C．图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
【答案】 D
【解析】 为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法，该方法需要使用图1中的①酒精灯(操作需要在酒精灯火焰附近进行，用酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌)、③培养基和④涂布器(接种工具)，②接种环是平板划线法接种时需要使用的接种工具，A错误；图2中Ⅱ处抑菌圈最小，说明此处微生物对该药物的敏感度最低，B错误；突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误；不同抗生素在平板上的扩散速度不同，会影响实验结果中抑菌圈的大小 ，D正确。
4．(2024·菏泽模拟)精氨酸依赖型是指谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上正常生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸依赖型菌并进行筛选的过程示意图，过程①将紫外线照射处理过的菌液接种在培养基甲上，培养至菌落不再增加时，平板上的菌落如图所示。过程②向培养基甲中添加某种物质，继续培养。下列相关叙述不正确的是( )
A．野生型菌液的培养皿中不会出现菌落
B．培养基甲中缺少精氨酸，是一种选择培养基
C．菌落A是采用平板划线法接种后培养得到的纯培养物
D．菌落A是野生型菌种，菌落B为鸟氨酸发酵的优良菌种
【答案】 C
【解析】 液体培养基只是用作细菌的快速大量繁殖，如果需要形成菌落，那么应该接种在固体培养基上，因此野生型菌液的培养皿中不会出现菌落，A正确；分析题图可知，甲平板上只有菌落A(野生型菌落)，过程②向培养基甲中添加精氨酸后出现B菌落，说明培养基甲中缺少精氨酸，是一种选择培养基，B正确；菌落A是采用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果，C错误；菌落A是野生型菌种，菌落B为精氨酸依赖型菌株，可作为鸟氨酸发酵的优良菌种，D正确。
5．(2024·烟台模拟)关于动物细胞培养和植物细胞培养，下列说法正确的是( )
A．动物细胞培养的原理是细胞增殖，植物细胞培养的原理是植物细胞的全能性
B．动物细胞培养需在培养基中添加血清等天然成分，还需添加琼脂以便于动物细胞贴壁生长
C．与植物细胞培养过程中细胞生长状态类似，一部分动物细胞也可以悬浮在培养液中生长
D．植物细胞培养的目的主要是获得植物生长和生存所必需的次生代谢物
【答案】 C
【解析】 动物细胞培养的原理是细胞增殖，植物细胞培养的原理也是细胞增殖，A错误；动物细胞培养需在培养基中添加血清等天然成分，不需要添加琼脂，需要用液体培养基，B错误；体外培养的动物细胞可以分为两大类：一类细胞能够悬浮在培养液中生长增殖；另一类则需要贴附于某些基质表面才能生长增殖，C正确；植物细胞培养的主要目的是通过大规模的细胞培养，以获得人类所需的细胞次生代谢物，D错误。
6．(2024·西安模拟)如图是研究2,4－D对红色金钱柳悬浮细胞生长与花青素合成影响的实验结果。相关叙述错误的是( )
A．细胞悬浮培养的主要原理是愈伤组织细胞分裂旺盛
B．培养基应用葡萄糖、无机盐、激素等配制
C．本实验中2,4－D具有抑制细胞生长的作用
D．结果表明一定浓度的2,4－D会促进花青素的合成
【答案】 B
【解析】 愈伤组织是不定形的薄壁组织团块，愈伤组织细胞分裂旺盛，是细胞悬浮培养的主要原理，A正确；将愈伤组织接种到含有特定激素的培养基上，就可以诱导其再分化成胚状体，长出芽和根，进而发育成完整的植株，愈伤组织的培养基需要添加蔗糖，B错误；2,4－D是生长素类似物，由图可知，生物量随2,4－D浓度的增大而减小，说明本实验中2,4－D具有抑制细胞生长的作用，C正确；当2,4－D的浓度小于0.25 mg·L－1时，花青素的产量高于对照组，说明一定浓度的2,4－D会促进花青素的合成，D正确。
6．(多选)(2024·西安模拟)当前生物技术发展非常迅猛，很多生物技术的应用已经与我们的日常生活密切相关。下列有关生物技术的说法或做法正确的是( )
A．消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面
B．我国坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验
C．对囊胚进行胚胎分割时，必须对整个胚胎进行均等分割
D．胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理
【答案】 ABD
【解析】 生物武器威胁巨大，消除生物武器威胁、防止生物武器扩散是生物安全防控的重要方面，A正确；我国对待克隆人的态度：坚决反对克隆人，不允许进行任何生殖性克隆人实验，B正确；对囊胚进行胚胎分割时，必须对内细胞团进行均等分割，C错误；胚胎工程繁育良种时，供体和受体母畜都要进行同期发情处理，保证胚胎移植入相同的生理环境，D正确。
7．(2024·杭州模拟)亨廷顿舞蹈病是一种由于亨廷顿蛋白(HTT)基因突变所导致的疾病。我国科学家利用基因编辑技术(CRISPR/Cas9)，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈病的基因“敲入”猪模型，操作过程如图所示。下列说法不正确的是( )
A．上述操作过程的原理有基因重组、动物细胞核全能性等
B．过程②为动物细胞融合技术，通常采用灭活病毒诱导
C．过程④为胚胎分割，该技术的关键是将内细胞团均等分割
D．基因“敲入”猪模型所携带的人突变HTT基因可遗传给后代
【答案】 B
【解析】 上述操作中基因编辑技术的原理是基因重组，过程①、②是细胞核移植技术，体现的生物学原理是动物细胞核的全能性，A正确；过程②是将成纤维细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，所利用的生物技术是细胞核移植技术，B错误；过程④为胚胎分割，该技术的关键是将内细胞团均等分割，否则影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，C正确；基因“敲入”猪模型所携带的人突变HTT基因属于基因重组，可遗传给后代，D正确。
8．(2024·泰安模拟)我国科学家成功地用iPS细胞克隆出了活体小鼠，部分流程如图所示，其中Kdm4d为组蛋白去甲基化酶，TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂。下列说法正确的是( )
A．组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程
B．①过程的小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞突变为iPS细胞
C．③过程中使用有活性的病毒处理的目的是诱导细胞融合
D．图示流程运用了重组 DNA、体细胞核移植、胚胎移植等技术
【答案】 A
【解析】 结合题图，重构胚中在加入Kdm4d的mRNA和TSA后，发育成克隆鼠，而Kdm4d的mRNA表达产物为组蛋白去甲基化酶，可以使组蛋白去甲基化，TSA为组蛋白脱乙酰酶抑制剂，起抑制组蛋白脱乙酰酶的作用，保持组蛋白乙酰化，即组蛋白乙酰化和去甲基化有利于重构胚后续的胚胎发育过程，A正确；①过程的小分子化合物诱导小鼠成纤维细胞脱分化为iPS细胞，并未发生突变，B错误；③体细胞核移植技术，应用显微注射方法，C错误；图示流程运用了体细胞核移植、胚胎移植等技术，并未运用重组 DNA技术(基因工程中核心技术)，D错误。
9．(2024·随州模拟)在体细胞克隆猴培育过程中，为调节相关基因的表达，提高胚胎的发育率和妊娠率，研究人员将组蛋白去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入了重构胚，同时用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(TSA)处理，具体培育流程如图所示。下列说法正确的是( )
A．选择胎猴的体细胞进行核移植的理由是动物胚胎细胞分化程度高，表现全能性相对容易
B．卵母细胞在去核环节实际操作中被去除的不是核膜包被的细胞核，而是纺锤体—染色体复合物
C．使用Kdm4d的mRNA和TSA处理重构胚都不利于重构胚的分裂和发育
D．为得到遗传背景相同的克隆猴用于科研，可用机械方法将早期胚胎随机切割成2份或4份后再进行胚胎移植
【答案】 B
【解析】 选择胎猴的体细胞进行核移植是因为动物胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易，A错误；将卵母细胞培养到减数分裂Ⅱ中期后进行去核操作，此时的去“核”事实上是去除卵母细胞中的纺锤体—染色体复合物，B正确；将组蛋白去甲基化酶(Kdm4d)的mRNA注入重构胚，同时用组蛋白脱乙酰酶抑制剂(TSA)处理重构胚，这样可降低组蛋白的甲基化水平，提高组蛋白的乙酰化水平，从而改变组蛋白的表观遗传修饰来调控基因表达，激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，提高了胚胎的发育率和妊娠率，C错误；为得到遗传背景相同的克隆猴用于科研，可用机械方法将早期胚胎均匀切割成2份或4份后再进行胚胎移植，随机切割会影响胚胎的恢复和进一步发育，D错误。
10．(2024·通化模拟)染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段。据此分析，下列有关叙述错误的是( )
A．凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来
B．染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用
C．构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸
D．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关
【答案】 C
【解析】 凝胶中的DNA分子经染色后，对波长为300 nm的紫外光吸收性强，可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，A正确；由图可知，染色质用核酸酶处理后，得到是部分水解的染色质，但若先将染色质中的蛋白质去掉后用核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段，说明染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用，B正确；染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的，核小体的组成成分是蛋白质和DNA，其基本单位是脱氧核糖核苷酸和氨基酸，C错误。
10．(多选)(2024·通化模拟)马奶酒是“蒙古八珍”之一，其中发酵型奶酒是利用某些微生物将马奶中的乳糖水解成单糖1和单糖2，酵母菌再利用这些单糖发酵产生酒精，从而制成马奶酒。科研人员分别利用野生型酵母菌和马奶酒中酵母菌研究其发酵情况，结果如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．乳糖属于二糖，其元素组成是C、H、O
B．14～16 h时，野生型酵母菌内可能正在进行单糖2发酵相关基因的表达
C．与野生型酵母菌相比，马奶酒中酵母菌完成酒精发酵用时更短
D．在发酵过程中，两种类型的酵母菌细胞内均存在[H]的积累
【答案】 ABC
【解析】 乳糖是二糖，元素组成为C、H、O，A正确；由野生型酵母菌的发酵情况可知，0～14 h单糖1含量减少直至耗尽，单糖2含量基本不变，酒精浓度增加，此时利用单糖1进行发酵，14～16 h时，酒精浓度基本不变，16～22 h酒精浓度增加，单糖2浓度减少，故可推知14～16 h时，野生型酵母菌可能正在进行单糖2发酵相关基因的表达，以利用单糖2进行发酵，B正确；马奶酒中酵母菌完成酒精发酵的时间约为14 h，野生型酵母菌完成酒精发酵的时间约为22 h，C正确；酒精发酵即无氧呼吸，无氧呼吸第一阶段产生的[H]用于无氧呼吸第二阶段，两种类型的酵母菌内均不存在[H]的积累，D 错误。
11．(2024·珠海模拟)如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的结合位置如图甲所示，限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 在质粒上的识别位点如图乙所示。下列说法中错误的是( )
A．PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个
B．若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因
C．过程①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒
D．对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境
【答案】 B
【解析】 PCR 技术大量扩增目的基因时，缓冲液中需要加入的引物个数计算公式为2n＋1－2(n为循环次数)，因此PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物24＋1－2＝30(个)，A正确；由于DNA聚合酶只能从5′端→3′端延伸子链，因此扩增目的基因时应选择引物1和4，B错误；①是基因表达载体的构建过程；若使用限制酶EcoRⅠ切割质粒会将目的基因插入启动子上游，目的基因不能正确表达；使用限制酶Hind Ⅲ切割质粒将破坏标记基因，不利于目的基因的鉴定和筛选，因此该过程中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒，C正确；为了防止污染环境，对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，D正确。
11．(多选)(2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
【答案】 AC
【解析】 利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确；电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误；依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)是3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5′－CTACCCGTGAT－3′，患者的测序结果为5′－CTACCTGTGAT－3′，C正确；对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。故选AC。
12．(2024·信阳模拟)亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状。研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880 kb至～903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示。下列说法错误的是( )
A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR
B．上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的
C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小
D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变
【答案】 A
【解析】 由于8号染色体的～880 kb至～903 kb区间与突变体甲的光籽表型相关，故应提取突变体甲和野生型的8号染色体上的DNA进行扩增，A错误；图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，主要依据分子量不同，采用外加电场使其分开，B正确；由图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较小，C正确；根据野生型和突变体甲经引物6扩增的产物不同可知，8号染色体上的第6对引物对应的区间发生基因突变是甲光籽性状出现的根本原因，D正确。
12．(多选)(2024·信阳模拟)亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状。研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880 kb至～903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如图所示。下列说法错误的是( )
A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR
B．上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的
C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较远
D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变
【答案】 AC
【解析】 由于8号染色体的～880 kb至～903 kb区间与突变体甲的光籽表型相关，故应提取突变体甲和野生型的8号染色体上的DNA进行扩增，A错误；图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，主要依据分子量不同，采用外加电场使其分开，B正确；由图可知，分子量较大的扩增产物迁移速率慢，与点样处的距离较近，C错误；根据野生型和突变体甲经引物6扩增的产物不同可知，8号染色体上的第6对引物对应的区间发生基因突变是甲光籽性状出现的根本原因，D正确。
二、非选择题
13．(2024·六安质检)芳香黄杆菌是食品行业常见的弹性蛋白酶产生菌，弹性蛋白酶具有良好的嫩化作用，通过处理难以食用的韧带、筋腱等蛋白原料，丰富了食物资源，提高了农副产品的深加工。芳香黄杆菌初筛培养基的部分配方如下表：
弹性蛋白 0.8 g
酵母膏 0.1 g
葡萄糖 0.1 g
KH2PO4 0.05 g
K2HPO4 0.01 g
MgSO4·7H2O 0.01 g
琼脂 2 g
(1)根据表中配方及物理性质分析，该培养基属于________培养基，为芳香黄杆菌提供主要氮源的物质是______________________________________________ ____________________________________________。
(2)为了提高弹性蛋白酶生产菌株的产量，需借助一定的方法优化菌种，常见的弹性蛋白酶生产工艺如图所示：
①接种前，应用__________________法对初筛培养基进行灭菌处理，由图可知，将菌悬液接种到初筛培养基的方法是____________________。
②高通量筛选是微生物菌种选育过程中常用的筛选技术，它以微孔板为载体，将诱变后培养得到的单菌落接种到含有发酵培养基的微孔板中培养，可以实现同一时间检测上万份产物产量的目标，据此分析弹性蛋白酶生产工艺中进行Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的目的是________________________________________________。发酵培养基选用液体培养基的主要目的是___________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)固体 弹性蛋白和酵母膏
(2)①高压蒸汽灭菌 稀释涂布平板法 ②通过高通量筛选技术快速得到弹性蛋白酶高产菌株(得到大量弹性蛋白酶高产菌株) 增大芳香黄杆菌(目的菌株)的浓度
【解析】 (1)根据表中配方，该培养基含有琼脂，琼脂属于凝固剂，故根据物理性质分析，该培养基属于固体培养基。蛋白质来源于动物原料和有机氮等营养物质，表中的弹性蛋白和酵母膏可为微生物生长提供氮源。(2)①微生物培养应注意营造无菌环境，接入菌种前，应对初筛培养基进行灭菌处理，一般采用高压蒸汽灭菌法处理。题图中初筛培养基上的菌落分布比较均匀，说明接种方法为稀释涂布平板法。②据题图分析，图示过程多次重复Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ过程，不断重复初筛和高通量筛选，其主要目的是通过高通量筛选技术快速得到大量弹性蛋白酶高产菌株。发酵培养基选用液体培养基能增大目的菌种与培养液中营养物质的接触，利于目的菌种生长和繁殖，从而增大芳香黄杆菌(目的菌株)的浓度。
14．(2024·潍坊模拟)靶向治疗是目前治疗肿瘤的有效方法之一，其原理是利用抗体等特异性物质作为载体，将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤，其作用原理如图1所示。为了生产能同时与药物和肿瘤细胞抗原结合的抗体，科学家创造了制备双特异性抗体的方法，过程如图2所示。请据图分析回答下列问题：
(1)由图1可以看出，抗体是由________条肽链构成的蛋白质，细胞内合成抗体时，其空间结构形成的场所主要是________。
(2)图2中①过程是给小鼠注射__________________________，从而获得已免疫的B淋巴细胞。
(3)为选出能产生专一抗体的细胞，要从HAT培养基上筛选出杂交瘤细胞，然后稀释滴入多孔培养板中，使多孔培养板每孔中有一个细胞，然后筛选出抗体检测呈________(填“阳性”或“阴性”)的细胞进行克隆化培养；该克隆化培养细胞具有的特点为______________________________________________________ _______________________________。
(4)图中⑤过程给小鼠注射抗肿瘤药物的目的是______________________，图2方框内的主要操作是__________________________________________________ ___________________________________________________________________________________________________。
(5)与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，对人体的副作用更小，原因是双特异性单克隆抗体能___________________ ________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1) 4 内质网
(2)癌细胞抗原(肿瘤细胞抗原)
(3)阳性 既能无限增殖，又能产生特异性抗体
(4)刺激小鼠产生相应的B淋巴细胞 将B淋巴细胞与单克隆杂交瘤细胞融合
(5)将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤
【解析】 (1)由图1可知，抗体含有4条肽链，肽链之间以二硫键相连。抗体的化学本质是蛋白质，合成场所是核糖体，需要经过内质网的加工才能形成特定的空间结构。(2)①过程表示用癌细胞抗原对小鼠进行免疫处理，获得已免疫的B淋巴细胞。(3)制备单克隆抗体的过程中，需要经过两次筛选，第一次是用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，第二次是用专一抗体检测，检测出呈阳性的细胞即能产生针对癌细胞抗原的杂交瘤细胞，进行克隆化培养。该细胞既可以无限增殖，又可以产生特定抗体。(4)⑤过程给小鼠注射抗肿瘤药物是为了刺激小鼠产生相应的B淋巴细胞，方框内表示将B淋巴细胞与单克隆杂交瘤细胞融合，进而筛选出能产生双特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。(5)双特异性单克隆抗体能同时与药物和肿瘤细胞抗原结合，将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤，与直接使用抗肿瘤药物相比，对人体的副作用更小。
15．(2024·常州模拟)花椰菜(2n＝18)，对黑腐病无抗性。黑芥(2n＝16)为花椰菜近缘野生种，对黑腐病等多种常见病害具有抗性。我国科学家用花椰菜下胚轴细胞和黑芥叶肉细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得抗黑腐病的杂合新植株。回答下列问题：
(1)在获取原生质体时，科学家利用含有____________________酶的蜗牛消化道提取液来降解细胞壁。
(2)植物组织培养常用MS培养基，该培养基中添加蔗糖的作用是______________________________________________________________。与微生物培养基的营养成分相比，诱导愈伤组织的培养基除了添加糖类，还应该添加________。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。融合细胞再生为完整植株的根本原因是__________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________。
(4)理论上获得的杂种植株染色体数目为______________，科学家对部分杂合新植株的染色体进行计数，结果如表所示。
植株 杂合新植株H1 杂合新植株H2 杂合新植株H3
染色体数/条 58 19 30
推测产生上述现象的原因是__________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________。
(5)写出鉴定抗黑腐病植株的方法_____________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)纤维素酶和果胶
(2)提供合成其他有机物的原料和能源、维持细胞渗透压 植物激素
(3)融合细胞含植株生长、发育的全套遗传信息
(4)34(条) 细胞融合是随机的，可能存在多个细胞融合，融合过程中可能存在染色体丢失
(5)对杂种植株进行黑腐病接种实验
【解析】 (1)细胞壁成分主要是纤维素和果胶，因此在获取原生质体时，可利用含有纤维素酶和果胶酶的蜗牛消化道提取液来降解细胞壁。(2)植物组织培养常用MS培养基，其中培养基中添加蔗糖的作用是提供合成其他有机物的原料和能源、维持细胞渗透压。另外诱导愈伤组织的培养基除了添加糖类，还应该添加植物激素。(3)由于融合细胞含植株生长、发育的全套遗传信息，因此融合细胞可以发育为完整植株。(4)理论上获得的杂种植株染色体数目为16＋18＝34条，但杂合新植株H1染色体数目大于34，H2、H3染色体数目小于34，原因可能是细胞融合是随机的，可能存在多个细胞融合，融合过程中可能存在染色体丢失。(5)鉴定抗黑腐病植株的方法：对杂种植株进行黑腐病接种实验，观察杂种植株是否患黑腐病。
16．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和__________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备____________________。
(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了______________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约___________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
【答案】 (1)野生型
(2)(运)载体 启动子和终止子
(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100 见解析图
【解析】 (1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和(运)载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，如图：
21世纪教育网(www.21cnjy.com)(共106张PPT)
专题九 生物技术与工程
第三讲 基因工程与生物技术的安全性和伦理问题
9.1 基因工程是一种重组DNA技术
9.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的
9.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具
9.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
9.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
9.2 蛋白质工程是基因工程的延伸
9.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质
9.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程
10.1 转基因产品的安全性引发社会的广泛关注
10.1.1 举例说出日常生活中的转基因产品
10.1.2 探讨转基因技术在应用过程中带来的影响
10.2 中国禁止生殖性克隆人
10.2.1 举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题
10.2.2 分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
10.3 世界范围内应全面禁止生物武器
10.3.1 举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害
10.3.2 认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散
1．利用PCR扩增目的基因需使用解旋酶。 ( )
提示：× PCR扩增是通过高温使DNA解旋为单链。
2．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是延伸。 ( )
提示：× PCR过程中温度最低的一步是复性(退火)。
3．限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。 ( )
提示：× 限制酶断开特定部位的磷酸二酯键。
4．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒。 ( )
提示：× 基因工程中真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
5．构建基因表达载体过程中通常用同种限制酶切割质粒和目的基因。 ( )
提示：√
6．基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。 ( )
提示：√
7．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C导入菊花中，用PCR等技术检测C基因是否整合到菊花染色体上。 ( )
提示：√
8．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动。 ( )
提示：× 电泳时，带电微粒会向着与其所带电荷相反的电极移动。
9．农杆菌中的Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上。 ( )
提示：× 农杆菌中的Ti质粒上只有T－DNA区段可整合到受体细胞染色体上。
10．DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液。 ( )
提示：√
11．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 ( )
提示：× 蛋白质工程直接改造的对象是DNA分子。
12．基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域是微生物基因工程。 ( )
提示：√
13．理性看待转基因技术，最重要的是要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 ( )
提示：√
14．我国对转基因技术的方针是研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。 ( )
提示：√
15．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者体内，进行基因治疗，不会遗传给子代。 ( )
提示：√
16．转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中。 ( )
提示：× 转基因作物被动物食用后，各种大分子会被消化分解为小分子物质，目的基因并不会转入动物体细胞中。
17．“设计试管婴儿”与“试管婴儿”技术没有什么不同。 ( )
提示：× “设计试管婴儿”会在胚胎植入前进行遗传学诊断；“试管婴儿”只要胎儿健康即可，一般不需要进行遗传学诊断。
18．转基因培育的植物，理论上目的基因只存在于特定的组织中。 ( )
提示：× 转基因培育的植物，目的基因存在于植物含有遗传物质的所有体细胞中，但是不一定在每一个细胞中表达。
19．生物武器是造价昂贵，却具有大规模杀伤性的武器。 ( )
提示：× 生物武器相对容易获得，成本相对较低。
20．种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的基因多样性。 ( )
提示：√
1.博耶和科恩将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明：____________________________________________________________。
2．目前，在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶，而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因：________________________________________
____________________________。
3．构建基因表达载体的目的是_______________________________ ____________________________________________________________。
体外重组的质粒可以进入细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
Taq DNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用
4．不能将目的基因插入载体的标记基因中，是因为___________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
5．启动子的位置和生物作用：______________________________ ____________________________________________________________________________。
6．农杆菌转化法中农杆菌的作用：__________________________ ____________________________________________________________。
标记基因可用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行后续的鉴定和筛选
启动子是位于基因上游一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA
农杆菌可侵染植物细胞，并将其所含的Ti质粒上的T－DNA转移并整合到受体细胞染色体的DNA上
7．通过对基因进行操作来实现对天然蛋白质的改造的原因有_____ __________________________________________________________________________________________________________________________。
8．常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________________ __________________________________________________。
蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；改造后的基因可以遗传给下一代，直接对蛋白质进行改造无法遗传给后代
获取蛋白S基因→构建蛋白S基因与载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定(检测受体能否产生蛋白S)
核心考点一
基因工程
1.基因工程的理论基础
2.基因工程的基本工具
3.基因工程的操作程序
4.PCR技术的过程
5.DNA的粗提取与鉴定
6.DNA片段的电泳鉴定
7.基因工程的应用
(1)在农牧业方面：改良动植物品质；提高作物和畜产品的产量。
(2)医药卫生领域：生产药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等；用转基因动物作器官移植的供体。
注意重点关注“乳腺生物反应器”：①外源基因：药用蛋白基因；②表达条件：药用蛋白基因＋乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件；③受体细胞：哺乳动物的受精卵。
(3)食品方面的应用：生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。
(4)基因工程在其他方面的应用：培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染；利用经过基因改造的微生物生产能源等。
常考题型一 基因工程的工具和过程
1. (2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(I～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________ _______________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是______________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是__________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是__________________________(答出2点即可)。
【答案】 (1)磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达 (2)C—G、A—T、U—A (3) N基因的两条链 不能扩增出目的基因 (4)不污染环境、增加土壤养分
【解析】 (1)限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常表达。(2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。(3)用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是不污染环境、增加土壤养分。
2. (2024·辽宁卷)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_________ _______________________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是__________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是______________________和________________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是_____________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________________________________________________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用____________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是____________和____________。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1—1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1—1362合成基因序列和1363—1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
【答案】 (1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
(2)PCR技术扩增 人工合成
(3)RNA聚合酶识别并结合的部位 同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性
(4)HygBR (5)F3 R2 (6)D
【解析】 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是同时实现两个目的基因的共同表达及调控，从而降低基因工程的成本与复杂性。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检
测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是用1—1362合成基因序列和1363—1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白，将1—1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列，未产生新的蛋白质，不属于蛋白质工程。A、B、C不符合题意，D符合题意。故选D。
3. (2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是____________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是____________。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________________________________________________ _______________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______________________________。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是__________________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是___________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________________________________________________________。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
【答案】 (1)变性 氢键
(2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4 DNA连接酶
(3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸
【解析】 (1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。(2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4 DNA连接酶连接。(3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，
可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸。
4. (2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________ __________________启动子。Nos为终止子，其作用为____________________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用____________的方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测__________________，通过____________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为____________。选择纯合体进行后续研究的原因是__________________ _______________________________________。
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的____________免疫和____________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是___________ _______________________________。(答出两点即可)
【答案】 (1)水稻胚乳细胞中特异性表达的 使转录在需要的地方停下来 HindⅢ EcoRⅠ (2)农杆菌转化 r2HN基因的mRNA 抗原—抗体杂交
(3)1/4 纯合体自交后代不发现性状分离 (4) 体液 细胞
(5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
【解析】 (1)利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，水稻胚乳细胞启动子在水稻胚乳细胞中更容易被RNA聚合酶识别和结合而驱动转录。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnⅠ破坏了启动子序列不能选用，SacⅠ位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录的r2HNmRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋
白。(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株，则相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。(4)据题图可知，实验组的抗体水平和CD8＋T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以筛选出转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
常考题型二 PCR技术与电泳技术
5. (2024·辽宁卷)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( )
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
【答案】 A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段向正极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。故选A。
6. (2024·山东卷)制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有( )
反应管 加入的单链DNA
① 5′－GCCGATCTTTATA－3′3′－GACCGGCTAGAAA－5′
② 5′－AGAGCCAATTGGC－3′
③ 5′－ATTTCCCGATCCG－3′3′－AGGGCTAGGCATA－5′
④ 5′－TTCACTGGCCAGT－3′
A．①② B．②③
C．①④ D．③④
【答案】 D
【解析】 ①反应管的两条链互相结合后，短缺的部分为5′端，无法合成和延伸；②反应管的该单链之间互相结合后，短缺的部分为3′端，但是合成和延伸的部分不含腺嘌呤脱氧核苷酸，不带有荧光标记；③反应管两条链互相结合后，短缺的部分为3′端，合成和延伸的部分含腺嘌呤脱氧核苷酸，带有荧光标记；④反应管的该单链之间互相结合后，短缺的部分为3′端，合成和延伸的部分含腺嘌呤脱氧核苷酸，带有荧光标记，④正确。故选D。
7. (2024·浙江6月卷)阅读下列材料，完成下面小题。
疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。
(1)下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是( )
A．F1－R1引物可用于特异性地扩增目的片段
B．F1－R2引物不能用于特异性地扩增目的片段
C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用
D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段
(2)为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样，处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。
1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是( )
A．1号和6号 B．2号和4号
C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号
【答案】 (1) D (2)B
【解析】 (1)根据图乙结果显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确；根据图乙信息可知，F1－R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确；根据图乙信息可知，F1－R1能扩增目的1条带，F2－R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确；根据图乙显示可知，F1－R1引物只扩增出一条片段，F1－R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。故选D。
(2)根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组中没有ApoⅠ酶切位点，而在敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1～6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，A、C、D错误。故选B。
8. (2024·浙江1月卷)小鼠毛囊中表达F蛋白。为研究F蛋白在毛发生长中的作用，利用基因工程技术获得了F基因敲除的突变型纯合体小鼠，简称f小鼠，突变基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠长50%，表现出毛绒绒的样子，其它表型正常。(注：野生型基因用＋＋表示；f杂合子基因型用＋f表示)
回答下列问题：
(1)F基因敲除方案如图甲。在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生__________________，导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质因为缺失了______________________而丧失活性。要达到此目的，还可以对该基因的特定碱基进行____________和____________。
(2)从野生型、f杂合子和f小鼠组织中分别提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，进行琼脂糖电泳，用DNA探针检测。探针的结合位置如图甲，检测结果如图乙，则f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第________泳道和第________泳道。
(3)g小鼠是长毛隐性突变体(gg)，表型与f小鼠相同。f基因和g基因位于同一条常染色体上。f杂合子小鼠与g小鼠杂交，若杂交结果是______________________，则g和f是非等位基因；若杂交结果是________________________，则g和f是等位基因。(注：不考虑互换；野生型基因用＋＋表示；g杂合子基因型用＋g表示)
(4)确定g和f为等位基因后，为进一步鉴定g基因，分别提取野生型(＋＋)、g杂合子(＋g)和g小鼠(gg)的mRNA，反转录为cDNA后用(2)小题同样的DNA探针和方法检测，结果如图丙。g小鼠泳道没有条带的原因是____________________________________________________。组织学检查发现野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，因此推测F蛋白具有的作用______________。
【答案】 (1)编码序列错位 氨基酸序列 替换 缺失 (2)3 2
(3)子代全为野生型 野生型∶突变型＝1∶1
(4)基因突变丢失了启动子，导致无法转录出 mRNA；反转录没有产物，检测不出结果 抑制毛发生长
【解析】 (1)依据题意，在F基因的编码区插入了一个DNA片段P，引起F基因产生编码序列错位，从而导致mRNA提前出现终止密码子，使得合成的蛋白质中氨基酸序列变短，蛋白质结构发生改变，结构决定功能，导致合成的蛋白质丧失活性。该基因突变是插入一个DNA片段引起的，除此之外，还可以缺失或者替换基因中的碱基，从而导致基因突变。(2)从图中看出，野生型基因和f基因都含有2个限制酶HindⅢ的识别序列，但f基因中含有P片段，因此限制酶HindⅢ切割野生型基因和f基因后，野生型基因切出来能与探针结合的片段较短，f基因切出来能与探针结合的片段较长，DNA分子越长，分子质量越大，在电泳时迁移
速度越慢，因此推测第1泳道中只有野生型基因，第2泳道中既有野生型基因，又有f基因，第3泳道中只有f基因，因此f小鼠和f杂合子对应的DNA片段分别位于第3泳道和第2泳道。(3)据题意可知，野生型基因用＋＋表示，g小鼠是长毛隐性突变体，基因型用gg表示，f杂合子小鼠基因型用＋f表示，f基因和g基因位于同一条常染色体上，如果g和f是非等位基因，f杂合子小鼠(＋f/＋＋)与g小鼠(＋＋/gg)杂交，后代为＋＋/＋g和＋f/＋g，全是野生型；如果g和f是等位基因，f杂合子小鼠(＋f)与g小鼠(gg)杂交，后代为＋g∶fg＝1∶1，即野生型与突变型比例为1∶1。(4)据图可知，野生型基因突变成g基因以后，启动子随着一部分DNA片段丢
失，无法转录出 mRNA，也无法形成cDNA，PCR时缺少模板，反转录没有产物，导致最终无结果，因此g小鼠泳道没有条带。g小鼠表型与f小鼠相同，表现出毛绒绒的样子，野生型和g杂合子表达F蛋白，g小鼠不表达F蛋白，即没有F蛋白，表现出长毛，说明F蛋白在毛发生长中起抑制作用。
引物设计主要遵循如下原则
1.引物的长度通常为20～30个核苷酸，太短则特异性不够强，太长则退火温度会比较高。
2.引物G＋C含量以40%～60%为宜，太少扩增效果不佳，过多则易出现非特异条带，4种碱基最好随机分布。
3.两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链得不到目的基因片段。
4.一条引物自身不能有大于4个碱基的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可形成发夹结构。如果这种结构在PCR条件下稳定，它会阻止引物和模板之间的退火。
5.设计的引物在合成之前，要在DNA数据库中进行BLAST检测，以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现，而与其他基因不具有互补性。
核心考点二
蛋白质工程和生物技术的安全性和伦理问题
1.蛋白质工程
(1)基本思路：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
(2)蛋白质工程难度很大的原因：蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。
(3)对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成来实现。
2.生物技术的安全性与伦理性
(1)转基因产品的安全性
②理性看待转基因技术。
(2)生殖性克隆人的伦理问题
①治疗性克隆与生殖性克隆的关系
类型
项目 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用于医学研究和治疗 利用克隆技术产生独立生存的新个体，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生的新细胞、组织、器官或新个体，遗传信息相同
②中国政府态度：不反对治疗性克隆，反对生殖性克隆。
(3)试管婴儿和设计试管婴儿的比较
①图示过程中①②③是试管婴儿的培育过程，①②④⑤是设计试管婴儿的培育过程。
②后者比前者多了胚胎移植前的“遗传学诊断”或“基因检测”。
③前者主要是解决不孕夫妇的生育问题，后者可用于白血病、贫血症等的治疗。
④相同点：都是体外受精，并进行体外胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
(4)禁止生物武器
①生物武器的种类：致病菌、病毒、生化毒剂等。
②中国政府的态度：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
常考题型一 蛋白质工程
1. (2022·重庆卷)将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是( )
A．进入人体后需经高尔基体加工 B．比人胰岛素多了2个肽键
C．与人胰岛素有相同的靶细胞 D．可通过基因工程方法生产
【答案】 A
【解析】 胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误；人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确；人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确；人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。
2. (广东卷)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是( )
A．合成编码目的肽的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽
D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽
【答案】 C
【解析】 蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质(目的肽多肽药物)的功能(抗菌性强但溶血性弱)出发→设计预期蛋白质的空间结构→推测应有的氨基酸序列(即C项表述)→合成相应的基因(即A项表述)→构建相应的基因表达载体(即B项表述)→导入受体细胞，相应基因的表达与鉴定(即D项表述)。从中可看出，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽，故选C。
3. (2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是______________________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有____________________________、_________________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是______________ ___________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是__________________________________________ ________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路______________ _________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性
(2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA半保留复制
(3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【解析】 (1)据题图可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后
下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
4. (2022·天津卷)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。
据图回答：
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有________个。
(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是_________。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成________种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽—重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是_____ ______________________________________________________________________________________________________________________。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有_________。
A．B细胞 B．T细胞
C．吞噬细胞 D．浆细胞
【答案】 (1)6 (2)ABCD (3)3 (4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 (5)AB
【解析】 (1)从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。(2)要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，
故选ABCD。(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。(4)乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。(5)人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。
蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
区别 过程 预期的蛋白质功能 →设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得蛋白质 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
项目 蛋白质工程 基因工程
区别 实质 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 生产自然界中没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过改造或合成基因实现
常考题型二 生物技术的安全性和伦理问题
5. (2024·浙江1月卷)关于生物技术的安全与伦理问题在我国相关法规明令禁止的是( )
A．试管动物的培育 B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆的研究 D．生物武器的发展和生产
【答案】 D
【解析】 试管动物的培育属于胚胎工程，没有禁止，A正确；我国目前不反对转基因的食品的生产，B正确；中国政府禁止生殖性克隆，支持治疗性克隆，C正确；生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D错误。故选D。
6. (江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是( )
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】 D
【解析】 将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。
7. (2023·浙江1月卷)以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是( )
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
【答案】 D
【解析】 试管婴儿为治疗不孕症开辟了新途径，不应全面禁止，A错误；我国政府一再重申四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，但治疗性克隆可在有效监控和严格审查下实施，B错误，D正确；生殖性克隆人冲击了现有的一些有关婚姻、家庭和两性关系的伦理道德观念，C错误。故选D。
8. (江苏卷)下列关于转基因生物安全性的叙述中，错误的是( )
A．我国已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度
B．国际上大多数国家都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害
C．开展风险评估、预警跟踪和风险管理是保障转基因生物安全的前提
D．目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上
【答案】 B
【解析】 我国为保护消费者的知情权，已经对转基因食品和转基因农产品强制实施了产品标识制度，A项正确；转基因生物是否存在安全问题，尚在争论之中，国家为了维护消费者对转基因产品的选择权和知情权，一般会加贴标注，但不会警示性注明可能的危害，B项错误；保障转基因生物安全的前提是开展风险评估、预警跟踪和风险管理等，C项正确；目前对转基因生物安全性的争论主要集中在食用安全性和环境安全性上，此外还有生物安全问题，D项正确。
对克隆的理解
克隆是指无性繁殖系，具体地说，是指从一个共同祖先通过无性繁殖的方法繁殖出来的一群遗传特征相同的DNA分子、细胞或个体。克隆有广义和狭义之分，广义的克隆有分子、细胞和个体三个水平的克隆；狭义的克隆是指通过细胞核移植产生重组细胞再发育成新个体。
1.分子水平的克隆：即DNA复制，如PCR扩增产生相同的基因，表达载体进入受体细胞或在生物中自我复制得到大量完全相同的基因等。
2.细胞水平的克隆：如通过细胞培养由亲代细胞分裂形成遗传信息相同的很多细胞或某些组织、器官；单克隆抗体的制备，单细胞生物如细菌进行分裂生殖等。
3.个体水平的克隆：是指通过各种生物技术获得基因型完全相同的两个或更多个体。如通过细胞核移植、胚胎分割等产生新个体。克隆的生殖方式属于无性生殖。(共119张PPT)
专题九 生物技术与工程
第二讲 细胞工程
8.1 植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术
8.1.1 阐明植物组织培养是在一定条件下，将离体植物器官、组织和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化，最终形成完整植株的过程
8.1.2 概述植物体细胞杂交是将不同植物体细胞在一定条件下融合成杂合细胞，继而培育成新植物体的技术
8.1.3 举例说明植物细胞工程利用快速繁殖、脱毒、次生代谢产物生产、育种等方式有效提高了生产效率
8.2 动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术
8.2.1 阐明动物细胞培养是从动物体获得相关组织，分散成单个细胞后，在适宜的培养条件下让细胞生长和增殖的过程。动物细胞培养是动物细胞工程的基础
8.2.2 阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中，并使重组细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的过程
8.2.3 阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程
8.2.4 概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术
8.2.5 简述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值
8.3 对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体
8.3.1 简述胚胎形成经过了受精及早期发育等过程
8.3.2 简述胚胎工程包括体外受精、胚胎移植和胚胎分割等技术
1．植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性。 ( )
提示：× 细胞在离体条件下，提供适宜的培养条件，并加入激素进行诱导，才能表现出全能性。
2．在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不会发生细胞的增殖和分化。 ( )
提示：× 菊花茎段形成幼苗的过程中，既有细胞增殖，也有细胞分化。
3．用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性。 ( )
提示：× 植物原生质体再生出新的细胞壁之后，仍然具有发育成完整个体的潜能，因为细胞中的遗传物质并没有丢失，原生质体也未失去全能性。
4．细胞膜的流动性是细胞融合的基础。 ( )
提示：√
5．若诱导植物细胞融合，则需先脱分化再诱导融合。 ( )
提示：× 若诱导植物细胞融合，则需先去除细胞壁再诱导融合，不需要脱分化。
6．需使用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，然后选用灭活的病毒诱导原生质体融合。 ( )
提示：× 灭活的病毒一般用于诱导动物细胞的融合，不能用于植物原生质体的融合。
7．原生质体虽无细胞壁但仍保持细胞的全能性，可用秋水仙素处理诱导细胞壁再生。 ( )
提示：× 秋水仙素可用于诱导染色体加倍，不能诱导细胞壁的再生。
8．植物细胞杂交的最终目的是得到细胞的代谢产物。 ( )
提示：× 植物细胞杂交的最终目的是得到杂种植株，培养新品种的作物。
9．制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。 ( )
提示：× 可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理剪碎的肝组织，胃蛋白酶的最适pH是酸性较强的环境，在中性的动物细胞培养液中没有活性。
10．动物细胞培养过程需要无菌环境，不需要无菌操作。 ( )
提示：× 无菌环境的营造离不开无菌操作技术的支持。
11．制备单克隆抗体时，要选用已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。 ( )
提示：× 实验操作时，不可能挑选脾中的B淋巴细胞去操作，也没有必要。因此，选用的材料是脾中的多种淋巴细胞，起作用的是脾中的B淋巴细胞。
12．通过体细胞核移植技术培育克隆牛的过程中，可用显微操作技术处理次级卵母细胞，去除细胞核。 ( )
提示：√
13．动、植物细胞培养时都要在培养基中添加适量蔗糖。 ( )
提示：× 植物组织培养或植物细胞培养的培养基中添加适量蔗糖，但是动物细胞培养基中一般不添加蔗糖。
14．酶处理细胞的时间过长可能会改变细胞膜的通透性。 ( )
提示：√
15．传代培养超过50代的细胞可能失去接触抑制的特性。 ( )
提示：√
16．胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。 ( )
提示：× 胚胎移植一般选取发育良好的桑葚胚或囊胚，原肠胚不能用于胚胎移植。
17．为了获得更多的囊胚，可以采用注射激素的方法促进成熟雌性个体超数排卵，然后将卵细胞从母体内取出，在试管内与人工采集的精子进行体外受精，培育成胚胎。 ( )
提示：× 卵细胞培养到MⅡ期，精子获能后才能进行体外受精。
18．从雄性奶牛中采集到的成熟精子可直接用于受精。 ( )
提示：× 发育成熟的精子需要获能处理后才能与卵细胞受精。
19．采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的。 ( )
提示：√
20．胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎产生排斥反应。 ( )
提示：× 雌性个体对移入子宫的胚胎一般不会出现免疫排斥反应。
1.植物组织培养时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是_____ __________________________________________。
2．“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄、地下长马铃薯，主要原因是_________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
茎尖、幼叶细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，“番茄—马铃薯”杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，不能像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序地表达
3．植物组织培养要无菌操作的原因是______________________ _________________________________________。
4．动物细胞培养需要添加血清的原因：_______________________ ___________________________________________________________________________________。
5．为防止肺癌细胞培养过程中发生污染，需要加入抗生素；同时还要提供适宜的温度、pH、O2和CO2等环境条件。此外，每48 h更换一次培养液，目的是______________________________________________ _____________________。
防止杂菌与培养物争夺营养，杂菌产生的有害物质会导致培养物死亡
由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚，因此在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分
提供营养物质，清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
6．动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是____________。也有人采用__________、________________和____________等方法，其实质是______________________________________________________。
7．___________是指应用外源促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子。进行同期发情处理的目的是________________ ___________________________________________。
8．为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是________ __________________________________________。
显微操作法
梯度离心
紫外线短时间照射
化学物质处理
在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性
超数排卵
使供受体生殖器官的生理变化同步，保证相同的生理环境
冷冻保存
刚排出的精子必须发生相应生理变化后才能受精
核心考点一
植物细胞工程及其应用
1.植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成，比例适中有利于愈伤组织的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2.植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
3.针对二类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程
4.植物繁殖的新途径
(1)快速繁殖：也叫微型繁殖，可对优良品种进行规模化的植物组织培养。
(2)作物脱毒：植物顶端分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，对离体茎尖进行组织培养可获得脱毒苗。
常考题型一 植物组织培养
1. (2024·辽宁卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是( )
A．迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B．诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C．悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D．茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物的合成速率
【答案】 B
【解析】 迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体，生长旺盛，分裂能力较强，A正确；诱导愈伤组织时需加入NAA和细胞分裂素，B错误；悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，获得更多的营养物质和氧气，使得其可以进一步分裂，C正确；加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢产物(不是植物生长所必需的)的合成速率，D正确。故选B。
2. (2024·浙江1月卷)山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是( )
外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗
A．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染
B．培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染
C．将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖
D．提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽
【答案】 D
【解析】 芽尖等分生组织分裂旺盛，且含病毒少，取材时常选用其作为外植体，A正确；培养基中有大量的营养物质容易被细菌污染，加入抗生素可降低杂菌的污染，B正确；将丛生芽切割后转移到新的培养基上继续进行扩大培养称为继代培养，其又可分为第二代培养、第三代培养等。大多数植物每隔4～6周进行一次继代培养，每进行一次继代培养，培养物一般能增殖3～4倍。正因为培养物可以不断继代培养，所以离体繁殖速度比常规方法通常要快数万倍，可实现快速繁殖，C正确；提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成根而不是芽，D错误。故选D。
3. (2024·安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素，设计了以下实验流程和培养装置(如图)，请同学们进行评议。下列评议不合理的是( )
A．实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织，制备悬浮细胞
B．装置中的充气管应置于液面上方，该管可同时作为排气管
C．装置充气口需要增设无菌滤器，用于防止杂菌污染培养液
D．细胞培养需要适宜的温度，装置需增设温度监测和控制设备
【答案】 B
【解析】 植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，欲利用愈伤组织制备悬浮细胞，可用纤维素酶和果胶酶进行处理愈伤组织，A正确；装置中的充气管应置于液面下方，以利于培养液中的溶氧量的增加，该管不能同时作为排气管，B错误；为了防止杂菌污染培养液，装置充气口需要增设无菌滤器，C正确；细胞培养时需要保证适宜的温度，因此装置需增设温度监测和控制设备，D正确。故选B。
4. (2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
【答案】 D
【解析】 在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。故选D。
植物激素对植物组织培养的影响
1.按照不同的顺序使用生长素、细胞分裂素这两类激素，会得到不同的实验结果
使用顺序 实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但细胞不分化
先使用细胞分裂素，后使用生长素 细胞既分裂也分化
同时使用 分化频率提高
简记：先“生”分裂不分化，后“生”分裂又分化，同“使”分化频率高
2.当同时使用生长素、细胞分裂素这两类激素时，两者用量的比值影响植物细胞的发育方向
生长素/细胞分裂素 植物细胞的发育方向
比值高 有利于根的分化、抑制芽的形成
比值低 有利于芽的分化、抑制根的形成
比值适中 促进愈伤组织的形成
简记：“高”根，“低”芽，“中”愈伤
常考题型二 植物体细胞杂交
5. (2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
【答案】 B
【解析】 酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，说明两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但在两个过程中二者的比例不同，C正确；植物丙是植物甲和植物乙体细胞杂交形成的个体，应具备两者的遗传物质，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。故选B。
6. (2023·广东卷)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是( )
A．细胞融合前应去除细胞壁
B．高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合
C．融合的细胞即为杂交细胞
D．杂交细胞可能具有生长快速的优势
【答案】 C
【解析】 在细胞融合前，必须先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，再诱导原生质体融合，A正确；人工诱导原生质体融合有物理法和化学法，用高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合，B正确；融合的细胞中有人参根—人参根细胞、人参根—胡萝卜根细胞、胡萝卜根—胡萝卜根细胞，只有人参根—胡萝卜根细胞才是杂交细胞，C错误；杂交细胞含两种细胞的遗传物质，可能具有生长快速的优势，D正确。故选C。
7. (2024·山东卷改编)下列关于植物愈伤组织的说法正确的是( )
A．用果胶酶和胶原蛋白酶去除愈伤组织的细胞壁获得原生质体
B．融合的原生质体可直接分裂分化形成杂种植株
C．体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的2个细胞核
D．通过愈伤组织再生出多个完整植株的过程属于无性繁殖
【答案】 D
【解析】 植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，故用果胶酶和纤维素酶去除愈伤组织的细胞壁获得原生质体，A错误；用纤维素酶和果胶酶分别处理不同的植物细胞，得到原生质体，运用物理方法或化学方法诱导融合，形成杂种细胞，生出新的细胞壁后再利用植物组织培养技术将杂种细胞培养成杂种植株，故融合的原生质体需再生出细胞壁后才能形成愈伤组织，B错误；体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自两个亲本的遗传物质，只有1个细胞核，C错误；通过愈伤组织再生出多个完整植株的过程属于植物的组织培养，从繁殖看属于无性繁殖，D正确。故选D。
8. (2023·浙江1月卷)甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的________为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是________ ________________________________________________________。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于________________________________ __________________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？_________。
A．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经________可形成胚状体或芽。胚状体能长出________，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的________。
Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，____________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经____________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】 (1)再生 叶
(2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用
(3)同一个杂种融合原生质体 ABD
(4)再分化 根和芽
(5)模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【解析】 (1)在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。(2)植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓
度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度，使其失去融合作用。(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。(4)愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚
状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。(5)Ⅰ.提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。Ⅱ.将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ.得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
关于植物体细胞的筛选
植物体细胞杂交中涉及不同植物原生质体的融合。在融合细胞中有同种和异种融合两种类型，因此涉及对杂种细胞的筛选和培养。杂种细胞的筛选，可用机械方法，也可用生理学或遗传学的方法。以机械方法为例，根据两种亲本细胞在形态、色泽上的差异，将细胞分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中放1～3个细胞。在显微镜下找出杂种细胞，并且标定位置。等杂种细胞分裂成细胞团时，转移到培养皿中，培养成愈伤组织。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对杂种细胞或植株进行鉴别与筛选。
核心考点二
动物细胞工程及其应用
1.动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来分散成单个细胞。
②保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键：是否分瓶培养。
(2)干细胞
比较项目 胚胎干细胞(ES细胞) 成体干细胞 诱导多能干细胞(iPS细胞)
来源 早期胚胎 成体组织或器官内 诱导高度分化的组织细胞形成的
特点 具有分化成为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 类似胚胎干细胞；诱导过程无须破坏胚胎，应用前景更广泛
2.单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖
(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能产生抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能迅速大量增殖，不能产生抗体。③杂交瘤细胞：既能产生抗体，又能迅速大量增殖。
(2)两次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
3.动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性
(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
常考题型一 动物细胞培养和单克隆抗体
1. (2024·辽宁卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
【答案】 D
【解析】 传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；①的细胞更接近延迟期(调整期)，②时细胞增长开始变得缓慢，B错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C错误；细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大、细胞间产生接触抑制、细胞代谢产物积累有关，D正确。故选D。
2. (2024·湖北卷)糖尿病是危害人类健康的主要疾病之一。恢复功能性胰岛B细胞总量是治疗糖尿病的重要策略。我国学者研究发现，向患有糖尿病的小鼠注射胰高血糖素受体单克隆抗体(mAb)，可以促进胰岛A细胞增殖，诱导少数胰岛A细胞向胰岛B细胞转化，促进功能性胰岛B细胞再生。根据上述实验结果，下列叙述错误的是( )
A．mAb的制备可能涉及细胞融合技术
B．注射mAb可降低胰腺分泌胰高血糖素的量
C．mAb和胰高血糖素均能与胰高血糖素受体特异性结合
D．胰高血糖素主要通过促进肝糖原分解和非糖物质转化为糖，升高血糖水平
【答案】 B
【解析】 单克隆抗体的制备涉及细胞融合技术和动物细胞培养技术，mAb属于单克隆抗体，其制备可能涉及细胞融合技术，A正确；单克隆抗体(mAb)，可以促进胰岛A细胞增殖；而胰岛A细胞可分泌胰高血糖素，可见注射mAb可提高胰岛A细胞分泌胰高血糖素的量，B错误；题干信息，mAb是胰高血糖素受体单克隆抗体，可见mAb和胰高血糖素均能与胰高血糖素受体特异性结合，C正确；胰高血糖素主要作用于肝，促进肝糖原分解成葡萄糖进入血液，促进非糖物质转变成糖，使血糖浓度回升到正常水平，D正确。故选B。
3. (2024·浙江1月卷)某动物细胞培养过程中，细胞贴壁生长至接触抑制时，需分装培养，实验操作过程如图。
下列叙述错误的是( )
A．①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离
B．②加培养液的目的是促进细胞增殖
C．③分装时需调整到合适的细胞密度
D．整个过程需要在无菌、无毒条件下进行
【答案】 B
【解析】 ①加消化液的目的是使细胞与瓶壁分离，A正确；②加培养液，多次加培养液先洗去残留的消化酶，然后终止消化液的消化作用，并对细胞加以稀释，B错误；③分装时需调整到合适的细胞密度，因为若密度过大细胞仍存在接触抑制，C正确；动物细胞培养需要无菌、无毒环境，因此整个过程需要在无菌、无毒条件下进行，D正确。故选B。
4. (2023·湖北卷)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是___________________________________________________________________________________________________________________。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对______________________________________________和____________________________生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是____________________________________________________________ ________________。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是________。
【答案】 (1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】 (1)浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不能通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原—抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5′端，—OH位于3′端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5′端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3′端的—OH相连，④符合题意。故选④。
动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较
比较项目 动物细胞融合 植物体细胞杂交
原理 细胞膜的流动性 细胞膜的流动性、细胞的全能性
融合前处理 使细胞分散开 去除细胞壁
相关酶 胰蛋白酶、胶原蛋白酶等 纤维素酶和果胶酶
诱导方法 除了物理法、化学法，还可以用灭活病毒诱导法 物理法、化学法
比较项目 动物细胞融合 植物体细胞杂交
结果 形成杂交细胞 形成杂种植株
应用 主要用于制备单克隆抗体 培育植物新品种
意义 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
常考题型二 核移植与克隆动物的培养
5. (2021·辽宁卷)下图是利用体细胞核移植技术克隆优质奶牛的简易流程图，有关叙述正确的是( )
A．后代丁的遗传性状由甲和丙的遗传物质共同决定
B．过程①需要提供95%空气和5%CO2的混合气体
C．过程②常使用显微操作去核法对受精卵进行处理
D．过程③将激活后的重组细胞培养至原肠胚后移植
【答案】 B
【解析】 后代丁的细胞核的遗传物质来自甲，细胞质的遗传物质来自于乙牛，则丁的遗传性状由甲和乙的遗传物质共同决定，A错误；动物细胞培养中需要提供95%空气(保证细胞的有氧呼吸)和5%CO2(维持培养液的pH)的混合气体，B正确；过程②常使用显微操作去核法对卵母细胞进行处理，C错误；过程③将激活后的重组细胞培养至囊胚或桑葚胚后移植，D错误。故选B。
6. (2020·天津卷)在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的( )
A．卵原细胞 B．初级卵母细胞
C．次级卵母细胞 D．卵细胞
【答案】 C
【解析】 在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数第二次分裂中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。故选C。
7. (2023·浙江6月卷)赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于________。根据这种调节方式，在培养基中添加_______________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因)，可通过检索____________获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞(BEF)。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生________，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为____________。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了________重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至________________，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以____________________________________为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行___________处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______________，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？_______________ __________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)负反馈调节 一定浓度的赖氨酸类似物
(2)①基因文库 ②融合 ③受体细胞 激活 ④桑葚胚或囊胚 ⑤含有目的基因的牛耳组织细胞 DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达
【解析】 (1)负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，可在培养基中添加一定浓度的赖氨酸类似物。(2)①从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物的许多基因片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。②表达载体包裹到磷脂等构
成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑葚胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验，排除未知变量对实验
产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因，应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
8. (2021·湖南卷)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如图所示。回答下列问题：
(1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是____________________________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的______________断开。
(2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是___________________________ _____________________________________________。
(3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是___________________________________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为__________________________(答出两点即可)，功能上具有____________________。
(4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的_________淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂种细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路__________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】 (1)限制酶(限制性内切核酸酶) 磷酸二酯键
(2)提供营养；清除代谢(产)物，防止细胞代谢(产)物积累对细胞自身造成危害
(3)体细胞分化程度高，恢复(表现)其全能性十分困难 细胞体积小，细胞核大，核仁明显 发育的全能性
(4)B 提取此克隆动物的肝脏蛋白，作为抗原，与M蛋白的单克隆抗体进行抗原—抗体杂交，若未出现杂交带，证明M基因已失活
【解析】 (1)限制酶识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸间的磷酸二酯键断开。(2)动物细胞体外培养需要无菌、无毒等适宜环境，因此动物细胞培养的培养液及所有培养用具使用前应进行无菌处理，还应定期更换培养液，以便为培养物提供营养并清除代谢(产)物，防止代谢(产)物积累对细胞自身造成危害。(3)哺乳动物核移植分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，其中胚胎细胞核移植较易成功，因为与胚胎细胞相比，动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难。胚胎干细胞存在于早期胚胎中，在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上具有发育的全能性。(4)制备单
克隆抗体时，应将从免疫小鼠中得到的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并筛选出可大量产生M蛋白抗体的杂交瘤细胞。为确定克隆动物A中M基因是否失活，可利用抗原—抗体特异性结合原理，将制备的M蛋白的单克隆抗体与转基因动物肝脏中提取的蛋白质混合，观察是否产生杂交带，若未出现杂交带，说明M基因已失活。
1.核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的原因
(1)克隆动物遗传物质来自两个亲本。
(2)发育过程中发生基因突变或染色体变异。
(3)外界环境条件引起性状的改变。
2.对核移植与克隆的理解
(1)核移植技术中选用的核供体应为具有优良性状的个体，提供卵母细胞的个体和代孕个体只需为同一物种的健康雌性个体即可。
(2)动物细胞核移植可以有两种操作方式：一是把供体细胞导入去核的卵母细胞，这是现在常用的方法；二是将供体动物的一个细胞核直接导入去核的卵母细胞，该过程需要用电刺激的方法促进融合。
(3)用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，形成早期胚胎才能进行胚胎移植。
(4)体细胞核移植体现了动物细胞核的全能性，而非动物细胞的全能性。
核心考点三
胚胎工程及其应用
1.准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程
(1)受精过程中的两个标志：受精的标志是观察到两个极体或雌雄原核；受精完成的标志是雌雄原核融合完成。
(2)桑葚胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团细胞仍具有全能性。
2.胚胎移植的操作流程
(1)胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。
(2)胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。
(3)用于移植的胚胎来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精获得的胚胎、转基因获得的胚胎、胚胎分割获得的胚胎等。
(4)胚胎存活的基础：受体不会对来自供体的胚胎发生免疫排斥反应。
3.胚胎分割
4.“克隆羊”“试管羊”“转基因羊”的产生过程及分析比较
名称 不同点 相同点
主要生物技术 遗传物质 遗传性状 生殖方式
克隆羊 动物体细胞
核移植技术 A羊核基因， B羊质基因 几乎全部表
现A羊性状 无性生殖 都用到胚胎移植技术、动物细胞培养技术
试管羊 体外受精 A、B羊核基因， B羊质基因 双亲性状 有性生殖
转基因羊 重组DNA 目的基因、
双亲基因 目的基因性状、双亲性状 有性生殖
常考题型一 胚胎工程的理论基础及过程
1. (2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是( )
A．超数排卵 B．精子获能处理
C．细胞核移植 D．胚胎培养
【答案】 C
【解析】 由题干信息可知，该过程通过体外受精获得胚胎，再通过胚胎移植，使长角羚羊成功妊娠并产仔，因此需要进行超数排卵、精子获能处理，并对获得的受精卵进行胚胎培养；由于该过程为有性生殖，因此不需要涉及细胞核移植，所以C符合题意，A、B、D不符合题意。故选C。
2. (2023·浙江1月卷)在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术。下列叙述错误的是( )
A．经获能处理的精子才能用于体外受精
B．受精卵经体外培养可获得早期胚胎
C．胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率
D．胚胎移植前需对受体进行选择和处理
【答案】 C
【解析】 精子需要经过获能处理才具有受精能力，A正确；受精卵经体外培养可获得早期胚胎，B正确；胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活的概率越小，C错误；胚胎移植前，需选择健康体质和正常繁殖能力的受体且进行同期发情处理，D正确。故选C。
3. (2024·甘肃卷)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是( )
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
【答案】 B
【解析】 促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数第二次分裂中期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使供受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。故选B。
4. (2023·海南卷)某团队通过多代细胞培养，将小鼠胚胎干细胞的Y染色体去除，获得XO胚胎干细胞，再经过一系列处理，使之转变为有功能的卵母细胞。下列有关叙述错误的是( )
A．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制
B．获得XO胚胎干细胞的过程发生了染色体数目变异
C．XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞的过程发生了细胞分化
D．若某濒危哺乳动物仅存雄性个体，可用该法获得有功能的卵母细胞用于繁育
【答案】 A
【解析】 营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞也会发生接触抑制，A错误；XO胚胎干细胞中丢失了Y染色体，因而该细胞的获得过程发生了染色体数目变异，B正确；XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞的过程发生了细胞分化，即细胞的功能发生了特化，因而发生了细胞分化，C正确；若某濒危哺乳动物仅存雄性个体，可用该法，即获得有功能的卵母细胞，进而用于繁育，实现濒危物种的保护，D正确。故选A。
1.胚胎移植中的几个注意点
两次激素使用 第一次：用激素对供、受体进行同期发情处理；
第二次：用促性腺激素处理使供体超数排卵
两次检查 第一次：对收集的胚胎进行检查；
第二次：对受体母畜是否妊娠进行检查
繁殖方式 胚胎由受精卵形成，属于有性生殖；
胚胎由核移植或胚胎分割形成，属于无性生殖
2.胚胎移植的生理学基础
常考题型二 胚胎工程的应用
5. (2024·湖北卷)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是( )
A．选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B．胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C．普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D．生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
【答案】 D
【解析】 选择遗传性状优良的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；胚胎移植前，采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；作为受体的杜泊母山羊只需具备健康的体质和正常繁殖能力即可，但山羊和绵羊是不同的物种，具有生殖隔离，不能将山羊的胚胎移植到绵羊子宫发育，即普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。故选D。
6. (2023·天津卷)根据下图，正确的是( )
A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1需要MⅡ期去核卵母细胞
C．过程2可以大幅改良动物性状
D．过程2为过程3提供了量产方式，过程3为过程1、2提供了改良性状的方式
【答案】 D
【解析】 子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无明显关系，A错误；核移植过程中需要处于MⅡ期的去核卵母细胞，而过程1是培育试管动物，需要培育到适宜时期(桑葚胚或囊胚等时期)进行胚胎移植，B错误；过程2得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误；过程2克隆技术可得到大量同种个体，为过程3提供了量产方式；过程3是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。故选D。
7. (2021·浙江6月卷)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术可将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因定点插入到受精卵的Y染色体上，获得转基因雄性小鼠。该转基因小鼠与野生型雌性小鼠交配，通过观察荧光可确定早期胚胎的性别。下列操作错误的是( )
A．基因编辑处理的受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液
B．基因编辑处理的受精卵经体外培养至2细胞期，须将其植入同期发情小鼠的子宫，才可获得表达EGFP的小鼠
C．分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植等技术可获得大量的转基因小鼠
D．通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的即为雄性小鼠胚胎
【答案】 B
【解析】 依据胚胎在不同发育阶段对培养条件的特定需要，受精卵在体外培养时，不同发育阶段的胚胎需用不同成分的培养液，A正确；基因编辑处理的受精卵一般经体外培养至桑葚胚或囊胚阶段，进行胚胎移植，可获得表达EGFP的小鼠，B错误；分离能表达EGFP的胚胎干细胞，通过核移植、早期胚胎培养、胚胎移植等技术，可获得大量的转基因小鼠，C正确；通过基因编辑技术将Y染色体用绿色荧光蛋白基因标记，通过观察早期胚胎的荧光，能表达EGFP的个体含有Y染色体，即为雄性小鼠胚胎，D正确。故选B。
8. (2024·北京卷)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。相关叙述错误的是( )
A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B．实验过程中使用的培养基含有糖类
C．类囊胚的获得利用了核移植技术
D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
【答案】 C
【解析】 体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A正确；实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B正确；类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。故选C。
胚胎移植的优势、地位和实质
1.优势
(1)充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。
(2)大大缩短了供体本身的繁殖周期。
(3)对供体施行超数排卵后，可获得多枚胚胎，增加供体一生繁殖后代的数量。
2.地位：胚胎移植作为胚胎工程的最终技术环节，还将推动胚胎工程其他技术的研究和应用。
3.实质：早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。(共84张PPT)
专题九 生物技术与工程
第一讲 发酵工程
7.1 获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础
7.1.1 阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提
7.1.2 阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术
7.1.3 举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物
7.1.4 概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法
7.1.5 概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法
7.2 发酵工程为人类提供多样的生物产品
7.2.1 举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的
7.2.2 阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能，工业化生产人类所需产品
7.2.3 举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值
1．果酒、果醋和泡菜制作过程中，发酵后形成的溶液都呈酸性。 ( )
提示：√
2．制作泡菜前用开水烫洗容器能达到灭菌的目的。 ( )
提示：× 开水烫洗只能达到消毒的效果，灭菌需要更加强烈的理化条件。
3．果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时。 ( )
提示：√
4．啤酒的工业化生产中，大麦经过了多道工序，其中焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌。 ( )
提示：× 焙烤是为了杀死大麦种子胚，但不使淀粉酶失活，因此条件较为温和，达不到灭菌的程度。
5．米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌生长。 ( )
提示：× 酵母菌为兼性厌氧菌，在有氧条件进行有氧呼吸，生长繁殖速度较快。
6．利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，保留利用尿素的微生物。 ( )
提示：× 尿素固体培养基并不能直接杀死其他微生物，但是不能利用尿素的微生物在该培养基上生长受到限制，无法形成菌落。
7．在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长。 ( )
提示：√
8．酵母菌中只存在一种与蛋白质合成有关的细胞器——核糖体。 ( )
提示：× 酵母菌为真核生物，含有多种细胞器，如：内质网、线粒体等，都和蛋白质的合成有关。
9．在制作泡菜过程中，整个发酵过程中亚硝酸盐含量不断增加故泡菜要尽早食用。 ( )
提示：× 亚硝酸盐在发酵后期会随着不断氧化含量逐渐降低。
10．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 ( )
提示：× 接种环经火焰灭菌后应冷却后再挑取菌落，防止高温杀死菌种。
11．在微生物接种的实验中，用95%酒精对实验者的双手和超净工作台进行消毒。 ( )
提示：× 常用70%酒精对实验者的双手和超净工作台进行消毒。
12．倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。 ( )
提示：× 倒平板是指培养基冷却至50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近将未凝固的培养基倒入培养皿。
13．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的pH降低。 ( )
提示：× 尿素转化为氨，会使培养基的pH升高，可使酚酞呈现红色。
14．传统发酵技术都是直接利用的天然原料中的微生物。 ( )
提示：× 传统发酵技术可直接利用原材料中天然存在的微生物，也可利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物。
15．发酵工程的菌种，可从自然界中筛选，也可通过基因工程育种或单倍体育种获得。 ( )
提示：× 发酵工程的菌种，可从自然界中筛选，也可通过基因工程育种或诱变育种获得。
16．发酵工程中所用的都是单一菌种，一旦有杂菌污染，可能导致产量大大下降。 ( )
提示：× 发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。
17．单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的一类蛋白质。 ( )
提示：× 单细胞蛋白是通过发酵获得的大量微生物菌体。
18．单细胞蛋白作为食品添加剂，能使家禽家畜增重快、产奶(蛋)高。 ( )
提示：× 单细胞蛋白制成的微生物饲料，能使家禽家畜增重快、产奶(蛋)高。
19．柠檬酸是一种广泛应用的食品酸度调节剂，可以通过黄曲霉发酵制得。 ( )
提示：× 柠檬酸可以通过黑曲霉发酵制得。
20．发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。 ( )
提示：√
1.制作泡菜时，盐水须煮沸后冷却再使用，煮沸有两大作用：_____ ________________________________________。冷却后再使用是为了___________________________。
2．酒精发酵瓶中的果汁量不能超过总体积的三分之二的原因：___________________________________________________________________________。
一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的微生物
防止杀死坛内的微生物菌种
初期可以为酵母菌繁殖提供氧气，后期可以暂时储存酵母菌发酵产生的二氧化碳
3．平板划线法划线过程中，不能将最后一次的划线与第一次的划线相连的原因是________________________________________________ _______________________________________________________________________________________。
4．分离分解尿素的细菌的选择培养基配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是______________。只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长的原因是______________________________________ _______________________________________________。
平板划线法通过依次在上一次划线末端再次划线达到稀释菌种，获得单菌落的目的，若将最后一次的划线与第一次的划线相连则无法达到这一目的
葡萄糖、尿素
分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可催化尿素分解产生NH3，从而为微生物生长提供氮源
5．单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。原因是__________ ______________________________________________________。
6．使啤酒的产量和质量明显提高的工程手段有_________________ ________________________________________等等。啤酒生产过程中后发酵要在________________________________，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。
在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
菌种的选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒
低温、密闭的环境下存储一段时间
7．实验室中微生物筛选的原理：_____________________________ ___________________________________________________________。
8．土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论：__________________________________ ___________________________________________________________。
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
核心考点一
传统发酵技术的应用和发酵工程
1.归纳微生物在传统发酵技术中的应用
果酒制作 果醋制作 泡菜制作
作用菌类 酵母菌(兼性厌氧型) 醋酸菌(需氧型) 乳酸菌(厌氧型)
温度 18～30 ℃ 30～35 ℃ 适宜温度
原理 酵母菌在无氧条件下将葡萄糖转化成酒精 氧气、糖源充足时，醋酸菌将糖分解为醋酸；缺少糖源时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为醋酸 乳酸菌在无氧条件下将葡萄糖转化为乳酸
果酒制作 果醋制作 泡菜制作
实验流程 挑选葡萄
↓
冲洗
↓
榨汁
↓
酒精发酵→果酒
↓
醋酸发酵→果醋
果酒制作 果醋制作 泡菜制作
操作注意
事项 a.材料选择与处理
b．防止发酵液被污染，控制好发酵条件 a.泡菜坛的选择
b．腌制条件(无氧)
c．控制温度、食盐用量及发酵时间
共同点 利用的都是天然存在的菌种，利用了微生物新陈代谢过程中代谢产物的作用或直接获取代谢产物
注意：生长最适温度≠发酵最适温度(酿酒酵母的最适生长温度与酒精发酵的最适温度不同，前者约为28 ℃，后者是18～30 ℃)
2.发酵工程的基本环节
(1)对发酵工程中心环节的分析
(2)不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵
①在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸。
②在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N－乙酰谷胺酰胺。
常考题型一 传统发酵技术
1. (2024·河北卷)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是( )
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
【答案】 C
【解析】 白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。故选C。
2. (2023·浙江6月卷)阅读下列材料，完成下面小题。
小曲白酒清香纯正，以大米、大麦、小麦等为原料，以小曲为发酵剂酿造而成。小曲中所含的微生物主要有好氧型微生物霉菌、兼性厌氧型微生物酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等细菌。酿酒的原理主要是酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖发酵产生酒精。传统酿造工艺流程如图所示。
(1)小曲白酒的酿造过程中，酵母菌进行了有氧呼吸和无氧呼吸。关于酵母菌的呼吸作用，下列叙述正确的是( )
A．有氧呼吸产生的[H]与O2结合，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合
B．有氧呼吸在线粒体中进行，无氧呼吸在细胞质基质中进行
C．有氧呼吸有热能的释放，无氧呼吸没有热能的释放
D．有氧呼吸需要酶催化，无氧呼吸不需要酶催化
(2)关于小曲白酒的酿造过程，下列叙述错误的是( )
A．糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖
B．发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测
C．若酿造过程中酒变酸，则发酵坛密封不严
D．蒸熟并摊晾的原料加入糟醅，立即密封可高效进行酒精发酵
【答案】 (1)A (2)D
【解析】 (1)有氧呼吸产生的[H]在第三阶段与O2结合生成水，无氧呼吸产生的[H]不与O2结合，A正确；有氧呼吸的第一阶段在细胞质基质中进行，第二和第三阶段分别在线粒体基质和线粒体内膜中进行，无氧呼吸的两个阶段都在细胞质基质中进行，B错误；酵母菌有氧呼吸和无氧呼吸过程中释放的能量均大多以热能形式散失，但无氧呼吸是不彻底的氧化分解过程，还有大部分能量存留在酒精，C错误；有氧呼吸和无氧呼吸过程都需要酶的催化，只是酶的种类不同，D错误。故选A。(2)由于酿酒酵母不能直接利用淀粉发酵产生酒精(乙醇)，故糖化过程主要是利用霉菌分泌的淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，以供发酵利用，A正
确；发酵液样品的蒸馏产物有无酒精，可用酸性重铬酸钾溶液检测，若存在酒精，则酒精与酸性的重铬酸钾反应呈灰绿色，B正确；酿造过程中应在无氧条件下进行，若密封不严，会导致醋酸菌在有氧条件下发酵产生醋酸而使酒变酸，C正确；蒸熟并摊晾的原料需要冷却后才可加入糟醅，以免杀死菌种，且需要在有氧条件下培养一段时间，让酵母菌大量繁殖，此后再密封进行酒精发酵，D错误。故选D。
3. (2023·山东卷)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理：①沸盐水冷却后再倒入坛中；②盐水需要浸没全部菜料；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是( )
A．①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B．②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C．③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D．④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
【答案】 C
【解析】 ①沸盐水冷却后再倒入坛中，是为了杀灭杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响，A错误；②盐水需要浸没全部菜料，造成无氧环境，有利于乳酸菌无氧呼吸，B错误；③盖好坛盖后，向坛盖边沿的水槽中注满水，是排气减压、隔绝空气、防止杂菌污染等，C正确；④检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少，D错误。故选C。
4. (2022·湖北卷)关于白酒、啤酒和果酒的生产，下列叙述错误的是( )
A．在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气
B．白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程
C．葡萄糖转化为乙醇所需的酶既存在于细胞质基质，也存在于线粒体
D．生产白酒、啤酒和果酒的原材料不同，但发酵过程中起主要作用的都是酵母菌
【答案】 C
【解析】 在白酒、啤酒和果酒的发酵初期需要提供一定的氧气，让酵母菌大量繁殖，再进行酒精发酵，A正确；白酒、啤酒和果酒酿制的过程也是微生物生长繁殖的过程，如发酵初期酵母菌大量繁殖，B正确；酒精发酵利用的菌种是酵母菌，葡萄糖转化为乙醇所需的酶存在于细胞质基质，不存在线粒体中，C错误，D正确。故选C。
1.理清3种传统发酵食品的制作技术
2.理清泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
3.发酵过程中控制杂菌的“四大措施”
(1)通过发酵条件控制杂菌：
①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧菌。②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌：如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌：如果酒、腐乳的制作。
(4)利用香辛料控制杂菌：如腐乳、泡菜的制作。
常考题型二 发酵工程
5. (2024·山东卷)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是( )
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
【答案】 D
【解析】 黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，柠檬酸产生速率越慢，A正确；菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，发酵中期添加一定量的硫酸铵，提高铵离子浓度，可提高柠檬酸产量，B正确；大多细菌适宜生长在中性或弱碱性的环境中，因此发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长，C正确；发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行分离、纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品，D错误。故选D。
6. (2024·浙江6月卷)柿子具有较高的营养价值和药用价值。采用液体发酵法可酿制出醋香浓郁、酸味纯正的柿子醋，提高了柿子的经济价值。柿子醋的酿造工艺流程如图所示。
(1)下列关于酒精发酵和醋酸发酵的叙述，错误的是( )
A．酒精发酵是吸能反应 B．酒精发酵在无氧条件下进行
C．醋酸发酵是放能反应 D．醋酸发酵在有氧条件下进行
(2)下列关于柿子醋酿造过程的叙述，错误的是( )
A．加酶榨汁环节加入果胶酶，有利于提高柿子汁产量
B．酒精发酵前可对柿子汁进行杀菌，以利于酒精发酵
C．若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵
D．用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味相同
【答案】 (1)A (2)D
【解析】 (1)酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，属于放能反应，A错误；酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件，B正确；醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，属于放能反应，C正确；醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件，D正确。故选A。(2)加酶榨汁环节加入果胶酶，破坏其细胞壁，有利于提高柿子汁产量，A正确；酒精发酵前可以先对柿子汁进行杀菌，再接种酵母菌，以利于酒精发酵，B正确；醋酸菌是好氧细菌当氧气糖源充足时可以将糖分解成醋酸，当缺少糖源时可以将乙醇转化为乙醛，再由乙醛转化为醋酸，因此若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵，C正确；用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味不相同，D错误。故选D。
7. (2023·山东卷)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比，共同点有( )
A．都利用了酵母菌无氧呼吸产生酒精的原理
B．都要一直保持无氧的环境
C．发酵前都需要对原料进行灭菌
D．发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期
【答案】 A
【解析】 二者均利用了酵母菌进行无氧呼吸产生酒精的原理，A正确；发酵前期，均需要一定的有氧环境，使酵母菌大量繁殖，B错误；果酒的家庭制作不需对原料进行灭菌，C错误；果酒的家庭制作不需要进行消毒，D错误。故选A。
8. (2024·北京卷)啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生________和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量________。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数(图甲)。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是________。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢(H2O2)浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由_____________________________ _____________________________。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生____________以抵抗H2O2的伤害。
【答案】 (1)酒精 能量 (2)无氧/无氧 (3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件 (4)过氧化氢酶
【解析】 (1)酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精(C2H5OH)和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。(2)由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。(3)依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。(4)过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
熟记发酵工程的应用及一些产品的工业化流程操作等
1.发酵工程的应用
(1)在食品工业上的应用：生产传统的发酵产品；生产各种各样的食品添加剂；生产酶制剂。
(2)在医药工业上的应用：生产抗生素、多种氨基酸；生产激素和免疫调节剂等。
(3)在农牧业上的应用：生产微生物肥料；生产微生物农药；生产微生物饲料。
(4)在其他方面的应用：利用嗜热菌、嗜盐菌生产洗涤剂等。
2.啤酒的工业化生产流程
(1)发芽：大麦种子发芽，释放淀粉酶。
(2)焙烤：加热杀死种子胚但不使淀粉酶失活。
(3)碾磨：将干燥的麦芽碾磨成麦芽粉。
(4)糖化：淀粉分解，形成糖浆。
(5)蒸煮：产生风味组分，终止酶的进一步作用，并对糖浆灭菌。
(6)发酵：酵母菌将糖转化为酒精和CO2。
(7)消毒：杀死啤酒中的大多数微生物，延长它的保存期。
(8)终止：过滤、调节、分装啤酒进行出售。
核心考点二
微生物的培养技术及应用
1.消毒和灭菌的辨析
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体(如牛奶)
化学药品消毒法 操作者双手、水源
紫外线消毒法 接种室、接种箱或超净工作台等
项目 条件 结果 常用方法 应用范围
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 湿热灭菌(其中高压蒸汽灭菌法效果最好) 培养基及容器的灭菌
干热灭菌法 耐高温的和需要保持干燥的物品(如玻璃器皿、金属用具等)
灼烧灭菌法 接种工具(如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具)
2.两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 ①一系列的梯度稀释；②涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都能在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
3.选择培养基与鉴别培养基的比较
项目 选择培养基 鉴别培养基
制备方法 培养基中加入或缺少某些化学物质 培养基中加入某种指示剂或化学药品
原理 依据某些微生物对某些物质或环境条件的嗜好或抗性而设计 产生特定的颜色或其他变化
用途 从众多微生物中分离出所需的微生物 鉴别不同种类的微生物
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)筛选菌株：利用选择培养基筛选菌株。
(2)测定微生物数量的常用方法：稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
(3)过程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。
(4)鉴定方法：含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培养基→培养细菌→指示剂变红，则该种细菌能分解尿素。
常考题型一 微生物培养的基本操作
1. (2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是( )
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
【答案】 D
【解析】 由图可知，②中拨出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
2. (2023·山东卷)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( )
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
【答案】 D
【解析】 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。故选D。
3. (2022·湖北卷)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( )
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
【答案】 D
【解析】 动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。故选D。
4. (2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业。用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
碳源 细胞干重(g/L) S产量(g/L)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0.00
制糖废液 2.30 0.18
回答下列问题。
(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________________________________ _________________(答出2点即可)。
(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是________；用菌株C生产S的最适碳源是____________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要____________________________________(答出2点即可)等营养物质。
(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是____________________。
(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：___________________ ___________________________________。
(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是___________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1点即可)。
【答案】 (1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌 (2)葡萄糖 制糖废液 氮源、无机盐、水 (3)缺少淀粉酶
(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度 (5)减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】 (1)通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培养物，需要使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，
故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。(3)分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。(4)要测定生产S的最适制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
识记微生物的培养、分离与计数
提醒：平板划线法、稀释涂布平板法及显微镜直接计数法的区别
1．平板划线法适用于微生物的纯化，但不能用于微生物的计数。
2．稀释涂布平板法常用于活菌计数，而显微镜直接计数法不能区分菌体的死活。
3．用稀释涂布平板法进行计数时，为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300之间的平板进行计数。
常考题型二 微生物的筛选和鉴别
5. (2024·山东卷)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z，trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上，生长情况如图。据图分析，3种酶在该合成途径中的作用顺序为( )
A．X→Y→Z B．Z→Y→X
C．Y→X→Z D．Z→X→Y
【答案】 A
6. (2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
【答案】 D
【解析】 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，因此在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，所以D正确，A、B、C错误。故选D。
7. (2024·浙江6月卷)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是( )
A．镍是组成脲酶的重要元素
B．镍能提高尿素水解反应的活化能
C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长繁殖
D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
【答案】 B
【解析】 根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。故选B。
8. (2023·新课标卷)根瘤菌与豆科植物之间是互利共生关系，根瘤菌侵入豆科植物根内可引起根瘤的形成，根瘤中的根瘤菌具有固氮能力。为了寻找抗逆性强的根瘤菌，某研究小组做了如下实验：从盐碱地生长的野生草本豆科植物中分离根瘤菌；选取该植物的茎尖为材料，通过组织培养获得试管苗(生根试管苗)；在实验室中探究试管苗根瘤中所含根瘤菌的固氮能力。回答下列问题。
(1)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养物，此实验中的纯培养物是__________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)研究小组用上述获得的纯培养物和试管苗为材料，研究接种到试管苗上的根瘤菌是否具有固氮能力，其做法是将生长在培养液中的试管苗分成甲、乙两组，甲组中滴加根瘤菌菌液，让试管苗长出根瘤。然后将甲、乙两组的试管苗分别转入________的培养液中培养，观察两组试管苗的生长状况，若甲组的生长状况好于乙组，则说明_____________ ______________________________________________________________________。
(4)若实验获得一种具有良好固氮能力的根瘤菌，可通过发酵工程获得大量根瘤菌，用于生产根瘤菌肥。根瘤菌肥是一种微生物肥料，在农业生产中使用微生物肥料的作用是_______________________________ _________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。
【答案】 (1)由根瘤菌繁殖形成的单菌落
(2)脱分化 再分化 细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性
(3)无氮源 接种到试管苗上的根瘤菌具有固氮能力
(4)促进植物生长，增加作物产量，能够减少化肥使用，改良土壤，减少污染，保护生态环境
【解析】 (1)在微生物学中将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。对于本实验来说纯培养物就是根瘤菌繁殖得到的单菌落。(2)植物组织培养的过程先是脱分化形成愈伤组织，后再分化形成试管苗。细胞全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。(3)控制变量，因为甲组和乙组的区别是有无固氮菌，所以要保证培养液中没有氮源，探究的是接种到试管苗上的根瘤菌是否具有固氮能力，如果甲长得好，说明接种到试管苗上的根瘤菌具有固氮能力。(4)微生物肥料除了能够促进植物生长，起到肥料的作用之外，还能够减少化肥的使用，改良土壤，保护环境。
快速确认两类培养基
1.鉴别培养基：加入的物质起“鉴别”作用(该物质可能与被鉴别菌种发生特殊颜色反应)，该物质加入后并未杀死其他微生物，其培养基中可生存多种微生物。
2.选择培养基：加入的物质起“筛选”作用，该物质可抑制或杀死其他微生物，只有被选择的“目的菌种”才能生存下来。
