押题10 基因表达与基因工程中PCR关联考题
猜押 10大题型
题型01融合基因中PCR的应用
题型02 DNA复制中自修复和冈崎片段问题
题型03双脱氧测序法
题型04 DNA的粗提取实验
题型05 DNA不同片段间互为引物的问题
题型06基因工程中选酶问题
题型07 PCR引物设计及电泳条带问题
题型08外源基因插入及基因序列问题
题型09重组基因中引物选择
题型10基因工程和孟德尔定律关联考题
猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据
基因表达与基因工程中PCR关联考题 2021年山东卷第25题 2022年山东卷第13、25题 2023年山东卷第5、25题 2024年山东卷第5、25题 2025年新高考生物新结构体系下，基因表达与基因工程中PCR关联题型更注重考察学生的审题能力和知识点掌握的全面和准确性；以基础知识为引导，深入考察延伸思路。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，对知识点的背景和应用有更多的掌握。 基因工程题型要求考生在细读题干的基础上，依据题目提供的信息，联系所学的知识和方法，实现信息的迁移，达到灵活解题的目的；遇到新情境问题，应耐心读题，分析题干信息及隐含的知识点，弄清新定义的性质，按新定义的要求，“照章办事”，逐条分析、验证、运算，使问题得以解决. 难度适中，可以预测2025年选择题拓展题目命题方向将会以新情境信息题型展开命题．
题型1 融合基因中PCR的应用
1．（多选）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（ ）
A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶
B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR
C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等
D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术
【答案】AD
【分析】基因工程的操作步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术。②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】A、PCR扩增时，需要再反应体系中加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶，A正确；
B、通过PCR技术扩增LTB-R9-Bp融合基因，需要与融合基因两端序列互补配对的引物，结合图示分析，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR，B错误；
C、终止密码子存在于mRNA上，不会存在于融合基因中，C错误；
D、若利用转基因植物生产该疫苗，则需要通过基因工程获得含有目的基因的受体细胞，再通过植物组织培养获得具备产生疫苗的植物，最终需要通过抗原抗体杂交技术进行目的基因成功表达的鉴定，D正确。
故选AD。
题型2 DNA复制中自修复和冈崎片段问题
1．已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（ ）
A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开
B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物
C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常
D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传
【答案】C
【分析】DNA连接酶（将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）：
（1）种类： E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）作用：E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段；而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
【详解】A、由图可知，PRE（光复活酶）切割的是相邻T碱基之间形成的环状共价键，并非磷酸二酯键，A错误；
B、无需光照，通过切除损伤单链并重新合成，即暗修复切除损伤片段后，DNA聚合酶可直接利用缺口处原有的3′OH末端延伸合成新链，不需要引物，B错误；
C、由于密码子具有简并性，基因的碱基替换未改变氨基酸得排列顺序，酶活性不变，则在光照条件下PRE的修复功能仍可能维持正常，C正确；
D、若嘧啶二聚体未被修复而导致DNA碱基序列永久改变，则该突变在细胞分裂过程中是可以遗传的，D错误。
故选C。
2．端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．图示体现了DNA半保留复制、双向复制的特点
B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除
C．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同
D．端粒缩短的原因是新合成的子链5'端变短
【答案】A
【分析】DNA复制过程为：（1）解旋：需要细胞提供能量，在解旋酶的作用下，两条螺旋的双链解开；（2）合成子链：以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下，利用游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，合成与母链互补的子链；（3）形成子代DNA分子：延伸子链，母链和相应子链盘绕成双螺旋结构。
【详解】A、DNA复制是半保留的，即每个新合成的DNA分子包含一条亲代链和一条新合成的子链，图示过程可体现DNA的半保留复制，但不能体现双向复制（从复制起点向两个方向同时进行）的特点，A错误；
B、结合图示可知，在DNA复制过程中，引物是短单链核酸，，用于启动DNA合成。随后，引物会被DNA聚合酶切除，并由DNA片段填补，B正确；
C、PCR（聚合酶链式反应）是一种体外DNA扩增技术，其原理与生物体内的DNA复制相似，都是DNA半保留复制，C正确；
D、结合图示可知，由于有冈崎片段等存在，新合成的子链5'端变短，从而导致端粒缩短，D正确。
故选A。
3．我国科学家敲除猪的糖抗原合成基因（β4GalNT2），转入相应的调节基因后，将基因编辑猪的单个肾移植给猕猴，同时切除猕猴的自体双肾，最终移植肾存活184天。在移植成功5个月内，猕猴的移植肾功能完全正常，之后出现逐渐加重的蛋白尿。下列说法正确的是（ ）
A．基因编辑猪的成功体现了动物细胞的全能性
B．出现蛋白尿的原因主要是肾小管细胞凋亡导致
C．猪和猕猴肾脏的差异体现了基因的选择性表达
D．敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，降低免疫排斥反应
【答案】D
【分析】器官移植是将一个个体的某一器官整体或部分地转移到另一个体（或本体的另一位置，如自体皮肤移植）的过程。器官移植存在的主要问题：免疫排斥反应和供体器官不足。针对免疫排斥反应，可采用免疫抑制剂来提高移植器官的成活率。
【详解】A、基因编辑猪的成功属于基因工程的应用范畴，其原理不是细胞的全能性，A错误；
B、出现蛋白尿的原因主要是肾小球通透性增强导致的，不是肾小管细胞凋亡导致，B错误；
C、猪和猕猴肾脏的差异体现了不同遗传物质对性状的决定，不是基因选择性表达的体现，因为猪和猕猴肾脏不是来源于同一物种，更不是同一细胞的后代，C错误；
D、β4GalNT2是糖抗原合成基因，因而敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，进而降低免疫排斥反应，D正确。
故选D。
4．一段双链DNA的一条核苷酸链上有2个胞嘧啶（C），其中1个C被甲基化生成5-甲基胞嘧啶（5-mC），C与5-mC进一步被氧化脱氨基分别生成胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。细胞内存在尿嘧啶错配修复系统，该系统能在U的两侧将核苷酸单链切开，清除两切点间包含U的核苷酸片段后再合成正确的片段。下列说法错误的是（ ）
A．尿嘧啶错配修复系统具有限制酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的功能
B．在修复并进行复制的过程中，可能使用4种核苷酸作为原料
C．修复时，以切口处末端核苷酸链为引物延伸正确DNA片段
D．若未被修复，复制两次后，两个位点的C才都会被A替代
【答案】D
【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。
【详解】A、尿嘧啶错配修复系统具有限制酶（用于在U的两侧切开DNA链）、DNA聚合酶（用于合成新的DNA片段以替换被切除的部分）和DNA连接酶（用于将新合成的DNA片段连接到原有的DNA链上）的功能，A正确；
B、DNA的基本单位是4种脱氧核糖核苷酸，故DNA修复和复制过程中需要四种核苷酸，B正确；
C、DNA子链的延伸方向是5'→3’，在DNA修复过程中，通常以切口处的3’末端作为引物，由DNA聚合酶延伸合成新的DNA片段，C正确；
D、未被修复的C和5-mC在复制过程中会被错误地配对，C会被错误地配对为A，5-mC被氧化脱氨基生成U，U会被配对为A，故若未被修复，在一次复制后两个位点的C都会被A替代，D错误。
故选D。
题型3双脱氧测序法
1．双脱氧测序法是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。
A．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 B．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列 D．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小
【答案】C
【分析】PCR技术：
（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；
（2）原理：DNA复制；
（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物
（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）
（5）过程：
①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【详解】A、在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，A正确；
B、患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，B正确；
C、依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，C错误；
D、电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，故据图可知沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小，D正确。
故选C。
2．采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（ ）
A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端
B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能
C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G
D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率
【答案】D
【分析】PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。 扩增的过程包括：变性、复性、延伸。
【详解】A、在DNA合成过程中，脱氧核苷三磷酸确实是通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端，A正确；
B、 PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能，从而发出荧光，B正确；
C、根据碱基互补配对原则，胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）配对，当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G，C正确；
D、若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，就无法根据碱基配对产生荧光的情况来确定模板链上的碱基顺序，不能提高DNA测序的效率，D错误。
故选D。
3．凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1～M6）作为7种竞争探针，进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（ ）
注：“+”表示加入相应物质；“-”表示未加入相应物质；竞争探针足够多
A．图中“？”是指荧光标记的指示探针
B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白全部与WT探针结合
C．在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响
D．突变对探针M4～M6与O2蛋白结合能力影响相对较小的是M4、M5
【答案】D
【分析】凝胶阻滞试验，又叫DNA迁移率变动的实验，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白质-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。
【详解】A、泳道1，没有加O2蛋白和竞争探针以及“ ”，且只有一条指示探针条带，说明图中“ ”是指荧光标记的指示探针，A正确；
B、泳道3，加入了O2蛋白和无荧光标记的竞争探针WT探针以及荧光标记的指示探针，只有一条指示探针条带，且于泳道1的指示探针条带宽度相同，说明O2蛋白没有与荧光标记的指示探针结合，都与无荧光标记的竞争探针WT探针结合了，所以观察不到阻滞条带，B正确；
C、O2蛋白与荧光标记的指示探针结合越多阻滞条带就会越宽，指示探针条带就会越窄，而对于加入无荧光标记的突变竞争探针会竞争性的与O2蛋白结合，从而使指示探针的条带会变宽，阻滞条带就会变窄，且突变的竞争探针与O2蛋白结合能力越强，阻滞条带就会越窄，因此在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响，C正确；
D、加入突变竞争探针M4、M5、M6的泳道，M6的阻滞条带最窄，说明突变的竞争探针中M6与O2蛋白结合能力最强，即M6发生的突变，对其与O2蛋白结合影响相对较小，D错误。
故选D。
题型4 DNA的粗提取实验
1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
【答案】A
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是： ①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同 浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可 以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出， 从而达到分离的目的; ②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离; ③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。
【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；
B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；
C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；
D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。
故选A。
题型5 DNA不同片段间互为引物的问题
1．制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
【答案】D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【详解】分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④。
故选D。
2．用DNaseI酶切割DNA分子，可产生一系列不同长度的DNA片段，且相邻片段只相差1个核苷酸。当DNA分子中的某一区段与特异的转录因子蛋白质结合后，加入DNaseI酶时该区段会得到保护，在凝胶电泳放射性自显影图片上会出现一个空白区“足迹”，这种检测DNA序列的方法称为DNaseI足迹法。上述过程如图所示，下列说法正确的是（ ）
A．需设置不添加DNaseI酶的对照组
B．对照组的每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂
C．未与特定蛋白结合的DNA切割后的片段长度相同
D．此方法可筛选能与DNA进行特异性结合的目标蛋白
【答案】D
【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【详解】A、该实验是研究加入DNaseI酶后，DNA分子与转录因子蛋白质结合情况及切割情况，不需要设置不添加DNaseI酶的对照组，因为重点是对比结合蛋白和未结合蛋白时DNA被DNaseI酶切割的差异，而不是与不添加酶的情况对比，A错误；
B、由题意可知，用DNaseI酶切割DNA分子可产生一系列不同长度的DNA片段，且相邻片段只相差1个核苷酸，这说明对照组的DNA分子被多次切割，磷酸二酯键多次断裂，而不是只发生一次磷酸二酯键的断裂，B错误；
C、因为用DNaseI酶切割DNA分子会产生一系列不同长度的DNA片段，所以未与特定蛋白结合的DNA切割后的片段长度是不同的，C错误；
D、由于当DNA分子中的某一区段与特异的转录因子蛋白质结合后，加入DNaseI酶时该区段会得到保护，在凝胶电泳放射性自显影图片上会出现一个空白区“足迹”，通过观察是否有“足迹”，就可以判断是否有能与DNA进行特异性结合的目标蛋白，所以此方法可筛选能与DNA进行特异性结合的目标蛋白，D正确。
故选D。
3．为制备带有荧光标记的DNA探针，研究人员在反应系统内只添加了DNA聚合酶、缓冲液、H2O和4种dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被荧光标记）的反应管①～③中分别加入适量单链DNA（如图）。形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。下列分析正确的是（ ）
反应管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′
反应管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′
反应管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′
A．实验中需要用荧光物质对dGTP的γ位磷酸基团进行标记
B．DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的5′端
C．反应管②的反应系统内因缺乏模板或引物不能进行PCR扩增
D．实验结束后，能得到带有荧光标记DNA探针的反应管只有③
【答案】D
【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。
【详解】A、dGTP的γ位与β位之间的高能磷酸键会断裂为PCR提供能量，因此若对dGTP的γ位磷酸基团进行标记，则标记不会出现在子链中，需要用荧光物质对dGTP的α位磷酸基团进行标记，A错误；
B、DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的3′端，B错误；
C、反应管②的两条单链DNA分子之间具有互补的序列，既是模板又是引物，可以进行PCR，但双链DNA区之外的5'端模板链中没有碱基C，不能与被荧光标记的dGTP结合，因此不能制备带有荧光标记的DNA探针，C错误；
D、①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针，③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的5'端有模板和碱基C，在模板链的3'端能连接上被荧光标记的dGTP，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针，D正确。
故选D。
题型6 基因工程中选酶问题
1．为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。
注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。
(3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。
(4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′
(2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
(3) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子、标记基因、复制原点
(4)IgG类抗体
【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程包括四个基本步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoI（S基因会被XhoI酶切），应该有用Smal酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaI酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′→3′，故PCR时新合成链的延伸方向是5′→3′。
（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
（3）依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。
（4）依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
2．水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。
注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列
(1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列）
(2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。
(3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。
(4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。
【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3'
(2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达
(3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质
(4) 受精卵 雌激素和荧光素
【分析】基因工程的步骤：
（1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。
（2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。
（3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
（4）目的基因的检测和表达。
【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。
（2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。
（3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。
（4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。
题型7 PCR引物设计及电泳条带问题
1．大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。
(1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。
(2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。
(3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是
(4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。
【答案】(1) 使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合 非模板链 GGATCCATGTTC
(2)2
(3) 能 100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少
(4)Y蛋白(通过与S基因启动子序列结合)促进S基因表达，促进固醇类化合物生成，增强物对干旱和盐胁迫的抗性
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）在PCR扩增过程中，复性的目的是使引物通过碱基互补配对与模板DNA单链结合，这是DNA聚合酶能够沿着模板链延伸合成新的DNA链的前提。转录出来的信使RNA，翻译时的起始密码子应该是AUG，AUG应该跟模板链TAC是互补配对的，跟非模板链ATG是相同的，图中Y基因单链部分，左端起始位置是ATG刚好跟信使RNA的起始位置是相同的，故图甲所示Y基因序列为转录的非模板链。据题图分析可知，Y基因上面没有那个EcoRI和BamHI的识别序列，所以要扩增Y基因的时，引物的5'端是要加上EcoRI和BamHI的识别序列，根据载体结构，左端是启动子，右端是终止子，图中Y基因单链部分是非模板链，所以Y基因是从左到右与载体部分连接。故在Y基因的左端连接EcoRI的识别序列，Y基因的右端连接BamHI的识别序列。即Y基因的下游扩增引物上面应该加BamHI的识别序列，再根据题干信息“在获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除”可知，Y基因下游最左端的三个碱基转录为终止密码子，故这三个碱基要剔除，所以为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- GGATCCATGTTC -3'。
（2）将初步构建的Y GFP基因表达载体转入大豆细胞后，需要对经潮霉素筛选得到的细胞系进行抗体检测以确认是否成功表达出Y GFP融合蛋白。根据图乙的电泳结果可以看出，细胞系2在预期位置出现了明显的条带而细胞系1没有，因此可以判断细胞系2能成功表达出Y GFP融合蛋白。
（3）根据图丙的实验结果和已知信息，可以看出Y蛋白与DNA序列结合后，可以在凝胶电泳中产生阻滞条带。而实验组（加入Y蛋白）的条带相对于对照组（未加入Y蛋白）产生了阻滞，说明Y蛋白能与S基因启动子序列结合。相比于a条带（对照组），b条带（实验组）放射性低的原因是100倍未标记的探针与同位素标记的探针竞争性结合Y蛋白，导致b处带有放射性的阻滞条带减少。
（4）根据题目信息和分析结果，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是Y蛋白与S基因启动子序列结合，促进S基因的表达，进而促进大豆固醇类化合物的合成，从而增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。
2．RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种（如图1），①~⑥表示相关过程。
(1)参与过程①的酶有 （至少写两种）。在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，原因是 。已知①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1的碱基序列 （只写出前8个碱基即可）。
(2)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是 ，过程④常用的方法是 ，⑤过程后可用含抗生素 的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。
(3)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2（Rubisco是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据图分析，RCA对光合作用的影响及机理是 。
【答案】(1) 反（逆）转录酶、热稳定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H） 引物1（2）中或两个引物1（2）之间因存在互补序列而相互连接成双链结构，不能和模板链结合 5'－CTCGAGGT－3'
(2) 驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达 钙离子处理法（或感受态细胞法） 潮霉素
(3)通过提高Rubisco活力来促进光合作用
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）过程①为反转录PCR，因此需要的酶有反（逆）转录酶、热稳定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H），在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，这是因为引物1（2）中或两个引物中存在互补的碱基序列，因而会形成双链结构，进而无法和模板链结合，导致扩增失败。 目的基因rca基因中已经存在BamH Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位点（质粒上也已有Sal Ⅰ的酶切位点”，所以在rca基因的上游不宜再选用Sal Ⅰ，这样会破坏目的基因，而应该选用与Sal Ⅰ产生相同黏性末端的Xho Ⅰ（同尾酶）。所以引物Ⅰ的碱基序列应该是5'-CTCGAGGT-3'。这样，质粒上用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ切割，rca基因用BglⅡ（与BamH Ⅰ属于同尾酶）和Xho Ⅰ切割。
（2）启动子是一段DNA序列，因此启动子的基本单位是脱氧核苷酸，C4pdk启动子是受光诱导的强启动子，驱动目的基因在光诱导下载叶肉细胞中特异性表达，经过程②替换 Ti质粒上原有启动子的目的是可使目的基因在大豆叶肉细胞中特异性表达。过程④是将重组质粒导入到农杆菌中，常用的方法Ca2+处理农杆菌（感受态细胞法）。由图可知T-DNA内部含有潮霉素抗性基因，因此⑤过程后可用含潮霉素的培养基筛选出转染成功的大豆细胞。
（3）与野生型大豆相比，转基因大豆的rca基因沉默，无RCA蛋白，光合速率降低，则可知RCA对玉米的光合作用具有促进作用。由图可知，rca基因沉默时Rubisco活力下降，因此可推测RCA对大豆的光合作用的作用机理为RCA可提高Rubisco活力，促进暗反应，进而促进光合作用。
3．滚环扩增技术（RCA）是借鉴自然界中病原生物体环状DNA分子滚环式复制方式发展起来的一种核酸扩增方法，在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测领域有着广泛应用。图1为RCA原理示意图。具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致结直肠肿瘤的形成。科研人员采用基于RCA的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度、高特异性的检测。图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，过程②是使锁式探针环化的过程。其中nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子，由两端的检测臂和无关序列组成。只有当环境中存在靶核酸序列时，锁式探针才能完成成环连接反应。检测探针中的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧光会被淬灭。
(1)由图1推测，Phi29DNA聚合酶的作用是 。与常规PCR相比，RCA缺乏 环节，因此可推测RCA扩增过程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。
(2)过程②锁式探针完成成环连接反应需要 的催化。肠道中含有多种微生物，为保证检测的特异性，在设计锁式探针时需保证 ，同时还需注意无关序列中不含 。
(3)若检测样品存在具核梭杆菌，检测探针中荧光基团发出荧光的原理是 。该检测方法具有高灵敏度的原因是 。
【答案】(1) 能既需催化磷酸二酯键的形成，也能催化氢键的断裂 变性 耐高温
(2) DNA连接酶 检测臂中含nusG基因的特异性序列 其它微生物的特异性碱基序列
(3) 长重复单链DNA与检测探针特异性结合，导致探针两端的FAM与BHQ-1距离增大，发出荧光 长重复单链DNA中可同时结合多个检测探针，从而使荧光强度增加
【分析】PCR是体外模拟DNA复制的过程，其原理是DNA双链复制。体内DNA复制过程中需要模板、原料、能量、引物和酶等，PCR过程中原料和能量由dNTP提供，酶是热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
【详解】（1）由图1可知，以单链环状DNA为模板可在Phi29DNA聚合酶作用下形成滚动形成长重复单链DNA，说明Phi29DNA聚合酶既需催化磷酸二酯键的形成，也需催化氢键的断裂；由于模板是单链DNA，因此扩增时不需要解旋形成单链，故与常规PCR相比，RCA缺乏变性环节，即该扩增过程不需要在高温条件下进行，因此可说明RCA扩增过程中所使用的Phi29DNA聚合酶不具有耐高温特性；
（2）过程②为锁式探针进行连接以实现环化，即在nusG基因一条链与锁式探针碱基互补配对的前提下，通过DNA连接酶形成磷酸二酯键将锁式探针连接形成环状，因此②过程中需要的酶是DNA连接酶；在设计锁式探针时需保证检测臂中含nusG基因的特异性序列，同时还需注意无关序列中不含其它微生物的特异性碱基序列，防止扩增的长重复单链中含有其它微生物的特定碱基序列；
（3）若检测样品存在具核酸杆菌，经图2中②-④过程得到的长重复单链DNA与检测探针特异性结合，导致探针两端的FAM与BHQ-1距离增大，发出荧光；由于长重复单链DNA中可同时结合多个检测探针，从而使荧光强度增加，因此提高了该检测方法的灵敏度。
题型8 外源基因插入及基因序列问题
1．由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。
(1)构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用 酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需 种酶。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选，理由是 。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。
(3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体，理由是 。
引物种类样品序号 LP+RP BP+RP
样品1 有大片段 无
样品2 有大片段 有小片段
样品3 无 有小片段
【答案】(1) EcoRⅠ和SpeⅠ酶 5
(2) 潮霉素 潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上
(3) 3 样品1表现为能合成大片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm。
【分析】基因工程技术的基本步骤：
(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
(4) 目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）构建基因表达载体时，切割目的基因需要用到的限制酶为MunⅠ和XbaⅠ，结合各种限制酶的识别序列可知，EcoRⅠ和SpeⅠ分别和MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶，因此，切割Ti质粒应选用EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶，共需要5种酶。
（2）将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选，因为潮霉素基因位于T-DNA中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上，因此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该具有对潮霉素的抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。
（3）农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。结合题图是以及题目信息可知，样品1没有插入相应的T-DNA片段，其基因型为MM，样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm，而样品2的基因型可表示为Mm。即根据下表中三种样品的电泳结果判断样品3是纯合突变体。
2．研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案】(1) 低 256 5'-CAAT-3' 5'-GTTT-3'
(2) 卡那霉素 Sac Ⅰ ④
(3)1/4
【分析】【关键能力】
（1）信息获取与加工
题干关键信息 所学知识 信息加工
黏性末端的种类 基因工程的工具 BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序
抗生素筛选 目的基因的检测与鉴定 重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株
（2）逻辑推理与论证
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为 256。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。
（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
题型9 重组基因中引物选择
1．科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2
a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。
2．某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
【答案】(1) 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
5'端
(2) P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。
在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
(3) 增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合
(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。
【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。
（2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
（4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可得出结论。
3．人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
【答案】 SalI EcoRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列；
2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶；
（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；
（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。
题型10 基因工程和孟德尔定律关联考题
1．某二倍体两性植物，抗病与感病、高秆与矮秆、耐盐与盐敏感分别由A/a、B/b、D/d三对基因控制，各相对性状均为完全显性。研究发现，在正常条件下，三对等位基因表达正常。在干旱胁迫下，只考虑上述三对基因的个体形成的配子中，某个基因的表达会因与其位于同一条染色体上的其他基因的影响而被抑制。为研究上述性状的遗传特性，选用该植物抗病矮秆耐盐品系（甲）和感病高秆盐敏感品系（乙）在不同条件下进行了杂交实验，实验结果如表所示。不考虑突变和交换。
组别 环境条件 亲本 F1表型及比例
实验一 正常条件 甲（）×乙（） 均为抗病矮秆耐盐
实验二 干旱胁迫 甲（）×乙（） 均为抗病高秆耐盐
(1)依据 （填“实验一”或“实验二”或“实验一或实验二”）可判断出三对相对性状的显隐性，理由是 。
(2)若实验一的F1自交后代中抗病矮秆所占比例为 ，可确定A/a和B/b两对等位基因位于一对同源染色体上。
(3)在干旱胁迫下，选取实验二F1自交获得的F2中感病高秆耐盐植株的叶片为材料，通过PCR检测每株个体中控制这3种性状的所有等位基因，以辅助确定这些基因在染色体上的相对位置关系。对被检测群体中所有个体按PCR产物的电泳条带组成（即基因型）相同的原则归类后，预期电泳图谱只有I或Ⅱ两种类型，如下图所示。已知各基因的PCR产物通过电泳均可区分，其中条带①和⑤分别代表基因D和a。
①图中条带②代表的基因是 。
②若电泳图谱为类型I，请在答题卡方框内画出F1个体三对等位基因的位置关系。 （用横线代表染色体，圆点代表基因）
③若电泳图谱为类型Ⅱ，被检测群体在F2中所占的比例为 ，其中能稳定遗传的比例为 。
(4)由上述信息可知，在干旱胁迫下，F1形成的配子中 基因受到与其位于同一条染色体上基因的影响而表达受抑制；若（3）中电泳图谱为类型Ⅱ，则干旱条件下F1减数分裂形成 （填“雌配子”、“雄配子”或“雌配子和雄配子”）时，该基因的表达会受到抑制，判断依据是 。
【答案】(1) 实验一 实验一正常条件下，基因表达正常，具有相对性状的亲本杂交，F1均表现为抗病矮秆耐盐
(2)3/4
(3) b（高杆基因/控制高杆的基因） 3/16 1/3
(4) B（矮杆基因/控制矮杆的基因） 雌配子和雄配子 若只有一种配子（雄配子）中该基因表达受抑制，则Ⅱ中感病高秆耐盐植株各基因PCR产物电泳的结果只有一种类型，与假设不符合。（或Ⅱ中左侧个体为BB/aaBBDD，为高杆，说明B在雌雄配子中均受到抑制；或者若只有一方配子中B被抑制，则与电泳图谱不符合。）
【分析】自由组合的实质：当具有两对（或更多对）相对性状的亲本进行杂交，在子一代产生配子时，在等位基因分离的同时，非同源染色体上的基因表现为自由组合。其实质是非等位基因自由组合，即一对染色体上的等位基因与另一对染色体上的等位基因的分离或组合是彼此间互不干扰的，各自独立地分配到配子中去。因此也称为独立分配定律。
【详解】（1）在正常条件下，三对等位基因表达正常在干旱胁迫下，只考虑上述三对基因的个体形成的配子中，某个基因的表达会因与其位于同一条染色体上的其他基因的影响而被抑制，因此要判断显隐性应该在正常条件下，实验一正常条件下，基因表达正常，具有相对性状的亲本杂交，F1均表现为抗病矮秆耐盐，抗病、矮秆、耐盐为显性。
（2）若A/a和B/b两对等位基因位于一对同源染色体上，则抗病矮秆耐盐品系（甲AABB）和感病高秆盐敏感品系（乙aabb）杂交，F1为AaBb，F1产生的配子为AB、ab，F1自交后代为AABB、AaBb、aabb，抗病矮秆（A_B_）所占比例为3/4。
（3）①图谱I中只有3条带和4条带，说明感病高秆都是隐性基因控制，而不是其它基因影响，而耐盐个体有DD或Dd，因此感病高秆耐盐植株的基因型为aabbDD、aabbDd，条带①和⑤分别代表基因D和a，②代表b，③代表d。②若电泳图谱为类型I，F1中感病高秆没有aaB_或A_bb的基因型，说明亲本中A与B连锁，a与b连锁，而D/d与前两对基因在两对染色体上， 因此F1的位置关系为。③若电泳图谱为类型Ⅱ，感病高秆耐盐植株对应的条带有3种和5种，条带①和⑤分别代表基因D和a，耐盐有DD和Dd两种，故④表示B基因，②表示b，③代表d，B与D连锁，且D抑制B的表述使B_表现为高秆，类型Ⅱ，感病高秆耐盐植株对应的基因型为aaBBDD（1/4×1/4）、aaBbDd（1/4×1/2），占比为3/16；其中能稳定遗传（aaBBDD）的比例为1/3。
（4）由上述信息可知，在干旱胁迫下，F1形成的配子中B基因受到同一条染色体上的D基因的抑制；若只有一种配子（雄配子）中该基因表达受抑制，则Ⅱ中感病高秆耐盐植株各基因PCR产物电泳的结果只有一种类型，与假设不符合，因此若（3）中电泳图谱为类型Ⅱ，则干旱条件下F1减数分裂形成雌配子和雄配子时，该基因的表达会受到抑制。
2．突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。
(1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。
(2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。
(3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。
(4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。
【答案】(1) 引物是根据转座酶基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与转座酶基因的cDNA特异性结合，与转座酶基因互补的序列） HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因））
(2) 2-9组 使用F2/R2引物PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件未切离；使用F2/R4引物进行PCR检测有条带，说明检测的细胞中D元件已切离
(3)③
(4)插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大）
【分析】1 、PCR技术需要引物的主要原因在于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链，而不能从头开始合成DNA 。引物的作用是为DNA聚合酶提供一个起始点，使其能够沿着模板链合成新的DNA链；
2、基因工程共四个步骤：第一步，获取目的基因；第二步，基因表达载体的构建；第三步，将目的基因导入受体细胞；第四步，目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）引物是根据目的基因（转座酶基因）两端的碱基序列设计的，引物F1/R1能与转座酶基因两端的特定序列互补配对，所以使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因。由图甲可知，载体上含有HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因）），当植物被农杆菌成功转化后，这些基因会进入植物细胞，可通过检测来判断植物是否被成功转化，所以可选用HPH（潮霉素抗性基因）、GFP（绿色荧光蛋白基因）、RFP（红色荧光蛋白基因））作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化；
（2）由题意可知，使用F2/R2引物扩增的是包含D元件的片段，使用F2/R4引物扩增时，若D元件未发生切离则扩增不出条带。观察图丙，植株2-9组用F2/R2引物扩增出条带，说明细胞中D元件未切离；用F2/R4引物也扩增出条带，说明部分细胞中的D元件发生了切离（因为未切离时F2/R4扩增不出条带），所以既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是2-9组；
（3）由图甲可知，D元件插入在绿色荧光蛋白基因（GFP）中，若D元件稳定存在，会破坏GFP基因，导致不产生绿色荧光；红色荧光蛋白基因（RFP）与D元件的转座无关。①组GFP(+)、RFP(+)，说明D元件可能发生了转座，从GFP基因中切离出来，使得GFP基因能正常表达；②组GFP(+)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况；③组GFP (-)、RFP(+)，说明D元件稳定存在于GFP基因中，破坏了GFP基因，且RFP基因正常表达，所以含有D元件且D元件遗传稳定性高的是③组；④组GFP (-)、RFP(-)，不符合载体的基因结构特点（正常载体有RFP基因），可能是异常情况；
（4）D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有插入的是非基因序列（或未选择表达的基因或内含子或非编码区等，插入D元件后引发的突变为隐性突变，插入D元件后表达的蛋白质功能未受影响或影响不大）。
3．帕金森病（PD）严重威胁中老年人健康。单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）是临床用于治疗PD的药物之一。天然猪脑中的GM1含量低，但合成GM1的原料GD1和GT1的含量较多，GD1和GT1可在唾液酸酶的作用下生成GM1。研究人员从某菌中获取唾液酸酶基因M，与质粒P构建成基因表达载体M—P，导入大肠杆菌中，以获得唾液酸酶高产菌株，用以满足工业化生产GM1的需求。目的基因部分序列、质粒P信息、相关限制酶识别序列及切割位点如图1、图2、图3所示。
(1)启动子是 识别和结合的部位。当诱导物存在时，诱导型启动子可 目的基因的表达。图2质粒P中的GD诱导型启动子可诱导M基因以a链为模板链进行转录，据此推测M基因的转录从其 （填“左侧”或“右侧”）开始。
(2)利用PCR技术扩增M基因时，需依据图1中的已知碱基序列等信息设计引物，设计的两引物碱基序列为5′- -3′（写出8个碱基）和5′ 3′（写出8个碱基）。所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。
(3)将基因表达载体M—P导入大肠杆菌前，一般先用 （填物质）处理大肠杆菌，其目的是 。
(4)为检测M基因的表达情况，可以采用 的方法对提取的受体大肠杆菌的蛋白质进行检测。
【答案】(1) RNA聚合酶 启动 右侧
(2) GAATTCCT GGATCCAT 低
(3) Ca2+ 增大大肠杆菌细胞膜的通透性，有利于构建好的重组质粒转入受体细胞大肠杆菌种
(4)抗原—抗体杂交
【分析】DNA连接酶和DNA聚合酶是两种不同的酶，主要的区别就在于它们的底物是不一样的，DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键，但是DNA连接酶连接的是DNA片段，DNA聚合酶主要就是将单个脱氧核糖核苷酸按照顺序连接到DNA链上。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术；将目的基因导人微生物细胞常用Ca2+处理法。
【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。当诱导物存在时，诱导型启动子可启动目的基因的表达。M基因以a链为转录模板链，基因转录时从模板链的3'开始，因此据此推测M基因的转录从其右侧开始。
（2）结合质粒中启动子的方向可知，目的基因a链3′端连接启动子，5′端连接终止子，为了能使扩增后的目的基因与质粒正向连接，需要在目的基因的左右两侧分别添加限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，所以需要在PCR扩增仪中加入的引物序列为5'-GAATTCCT-3'和5'-GGATCCAT-3'。引物越短，则其与目标序列配对的专一性越“低”。
（3）Ca2+处理大肠杆菌，可以增大细胞膜的通透性，大肠杆菌变为感受态的大肠杆菌，有利于构建好的重组质粒转入受体细胞大肠杆菌。
（4）为检测 M 基因是否成功表达，可对受体菌提取的蛋白质进行抗原—抗体杂交的方法对提取的受体大肠杆菌的蛋白质进行检测。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)押题10 基因表达与基因工程中PCR关联考题
猜押 10大题型
题型01融合基因中PCR的应用
题型02 DNA复制中自修复和冈崎片段问题
题型03双脱氧测序法
题型04 DNA的粗提取实验
题型05 DNA不同片段间互为引物的问题
题型06基因工程中选酶问题
题型07 PCR引物设计及电泳条带问题
题型08外源基因插入及基因序列问题
题型09重组基因中引物选择
题型10基因工程和孟德尔定律关联考题
猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据
基因表达与基因工程中PCR关联考题 2021年山东卷第25题 2022年山东卷第13、25题 2023年山东卷第5、25题 2024年山东卷第5、25题 2025年新高考生物新结构体系下，基因表达与基因工程中PCR关联题型更注重考察学生的审题能力和知识点掌握的全面和准确性；以基础知识为引导，深入考察延伸思路。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，对知识点的背景和应用有更多的掌握。 基因工程题型要求考生在细读题干的基础上，依据题目提供的信息，联系所学的知识和方法，实现信息的迁移，达到灵活解题的目的；遇到新情境问题，应耐心读题，分析题干信息及隐含的知识点，弄清新定义的性质，按新定义的要求，“照章办事”，逐条分析、验证、运算，使问题得以解决. 难度适中，可以预测2025年选择题拓展题目命题方向将会以新情境信息题型展开命题．
题型1 融合基因中PCR的应用
1．（多选）丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB-R9-Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9-Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是（ ）
A．PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶
B．若要大量扩增LTB-R9-Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行PCR
C．融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密码子等
D．若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗原抗体杂交技术
题型2 DNA复制中自修复和冈崎片段问题
1．已知紫外线（UV）可诱导DNA单链上相邻的T之间相互结合形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对而导致复制错误引起突变，DNA修复机制对维持遗传稳定性至关重要。研究人员发现某细菌中存在两种如图所示修复机制：①光复活修复：光复活酶（PRE）在可见光下直接切割二聚体，恢复原结构；②暗修复：无需光照，通过切除损伤单链并重新合成。下列说法正确的是（ ）
A．PRE可将嘧啶二聚体的磷酸二酯键断开
B．暗修复过程中还需消耗原料、能量和引物
C．PRE基因发生碱基替换后，在光照下PRE的修复功能可能正常
D．UV诱导DNA形成嘧啶二聚体引起的变异不可遗传
2．端粒学说是细胞衰老的假说之一，研究发现，端粒缩短与DNA复制方式有关。人体细胞内DNA复制部分过程如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．图示体现了DNA半保留复制、双向复制的特点
B．图示引物为短单链核酸，复制过程中会被酶切除
C．PCR扩增的原理与生物体内DNA复制的原理相同
D．端粒缩短的原因是新合成的子链5'端变短
3．我国科学家敲除猪的糖抗原合成基因（β4GalNT2），转入相应的调节基因后，将基因编辑猪的单个肾移植给猕猴，同时切除猕猴的自体双肾，最终移植肾存活184天。在移植成功5个月内，猕猴的移植肾功能完全正常，之后出现逐渐加重的蛋白尿。下列说法正确的是（ ）
A．基因编辑猪的成功体现了动物细胞的全能性
B．出现蛋白尿的原因主要是肾小管细胞凋亡导致
C．猪和猕猴肾脏的差异体现了基因的选择性表达
D．敲除β4GalNT2能改变膜蛋白种类，降低免疫排斥反应
4．一段双链DNA的一条核苷酸链上有2个胞嘧啶（C），其中1个C被甲基化生成5-甲基胞嘧啶（5-mC），C与5-mC进一步被氧化脱氨基分别生成胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。细胞内存在尿嘧啶错配修复系统，该系统能在U的两侧将核苷酸单链切开，清除两切点间包含U的核苷酸片段后再合成正确的片段。下列说法错误的是（ ）
A．尿嘧啶错配修复系统具有限制酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的功能
B．在修复并进行复制的过程中，可能使用4种核苷酸作为原料
C．修复时，以切口处末端核苷酸链为引物延伸正确DNA片段
D．若未被修复，复制两次后，两个位点的C才都会被A替代
题型3双脱氧测序法
1．双脱氧测序法是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸。
A．上述PCR反应体系中模板链需要足够多 B．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
C．5'－TAGTGCCCATC－3'为对照个体的一段序列 D．沿电泳方向，核苷酸链长度逐渐减小
2．采用焦磷酸光化测序法进行DNA测序的原理是：将待测DNA链固定到一个磁珠上，将磁珠包被在单个油水混合小滴（乳滴）中，在该乳滴里进行独立的DNA复制，四种脱氧核苷三磷酸依照T、A、C、G的顺序一个一个进入该乳滴，如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸（PPi），PPi经过一系列酶促反应后发出荧光。下列说法错误的是（ ）
A．脱氧核苷三磷酸通过磷酸二酯键把脱氧核苷酸接到多核苷酸链的3'-OH末端
B．PPi经过一系列的酶促反应后，释放出的能量一部分可转化为光能
C．当胞嘧啶脱氧核苷三磷酸进入后能发出荧光，说明此位置模板链上为G
D．若将四种脱氧核苷三磷酸同时加入反应体系中，可大大提高DNA测序的效率
3．凝胶阻滞试验（EMSA）的基本原理是：荧光标记的DNA与蛋白质结合后分子量增大，电泳后通过荧光检测可在相应位置显示出阻滞条带。已知O2蛋白通过与ZmGRAS11基因启动子区的motif序列结合来调控ZmGRAS11基因的表达，科学家为证实motif序列是与O2蛋白结合的关键序列，利用荧光标记的motif序列作为指示探针，无荧光标记的motif序列（WT）和无荧光标记的突变motif序列（M1～M6）作为7种竞争探针，进行EMSA试验，实验结束后进行荧光检测，结果如下图所示，下列说法错误的是（ ）
注：“+”表示加入相应物质；“-”表示未加入相应物质；竞争探针足够多
A．图中“？”是指荧光标记的指示探针
B．泳道3无阻滞条带的原因是O2蛋白全部与WT探针结合
C．在竞争探针中引入突变可评估突变对竞争探针与O2蛋白结合的影响
D．突变对探针M4～M6与O2蛋白结合能力影响相对较小的是M4、M5
题型4 DNA的粗提取实验
1．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（ ）
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
题型5 DNA不同片段间互为引物的问题
1．制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A．①② B．②③ C．①④ D．③④
2．用DNaseI酶切割DNA分子，可产生一系列不同长度的DNA片段，且相邻片段只相差1个核苷酸。当DNA分子中的某一区段与特异的转录因子蛋白质结合后，加入DNaseI酶时该区段会得到保护，在凝胶电泳放射性自显影图片上会出现一个空白区“足迹”，这种检测DNA序列的方法称为DNaseI足迹法。上述过程如图所示，下列说法正确的是（ ）
A．需设置不添加DNaseI酶的对照组
B．对照组的每个DNA分子只发生一次磷酸二酯键的断裂
C．未与特定蛋白结合的DNA切割后的片段长度相同
D．此方法可筛选能与DNA进行特异性结合的目标蛋白
3．为制备带有荧光标记的DNA探针，研究人员在反应系统内只添加了DNA聚合酶、缓冲液、H2O和4种dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被荧光标记）的反应管①～③中分别加入适量单链DNA（如图）。形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。下列分析正确的是（ ）
反应管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′
反应管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′
反应管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′
A．实验中需要用荧光物质对dGTP的γ位磷酸基团进行标记
B．DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的5′端
C．反应管②的反应系统内因缺乏模板或引物不能进行PCR扩增
D．实验结束后，能得到带有荧光标记DNA探针的反应管只有③
题型6 基因工程中选酶问题
1．为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。
注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。
(1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。
(2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。
(3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。
(4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。
2．水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。
注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列
(1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列）
(2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。
(3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。
(4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。
题型7 PCR引物设计及电泳条带问题
1．大豆中转录调控因子Y 蛋白可以和某些基因启动子序列结合，促进其表达以增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。研究人员通过逆转录获得Y 基因并将其下游终止密码子对应序列剔除，然后与载体上绿色荧光蛋白基因 (GFP) 进行拼接获得融合基因。成功表达的Y-GFP融合蛋白可用于Y 蛋白调控机理的研究。
(1)研究中首先要对Y基因进行PCR扩增，扩增过程中复性的目的是 。图甲所示Y基因序列为转录的 (填“模板链”或“非模板链”)。已知EcoRI识别序列为5'-GAATTC-3'，BamHI识别序列为5'-GGATCC-3'，这些限制酶识别序列不影响融合蛋白基因的表达。为使Y基因正确接入载体并成功表达出Y-GFP 融合蛋白，Y基因下游扩增引物应 为5'- -3'(包括添加的限制酶识别序列，共写12个碱基)。
(2)将初步构建的Y-GFP 基因表达载体转入大豆细胞后，对经潮霉素筛选得到的两个不同细胞系总蛋白进行抗体检测，电泳结果如图乙所示。其中细胞系 能成功表达出Y-GFP融合蛋白 。
(3)为探究Y 蛋白能否与S 基因(大豆类固醇化合物合成的关键基因)启动子序列结合，用S基因启动子序列制作的探针进行相关实验，实验结果如图丙所示。已知Y 蛋白与DNA 序列结合后，可在凝胶电泳中产生阻滞条带。据图分析，Y 蛋白 (填“能”或“不能”) 与S 基因启动子序列结合，相比于a 条带，b条带放射性低的原因是
(4)过表达Y基因或施加外源大豆类固醇化合物均可显著增强大豆对干旱和盐胁迫的抗性。综上所述，Y蛋白增强大豆对干旱和盐胁迫抗性的机理是 。
2．RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种（如图1），①~⑥表示相关过程。
(1)参与过程①的酶有 （至少写两种）。在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，原因是 。已知①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1的碱基序列 （只写出前8个碱基即可）。
(2)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是 ，过程④常用的方法是 ，⑤过程后可用含抗生素 的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。
(3)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2（Rubisco是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据图分析，RCA对光合作用的影响及机理是 。
3．滚环扩增技术（RCA）是借鉴自然界中病原生物体环状DNA分子滚环式复制方式发展起来的一种核酸扩增方法，在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、生物小分子和病毒检测领域有着广泛应用。图1为RCA原理示意图。具核梭杆菌为一种强粘附性消化道细菌，侵入肠黏膜后可诱导局部炎症和细胞因子的表达增加，导致结直肠肿瘤的形成。科研人员采用基于RCA的荧光标记滚环扩增检测方法，实现了在微量样品及复杂环境下的高灵敏度、高特异性的检测。图2为荧光标记滚环扩增检测过程示意图，过程②是使锁式探针环化的过程。其中nusG基因为具核梭杆菌的特异性基因，锁式探针为依据nusG基因序列设计出来的单链DNA分子，由两端的检测臂和无关序列组成。只有当环境中存在靶核酸序列时，锁式探针才能完成成环连接反应。检测探针中的荧光基团（FAM）距离淬灭基团（BHQ-1）比较近时，荧光会被淬灭。
(1)由图1推测，Phi29DNA聚合酶的作用是 。与常规PCR相比，RCA缺乏 环节，因此可推测RCA扩增过程中使用的Phi29DNA聚合酶不具有 的特性。
(2)过程②锁式探针完成成环连接反应需要 的催化。肠道中含有多种微生物，为保证检测的特异性，在设计锁式探针时需保证 ，同时还需注意无关序列中不含 。
(3)若检测样品存在具核梭杆菌，检测探针中荧光基团发出荧光的原理是 。该检测方法具有高灵敏度的原因是 。
题型8 外源基因插入及基因序列问题
1．由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示。
(1)构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用 酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共需 种酶。
(2)将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入 （填“潮霉素”、“卡那霉素”或“潮霉素或卡那霉素”）进行筛选，理由是 。筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。
(3)农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形成）根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体，理由是 。
引物种类样品序号 LP+RP BP+RP
样品1 有大片段 无
样品2 有大片段 有小片段
样品3 无 有小片段
2．研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
题型9 重组基因中引物选择
1．科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
2．某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是 。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是 ；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
3．人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于 ，理由是 。
题型10 基因工程和孟德尔定律关联考题
1．某二倍体两性植物，抗病与感病、高秆与矮秆、耐盐与盐敏感分别由A/a、B/b、D/d三对基因控制，各相对性状均为完全显性。研究发现，在正常条件下，三对等位基因表达正常。在干旱胁迫下，只考虑上述三对基因的个体形成的配子中，某个基因的表达会因与其位于同一条染色体上的其他基因的影响而被抑制。为研究上述性状的遗传特性，选用该植物抗病矮秆耐盐品系（甲）和感病高秆盐敏感品系（乙）在不同条件下进行了杂交实验，实验结果如表所示。不考虑突变和交换。
组别 环境条件 亲本 F1表型及比例
实验一 正常条件 甲（）×乙（） 均为抗病矮秆耐盐
实验二 干旱胁迫 甲（）×乙（） 均为抗病高秆耐盐
(1)依据 （填“实验一”或“实验二”或“实验一或实验二”）可判断出三对相对性状的显隐性，理由是 。
(2)若实验一的F1自交后代中抗病矮秆所占比例为 ，可确定A/a和B/b两对等位基因位于一对同源染色体上。
(3)在干旱胁迫下，选取实验二F1自交获得的F2中感病高秆耐盐植株的叶片为材料，通过PCR检测每株个体中控制这3种性状的所有等位基因，以辅助确定这些基因在染色体上的相对位置关系。对被检测群体中所有个体按PCR产物的电泳条带组成（即基因型）相同的原则归类后，预期电泳图谱只有I或Ⅱ两种类型，如下图所示。已知各基因的PCR产物通过电泳均可区分，其中条带①和⑤分别代表基因D和a。
①图中条带②代表的基因是 。
②若电泳图谱为类型I，请在答题卡方框内画出F1个体三对等位基因的位置关系。 （用横线代表染色体，圆点代表基因）
③若电泳图谱为类型Ⅱ，被检测群体在F2中所占的比例为 ，其中能稳定遗传的比例为 。
(4)由上述信息可知，在干旱胁迫下，F1形成的配子中 基因受到与其位于同一条染色体上基因的影响而表达受抑制；若（3）中电泳图谱为类型Ⅱ，则干旱条件下F1减数分裂形成 （填“雌配子”、“雄配子”或“雌配子和雄配子”）时，该基因的表达会受到抑制，判断依据是 。
2．突变体是植物功能基因组学研究的基础材料，科研人员利用玉米转座酶基因和D元件的双荧光载体的转座系统（如图甲所示），进行二穗短柄草突变体培育实验。转座酶可识别D元件两端的反向重复序列并将其切离。此外，转座酶能够不断将D元件重新连接到染色体的任意位置，即完成了“转座”过程。相关实验过程、结果如下图所示。
(1)使用引物F1/R1通过PCR技术可特异性扩增转座酶基因，原因是 ；可选用 基因作为筛选基因检测植物是否被农杆菌成功转化。
(2)为了检测图中载体中的D元件是否成功在二穗短柄草基因组中发生切离，分别使用F2/R2引物和F2/R4引物对T0代转基因阳性苗进行PCR检测，已知若D元件未发生切离，使用F2/R4引物进行PCR扩增不出条带。据图丙所示植株1至10的电泳结果，既含有转座的细胞又含有未发生转座的细胞的植株是 ，原因是 。
(3)对T0代阳性植株自交得到的T1代的幼根同时观察绿色荧光（GFP）和红色荧光（RFP），得到4组结果：①GFP（+）、RFP（+）；②GFP（+）、RFP（-）；③GFP（-）、RFP（+）；④GFP（-）、RFP（-）。根据上述实验结果推测含有D元件且D元件遗传稳定性高的是 （填序号）组。
(4)研究发现，D元件随机插入染色体后获得具有突变表型的植物个体的比率较低，可能的原因有 。
3．帕金森病（PD）严重威胁中老年人健康。单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1）是临床用于治疗PD的药物之一。天然猪脑中的GM1含量低，但合成GM1的原料GD1和GT1的含量较多，GD1和GT1可在唾液酸酶的作用下生成GM1。研究人员从某菌中获取唾液酸酶基因M，与质粒P构建成基因表达载体M—P，导入大肠杆菌中，以获得唾液酸酶高产菌株，用以满足工业化生产GM1的需求。目的基因部分序列、质粒P信息、相关限制酶识别序列及切割位点如图1、图2、图3所示。
(1)启动子是 识别和结合的部位。当诱导物存在时，诱导型启动子可 目的基因的表达。图2质粒P中的GD诱导型启动子可诱导M基因以a链为模板链进行转录，据此推测M基因的转录从其 （填“左侧”或“右侧”）开始。
(2)利用PCR技术扩增M基因时，需依据图1中的已知碱基序列等信息设计引物，设计的两引物碱基序列为5′- -3′（写出8个碱基）和5′ 3′（写出8个碱基）。所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。
(3)将基因表达载体M—P导入大肠杆菌前，一般先用 （填物质）处理大肠杆菌，其目的是 。
(4)为检测M基因的表达情况，可以采用 的方法对提取的受体大肠杆菌的蛋白质进行检测。
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