考点1 植物细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会选择性地表达。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)图中过程①用纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁，得到的原生质体包括细胞膜、细胞质和细胞核三部分。
(2)酶解去壁前用较高渗透压溶液处理细胞：使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
(3)图中过程②的诱导方法有电融合法、离心法、聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生质体融合成功的标志是杂种细胞再生出细胞壁。
3．植物体细胞杂交和有性杂交的比较
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
B [酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物细胞融合，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但在两个过程中比例不同，C正确；可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。]
2．(2024·黑、吉、辽卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是( )
A．迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B．诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C．悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D．茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率
B [迷迭香顶端幼嫩的茎段含有较高的生长素和细胞分裂素，适合用作外植体，A正确；诱导愈伤组织时需加入NAA和细胞分裂素，B错误；悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，C正确；加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率，D正确。]
判断与填空
1．研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁。(2023·江苏卷T13) (×)
提示：紫菜细胞的细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，用蛋白酶无法去除细胞壁。
2．利用植物细胞培养技术在离体条件下对单个细胞或细胞团进行培养使其增殖，可获得植物细胞的某些次生代谢物。次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养。(2023·山东卷T14) (×)
提示：次生代谢物不是植物生长所必需的，其含量少，可以通过增加细胞的数量来增加次生代谢物的产量。
3．人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合。(2023·广东卷T12) (√)
4．在蓝莓组织培养过程中，宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。(2022·辽宁卷T14) (×)
提示：宜选用蓝莓幼嫩叶片为材料制备外植体，因为幼嫩叶片细胞分裂旺盛、易培养。
5．植物组织培养技术常用于商业化生产：其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。提高培养基中生长素与细胞分裂素的比值，有利于诱导生根。(2021·江苏卷T5) (√)
6．植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加______________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
提示：负反馈调节 过量赖氨酸类似物
7．利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
提示：短 脱分化
8．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是______________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________(用流程图表示)。(2019·全国Ⅱ卷T38)
提示：含目的基因的细胞愈伤组织小植株
植物细胞工程的基本技术
1．(2024·广东茂名三模)转录因子Gh1和GhE1能调控棉花愈伤组织细胞的生长发育，参与体细胞胚胎发生过程中细胞命运的重塑，其机制如图所示。下列相关分析正确的是( )
A．将愈伤组织细胞在脱分化培养基上继续培养可得到幼苗
B．Gh1基因发生甲基化可能会抑制愈伤组织细胞的增殖
C．促进GhE1基因的表达可促进愈伤组织分化成根等器官
D．Gh1与GhE1单独作用均能调控GhPs基因的表达
B [将脱分化产生的愈伤组织，在再分化培养基上继续培养可得到幼苗，A错误；Gh1基因发生甲基化，则会抑制Gh1基因的表达，不能与GhE1基因的表达产物形成复合物调控GhPs的表达，从而抑制愈伤组织细胞的增殖，B正确；促进GhE1基因的表达，可能会导致GhPs基因的表达产物增多，从而促进愈伤组织细胞的增殖，抑制愈伤组织分化成根等器官，C错误；Gh1基因与GhE1基因表达后形成的蛋白质相互结合可调控GhPs基因的表达，Gh1与GhE1单独作用不能调控GhPs基因的表达，D错误。]
2．(2024·湖南衡阳模拟)现有甲、乙两个烟草品种(2n＝48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，A/a、B/b这两对基因位于非同源染色体上。在光强度大于800 lx时，甲、乙两种烟草都不能生长，这是它们中各自存在的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲、乙两烟草品种的花粉分别培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体并混合，然后使之融合，诱导产生细胞团。随后将诱导产生的细胞团放到光强度大于800 lx的光下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。如果只考虑原生质体的两两融合，下列叙述正确的是( )
A．过程①是在无菌水中进行，需要纤维素酶和果胶酶
B．过程②是在固体培养基中进行，可用灭活的病毒诱导
C．过程③培养基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的细胞团发育成的植株自交，后代在光强度大于800 lx的光下，能生长的植株占7/16
C [过程①是在等渗或较高渗溶液中进行，而不是在无菌水中进行，A错误；过程②是诱导融合，需要在液体培养基中进行，灭活的病毒可诱导动物细胞融合，B错误；过程③培养基中通常添加蔗糖作碳源和能源，C正确；据题分析可知，基因型为AaBb的细胞团能分化发育成植株，该植株自交产生的后代中，在光强度大于800 lx的光下能生长的植株的基因型为A_B_，所占比例为3/4×3/4＝9/16，D错误。]
植物体细胞工程的应用
3．(2024·湖南长沙二模)红豆杉(2n＝24)能产生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生长迅速。红豆杉—柴胡是通过植物细胞工程培育的一种既能产生紫杉醇，又能迅速生长的杂交植株。部分培育过程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．获得原生质体的过程需要用纤维素酶和胰蛋白酶去除细胞壁
B．过程①可用高Ca2+—高pH融合法诱导，利用了细胞膜的流动性
C．过程②的培养基中需添加适量的生长素类和赤霉素类植物生长调节剂
D．红豆杉—柴胡杂种植株是二倍体，能够产生可育配子
B [植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，获得原生质体的过程需要用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞的细胞壁，A错误；过程①是诱导原生质体融合，可用高Ca2+—高pH融合法，利用了细胞膜的流动性，B正确；过程②为脱分化，该过程需要在培养基中添加适量的生长素类和细胞分裂素类植物生长调节剂，C错误；红豆杉—柴胡杂种植株是异源四倍体而不是二倍体，能够产生可育配子，D错误。]
4．(2024·山东淄博二模)铁皮石斛是名贵中药，其有效成分生物碱为细胞的次生代谢物。研究人员将铁皮石斛的营养芽采用组织培养技术培养成拟原球茎(PLBs，类似愈伤组织)，培养过程中PLBs重量、生物碱含量的变化如图。下列说法错误的是( )
A．在培养前应对营养芽进行消毒，在火焰旁进行接种操作可减少污染
B．因新生营养芽的细胞分化程度低，作外植体培养时容易诱导形成PLBs
C．诱导营养芽形成PLBs的过程称为细胞的脱分化，生物碱为该过程提供营养
D．与黑暗条件相比，PLBs在光照条件下的生长起始时间早、快速生长时间长
C [在接种前对外植体进行消毒，并在火焰旁进行接种可减少污染，A正确；选用新生营养芽为外植体是因为其分化程度低、分裂能力旺盛且几乎不携带病毒，作外植体培养时容易诱导形成PLBs，B正确；生物碱为细胞的次生代谢物，不能提供营养，C错误；由图可知，与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下的生长起始时间早、快速生长时间长，D正确。]
考点2 动物细胞工程和胚胎工程
1．动物细胞培养
(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
(2)区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。
2．克隆动物培育的流程
3．胚胎早期发育过程
4．胚胎移植的生理学基础
5．“试管羊”“克隆羊”和“转基因羊”的产生过程比较
1．(2024·黑、吉、辽卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
D [传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定，适合进行传代培养，离体培养的细胞生命力比较脆弱，需要适应培养基的环境，传代最好在细胞生长覆盖瓶底80%～90%进行，选取②的细胞进行传代培养比①更合理，B错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C错误；细胞密度过大、营养物质减少、代谢废物增多，都会导致细胞停止分裂而进入平台期，D正确。]
2．(不定项)(2024·江西卷)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是( )
A．利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞
B．制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体
C．用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，但不能冻存
D．单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白
AD [胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A正确；由于S蛋白含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，单克隆抗体A和单克隆抗体B可能来自不同的杂交瘤细胞，因此制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B不一定是相同的单克隆抗体，B错误；用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冻存，C错误；单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D正确。]
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如下表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是( )
甲的浓度 (μg/mL) 卵母细 胞(个) 第一极体 排出(个) 成熟率 (%) 卵裂数 (个) 卵裂率 (%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
A [由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；对照组第一极体排出个数为70个，甲浓度过高(＞10 μg/mL，第一极体排出个数＜70)抑制第一极体的排出，B正确；添加1 μg/mL的甲，卵裂数和卵裂率均增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确；据题分析可知，作为卵母细胞成熟的判断标准是第一极体的排出，D正确。]
判断与填空
1．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(2023·海南卷T7) (×)
提示：营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞也会发生接触抑制。
2．甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，需要制备用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) (√)
3．科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作有细胞核移植。(2023·广东卷T3) (√)
4．在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术，其中胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) (×)
提示：胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活率越小。
5．哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质。(2022·江苏卷T4) (×)
提示：哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、无机盐等。
6．兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是实验材料取自小鼠胚胎的脑组织。(2022·湖北卷T7) (√)
7．将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷T11) (×)
提示：将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导融合后的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等。
8．在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的初级卵母细胞。(2020·天津卷T1) (×)
提示：在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数分裂Ⅱ中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。
9．经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。(2020·山东卷T14) (×)
提示：胚胎移植通常选择囊胚期之前的阶段，如桑葚胚或囊胚阶段。
10．与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)______________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(2023·湖北卷T22)
提示：不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
11．与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是______________________________________________________________________________________。(2021·湖南卷T22)
提示：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难
动物细胞的培养及核移植
1．(2024·广东佛山二模)卡铂为广谱抗肿瘤药，通过抑制DNA复制而起效。卡铂微溶于水，其水溶液在光下不稳定，溶液中的Cl－也会促进其分解。临床上用5%葡萄糖溶液与卡铂制成卡铂试剂后注射治疗，口服无效。相关实验的设计思路如下图，下列说法正确的是( )
A．本实验的自变量是卡铂试剂和DNA复制抑制剂的有无
B．本实验可用生理盐水代替5%葡萄糖溶液来配制卡铂试剂
C．本实验预期结果为①与④组数据接近，②与③组数据接近
D．宫颈癌细胞培养时的气体环境是95%氧气和5% CO2
A [由题图分析可知，本实验的自变量是卡铂试剂、DNA复制抑制剂的有无，A正确；生理盐水中含Cl－，会促进卡铂的分解，失去疗效，因此不可用生理盐水代替5%葡萄糖溶液来配制卡铂试剂，B错误；①组不会抑制DNA的复制，④组会抑制DNA的复制，所以预期实验结果不相近，C错误；宫颈癌细胞培养时的气体环境是95%空气和5% CO2，D错误。]
2．(2024·吉林松原联考)种间体细胞核移植(iSCNT)将供体动物体细胞与来自不同种、科、目或纲的家畜(驯养动物)的去核卵母细胞融合并激活，以获得较多的重构胚，进而获得动物个体，是体细胞核移植(SCNT)中极具潜力的研究方向之一。由于多种野生动物数量稀少且呈持续下降趋势，因此采集精子或卵子开展常规辅助生殖较为困难，甚至无法完成，而从活体或死后不久的野生动物体内采集体细胞利用iSCNT技术获得动物个体，可在一定程度上维持濒危动物数量。下列叙述正确的是( )
A．iSCNT技术必须通过显微操作技术将供体细胞的细胞核取出，然后注入去核的卵母细胞
B．若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的固体培养基进行培养
C．iSCNT技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2+激活重构胚
D．同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同
D [据题分析可知，iSCNT技术可以通过显微操作技术将供体细胞注入去核的卵母细胞，A错误；若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的液体培养基进行培养，以增加体细胞的数目，B错误；iSCNT技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2+载体激活重构胚，C错误；在种间体细胞核移植过程中，去核的卵母细胞来自不同种、科、目或纲的家畜(驯养动物)，获得的重构胚的细胞质遗传物质可能不同，因此同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同，D正确。]
动物细胞融合及单克隆抗体
3．(2024·河北衡水二模)科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，基本流程如下。下列相关叙述正确的是( )
A．注射的特定抗原是正常肺细胞和肺癌细胞共有的大分子
B．抗体—肺癌药物偶联物中a代表肺癌药物，b代表抗体
C．经②③最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体
D．抗体—肺癌药物偶联物只能定向运输至肺癌细胞，将其杀伤
C [根据题意可知，科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，据此可推测，该单抗制备过程中需要注射的特定抗原是肺癌细胞特有的大分子，A错误；抗体—肺癌药物偶联物中b代表肺癌药物，a代表抗体，B错误；经②③两次筛选最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体，而后对其进行大量体外或体内培养，获得特定的抗体，C正确；抗体—肺癌药物偶联物能运输到全身各处，但只能定向作用至肺癌细胞，将其杀伤，D错误。]
4．(不定项)(2024·湖南长郡中学模拟)一种抗体只能结合一种抗原。科研工作者设法获得一种三特异性抗体，实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞(MM)的选择性杀伤，作用机理如图所示。下列叙述正确的是( )
A．同时给小鼠注射3种抗原可刺激小鼠浆细胞分泌得到三特异性抗体
B．推测T淋巴细胞中也会大量表达CD38基因
C．三特异性抗体通过T细胞的活化并释放细胞因子提高对MM的杀伤力
D．三特异性抗体与CD28和TCR结合可保持较高的T细胞数量和活性
CD [一种浆细胞只能分泌一种抗体，A错误；据题意可知，三特异性抗体能实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞(MM)的选择性杀伤，原因是CD38基因在正常体细胞中不表达或者表达量很低，B错误；三特异性抗体能促进T细胞活化产生并释放细胞因子，细胞因子会促进T淋巴细胞的活化，从而提高机体对MM的杀伤力，C正确；据图可知，一方面三特异性抗体与T细胞膜上的CD28结合，抑制T细胞死亡，另一方面特异性抗体与T细胞膜上的TCR结合，促进T细胞活化，所以三特异性抗体与CD28和TCR结合可保持较高的T细胞数量和活性，D正确。]
胚胎工程技术及其应用
5．(2024·广西南宁二模)目前发现的双胞胎有同卵双胞胎、异卵双胞胎和“半同卵双胞胎”。1对“半同卵小姐弟双胞胎”形成过程如图所示，图中染色单体分离后分别移向细胞的三个不同方向，从而分裂成a、b、c三个细胞，染色体全部来自父系的“合子”致死。其中两个细胞发育成姐弟二人。下列说法正确的是( )
A．受精卵发育为桑葚胚的过程是在透明带内完成的，孵化后进入囊胚期阶段
B．卵子在子宫内发育成熟并完成受精过程
C．若细胞a的染色体组成为MP1，则细胞b的染色体组成为MP2
D．这对双胞胎来源于母亲的染色体相同，来源于父亲的染色体不一定不同
C [囊胚期时，囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化，A错误；卵子在输卵管内发育成熟并完成受精过程，B错误；来自母系的染色体为M，来自父系的染色体为P1、P2，经过复制后，染色体进行组合，若细胞a的染色体组成为MP1，细胞c的染色体均来自父亲，其染色体组成为P1P2，细胞b的染色体组成为MP2，C正确；细胞a的染色体组成为MP1，细胞b的染色体组成为MP2，这对双胞胎发育为姐弟，来源于父亲的性染色体不同，D错误。]
6．(2024·海南海口一模)近年来由于栖息地丧失和人为捕猎，亚洲黑熊数量骤减，科学家期望通过体内受
精、胚胎移植等方法拯救亚洲黑熊，其过程如下图。以下说法正确的是( )
A．胚胎工程一般采用促性腺激素释放激素处理A使其超数排卵
B．E后代遗传性状与A和C一致，F后代遗传性状与B一致
C．D受体雌性必须和A、B同期发情处理
D．A排出的卵子必须培养成熟到MⅡ期才能与C的获能精子受精
D [胚胎工程一般采用促性腺激素处理A使其超数排卵，A错误；E后代(由A的卵细胞和C的精子体内受精形成的受精卵发育形成)遗传物质来源于A和C，E后代遗传性状与A和C一致，而F后代(A的卵细胞提供细胞质，B提供细胞核)遗传物质来源于A和B，F后代遗传性状大部分与B一致，少部分与A相同，B错误；D受体雌性接受来自动物园亚洲黑熊♀A体内的胚胎，所以必须和动物园亚洲黑熊♀A同期发情处理，而野生亚洲黑熊♀B只需要提供体细胞，所以不需要同期发情处理，C错误；A超数排卵排出的细胞必须培养成熟到MⅡ期才具有受精能力，因此A排出的卵子必须培养成熟到MⅡ期才能与C的获能精子受精，D正确。]
考点3 基因工程和蛋白质工程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
提醒：辨析农杆菌转化法中的“两次拼接与两次导入”
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
3．PCR
(1)PCR的原理与条件等
(2)PCR反应过程
(3)PCR过程中引物的设计
①引物设计有3条基本原则
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体等结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
②引物设计的注意事项
A．引物的长度一般为20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不应大于38 bp，因为过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于耐高温的DNA聚合酶进行反应。
b．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3′端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3′端出现3 个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发概率增加。
c．引物序列的GC含量一般为40～60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．对引物的修饰一般是在5′端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况下只能退而求其次，尽量去满足条件。
4．蛋白质工程
5．DNA的粗提取与鉴定
6．DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-________-3′和5′-________-3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
[解析] (1)在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。结合BsaⅠ识别序列可知，BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4＝44种。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，以题述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两个条带，目标序列是一个条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测却发现其体细胞中只有一条染色体有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
[答案] (1)低 44 GTTT CAAT (2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的____________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________________，理由是__________________________________
____________________________________________________________________。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_________________________________________________
____________________________________________________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与pMag-T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为抑制杂菌和去除丢失质粒的菌株。(4)由(2)分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。
[答案] (1)碳源、氮源 (2)PT7、PBAD和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达 (3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株 (4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素 (5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶
判断与填空
1．构建重组质粒需要使用DNA连接酶。属于DNA连接酶底物。(2023·湖北卷T22) (√)
2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(2022·山东卷T13) (×)
提示：离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀。
3．采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。(2022·江苏卷T6) (√)
4．我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列。(2021·山东卷T4) (√)
5．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。增加模板DNA的量可减少反应中非特异条带的产生。(2021·湖北卷T16) (×)
提示：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应中非特异条带。
6．热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增，与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物。(2021·江苏卷T23) (√)
7．用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__________________。(2023·广东卷T20)
提示：运载体 启动子和终止子
8．农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(2023·海南卷T20)
提示：农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上
9．制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________________________________________________________________。
(2023·全国甲卷T38)
提示：筛选 RNA聚合酶
10．为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是___________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山东卷T25)
提示：能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5′端
11．某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR扩增时，需在__________________________催化下，在引物________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(2022·江苏卷T24)
提示：溶解DNA 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 3′
基因工程的原理及应用
1．(2024·湖北八市联考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是( )
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
B [图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；目的基因两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；PCR技术扩增目的基因时，若复性温度偏低，则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目标序列，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。]
2．(2024·山东泰安二模)为获得转Gata3-RFP融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。
(1)在PCR反应溶液中常添加________，其作用是__________________________。在利用PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的________(填“3′”或“5′”)端需分别插入___________的限制酶识别序列，以使RFP基因能正确插入载体中。用于扩增RFP编码区序列的引物需满足的条件是________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有______________________________________。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠(P)进行杂交获得F1若干，选取1～5五只小鼠，从中提取含Gata3基因的相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则________小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增，________(填“能”或“不能”)区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物，结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA________个(用科学计数法表示)，在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受______________________________的影响。
[解析] (1)PCR的全称是聚合酶链式反应，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，所以PCR反应溶液中一般要添加Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶的活性。若要对RFP基因进行扩增，需在引物的5′端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3′端添加限制酶识别序列，会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切时，调控序列会被破坏。RFP基因的终止子在右侧(即转录方向为从左到右)，故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计时：R引物末端插入对应下方载体的MunⅠ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的XhoⅠ酶切位点，又因为RFP基因中含有的XhoⅠ和MunⅠ酶切位点，因此不能用XhoⅠ和MunⅠ酶来切割，否则会破坏基因序列。结合题干中所给的5种限制酶的识别序列，XhoⅠ和SalⅠ互为同尾酶(即切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切酶)；MunⅠ和EcoRⅠ互为同尾酶。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择SalⅠ，这样可以与下方载体中XhoⅠ的酶切位点结合；同理R末端应选用与MunⅠ同尾的EcoRⅠ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有效片段，又能使之正确转录。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，由于扩增目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。(2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要限制酶，且载体构建过程中用到DNA扩增技术，所以还需要Taq DNA聚合酶，载体构建完成还需要DNA连接酶将DNA片段连接起来。(3)Gata3-RFP基因为大片段，故结合图乙可知1和5小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。由图乙可知，RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带，故用引物A和B进行PCR扩增，不能区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子。(4)100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA：100×20×210＝2.048×106。根据题干“经若干次循环后，低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物”可知，该过程中ss-DNA的产生量主要受限制性引物和非限制性引物比例的影响。
[答案] (1)Mg2+ 激活DNA聚合酶的活性 5′ SalⅠ、EcoRⅠ 分别与两条模板链(RFP编码区序列)3′端的碱基序列互补 (2)Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶 (3)1和5 不能 两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带 (4)2.048×106 限制性引物和非限制性引物比例
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．(2024·湖北武汉二模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是( )
A．需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B．应在PCR扩增体系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生
D．用酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子
B [PCR引物一般是单链DNA，A错误；PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，B正确；复性温度过低会增加PCR中非特异性条带，C错误；用酶B作用后进行电泳，得到2条条带，据此无法判断是否为杂合子，D错误。]
4．(2024·广东梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将光敏色素基因A转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是( )
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
C [由图分析可知，构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。]
DNA的粗提取及鉴定实验
5．(2024·山东青岛一模)“DNA的粗提取与鉴定”的实验步骤：研磨→去杂质→析出→鉴定。某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法错误的是( )
去杂质方式 沉淀质量/g DNA浓度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鉴定
离心 0.068 81.5 1.53 蓝色
4 ℃冰箱静置 0.102 8 336.4 1.41
注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时的离心转速
B [DNA的粗提取与鉴定实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；析出时的离心转速明显高于去杂质时的离心转速，D正确。]
蛋白质工程及应用
6．(2024·天津和平区二模)人工接种纯种毛霉生产的腐乳滋味平淡、香气不佳，研究人员欲从自然发酵的传统腐乳中筛选出新的毛霉菌株改良腐乳风味。他们想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，下图为M4菌株改造的基本思路。关于图中M4菌株改造的基本思路，下列说法错误的是( )
A．预期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．获得A的基本策略是定点突变
C．获取目的基因时可采用PCR技术
D．预期产品一定具备预期的蛋白质功能
D [腐乳制作的原理主要是利用毛霉等微生物产生的蛋白酶、脂肪酶的催化作用，蛋白质最终被水解为氨基酸，脂肪被水解为甘油和脂肪酸，故预期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶，A正确；根据应有的氨基酸序列，推测基因的碱基序列，进而可通过定点突变获取目的基因，B正确；获取目的基因时可采用PCR技术，该技术是体外扩增目的基因的技术，可实现短时间获得大量目的基因，C正确；理论上预期产品应该具备预期的蛋白质功能，但在实际操作过程中可能存在技术上或者其他方面的问题，可能导致获得的蛋白质没有相应的功能，D错误。]
课后限时集训(十三) 细胞工程和基因工程
(建议用时：30分钟)
一、选择题
1．(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
D [在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。]
2．(2024·湖北武汉模拟预测)青霉菌(属真菌)发酵为高耗氧过程，透明颤菌(属细菌)可通过在低氧条件下高表达血红蛋白以促进氧气供应和增强细胞呼吸。下图为将透明颤菌的血红蛋白引入青霉菌的方案。下列说法错误的是( )
A．处理①、②中都可以用溶菌酶去除细胞壁
B．处理③可用电融合法或者聚乙二醇融合法
C．处理④需将融合细胞接种在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培养基上
D．为验证方案是否成功可在低氧条件下培养杂种菌株并检测其密度
A [透明颤菌属于细菌，细胞壁的成分主要是肽聚糖，可用溶菌酶去除细胞壁，但青霉菌是真菌，细胞壁成分主要是几丁质，不能用溶菌酶去除细胞壁，A错误；处理③可用物理法电融合法或化学法聚乙二醇等诱导融合，B正确；处理④在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培养基培养融合细胞，能够生长的即为杂种菌株，C正确；青霉菌(属真菌)发酵为高耗氧过程，透明颤菌(属细菌)可通过在低氧条件下高表达血红蛋白以促进氧气供应和增强细胞呼吸，为验证方案是否成功可在低氧条件下培养杂种菌株并检测其密度，D正确。]
3．(2024·福建福州模拟)植物体细胞通常被诱导为愈伤组织后才能表现全能性。研究发现，愈伤组织的中层细胞是根或芽再生的源头干细胞，其在不同条件下，通过基因的特异性表达调控生长素、细胞分裂素的作用，表现出不同的效应(见下表)。已知生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生；反之，有利于芽的再生。下列推论合理的是( )
条件 基因表达产物和相互作用 效应
① WOX5 维持未分化状态
② WOX5＋PLT 诱导出根
③ WOX5＋ARR2，抑制ARR5 诱导出芽
A．WOX5失活后，中层细胞会维持干细胞特性
B．WOX5＋PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累
C．ARR5促进细胞分裂素积累或提高细胞对细胞分裂素的敏感性
D．体细胞中生长素和细胞分裂素具有协同作用
B [根据表格信息可知，WOX5能维持未分化状态，使植物细胞保持分裂能力强、较高的全能性，若WOX5失活后，中层细胞会丧失干细胞分裂能力强、分化程度低的特性，A错误；由题干信息“生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生”，再结合表格信息，WOX5＋PLT可能诱导出根，可推测WOX5＋PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累，B正确；由题意可知，生长素的生理作用小于细胞分裂素时有利于芽的再生，而抑制ARR5能诱导出芽，可知ARR5被抑制时细胞分裂素较多，故可推测ARR5抑制细胞分裂素积累或降低细胞对细胞分裂素的敏感性，C错误；出芽或出根都是生长素与细胞分裂素含量不均衡时才会发生，故可推测体细胞中生长素和细胞分裂素的作用可能相互抑制，D错误。]
4．(2024·山东聊城二模)灌流式培养是在细胞培养管内，一边不断注入新鲜培养基，一边将培养液的上清液不断移出。区别传统的悬浮培养，灌流式培养可避免因细胞密度过大、有害代谢物积累等因素而使细胞分裂受阻的现象出现。下列叙述正确的是( )
A．灌流式培养的细胞会贴壁生长，但不会出现接触抑制的现象
B．灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的
C．灌流速率越高，营养物质利用越充分
D．向培养管注入的新鲜培养基中补充动物血清是为了防止杂菌污染
B [据题分析可知，灌流式培养的动物细胞可以避免出现贴壁生长的现象，A错误；灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的，B正确；过高的灌流速率，会导致培养的细胞不能及时利用营养物质，而使营养物质不能得到充分利用，C错误；补充动物血清是为了提供动物细胞培养所需要的营养物质和某种生长因子，D错误。]
5．(2024·湖北华中师大附中模拟)慢性乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，HBV在患者体内持续存在且含量较高。E肽是HBV的一种外壳蛋白，可作为抗原被宿主免疫系统识别并应答。为治疗和预防慢性乙肝，科研人员设计了以下方案，合理的是( )
A．输入乙肝康复者的血清可治疗和长期预防乙肝
B．将E蛋白重组到腺病毒基因组中可制成乙肝疫苗
C．利用单克隆抗体技术获得的抗E蛋白抗体，可用于检测乙肝
D．将E蛋白对应的mRNA制成疫苗，可刺激机体在血浆中表达出E蛋白
C [乙肝康复者的血清中含有对抗乙肝病毒的抗体，因而可治疗乙肝，但抗体不具有长久性，A错误；将E蛋白的相关基因重组到腺病毒基因组中可制成乙肝疫苗，B错误；利用单克隆抗体技术获得的抗E蛋白抗体，可用于检测乙肝病毒的存在，C正确；将E蛋白对应的mRNA制成疫苗，可进入细胞内编码出相应的抗原蛋白，进而刺激机体产生特异性免疫反应，而E蛋白的合成过程不会发生在血浆中，D错误。]
6．(2024·甘肃卷)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是( )
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
B [促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ中期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。]
7．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
8．(2024·广东汕头二模)当水稻处于高Na＋环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H＋浓度梯度将Na＋排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是( )
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na＋运输到细胞外
B．将SOS1基因插入表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1-GFP基因的纯合子
D [由题意可知，当水稻处于高Na＋环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H＋浓度梯度以主动运输的方式将Na＋排到细胞外，A正确；SOS1基因含有限制酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，所以将SOS1基因插入表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ，B正确；检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增，C正确；F2和R2为绿色荧光蛋白基因(GFP)的引物，无法检测到是否含有SOS1基因，D错误。]
9．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA。构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( )
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
A [题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(gadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶(gadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠是反应原料，而非起供能作用，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；据题中信息无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。]
10．(2024·湖北武汉二模)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Ga14蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
A．斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．ERE直接驱动了GFP基因的表达
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
B [将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体 E 物质，推测斑马鱼的某些细胞存在 E 物质的受体，A正确；结合题图，ERE诱导Ga14基因转录，其翻译产物Ga14蛋白与USA结合驱动了GFP基因的表达，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B错误；用于监测 E 物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D正确。]
11．(不定项)(2024·湖南岳阳模拟)东南景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述错误的是( )
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
ABD [由于引物接在了目的基因的两侧，因此经过两轮PCR后，可获得与HMA3基因等长的DNA单链，故若要获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；质粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含普通质粒的受体细胞，D错误。]
12．(不定项)(2024·山东潍坊三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析错误的是( )
A．敲除2、3、4片段引起的变异属于染色体变异
B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA
C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子
D．图2中，3、5、7个体的体内均能检测到PD-1
ABD [据图分析，将野生型基因内部的部分碱基剪切，改变的是基因内部的碱基序列，属于可遗传变异中的基因突变，A错误；分析图1可知，要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要设计2个sgRNA，B错误；基因敲除后，其核苷酸数量减少，电泳时移动速度快，距离加样孔的位置远，4和12个体均为基因敲除纯合子，因此4和12个体杂交的子代均为基因敲除纯合子，C正确；3个体的基因未敲除，5个体为基因敲除杂合子，7个体为基因敲除纯合子，因此3和5体内均能检测到PD-1，7个体检测不到PD-1，D错误。]
二、非选择题
13．(2024·广东广州二模)癌症的免疫疗法通过重新激活抗肿瘤的免疫细胞，克服肿瘤的免疫逃逸，科研人员在不断研究中发现多种免疫治疗方法的结合是提高治疗效果的途径之一。请回答下列问题：
(1)免疫系统能够识别和清除突变的细胞，这体现了免疫系统的________功能。
(2)由于基因突变，癌细胞表面物质发生改变，如某些种类癌细胞表面高表达膜蛋白PSMA和PD-L1。图1中PD-L1能抑制T细胞的活化，使癌细胞发生免疫逃逸。临床上可利用PD-1的单克隆抗体进行癌症治疗，据图1推测，其原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)CD28是T细胞表面受体，T细胞的有效激活依赖于CD28在癌细胞与T细胞结合部位的聚集。因此，科研人员尝试构建既能结合PSMA，又能结合CD28的双特异性抗体PSMA×CD28，诱导T细胞定向杀伤癌细胞，如图2所示。
制备过程：先将________________分别注射到小鼠体内，分离出B淋巴细胞，诱导其与小鼠的骨髓瘤细胞融合，筛选得到________________，再诱导两种细胞融合。成功融合的细胞会表达两种L链和两种H链，由于________________会产生多种抗体，因此还需进行筛选，才能获得所需的双特异性抗体PSMA×CD28。
(4)科研人员将癌细胞和T细胞共同培养，加入不同抗体，比较不同抗体对T细胞活化的作用。实验各组由活化T细胞产生的细胞因子IL-2含量如图3所示，实验结果说明________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)免疫系统能够识别和清除突变的细胞，这体现了免疫系统的免疫监视功能。(2)图1中癌细胞表面的PD-L1和T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的活化。PD-1的单克隆抗体与PD-1特异性结合，阻断了PD-L1和PD-1的结合，避免PD-L1抑制T细胞的活化。(3)制备双特异性抗体PSMA×CD28，则抗原是CD28和PSMA，将两种物质分别注射到小鼠体内，分离出两类B淋巴细胞，将这两类B淋巴细胞分别和小鼠的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，再诱导杂交瘤细胞融合。成功融合的细胞会表达两种L链和两种H链，所需的双特异性抗体PSMA×CD28是特定的L链和H链结合形成的，由于L链和H链随机组合，因此还需要进行筛选，才能获得所需的抗体。(4)自变量是抗体种类，分析图3可知，PSMA×CD28和PD-1单抗联合使用能够显著激活T细胞，且在一定范围内激活作用随抗体浓度的增加而增强；单独使用PSMA×CD28或PD-1单抗都不能显著激活T细胞。
[答案] (1)免疫监视 (2)PD-1的单克隆抗体与PD-1结合，阻断了PD-1和PD-L1的结合，避免PD-L1抑制T细胞的活化 (3)PSMA、CD28 两种杂交瘤细胞 L链和H链随机组合 (4)PSMA×CD28和PD-1单抗联合使用能够显著激活T细胞，且在一定范围内激活作用随抗体浓度的增加而增强；单独使用PSMA×CD28或PD-1单抗都不能显著激活T细胞(合理即可)
14．(2024·山东潍坊二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。
注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ为限制酶。
(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有____________________________。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5′端序列与_________________互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为________________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′
②5′-…TAAGTTGTCT-3′
③5′-…ATTCAACAGA-3′
④5′-…TCTGTTGAAT-3′
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是______________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示：
部位 根 茎 叶
完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝
缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝
分析表明，该激素最主要的合成部位是________，通过实验结果分析该激素的生理作用是____________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)由题图信息可知，利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，所以无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5′端序列与F1(或P基因左侧)3′端序列互补。(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒选用的限制酶为BclⅠ和SmaⅠ。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3′端序列可以与④5′-…TCTGTTGAAT-3′配对，5′端序列的互补链可以与①5′-…CTTGGATGAT-3′配对，因此选用的引物组合为①④。(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收。
[答案] (1)DNA聚合酶和DNA连接酶 F1(或P基因左侧)3′端序列 (2)BclⅠ和SmaⅠ ①④
(3)先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞 (4)根 促进植物对磷元素的吸收
(教师用书独具)
(2024·湖南衡阳三模)Ⅰ.复椰子树属棕榈复椰子属，树高15～30米，树干通直，直径约30厘米，叶呈大扇形，长7米，宽2米，雌雄异株。复椰子树的雌花从受粉到果实成熟需要10～13年之久，种子发芽期也需3年，而且要求烈日照晒。由于复椰子树种子形状奇特，体积庞大(重达20千克，直径30厘米)有些人将它用作容器，如今复椰子树已濒临灭绝。复椰子果肉煮汤饮服，有治疗久咳和止血的功效。有人想到了一个好的方法，制造“人工种子”，解决复椰子树的种子形成时间漫长的问题。其操作流程如下：
(1)图中的外植体是_______________________，先用________冲洗，再消毒。常用的消毒剂是_____________________________(写两种)。
(2)人工种皮除了有保护作用以外，还要有________性，以满足胚状体代谢的需要。为了保证胚状体在适宜条件下成功发芽发育成幼苗，而不会腐败变质，人工胚乳除加入适量的养分(如水、无机盐、有机碳源)外，还可以适当添加农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些_________________________(填“植物激素”“植物生长调节剂”或“生长素类似物”)。
Ⅱ.科研人员构建了可表达WRK10-MYC融合蛋白的重组农杆菌 Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，该质粒的部分结构如图2所示，其中Kan为卡那霉素抗性基因，Hyg为潮霉素抗性基因，MYC标签序列编码标签短肽 MYC，WRK10 蛋白为转录因子。
(3)位于 Ti 质粒不同位置的卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的作用分别是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
图中启动子的方向与对应基因转录的方向一致，从编码链的角度分析 P1 和 P2方向不同的原因是___________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)已知利用LP 和 RP扩增结果为大带，BP 和 RP扩增结果为小带。可用图中三引物进行两次PCR 的方法鉴定转基因植物后代中的纯合转基因植株。T-DNA 插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，则纯合转基因植株 PCR 检测结果为________(填“大带”“大带和小带”或“小带”)。
[解析] (1)进行植物组织培养时，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体。外植体消毒过程中，用酒精擦拭双手和超净工作台台面，将流水充分冲洗后的外植体用酒精消毒30 s，然后立即用无菌水清洗2～3次，再用次氯酸钠溶液处理30 min后，立即用无菌水清洗2～3次。(2)胚状体相当于种子中的胚，若氧气不足，细胞无氧呼吸产生酒精，会导致人工种子坏死，故种皮除有保护作用外，还要有透气性。人工胚乳要为胚状体的发育提供营养物质，故要加入适量的养分(如水、无机盐、有机碳源)；外界环境中许多微生物与胚状体的细胞竞争营养物质，也可能寄生在胚状体细胞中，故可以适当添加农药、抗生素、有益菌等；植物生长调节剂是人类合成的，对植物生长、发育有重要调节作用的化学物质，具有原料广泛、容易合成、效果稳定等优点，为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。(3)构建了可表达WRK10-MYC 融合蛋白的重组农杆菌Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，先构建含有重组 Ti 质粒的农杆菌，然后在让该农杆菌去侵染植物细胞，如图，Hyg为潮霉素抗性基因，位于T-DNA 片段上，故卡那霉素抗性基因可用于筛选成功转化的农杆菌(或用于筛选重组农杆菌或成功导入了质粒的农杆菌)；潮霉素抗性基因可用于筛选成功转化的植物细胞(或筛选转基因植物细胞或成功导入了目的基因的植物细胞)。基因转录的方向是5′→3′，而启动子的方向与对应基因转录的方向一致，故P1和P2方向不同的原因是潮霉素抗性基因的编码链是 b 链(或Hyg基因所对应的编码链是b链)，WRK10基因的编码链是a链。(4)BP位点在T-DNA片段上，又T-DNA 插入植物染色体 DNA 分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，故纯合转基因植株 PCR 检测结果为 BP 和 RP 扩增的小带。
[答案] (1)离体的植物器官、组织或细胞 流水 酒精和次氯酸钠溶液 (2)透气 植物生长调节剂 (3)卡那霉素抗性基因可用于筛选成功转化的农杆菌(或用于筛选重组农杆菌或成功导入了质粒的农杆菌)；潮霉素抗性基因可用于筛选成功转化的植物细胞(或筛选转基因植物细胞或成功导入了目的基因的植物细胞) 潮霉素抗性基因的编码链是b链(或Hyg基因所对应的编码链是b链)，WRK10基因的编码链是a链 (4)小带
21世纪教育网(www.21cnjy.com)考点1 植物细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会________________。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)图中过程①用____________________处理去除细胞壁，得到的原生质体包括细胞膜、细胞质和细胞核三部分。
(2)酶解去壁前用较高渗透压溶液处理细胞：使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
(3)图中过程②的诱导方法有________、离心法、________________________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生质体融合成功的标志是________________________________。
3．植物体细胞杂交和有性杂交的比较
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
2．(2024·黑、吉、辽卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是( )
A．迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B．诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C．悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D．茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率
判断与填空
1．研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁。(2023·江苏卷T13) ( )
2．利用植物细胞培养技术在离体条件下对单个细胞或细胞团进行培养使其增殖，可获得植物细胞的某些次生代谢物。次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养。(2023·山东卷T14) ( )
3．人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合。(2023·广东卷T12) ( )
4．在蓝莓组织培养过程中，宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。(2022·辽宁卷T14) ( )
5．植物组织培养技术常用于商业化生产：其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。提高培养基中生长素与细胞分裂素的比值，有利于诱导生根。(2021·江苏卷T5) ( )
6．植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加______________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
7．利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
8．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是____________________________
_____________________________________________________________________(用流程图表示)。(2019·全国Ⅱ卷T38)
植物细胞工程的基本技术
1．(2024·广东茂名三模)转录因子Gh1和GhE1能调控棉花愈伤组织细胞的生长发育，参与体细胞胚胎发生过程中细胞命运的重塑，其机制如图所示。下列相关分析正确的是( )
A．将愈伤组织细胞在脱分化培养基上继续培养可得到幼苗
B．Gh1基因发生甲基化可能会抑制愈伤组织细胞的增殖
C．促进GhE1基因的表达可促进愈伤组织分化成根等器官
D．Gh1与GhE1单独作用均能调控GhPs基因的表达
2．(2024·湖南衡阳模拟)现有甲、乙两个烟草品种(2n＝48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，A/a、B/b这两对基因位于非同源染色体上。在光强度大于800 lx时，甲、乙两种烟草都不能生长，这是它们中各自存在的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲、乙两烟草品种的花粉分别培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体并混合，然后使之融合，诱导产生细胞团。随后将诱导产生的细胞团放到光强度大于800 lx的光下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。如果只考虑原生质体的两两融合，下列叙述正确的是( )
A．过程①是在无菌水中进行，需要纤维素酶和果胶酶
B．过程②是在固体培养基中进行，可用灭活的病毒诱导
C．过程③培养基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的细胞团发育成的植株自交，后代在光强度大于800 lx的光下，能生长的植株占7/16
植物体细胞工程的应用
3．(2024·湖南长沙二模)红豆杉(2n＝24)能产生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生长迅速。红豆杉—柴胡是通过植物细胞工程培育的一种既能产生紫杉醇，又能迅速生长的杂交植株。部分培育过程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．获得原生质体的过程需要用纤维素酶和胰蛋白酶去除细胞壁
B．过程①可用高Ca2+—高pH融合法诱导，利用了细胞膜的流动性
C．过程②的培养基中需添加适量的生长素类和赤霉素类植物生长调节剂
D．红豆杉—柴胡杂种植株是二倍体，能够产生可育配子
4．(2024·山东淄博二模)铁皮石斛是名贵中药，其有效成分生物碱为细胞的次生代谢物。研究人员将铁皮石斛的营养芽采用组织培养技术培养成拟原球茎(PLBs，类似愈伤组织)，培养过程中PLBs重量、生物碱含量的变化如图。下列说法错误的是( )
A．在培养前应对营养芽进行消毒，在火焰旁进行接种操作可减少污染
B．因新生营养芽的细胞分化程度低，作外植体培养时容易诱导形成PLBs
C．诱导营养芽形成PLBs的过程称为细胞的脱分化，生物碱为该过程提供营养
D．与黑暗条件相比，PLBs在光照条件下的生长起始时间早、快速生长时间长
考点2 动物细胞工程和胚胎工程
1．动物细胞培养
(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
(2)区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。
2．克隆动物培育的流程
3．胚胎早期发育过程
4．胚胎移植的生理学基础
5．“试管羊”“克隆羊”和“转基因羊”的产生过程比较
1．(2024·黑、吉、辽卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
2．(不定项)(2024·江西卷)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是( )
A．利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞
B．制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体
C．用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，但不能冻存
D．单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如下表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是( )
甲的浓度 (μg/mL) 卵母细 胞(个) 第一极体 排出(个) 成熟率 (%) 卵裂数 (个) 卵裂率 (%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
判断与填空
1．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(2023·海南卷T7) ( )
2．甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，需要制备用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) ( )
3．科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作有细胞核移植。(2023·广东卷T3) ( )
4．在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术，其中胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) ( )
5．哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质。(2022·江苏卷T4) ( )
6．兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是实验材料取自小鼠胚胎的脑组织。(2022·湖北卷T7) ( )
7．将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷T11) ( )
8．在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的初级卵母细胞。(2020·天津卷T1) ( )
9．经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。(2020·山东卷T14) ( )
10．与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)______________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是____________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2023·湖北卷T22)
11．与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2021·湖南卷T22)
动物细胞的培养及核移植
1．(2024·广东佛山二模)卡铂为广谱抗肿瘤药，通过抑制DNA复制而起效。卡铂微溶于水，其水溶液在光下不稳定，溶液中的Cl－也会促进其分解。临床上用5%葡萄糖溶液与卡铂制成卡铂试剂后注射治疗，口服无效。相关实验的设计思路如下图，下列说法正确的是( )
A．本实验的自变量是卡铂试剂和DNA复制抑制剂的有无
B．本实验可用生理盐水代替5%葡萄糖溶液来配制卡铂试剂
C．本实验预期结果为①与④组数据接近，②与③组数据接近
D．宫颈癌细胞培养时的气体环境是95%氧气和5% CO2
2．(2024·吉林松原联考)种间体细胞核移植(iSCNT)将供体动物体细胞与来自不同种、科、目或纲的家畜(驯养动物)的去核卵母细胞融合并激活，以获得较多的重构胚，进而获得动物个体，是体细胞核移植(SCNT)中极具潜力的研究方向之一。由于多种野生动物数量稀少且呈持续下降趋势，因此采集精子或卵子开展常规辅助生殖较为困难，甚至无法完成，而从活体或死后不久的野生动物体内采集体细胞利用iSCNT技术获得动物个体，可在一定程度上维持濒危动物数量。下列叙述正确的是( )
A．iSCNT技术必须通过显微操作技术将供体细胞的细胞核取出，然后注入去核的卵母细胞
B．若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的固体培养基进行培养
C．iSCNT技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2+激活重构胚
D．同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同
动物细胞融合及单克隆抗体
3．(2024·河北衡水二模)科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，基本流程如下。下列相关叙述正确的是( )
A．注射的特定抗原是正常肺细胞和肺癌细胞共有的大分子
B．抗体—肺癌药物偶联物中a代表肺癌药物，b代表抗体
C．经②③最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体
D．抗体—肺癌药物偶联物只能定向运输至肺癌细胞，将其杀伤
4．(不定项)(2024·湖南长郡中学模拟)一种抗体只能结合一种抗原。科研工作者设法获得一种三特异性抗体，实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞(MM)的选择性杀伤，作用机理如图所示。下列叙述正确的是( )
A．同时给小鼠注射3种抗原可刺激小鼠浆细胞分泌得到三特异性抗体
B．推测T淋巴细胞中也会大量表达CD38基因
C．三特异性抗体通过T细胞的活化并释放细胞因子提高对MM的杀伤力
D．三特异性抗体与CD28和TCR结合可保持较高的T细胞数量和活性
胚胎工程技术及其应用
5．(2024·广西南宁二模)目前发现的双胞胎有同卵双胞胎、异卵双胞胎和“半同卵双胞胎”。1对“半同卵小姐弟双胞胎”形成过程如图所示，图中染色单体分离后分别移向细胞的三个不同方向，从而分裂成a、b、c三个细胞，染色体全部来自父系的“合子”致死。其中两个细胞发育成姐弟二人。下列说法正确的是( )
A．受精卵发育为桑葚胚的过程是在透明带内完成的，孵化后进入囊胚期阶段
B．卵子在子宫内发育成熟并完成受精过程
C．若细胞a的染色体组成为MP1，则细胞b的染色体组成为MP2
D．这对双胞胎来源于母亲的染色体相同，来源于父亲的染色体不一定不同
6．(2024·海南海口一模)近年来由于栖息地丧失和人为捕猎，亚洲黑熊数量骤减，科学家期望通过体内受精、胚胎移植等方法拯救亚洲黑熊，其过程如下图。以下说法正确的是( )
A．胚胎工程一般采用促性腺激素释放激素处理A使其超数排卵
B．E后代遗传性状与A和C一致，F后代遗传性状与B一致
C．D受体雌性必须和A、B同期发情处理
D．A排出的卵子必须培养成熟到MⅡ期才能与C的获能精子受精
考点3 基因工程和蛋白质工程
1．基因工程的基本工具
2．基因工程的基本操作程序
提醒：辨析农杆菌转化法中的“两次拼接与两次导入”
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
3．PCR
(1)PCR的原理与条件等
(2)PCR反应过程
(3)PCR过程中引物的设计
①引物设计有3条基本原则
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体等结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
②引物设计的注意事项
a．引物的长度一般为20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不应大于38 bp，因为过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于耐高温的DNA聚合酶进行反应。
b．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3′端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3′端出现3 个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发概率增加。
c．引物序列的GC含量一般为40～60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．对引物的修饰一般是在5′端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况下只能退而求其次，尽量去满足条件。
4．蛋白质工程
5．DNA的粗提取与鉴定
6．DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-________________-3′和5′-__________-3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素__________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是__________，其中纯合的突变植株是____________(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为____________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的____________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________________，理由是___________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为__________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
判断与填空
1．构建重组质粒需要使用DNA连接酶。属于DNA连接酶底物。(2023·湖北卷T22) ( )
2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(2022·山东卷T13) ( )
3．采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。(2022·江苏卷T6) ( )
4．我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列。(2021·山东卷T4) ( )
5．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。增加模板DNA的量可减少反应中非特异条带的产生。(2021·湖北卷T16) ( )
6．热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增，与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物。(2021·江苏卷T23) ( )
7．用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和____________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__________________________________。(2023·广东卷T20)
8．农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。(2023·海南卷T20)
9．制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是____________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________________。(2023·全国甲卷T38)
10．为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是___________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的____________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山东卷T25)
11．某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(2022·江苏卷T24)
基因工程的原理及应用
1．(2024·湖北八市联考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是( )
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
2．(2024·山东泰安二模)为获得转Gata3-RFP融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引物。
(1)在PCR反应溶液中常添加________，其作用是__________________________。在利用PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的________(填“3′”或“5′”)端需分别插入___________的限制酶识别序列，以使RFP基因能正确插入载体中。用于扩增RFP编码区序列的引物需满足的条件是_________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠(P)进行杂交获得F1若干，选取1～5五只小鼠，从中提取含Gata3基因的相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则________小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增，________(填“能”或“不能”)区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是_______________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物，结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA________个(用科学计数法表示)，在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受_______________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________的影响。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．(2024·湖北武汉二模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是( )
A．需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B．应在PCR扩增体系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生
D．用酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子
4．(2024·广东梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将光敏色素基因A转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是( )
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
DNA的粗提取及鉴定实验
5．(2024·山东青岛一模)“DNA的粗提取与鉴定”的实验步骤：研磨→去杂质→析出→鉴定。某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法错误的是( )
去杂质方式 沉淀质量/g DNA浓度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鉴定
离心 0.068 81.5 1.53 蓝色
4 ℃冰箱静置 0.102 8 336.4 1.41
注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时的离心转速
蛋白质工程及应用
6．(2024·天津和平区二模)人工接种纯种毛霉生产的腐乳滋味平淡、香气不佳，研究人员欲从自然发酵的传统腐乳中筛选出新的毛霉菌株改良腐乳风味。他们想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，下图为M4菌株改造的基本思路。关于图中M4菌株改造的基本思路，下列说法错误的是( )
A．预期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．获得A的基本策略是定点突变
C．获取目的基因时可采用PCR技术
D．预期产品一定具备预期的蛋白质功能
21世纪教育网(www.21cnjy.com)(共176张PPT)
专题五 生物技术与工程
微专题13 细胞工程和基因工程
考点1 植物细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
再分化
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会____________。
选择性地表达
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)图中过程①用____________________处理去除细胞壁，得到的原生质体包括细胞膜、细胞质和细胞核三部分。
纤维素酶和果胶酶
(2)酶解去壁前用较高渗透压溶液处理细胞：使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
(3)图中过程②的诱导方法有___________、离心法、_____________________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生质体融合成功的标志是___________________________。
电融合法
聚乙二醇(PEG)融合法
杂种细胞再生出细胞壁
3．植物体细胞杂交和有性杂交的比较
基因重组
1．(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．过程①中酶处理的时间差异，原
因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
√
B [酶解是为了去除植物细胞的细胞壁，过程①中酶处理的时间不同，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异，A正确；过程②为原生质体的融合，常用PEG诱导原生质体融合，灭活的仙台病毒可诱导动物细胞融合，不能用于植物细胞融合，B错误；过程④脱分化和⑤再分化的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素，但在两个过程中比例不同，C正确；可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株，D正确。]
2．(2024·黑、吉、辽卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时，先诱导外植体形成愈伤组织，再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸，加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是( )
A．迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B．诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C．悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D．茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率
√
B [迷迭香顶端幼嫩的茎段含有较高的生长素和细胞分裂素，适合用作外植体，A正确；诱导愈伤组织时需加入NAA和细胞分裂素，B错误；悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团，C正确；加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量，推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率，D正确。]
判断与填空
1．研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁。(2023·江苏卷T13) ( )
提示：紫菜细胞的细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，用蛋白酶无法去除细胞壁。
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2．利用植物细胞培养技术在离体条件下对单个细胞或细胞团进行培养使其增殖，可获得植物细胞的某些次生代谢物。次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养。(2023·山东卷T14) ( )
提示：次生代谢物不是植物生长所必需的，其含量少，可以通过增加细胞的数量来增加次生代谢物的产量。
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3．人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合。(2023·广东卷T12) ( )
4．在蓝莓组织培养过程中，宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。(2022·辽宁卷T14) ( )
提示：宜选用蓝莓幼嫩叶片为材料制备外植体，因为幼嫩叶片细胞分裂旺盛、易培养。
√
×
5．植物组织培养技术常用于商业化生产：其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。提高培养基中生长素与细胞分裂素的比值，有利于诱导生根。(2021·江苏卷T5) ( )
6．植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于__________。根据这种调节方式，在培养基中添加______________________，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。(2023·浙江6月卷T23)
√
提示：负反馈调节 过量赖氨酸类似物
7．利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。(2020·浙江7月卷T29)
提示：短 脱分化
8．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是________(用流程图表示)。(2019·全国Ⅱ卷T38)
题组1 植物细胞工程的基本技术
1．(2024·广东茂名三模)转录因子Gh1和GhE1能调控棉花愈伤组织细胞的生长发育，参与体细胞胚胎发生过程中细胞命运的重塑，其机制如图所示。下列相关分析正确的是( )
2
4
1
3
题号
A．将愈伤组织细胞在脱分化培养基上继续培养可得到幼苗
B．Gh1基因发生甲基化可能会抑制愈伤组织细胞的增殖
C．促进GhE1基因的表达可促进愈伤组织分化成根等器官
D．Gh1与GhE1单独作用均能调控GhPs基因的表达
√
2
4
1
3
题号
B [将脱分化产生的愈伤组织，在再分化培养基上继续培养可得到幼苗，A错误；Gh1基因发生甲基化，则会抑制Gh1基因的表达，不能与GhE1基因的表达产物形成复合物调控GhPs的表达，从而抑制愈伤组织细胞的增殖，B正确；促进GhE1基因的表达，可能会导致GhPs基因的表达产物增多，从而促进愈伤组织细胞的增殖，抑制愈伤组织分化成根等器官，C错误；Gh1基因与GhE1基因表达后形成的蛋白质相互结合可调控GhPs基因的表达，Gh1与GhE1单独作用不能调控GhPs基因的表达，D错误。]
2
4
1
3
题号
2．(2024·湖南衡阳模拟)现有甲、乙两个烟草品种(2n＝48)，其基因型分别为aaBB和AAbb，A/a、B/b这两对基因位于非同源染色体上。在光强度大于800 lx时，甲、乙两种烟草都不能生长，这是它们中各自存在的一对隐性纯合基因(aa或bb)作用的结果。取甲、乙两烟草品种的花粉分别培养成植株，将它们的叶肉细胞制成原生质体并混合，然后使之融合，诱导产生细胞团。随后将诱导产生的细胞团放到光强度大于800 lx的光下培养，结果有的细胞团不能分化，有的能分化发育成植株。如果只考虑原生质体的两两融合，下列叙述正确的是( )
2
4
1
3
题号
A．过程①是在无菌水中进行，需要纤维素酶和果胶酶
B．过程②是在固体培养基中进行，可用灭活的病毒诱导
C．过程③培养基中通常添加蔗糖作碳源和能源
D．能分化的细胞团发育成的植株自交，后代在光强度大于800 lx的光下，能生长的植株占7/16
√
2
4
1
3
题号
C [过程①是在等渗或较高渗溶液中进行，而不是在无菌水中进行，A错误；过程②是诱导融合，需要在液体培养基中进行，灭活的病毒可诱导动物细胞融合，B错误；过程③培养基中通常添加蔗糖作碳源和能源，C正确；据题分析可知，基因型为AaBb的细胞团能分化发育成植株，该植株自交产生的后代中，在光强度大于800 lx的光下能生长的植株的基因型为A_B_，所占比例为3/4×3/4＝9/16，D错误。]
2
4
1
3
题号
题组2 植物体细胞工程的应用
3．(2024·湖南长沙二模)红豆杉(2n＝24)能产生具有高抗癌活性的紫杉醇，柴胡(2n＝12)生长迅速。红豆杉—柴胡是通过植物细胞工程培育的一种既能产生紫杉醇，又能迅速生长的杂交植株。部分培育过程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
2
4
1
3
题号
A．获得原生质体的过程需要用纤维素酶和胰蛋白酶去除细胞壁
B．过程①可用高Ca2+—高pH融合法诱导，利用了细胞膜的流动性
C．过程②的培养基中需添加适量的生长素类和赤霉素类植物生长调节剂
D．红豆杉—柴胡杂种植株是二倍体，能够产生可育配子
√
2
4
1
3
题号
B [植物细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，获得原生质体的过程需要用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞的细胞壁，A错误；过程①是诱导原生质体融合，可用高Ca2+—高pH融合法，利用了细胞膜的流动性，B正确；过程②为脱分化，该过程需要在培养基中添加适量的生长素类和细胞分裂素类植物生长调节剂，C错误；红豆杉—柴胡杂种植株是异源四倍体而不是二倍体，能够产生可育配子，D错误。]
2
4
1
3
题号
4．(2024·山东淄博二模)铁皮石斛是名贵中药，其有效成分生物碱为细胞的次生代谢物。研究人员将铁皮石斛的营养芽采用组织培养技术培养成拟原球茎(PLBs，类似愈伤组织)，培养过程中PLBs重量、生物碱含量的变化如图。下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
A．在培养前应对营养芽进行消毒，在火焰旁进行接种操作可减少污染
B．因新生营养芽的细胞分化程度低，作外植体培养时容易诱导形成PLBs
C．诱导营养芽形成PLBs的过程称为细胞的脱分化，生物碱为该过程提供营养
D．与黑暗条件相比，PLBs在光照条件下的生长起始时间早、快速生长时间长
√
2
4
1
3
题号
C [在接种前对外植体进行消毒，并在火焰旁进行接种可减少污染，A正确；选用新生营养芽为外植体是因为其分化程度低、分裂能力旺盛且几乎不携带病毒，作外植体培养时容易诱导形成PLBs，B正确；生物碱为细胞的次生代谢物，不能提供营养，C错误；由图可知，与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下的生长起始时间早、快速生长时间长，D正确。]
2
4
1
3
题号
考点2 动物细胞工程和胚胎工程
1．动物细胞培养
悬浮生
长
细胞贴壁
生长
(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
(2)区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。
2．克隆动物培育的流程
基本相同
3．胚胎早期发育过程
内细胞团
滋养层
4．胚胎移植的生理学基础
5．“试管羊”“克隆羊”和“转基因羊”的产生过程比较
1．(2024·黑、吉、辽卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
√
D [传代培养时需要营造无菌、无毒以及95%空气＋5%CO2的气体环境，而非密封，A错误；处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定，适合进行传代培养，离体培养的细胞生命力比较脆弱，需要适应培养基的环境，传代最好在细胞生长覆盖瓶底80%～90%进行，选取②的细胞进行传代培养比①更合理，B错误；对于贴壁生长的细胞进行传代培养时，先需要用胰蛋白酶等处理，使之分散为单个细胞，然后再用离心法收集，C错误；细胞密度过大、营养物质减少、代谢废物增多，都会导致细胞停止分裂而进入平台期，D正确。]
2．(不定项)(2024·江西卷)某病毒颗粒表面有一特征性的大分子结构蛋白S(含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体)。为了建立一种灵敏、高效检测S蛋白的方法，研究人员采用杂交瘤技术制备了抗-S单克隆抗体(如图)。下列说法正确的是( )
A．利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞
B．制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B是相同的单克隆抗体
C．用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，但不能冻存
D．单克隆抗体A和单克隆抗体B都能够特异性识别S蛋白
√
√
AD [胶原蛋白酶可以催化分解细胞外的胶原蛋白，因此利用胶原蛋白酶处理，可分散贴壁生长的骨髓瘤细胞，A正确；由于S蛋白含有多个不同的抗原决定基，每一个抗原决定基能够刺激机体产生一种抗体，单克隆抗体A和单克隆抗体B可能来自不同的杂交瘤细胞，因此制备的单克隆抗体A和单克隆抗体B不一定是相同的单克隆抗体，B错误；用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可传代培养，也可冻存，C错误；单克隆抗体A和单克隆抗体B都来自筛选出的杂交瘤细胞，因此都能够特异性识别S蛋白上的抗原决定基，D正确。]
3．(2024·湖北卷)研究者探究不同浓度的雌激素甲对牛的卵母细胞和受精卵在体外发育的影响，实验结果如下表所示。根据实验数据，下列叙述错误的是( )
甲的浓度
(μg/mL) 卵母细
胞(个) 第一极体
排出(个) 成熟率
(%) 卵裂数
(个) 卵裂率
(%)
0 106 70 66.0 28 40.0
1 120 79 65.8 46 58.2
10 113 53 46.9 15 28.3
100 112 48 42.8 5 10.4
A．实验结果说明甲抑制卵裂过程
B．甲浓度过高抑制第一极体的排出
C．添加1 μg/mL的甲可提高受精后胚胎发育能力
D．本实验中，以第一极体的排出作为卵母细胞成熟的判断标准
√
A [由表可知，甲低浓度时促进卵裂，高浓度时抑制卵裂，A错误；对照组第一极体排出个数为70个，甲浓度过高(＞10 μg/mL，第一极体排出个数＜70)抑制第一极体的排出，B正确；添加1 μg/mL的甲，卵裂数和卵裂率均增大，即该条件可提高受精后胚胎发育能力，C正确；据题分析可知，作为卵母细胞成熟的判断标准是第一极体的排出，D正确。]
判断与填空
1．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(2023·海南卷T7) ( )
提示：营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞也会发生接触抑制。
2．甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，需要制备用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷T12) ( )
×
√
3．科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作有细胞核移植。(2023·广东卷T3) ( )
4．在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术，其中胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷T12) ( )
提示：胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活率越小。
√
×
5．哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质。(2022·江苏卷T4) ( )
提示：哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、无机盐等。
6．兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是实验材料取自小鼠胚胎的脑组织。(2022·湖北卷T7) ( )
×
√
7．将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(2021·江苏卷T11) ( )
提示：将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导融合后的细胞不都是杂交瘤细胞，还有B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞等。
8．在克隆哺乳动物过程中，通常作为核移植受体细胞的是去核的初级卵母细胞。(2020·天津卷T1) ( )
提示：在克隆哺乳动物过程中，通常选择减数分裂Ⅱ中期的去核卵母细胞作为受体细胞，即次级卵母细胞。
×
×
9．经遗传改造的小鼠胚胎干细胞注入囊胚，通过胚胎工程的相关技术可以获得具有不同遗传特性的实验小鼠。胚胎移植前要检查胚胎质量并在囊胚或原肠胚阶段移植。(2020·山东卷T14) ( )
提示：胚胎移植通常选择囊胚期之前的阶段，如桑葚胚或囊胚阶段。
×
10．与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)______________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是_________。(2023·湖北卷T22)
提示：不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
11．与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是_____________________________。(2021·湖南卷T22)
提示：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易，而动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难
2
4
1
3
题号
5
6
题组1 动物细胞的培养及核移植
1．(2024·广东佛山二模)卡铂为广谱抗肿瘤药，通过抑制DNA复制而起效。卡铂微溶于水，其水溶液在光下不稳定，溶液中的
Cl－也会促进其分解。临床上用5%葡萄糖溶液与卡铂制成卡铂试剂后注射治疗，口服无效。相关实验的设计思路如下图，下列说法正确的是( )
A．本实验的自变量是卡铂试剂和DNA复制抑制剂的有无
B．本实验可用生理盐水代替5%葡萄糖溶液来配制卡铂试剂
C．本实验预期结果为①与④组数据接近，②与③组数据接近
D．宫颈癌细胞培养时的气体环境是95%氧气和5% CO2
√
2
4
1
3
题号
5
6
A [由题图分析可知，本实验的自变量是卡铂试剂、DNA复制抑制剂的有无，A正确；生理盐水中含Cl－，会促进卡铂的分解，失去疗效，因此不可用生理盐水代替5%葡萄糖溶液来配制卡铂试剂，B错误；①组不会抑制DNA的复制，④组会抑制DNA的复制，所以预期实验结果不相近，C错误；宫颈癌细胞培养时的气体环境是95%空气和5% CO2，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
2．(2024·吉林松原联考)种间体细胞核移植(iSCNT)将供体动物体细胞与来自不同种、科、目或纲的家畜(驯养动物)的去核卵母细胞融合并激活，以获得较多的重构胚，进而获得动物个体，是体细胞核移植(SCNT)中极具潜力的研究方向之一。由于多种野生动物数量稀少且呈持续下降趋势，因此采集精子或卵子开展常规辅助生殖较为困难，甚至无法完成，而从活体或死后不久的野生动物体内采集体细胞利用iSCNT技术获得动物个体，可在一定程度上维持濒危动物数量。下列叙述正确的是( )
2
4
1
3
题号
5
6
A．iSCNT技术必须通过显微操作技术将供体细胞的细胞核取出，然后注入去核的卵母细胞
B．若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的固体培养基进行培养
C．iSCNT技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2+激活重构胚
D．同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同
√
2
4
1
3
题号
5
6
D [据题分析可知，iSCNT技术可以通过显微操作技术将供体细胞注入去核的卵母细胞，A错误；若从野生动物体内采集到的体细胞数目较少，可先用添加动物血清的液体培养基进行培养，以增加体细胞的数目，B错误；iSCNT技术的原理是动物细胞核具有全能性，操作过程中可用Ca2+载体激活重构胚，C错误；在种间体细胞核移植过程中，去核的卵母细胞来自不同种、科、目或纲的家畜(驯养动物)，获得的重构胚的细胞质遗传物质可能不同，因此同一野生动物经iSCNT技术获得的多个重构胚中，遗传物质可能不完全相同，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
6
题组2 动物细胞融合及单克隆抗体
3．(2024·河北衡水二模)科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，基本流程如下。下列相关叙述正确的是( )
A．注射的特定抗原是正常肺细胞和肺
癌细胞共有的大分子
B．抗体—肺癌药物偶联物中a代表肺癌药物，b代表抗体
C．经②③最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体
D．抗体—肺癌药物偶联物只能定向运输至肺癌细胞，将其杀伤
√
2
4
1
3
题号
5
6
C [根据题意可知，科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，据此可推测，该单抗制备过程中需要注射的特定抗原是肺癌细胞特有的大分子，A错误；抗体—肺癌药物偶联物中b代表肺癌药物，a代表抗体，B错误；经②③两次筛选最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体，而后对其进行大量体外或体内培养，获得特定的抗体，C正确；抗体—肺癌药物偶联物能运输到全身各处，但只能定向作用至肺癌细胞，将其杀伤，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
4．(不定项)(2024·湖南长郡中学模拟)一种抗体只能结合一种抗原。科研工作者设法获得一种三特异性抗体，实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞(MM)的选择性杀伤，作用机理如图所示。下列叙述正确的是( )
2
4
1
3
题号
5
6
A．同时给小鼠注射3种抗原可刺激小鼠浆细胞分泌得到三特异性抗体
B．推测T淋巴细胞中也会大量表达CD38基因
C．三特异性抗体通过T细胞的活化并释放细胞因子提高对MM的杀伤力
D．三特异性抗体与CD28和TCR结合可保持较高的T细胞数量和活性
√
√
2
4
1
3
题号
5
6
CD [一种浆细胞只能分泌一种抗体，A错误；据题意可知，三特异性抗体能实现对小鼠多发性骨髓瘤细胞(MM)的选择性杀伤，原因是CD38基因在正常体细胞中不表达或者表达量很低，B错误；三特异性抗体能促进T细胞活化产生并释放细胞因子，细胞因子会促进T淋巴细胞的活化，从而提高机体对MM的杀伤力，C正确；据图可知，一方面三特异性抗体与T细胞膜上的CD28结合，抑制T细胞死亡，另一方面特异性抗体与T细胞膜上的TCR结合，促进T细胞活化，所以三特异性抗体与CD28和TCR结合可保持较高的T细胞数量和活性，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
6
题组3 胚胎工程技术及其应用
5．(2024·广西南宁二模)目前发现的双胞胎有同卵双胞胎、异卵双胞胎和“半同卵双胞胎”。1对“半同卵小姐弟双胞胎”形成过程如图所示，图中染色单体分离后分别移向细胞的三个不同方向，从而分裂成a、b、c三个细胞，染色体全部来自父系的“合子”致死。其中两个细胞发育成姐
弟二人。下列说法正确的是( )
2
4
1
3
题号
5
6
A．受精卵发育为桑葚胚的过程是在透明带内完成的，孵化后进入囊胚期阶段
B．卵子在子宫内发育成熟并完成受精过程
C．若细胞a的染色体组成为MP1，则细胞b的染色体组成为MP2
D．这对双胞胎来源于母亲的染色体相同，来源于父亲的染色体不一定不同
√
2
4
1
3
题号
5
6
C [囊胚期时，囊胚进一步扩大，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，这一过程叫作孵化，A错误；卵子在输卵管内发育成熟并完成受精过程，B错误；来自母系的染色体为M，来自父系的染色体为P1、P2，经过复制后，染色体进行组合，若细胞a的染色体组成为MP1，细胞c的染色体均来自父亲，其染色体组成为P1P2，细胞b的染色体组成为MP2，C正确；细胞a的染色体组成为MP1，细胞b的染色体组成为MP2，这对双胞胎发育为姐弟，来源于父亲的性染色体不同，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
6．(2024·海南海口一模)近年来由于栖息地丧失和人为捕猎，亚洲黑熊数量骤减，科学家期望通过体内受精、胚胎移植等方法拯救亚洲黑熊，其过程如下图。以下说法正确的是( )
A．胚胎工程一般采用促性腺激素释放激
素处理A使其超数排卵
B．E后代遗传性状与A和C一致，F后代
遗传性状与B一致
C．D受体雌性必须和A、B同期发情处理
D．A排出的卵子必须培养成熟到MⅡ期才能与C的获能精子受精
√
2
4
1
3
题号
5
6
D [胚胎工程一般采用促性腺激素处理A使其超数排卵，A错误；E后代(由A的卵细胞和C的精子体内受精形成的受精卵发育形成)遗传物质来源于A和C，E后代遗传性状与A和C一致，而F后代(A的卵细胞提供细胞质，B提供细胞核)遗传物质来源于A和B，F后代遗传性状大部分与B一致，少部分与A相同，B错误；D受体雌性接受来自动物园亚洲黑熊♀A体内的胚胎，所以必须和动物园亚洲黑熊♀A同期发情处理，而野生亚洲黑熊♀B只需要提供体细胞，所以不需要同期发情处理，C错误；A超数排卵排出的细胞必须培养成熟到MⅡ期才具有受精能力，因此A排出的卵子必须培养成熟到MⅡ期才能与C的获能精子受精，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
6
考点3 基因工程和蛋白质工程
1．基因工程的基本工具
磷酸二酯键
T4 DNA连接酶
2．基因工程的基本操作程序
结构和功能
PCR
识别和结合
转录
显微注射法
提醒：辨析农杆菌转化法中的“两次拼接与两次导入”
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
3．PCR
(1)PCR的原理与条件等
DNA的半保留复制
耐高
温的DNA聚合酶
5′
3′
(2)PCR反应过程
(3)PCR过程中引物的设计
①引物设计有3条基本原则
首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体等结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
②引物设计的注意事项
a．引物的长度一般为20～30 bp，常用的是18～27 bp，但不应大于38 bp，因为过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于耐高温的DNA聚合酶进行反应。
b．引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3′端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3′端出现3 个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发概率增加。
c．引物序列的GC含量一般为40～60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
d．对引物的修饰一般是在5′端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况下只能退而求其次，尽量去满足条件。
4．蛋白质工程
预期的蛋白质结构
合成新的基因
5．DNA的粗提取与鉴定
蓝色
6．DNA片段的扩增及电泳鉴定
凝胶
的浓度
300 nm
1．(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-________-3′和5′-________-3′。
低
44
GTTT
CAAT
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
卡那霉素
Sac Ⅰ
④
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
[解析] (1)在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。结合BsaⅠ识别序列可知，BsaⅠ酶切后产生的黏性末端含有4个碱基，故若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有4×4×4×4＝44种。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。
(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，以题述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两个条带，目标序列是一个条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测却发现其体细胞中只有一条染色体有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的____________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
碳源、氮源
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌 RNA 聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为____________
_____，理由是______________________________________________
_______________。
PT7、PBAD和
PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启
动基因1表达
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为____________________________
(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________________________________________
________。
抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成
黑色素
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：_____________________________________。
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶
[解析] (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
(2)题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与pMag-T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为抑制杂菌和去除丢失质粒的菌株。(4)由(2)分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
(5)由(2)分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。
判断与填空
1．构建重组质粒需要使用DNA连接酶。 属于DNA连接酶底物。(2023·湖北卷T22) ( )
2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(2022·山东卷T13) ( )
提示：离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀。
√
×
3．采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。用特异启动子诱导表达iaaM(生长素合成基因)可获得无子果实。(2022·江苏卷T6) ( )
4．我国考古学家利用现代人的DNA序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类DNA从提取自土壤沉积物中的多种生物的DNA中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。设计“引子”前不需要知道古人类的DNA序列。(2021·山东卷T4) ( )
√
√
5．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。增加模板DNA的量可减少反应中非特异条带的产生。(2021·湖北卷T16) ( )
提示：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应中非特异条带。
×
6．热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增，与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物。(2021·江苏卷T23) ( )
7．用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__________________。(2023·广东卷T20)
√
提示：运载体 启动子和终止子
8．农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是____________________________________。(2023·海南卷T20)
提示：农杆菌细胞内含Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上
9．制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是_____________________。(2023·全国甲卷T38)
提示：筛选 RNA聚合酶
10．为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山东卷T25)
提示：能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5′端
11．某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mo1/L的目的是____________。PCR扩增时，需在__________________________催化下，在引物________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(2022·江苏卷T24)
提示：溶解DNA 耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 3′
2
4
1
3
题号
5
6
题组1 基因工程的原理及应用
1．(2024·湖北八市联考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。
几种可供选择的限制酶识别序列如下，
下列说法错误的是( )
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
2
4
1
3
题号
5
6
√
B [图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；目的基因两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；PCR技术扩增目的基因时，若复性温度偏低，则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目标序列，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
6
2．(2024·山东泰安二模)为获得转Gata3-RFP融合基因纯合小鼠，科研人员将红色荧光蛋白基因(RFP)插入含Gata3基因的载体中，然后导入小鼠受精卵，获得能正常表达两种蛋白质的杂合子雌、雄小鼠各一只。利用荧光蛋白活体成像系统
进行检测，发现两者均为阳性RFP转基因小
鼠。相关限制酶识别序列及限制酶识别位
点如图甲所示，A、B、C、F、R为不同引
物。
2
4
1
3
题号
5
6
(1)在PCR反应溶液中常添加________，其作用是______________
_____________。在利用PCR扩增RFP编码区序列的过程中，需要设计引物F和R，在两个引物的_____(填“3′”或“5′”)端需分别插入________________的限制酶识别序列，以使RFP基因能正确插入载体中。用于扩增RFP编码区序列的引物需满足的条件是___
________________________________________________。
(2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要的工具酶有______________________________________。
2
4
1
3
题号
5
6
Mg2+
激活DNA聚合
酶的活性
5′
SalⅠ、EcoRⅠ
分
别与两条模板链(RFP编码区序列)3′端的碱基序列互补
Taq DNA聚合酶、DNA连接酶、限制酶
(3)将实验获得的两只雌、雄杂合子小鼠(P)进行杂交获得F1若干，选取1～5五只小鼠，从中提取含Gata3基因的相关DNA片段，设计了引物A和C用于PCR扩增，扩增产物电泳结果如图乙所示，则________小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠；若用引物A和B进行PCR扩增，________(填“能”或“不能”)区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子，原因是________________________
___________________________________________。
2
4
1
3
题号
5
6
1和5
不能
两种阳性小鼠提取的相关
DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带
(4)为制备大量单链DNA片段，研究人员常采用不对称PCR技术。其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物，结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA__________个(用科学计数法表示)，在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受______________________________的影响。
2
4
1
3
题号
5
6
2.048×106
限制性引物和非限制性引物比例
[解析] (1)PCR的全称是聚合酶链式反应，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，所以PCR反应溶液中一般要添加Mg2+，其作用是激活DNA聚合酶的活性。若要对RFP基因进行扩增，需在引物的5′端添加限制酶识别序列，因为引物对应区段也属于调控序列，若在3′端添加限制酶识别序列，会导致限制酶的切割位点位于调控序列内部，进行相应酶切时，调控序列会被破坏。RFP基因的终止子在右侧(即转录方向为从左到右)，故插入的调控序列应颠倒进行插入，即设计时：R引物末端插入对应下方载体的MunⅠ酶切位点，F引物末端插入对应下方载体的XhoⅠ
2
4
1
3
题号
5
6
酶切位点，又因为RFP基因中含有的XhoⅠ和MunⅠ酶切位点，因此不能用XhoⅠ和MunⅠ酶来切割，否则会破坏基因序列。结合题干中所给的5种限制酶的识别序列，XhoⅠ和SalⅠ互为同尾酶(即切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制性内切酶)；MunⅠ和EcoRⅠ互为同尾酶。因此可通过使用同尾酶进行替代，即剪切扩增产物时，F末端添加的序列所对应的限制酶应选择SalⅠ，这样可以与下方载体中XhoⅠ的酶切位点结合；同理R末端应选用与MunⅠ同尾的EcoRⅠ剪切。这样利用产生相同黏性末端的同尾酶对扩增产物和载体进行酶切，可以保证既能得到有
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1
3
题号
5
6
效片段，又能使之正确转录。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，由于扩增目的基因时有两条模板链，设计引物时，两种引物要分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。(2)在RFP基因的扩增及重组载体的构建过程中，需要限制酶，且载体构建过程中用到DNA扩增技术，所以还需要Taq DNA聚合酶，载体构建完成还需要DNA连接酶将DNA片段连接起来。(3)Gata3-RFP基因为大片段，故结合图乙可知1和5小鼠是Gata3-RFP基因纯合子小鼠。由图乙可知，RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合子两种阳性小鼠提取的相关DNA片段扩增产物的电泳结果均只有一条条带，故用引物A和B进行PCR扩增，不能区分RFP转基因阳性小鼠中的杂合子和纯合。(4)100个模板DNA，
2
4
1
3
题号
5
6
最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行20个循环，理论上可制备ss-DNA：100×20×210＝2.048×106。根据题干“经若干次循环后，低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物”可知，该过程中ss-DNA的产生量主要受限制性引物和非限制性引物比例的影响。
2
4
1
3
题号
5
6
题组2 DNA片段的扩增及电泳鉴定
3．(2024·湖北武汉二模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比，黄化叶基因有一个碱基对发生了改变，从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型，提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是( )
A．需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
B．应在PCR扩增体系中添加Mg2+，以激活DNA聚合酶
C．可适当降低复性的温度，以减少PCR中非特异性条带的产生
D．用酶B作用后进行电泳，若有2条电泳条带可判断为杂合子
2
4
1
3
题号
5
6
√
B [PCR引物一般是单链DNA，A错误；PCR过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶，B正确；复性温度过低会增加PCR中非特异性条带，C错误；用酶B作用后进行电泳，得到2条条带，据此无法判断是否为杂合子，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
4．(2024·广东梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将光敏色素基因A转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是( )
2
4
1
3
题号
5
6
A．为构建正确连接的表达载体，应选用
BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经
历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素
的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
2
4
1
3
题号
5
6
√
C [由图分析可知，构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
题组3 DNA的粗提取及鉴定实验
5．(2024·山东青岛一模)“DNA的粗提取与鉴定”的实验步骤：研磨→去杂质→析出→鉴定。某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如下表所示。下列说法错误的是
( )
2
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1
3
题号
5
6
去杂质方式 沉淀质量/g DNA浓度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鉴定
离心 0.068 81.5 1.53 蓝色
注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。
2
4
1
3
题号
5
6
去杂质方式 沉淀质量/g DNA浓度/(ng/μL) OD260/OD280 二苯胺鉴定
4 ℃冰箱静置 0.102 8 336.4 1.41 蓝色
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．析出时的离心转速明显高于去杂质时的离心转速
2
4
1
3
题号
5
6
√
B [DNA的粗提取与鉴定实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；析出时的离心转速明显高于去杂质时的离心转速，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
6
题组4 蛋白质工程及应用
6．(2024·天津和平区二模)人工接种纯种毛霉生产的腐乳滋味平淡、香气不佳，研究人员欲从自然发酵的传统腐乳中筛选出新的毛霉菌株改良腐乳风味。他们想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，下图为M4菌株改造的基本思路。关于图中M4菌株改造的基本思路，
下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
6
A．预期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶
B．获得A的基本策略是定点突变
C．获取目的基因时可采用PCR技术
D．预期产品一定具备预期的蛋白质功能
2
4
1
3
题号
5
6
√
D [腐乳制作的原理主要是利用毛霉等微生物产生的蛋白酶、脂肪酶的催化作用，蛋白质最终被水解为氨基酸，脂肪被水解为甘油和脂肪酸，故预期的A指活力更高的蛋白酶或脂肪酶，A正确；根据应有的氨基酸序列，推测基因的碱基序列，进而可通过定点突变获取目的基因，B正确；获取目的基因时可采用PCR技术，该技术是体外扩增目的基因的技术，可实现短时间获得大量目的基因，C正确；理论上预期产品应该具备预期的蛋白质功能，但在实际操作过程中可能存在技术上或者其他方面的问题，可能导致获得的蛋白质没有相应的功能，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
6
课后限时集训(十三) 细胞工程和基因工程
题号
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6
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13
(建议用时：30分钟)
一、选择题
1．(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
14
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
题号
1
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4
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14
√
D [在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。]
题号
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题号
1
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12
2．(2024·湖北武汉模拟预测)青霉菌(属真菌)发酵为高耗氧过程，透明颤菌(属细菌)可通过在低氧条件下高表达血红蛋白以促进氧气供应和增强细胞呼吸。下图为将透明颤菌的血红蛋白引入青霉菌的方案。下列说法错误的是( )
13
14
√
A．处理①、②中都可以用溶菌酶去除细胞壁
B．处理③可用电融合法或者聚乙二醇融合法
C．处理④需将融合细胞接种在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培养基上
D．为验证方案是否成功可在低氧条件下培养杂种菌株并检测其密度
题号
1
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13
14
A [透明颤菌属于细菌，细胞壁的成分主要是肽聚糖，可用溶菌酶去除细胞壁，但青霉菌是真菌，细胞壁成分主要是几丁质，不能用溶菌酶去除细胞壁，A错误；处理③可用物理法电融合法或化学法聚乙二醇等诱导融合，B正确；处理④在缺乏甲硫氨酸和精氨酸的培养基培养融合细胞，能够生长的即为杂种菌株，C正确；青霉菌(属真菌)发酵为高耗氧过程，透明颤菌(属细菌)可通过在低氧条件下高表达血红蛋白以促进氧气供应和增强细胞呼吸，为验证方案是否成功可在低氧条件下培养杂种菌株并检测其密度，D正确。]
题号
1
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题号
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3．(2024·福建福州模拟)植物体细胞通常被诱导为愈伤组织后才能表现全能性。研究发现，愈伤组织的中层细胞是根或芽再生的源头干细胞，其在不同条件下，通过基因的特异性表达调控生长素、细胞分裂素的作用，表现出不同的效应(见下表)。已知生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生；反之，有利于芽的再生。下列推论合理的是( )
条件 基因表达产物和相互作用 效应
① WOX5 维持未分化状态
13
14
A．WOX5失活后，中层细胞会维持干细胞特性
B．WOX5＋PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累
C．ARR5促进细胞分裂素积累或提高细胞对细胞分裂素的敏感性
D．体细胞中生长素和细胞分裂素具有协同作用
条件 基因表达产物和相互作用 效应
② WOX5＋PLT 诱导出根
③ WOX5＋ARR2，抑制ARR5 诱导出芽
题号
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14
√
B [根据表格信息可知，WOX5能维持未分化状态，使植物细胞保持分裂能力强、较高的全能性，若WOX5失活后，中层细胞会丧失干细胞分裂能力强、分化程度低的特性，A错误；由题干信息“生长素的生理作用大于细胞分裂素时有利于根的再生”，再结合表格信息，WOX5＋PLT可能诱导出根，可推测WOX5＋PLT可能有利于愈伤组织中生长素的积累，B正确；由题意可知，生长素的生理作用小于细胞分裂素时有利于芽的再生，而抑制ARR5能诱导出芽，可知ARR5被抑制时细胞分裂素较多，故可推测ARR5抑制细胞分裂素积累或降低细胞对细胞分裂素的敏感性，C错误；出芽或出根都是生长素与细胞分裂素含量不均衡时才会发生，故可推测体细胞中生长素和细胞分裂素的作用可能相互抑制，D错误。]
题号
1
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题号
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4．(2024·山东聊城二模)灌流式培养是在细胞培养管内，一边不断注入新鲜培养基，一边将培养液的上清液不断移出。区别传统的悬浮培养，灌流式培养可避免因细胞密度过大、有害代谢物积累等因素而使细胞分裂受阻的现象出现。下列叙述正确的是( )
A．灌流式培养的细胞会贴壁生长，但不会出现接触抑制的现象
B．灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的
C．灌流速率越高，营养物质利用越充分
D．向培养管注入的新鲜培养基中补充动物血清是为了防止杂菌污染
13
14
√
B [据题分析可知，灌流式培养的动物细胞可以避免出现贴壁生长的现象，A错误；灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行的，B正确；过高的灌流速率，会导致培养的细胞不能及时利用营养物质，而使营养物质不能得到充分利用，C错误；补充动物血清是为了提供动物细胞培养所需要的营养物质和某种生长因子，D错误。]
题号
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题号
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5．(2024·湖北华中师大附中模拟)慢性乙型肝炎由乙肝病毒(HBV)感染引起，HBV在患者体内持续存在且含量较高。E肽是HBV的一种外壳蛋白，可作为抗原被宿主免疫系统识别并应答。为治疗和预防慢性乙肝，科研人员设计了以下方案，合理的是( )
A．输入乙肝康复者的血清可治疗和长期预防乙肝
B．将E蛋白重组到腺病毒基因组中可制成乙肝疫苗
C．利用单克隆抗体技术获得的抗E蛋白抗体，可用于检测乙肝
D．将E蛋白对应的mRNA制成疫苗，可刺激机体在血浆中表达出E蛋白
13
14
√
C [乙肝康复者的血清中含有对抗乙肝病毒的抗体，因而可治疗乙肝，但抗体不具有长久性，A错误；将E蛋白的相关基因重组到腺病毒基因组中可制成乙肝疫苗，B错误；利用单克隆抗体技术获得的抗E蛋白抗体，可用于检测乙肝病毒的存在，C正确；将E蛋白对应的mRNA制成疫苗，可进入细胞内编码出相应的抗原蛋白，进而刺激机体产生特异性免疫反应，而E蛋白的合成过程不会发生在血浆中，D错误。]
题号
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题号
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6．(2024·甘肃卷)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是( )
13
14
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
题号
1
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√
B [促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟(减数分裂Ⅱ中期)后才可与获能的精子进行体外受精，B错误；在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确；后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。]
题号
1
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题号
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√
7．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
13
14
B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
题号
1
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题号
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8．(2024·广东汕头二模)当水稻处于高Na＋环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H＋浓度梯度将Na＋排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是( )
13
14
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na＋运输到细胞外
B．将SOS1基因插入表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1-GFP基因的纯合子
题号
1
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√
D [由题意可知，当水稻处于高Na＋环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H＋浓度梯度以主动运输的方式将Na＋排到细胞外，A正确；SOS1基因含有限制酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，所以将SOS1基因插入表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ，B正确；检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增，C正确；F2和R2为绿色荧光蛋白基因(GFP)的引物，无法检测到是否含有SOS1基因，D错误。]
题号
1
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题号
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9．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA。构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。
下列叙述正确的是( )
13
14
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
题号
1
3
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2
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√
A [题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(gadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶(gadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠是反应原料，而非起供能作用，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；据题中信息无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。]
题号
1
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题号
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10．(2024·湖北武汉二模)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Ga14蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
13
14
A．斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．ERE直接驱动了GFP基因的表达
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
题号
1
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√
B [将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Ga14蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体 E 物质，推测斑马鱼的某些细胞存在 E 物质的受体，A正确；结合题图，ERE诱导Ga14基因转录，其翻译产物Ga14蛋白与USA结合驱动了GFP基因的表达，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B错误；用于监测 E 物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D正确。]
题号
1
3
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题号
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11．(不定项)(2024·湖南岳阳模拟)东南景天中的HMA3基因能编码Cd(镉)转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用下图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述错误的是( )
13
14
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
题号
1
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2
4
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√
√
√
ABD [由于引物接在了目的基因的两侧，因此经过两轮PCR后，可获得与HMA3基因等长的DNA单链，故若要获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；质粒上含有潮霉素抗性基因，用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或含普通质粒的受体细胞，D错误。]
题号
1
3
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题号
1
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12．(不定项)(2024·山东潍坊三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。将体外转录获得的Cas9mRNA和sgRNA导入小鼠的受精卵中，获得了12只基因编辑小鼠。利用PCR鉴定小鼠的基因型，电泳结果如图2所示。已知P1和P2是PCR的引物。下列相关分析错误的是( )
13
14
A．敲除2、3、4片段引起的变异属于染色体变异
B．敲除前，根据敲除的位置需要设计3个sgRNA
C．图2中，4和12个体杂交的子代均为敲除纯合子
D．图2中，3、5、7个体的体内均能检测到PD-1
题号
1
3
5
2
4
6
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9
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14
√
√
√
ABD [据图分析，将野生型基因内部的部分碱基剪切，改变的是基因内部的碱基序列，属于可遗传变异中的基因突变，A错误；分析图1可知，要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要设计2个sgRNA，B错误；基因敲除后，其核苷酸数量减少，电泳时移动速度快，距离加样孔的位置远，4和12个体均为基因敲除纯合子，因此4和12个体杂交的子代均为基因敲除纯合子，C正确；3个体的基因未敲除，5个体为基因敲除杂合子，7个体为基因敲除纯合子，因此3和5体内均能检测到PD-1，7个体检测不到PD-1，D错误。]
题号
1
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14
二、非选择题
13．(2024·广东广州二模)癌症的免疫疗法通过重新激活抗肿瘤的免疫细胞，克服肿瘤的免疫逃逸，科研人员在不断研究中发现多种免疫治疗方法的结合是提高治疗效果的途径之一。请回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
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13
14
(1)免疫系统能够识别和清除突变的细胞，这体现了免疫系统的________功能。
(2)由于基因突变，癌细胞表面物质发生改变，如某些种类癌细胞表面高表达膜蛋白PSMA和PD-L1。图1中PD-L1能抑制T细胞的活化，使癌细胞发生免疫逃逸。临床上可利用PD-1的单克隆抗体进行癌症治疗，据图1推测，其原因是_____________________________
____________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
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14
免疫监视
PD-1的单克隆抗体与PD-1结合，
阻断了PD-1和PD-L1的结合，避免PD-L1抑制T细胞的活化
(3)CD28是T细胞表面受体，T细胞的有效激活依赖于CD28在癌细胞与T细胞结合部位的聚集。因此，科研人员尝试构建既能结合PSMA，又能结合CD28的双特异性抗体PSMA×CD28，诱导T细胞定向杀伤癌细胞，如图2所示。
制备过程：先将________________分别注射到小鼠体内，分离出B淋巴细胞，诱导其与小鼠的骨髓瘤细胞融合，筛选得到________________，再诱导两种细胞融合。成功融合的细胞会表达两种L链和两种H链，由于__________________会产生多种抗体，因此还需进行筛选，才能获得所需的双特异性抗体PSMA×CD28。
题号
1
3
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2
4
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13
14
PSMA、CD28
两种杂交瘤细胞
L链和H链随机组合
(4)科研人员将癌细胞和T细胞共同培养，加入不同抗体，比较不同抗体对T细胞活化的作用。实验各组由活化T细胞产生的细胞因子IL-2含量如图3所示，实验结果说明____________________________
___________________________________________________________
____________________________________
____________________________________
_____。
题号
1
3
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2
4
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14
PSMA×CD28和PD-1单抗联
合使用能够显著激活T细胞，且在一定范围内激活作用随抗体浓度
的增加而增强；单独使用PSMA×CD28或
PD-1单抗都不能显著激活T细胞(合理即
可)
[解析] (1)免疫系统能够识别和清除突变的细胞，这体现了免疫系统的免疫监视功能。
(2)图1中癌细胞表面的PD-L1和T细胞表面的PD-1结合，抑制T细胞的活化。PD-1的单克隆抗体与PD-1特异性结合，阻断了PD-L1和PD-1的结合，避免PD-L1抑制T细胞的活化。
(3)制备双特异性抗体PSMA×CD28，则抗原是CD28和PSMA，将两种物质分别注射到小鼠体内，分离出两类B淋巴细胞，将这两类B淋巴细胞分别和小鼠的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，再诱导杂交瘤细胞融合。成功融合的细胞会表达两种L链和两种H链，所需的双特异性抗体PSMA×CD28是特定的L链和H链结合形成的，由于L链和H链随机组合，因此还需要进行筛选，才能获得所需的抗体。
题号
1
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2
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(4)自变量是抗体种类，分析图3可知，PSMA×CD28和PD-1单抗联合使用能够显著激活T细胞，且在一定范围内激活作用随抗体浓度的增加而增强；单独使用PSMA×CD28或PD-1单抗都不能显著激活T细胞。
题号
1
3
5
2
4
6
8
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14
14．(2024·山东潍坊二模)A蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如下图所示。
注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ为限制酶。
题号
1
3
5
2
4
6
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9
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14
注：①bar为抗草甘膦(一种除草剂)基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因；②F1、F2、R1、R2为引物；③BamHⅠ、SmaⅠ、BclⅠ为限制酶。
(1)无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有____________________________。用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5′端序列与_______________________互补。
题号
1
3
5
2
4
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14
DNA聚合酶和DNA连接酶
F1(或P基因左侧)3′端序列
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒，选用的限制酶为________________。扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为________。
①5′-…CTTGGATGAT-3′
②5′-…TAAGTTGTCT-3′
③5′-…ATTCAACAGA-3′
④5′-…TCTGTTGAAT-3′
题号
1
3
5
2
4
6
8
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9
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11
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13
14
BclⅠ和SmaⅠ
①④
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是________________________
___________________________________________________________
________________________________________________。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入X-Gluc进行鉴定，结果如下表所示：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
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13
14
先筛选出能在含四环素培养
基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草
甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞
分析表明，该激素最主要的合成部位是________，通过实验结果分析该激素的生理作用是__________________________。
部位 根 茎 叶
完全培养液 蓝色 浅蓝 浅蓝
缺磷培养液 深蓝 蓝色 浅蓝
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
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12
13
14
根
促进植物对磷元素的吸收
[解析] (1)由题图信息可知，利用无缝克隆技术将A蛋白结合蛋白基因(P基因)与葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)融合，构建A蛋白检测探针，所以无缝克隆时所需的酶除T5核酸外切酶外还有DNA聚合酶和DNA连接酶。DNA的两条链是反向平行的，用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是R2引物5′端序列与F1(或P基因左侧)3′端序列互补。
(2)利用双酶切法将融合基因插入Ti质粒选用的限制酶为BclⅠ和SmaⅠ。根据融合基因的放大图可知，扩增时以DNA的两条链分别作模板，扩增融合基因所需的引物R1和F2应选用下列引物组合为3′端序列可以与④5′-…TCTGTTGAAT-3′配对，5′端序列的互补链可以与①5′-…CTTGGATGAT-3′配对，因此选用的引物组合为①④。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
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12
13
14
(3)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。
(4)葡萄糖苷酸酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，只有根呈现蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根，与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝，而在含磷的完全培养液中出现蓝色，说明该激素的生理作用是促进植物对磷元素的吸收。
题号
1
3
5
2
4
6
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(教师用书独具)
(2024·湖南衡阳三模)Ⅰ.复椰子树属棕榈复椰子属，树高15～30米，树干通直，直径约30厘米，叶呈大扇形，长7米，宽2米，雌雄异株。复椰子树的雌花从受粉到果实成熟需要10～13年之久，种子发芽期也需3年，而且要求烈日照晒。由于复椰子树种子形状奇特，体积庞大(重达20千克，直径30厘米)有些人将它用作容器，如今复椰子树已濒临灭绝。复椰子果肉煮汤饮服，有治疗久咳和止血的功效。有人想到了一个好的方法，制造“人工种子”，解决复椰子树的种子形成时间漫长的问题。其操作流程如下：
(1)图中的外植体是___________________________，先用_______冲洗，再消毒。常用的消毒剂是______________________(写两种)。
离体的植物器官、组织或细胞
流水
酒精和次氯酸钠溶液
(2)人工种皮除了有保护作用以外，还要有________性，以满足胚状体代谢的需要。为了保证胚状体在适宜条件下成功发芽发育成幼苗，而不会腐败变质，人工胚乳除加入适量的养分(如水、无机盐、有机碳源)外，还可以适当添加农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些______________
(填“植物激素”“植物生长调节剂”或“生长素类似物”)。
透气
植物生长调节剂
Ⅱ.科研人员构建了可表达WRK10-MYC融合蛋白的重组农杆菌 Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，该质粒的部分结构如图2所示，其中Kan为卡那霉素抗性基因，Hyg为潮霉素抗性基因，MYC标签序列编码标签短肽 MYC，WRK10 蛋白为转录因子。
(3)位于 Ti 质粒不同位置的卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的作用分别是_________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________。
图中启动子的方向与对应基因转录的方向一致，从编码链的角度分析 P1 和 P2方向不同的原因是_________________________________
______________________________________________________。
卡那霉素抗性基因可用于筛选成功转化的农杆菌(或用于
筛选重组农杆菌或成功导入了质粒的农杆菌)；潮霉素抗性基因可用
于筛选成功转化的植物细胞(或筛选转基因植物细胞或成功导入了目
的基因的植物细胞)
潮霉素抗性基因的编码链是b链(或
Hyg基因所对应的编码链是b链)，WRK10基因的编码链是a链
(4)已知利用LP 和 RP扩增结果为大带，BP 和 RP扩增结果为小带。可用图中三引物进行两次PCR 的方法鉴定转基因植物后代中的纯合转基因植株。T-DNA 插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，则纯合转基因植株 PCR 检测结果为________(填“大带”“大带和小带”或“小带”)。
小带
[解析] (1)进行植物组织培养时，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体。外植体消毒过程中，用酒精擦拭双手和超净工作台台面，将流水充分冲洗后的外植体用酒精消毒30 s，然后立即用无菌水清洗2～3次，再用次氯酸钠溶液处理30 min后，立即用无菌水清洗2～3次。(2)胚状体相当于种子中的胚，若氧气不足，细胞无氧呼吸产生酒精，会导致人工种子坏死，故种皮除有保护作用外，还要有透气性。人工胚乳要为胚状体的发育提供营养物质，故要加入适量的养分(如水、无机盐、有机碳源)；外界环境中许多微生物与胚状体的细胞竞争营养物质，也可能寄生在胚状体细胞中，故可以适当添加农药、抗生素、有益菌等；植物生长调节剂是人类合成的，
对植物生长、发育有重要调节作用的化学物质，具有原料广泛、容易合成、效果稳定等优点，为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。(3)构建了可表达WRK10-MYC 融合蛋白的重组农杆菌Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，先构建含有重组 Ti 质粒的农杆菌，然后在让该农杆菌去侵染植物细胞，如图，Hyg为潮霉素抗性基因，位于T-DNA 片段上，故卡那霉素抗性基因可用于筛选成功转化的农杆菌(或用于筛选重组农杆菌或成功导入了质粒的农杆菌)；潮霉素抗性基因可用于筛选成功转化的植物细胞(或筛选转基因植物细胞或成功导入了目的基因的
植物细胞)。基因转录的方向是5′→3′，而启动子的方向与对应基因转录的方向一致，故P1和P2方向不同的原因是潮霉素抗性基因的编码链是 b 链(或Hyg基因所对应的编码链是b链)，WRK10基因的编码链是a链。(4)BP位点在T-DNA片段上，又T-DNA 插入植物染色体 DNA 分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，故纯合转基因植株 PCR 检测结果为 BP 和 RP 扩增的小带。
