1．事实概述类
(1)黄酒发酵通常选择在较寒冷的冬天进行，实践证明，若选在夏天酿制黄酒，即便严格密封也会出现黄酒变酸的现象，原因可能是__________________________
____________________________________________________________________。
提示：发酵液中混有醋酸菌，在温度升高、缺少糖源时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸
(2)划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条划线上无菌落，其他划线上有菌落。造成第一条划线无菌落的错误操作可能是____________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始
2．判断依据类
(1)蓝莓含有丰富的维生素、多酚等天然活性成分，被赞为浆果之王。某生物学兴趣小组以蓝莓为原料，尝试发酵制作蓝莓酒，兴趣小组有三位同学设计的酿蓝莓酒的装置如下图所示，其中最合理的是瓶________，其判断依据是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：乙 果酒发酵过程是无氧条件，且出气口不能没入发酵液，发酵液不能装太满
(2)在细胞内DNA合成一般有两条途径。主要途径(途径一)是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断此途径，另一辅助途径(途径二)是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。根据这样的原理，向经诱导后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合培养液中添加氨基蝶呤能筛选杂交瘤细胞，其判断依据是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：杂交瘤细胞能通过途径一和途径二合成DNA，而骨髓瘤细胞只能通过途径一合成DNA，而B淋巴细胞不能无限增殖，所以加入氨基蝶呤阻断途径一后，只有杂交瘤细胞能利用途径二进行增殖
3．原因分析类
(1)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
(2)重组疫苗是一种基因工程疫苗，该疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统
(3)某课题组用生物技术制备转基因小鼠，通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是__________________________________
____________________________________________________________________。
提示：雄原核较大，更容易容纳外源DNA
4．判断依据类
(1)EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。抗原的选择和制备过程为：将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1和VP2、非EV71蛋白注射到小鼠体内，多次免疫后，取上述各组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，结果如下图所示。
EV71免疫的小鼠血清抗体________(填“是”或“不是”)单一抗体，据图分析判断依据是__________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：不是 用EV71免疫的小鼠血清的抗体与VP1和VP2抗原的结合强度都较高
(2)为了解乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式是抑制细菌生长、溶菌性杀死细菌(细胞破裂)还是非溶菌性杀死细菌，科研人员将乳链菌肽加入革兰氏阳性菌菌液中，随着发酵时间的延长，检测革兰氏阳性菌的活菌数、除去菌体的上清液中核酸含量，实验结果如下图所示。
以上实验表明乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式为________________，其判断依据是______________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：非溶菌性杀死细菌 曲线3活菌数降为零，说明是杀死细菌；除去菌体的上清液中核酸含量没有明显变化，说明不是溶菌
5．实验思路类
(1)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置后，统计三支试管中血液凝固所需时间
(2)URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
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____________________________________________________________________
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提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组质粒，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况
6．结果预期类
(1)在探究菌株A对金黄色葡萄球菌的抑菌机理时，该研究人员作出了这样的假设：菌株A通过分泌某种化学物质来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。请利用以下材料设计实验证明该假设成立。
实验材料设备：含菌株A的发酵液、无菌水、含金黄色葡萄球菌的指示培养基(已打有大小相同的两个孔)、离心机等。
①完善实验思路：用离心机____________________________，取适量且等量的________________，分别接种到含有金黄色葡萄球菌的指示培养基的两个孔中，一段时间后，观察是否出现抑菌圈。
②预期结果：________________________________________________________
____________________________________________________________________。
提示：①对含菌株A的发酵液进行离心 上清液和无菌水 ②若加有上清液的小孔周围出现抑菌圈，则证明菌株A通过分泌某种化学物质来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖
(2)葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。(简要写出实验步骤和预期结果)
提示：实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小；预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落
7．分析评价类
(1)红酸汤是我国西南地区独特的民间饮食文化，“三天不吃酸，走路打蹿蹿”，反映了当地老百姓对红酸汤的喜爱。如图为某兴趣小组对红酸汤制作过程中发酵液的pH和亚硝酸盐含量的检测结果，据图说明取用红酸汤的最佳时间，并作出合理解释。
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提示：建议发酵14 d后取食，取食过早发酵时间太短，红酸汤不够酸，风味不佳，另外亚硝酸盐含量高影响身体健康。14 d以后pH呈酸性、亚硝酸盐含量大大降低，更适合食用
(2)黄酒中的低聚糖能促进肠道内乳酸杆菌等益生菌的增殖。某同学认为有氧环境下乳酸杆菌在MRS培养基(乳酸杆菌能溶解MRS培养基中的碳酸钙而使菌落周围形成溶钙圈)上增殖的速度会加快，你是否同意该同学的观点。 请写出实验探究方案以证明你的观点。
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提示：不同意。实验设计思路：将生活状态良好的乳酸杆菌随机分为甲、乙两组，甲组在有氧条件下接种于MRS培养基上，乙组在无氧条件下接种于相同的培养基上，在适宜条件下培养一段时间后观察溶钙圈的形成情况；预期实验结果：甲组无溶钙圈形成或溶钙圈较小，乙组溶钙圈显著大于甲组
8．开放思维类
黄酮类化合物是广泛分布于植物体内的次生代谢物。某同学认为利用细胞产物的工厂化生产黄酮类化合物主要是利用促进细胞生长的培养条件，来提高单个细胞中黄酮类化合物的含量，你同意该同学的观点吗，并说明相应的理由。
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提示：不同意。植物细胞的次生代谢物含量很低，利用细胞产物的工厂化生产黄酮类化合物主要是通过增加细胞数量从而增加黄酮类化合物的含量
专题限时集训(五) 生物技术与工程
(建议用时：40分钟)
一、选择题
1．(2024·湖北十堰模拟)酱油起源于我国，至今已有数千年历史。参与酱油酿造过程的微生物主要有米曲霉、酵母菌和乳酸菌等，在众多微生物及其酶系的作用下，大豆、小麦中的蛋白质、脂肪等有机物被分解，最终形成具有特殊色泽和良好风味的酱油。酱油的制作流程及发酵过程中主要微生物的数量变化如图1、图2所示。下列说法错误的是( )
A．米曲霉发酵的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，分泌制作酱油所需的蛋白酶、脂肪酶等
B．已知发酵池发酵阶段是密封进行的，此时酵母菌与乳酸菌对氧气的代谢方式可能相同
C．乳酸菌发酵产生的乳酸能抑制杂菌生长，与酵母菌表现为原始合作关系
D．发酵池中加入食盐的主要作用之一是抑制部分有害微生物的生长
C [米曲霉发酵的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，分泌制作酱油所需的蛋白酶、脂肪酶等，A正确；由于发酵阶段是密封进行的，此时酵母菌与乳酸菌都只进行无氧呼吸，代谢方式相同，B正确；分析图2可知，发酵过程中乳酸菌数量减少时，酵母菌的数量在增加，由此可知两者不是原始合作关系，C错误；抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，发酵池中加入食盐可抑制部分有害微生物的生长，D正确。]
2．(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是( )
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
D [由图可知，②中拨出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。综上所述，①③④⑤正确，故选D。]
3．(2024·山东潍坊期末)植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。某研究团队从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮菌时，筛选出一株分解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果如表所示。下列说法正确的是( )
测试菌 抗菌肽浓度/(μg·mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
甲 － － － － － ＋ ＋
乙 － － － － － ＋ ＋
丙 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
丁 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
注：“＋”表示出现菌落，“－”表示不出现菌落。
A．筛选固氮细菌时，培养基的主要营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源
B．若统计平板上分解淀粉的固氮菌数量，则菌落数往往比活菌数多
C．该抗菌肽对丙菌和丁菌的抑制效果较好
D．要确定对甲菌抑制效果的最低浓度，需在1.73～3.45 μg·mL-1区间进一步实验
D [固氮细菌能够自身固氮，培养基中不需要氮源，因此其培养基的主要营养物质包括水、无机盐和碳源，A错误；由于连在一起的细菌形成一个菌落，对固氮菌进行计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，B错误；由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45～55.20 μg·mL-1范围内，甲菌和乙菌均不能生长，表明该抗菌肽对甲菌和乙菌的抑菌效果较好，C错误；要确定对甲菌抑制效果的最低浓度，需在1.73～3.45 μg·mL-1区间进一步实验，D正确。]
4．(2024·吉林长春模拟)研究人员将粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞进行融合培育出新的烟草品种，其大致过程为：制备原生质体→促进原生质体融合→融合细胞→愈伤组织→烟草幼苗。同时研究人员探究了PEG 对原生质体融合的影响，结果如下表所示。下列相关叙述正确的是( )
编号 PEG用量/μL PEG：原生质体悬浮液 融合率/% 细胞碎片
1 20 1∶5 6.5 ＋
2 40 2∶5 15.5 ＋
3 60 3∶5 19.4 ＋
4 80 4∶5 20.4 ＋＋
5 100 1∶1 21.6 ＋＋＋
注：原生质体悬浮液用量100 μL，融合25 min。“＋”表示很少；“＋＋”表示少量；“＋＋＋”表示较多。
A．制备原生质体时需用含纤维素酶和果胶酶的低渗溶液处理细胞
B．若PEG对原生质体处理时间远长于25 min，则融合率会提高
C．由实验结果可知，促进原生质体融合的较适PEG用量为60 μL
D．细胞融合完成的标志是再生出细胞壁，其经再分化形成愈伤组织
C [制备原生质体时需用含纤维素酶和果胶酶的等渗溶液处理细胞，以维持原生质体正常的形态和功能，A错误；题中只探究了PEG对原生质体处理时间25 min时的融合率，若处理时间长于25 min，则融合率如何变化未知，B错误；PEG用量为60 μL时，融合率较高且细胞碎片很少，故促进原生质体融合的较适PEG用量为60 μL，C正确；细胞融合完成的标志是再生出细胞壁，其经脱分化形成愈伤组织，D错误。]
5．(2024·广东广州模拟)普通六倍体小麦(6n＝42)的基因组庞大，其研究工作相对困难；拟南芥(2n＝10)是应用广泛的模式植物，其基因组测序已完成，遗传背景相对清晰。以普通小麦胚性愈伤组织来源的原生质体为供体，用紫外线分别照射30 s、1 min、2 min后，再与拟南芥原生质体进行融合，希望将小麦染色体小片段插入拟南芥基因组，从而借助其清晰的遗传背景对小麦基因组进行研究。下列相关说法错误的是( )
A．可用聚乙二醇或高Ca2+—高pH融合法等化学方法诱导原生质体融合
B．原生质体融合后，应进一步筛选染色体数为52的细胞来对小麦进行研究
C．外植体经诱导形成愈伤组织的过程需要控制生长素与细胞分裂素的比例
D．该过程还探究了紫外线处理时间(剂量)对供体染色体断裂程度的影响
B [诱导植物细胞原生质体融合时，可用聚乙二醇或高Ca2+—高pH融合法等化学方法，A正确；本实验中，细胞融合的目的是将小麦染色体小片段插入拟南芥基因组，从而借助其清晰的遗传背景对小麦基因组进行研究，而不是单纯得到两细胞核融合的细胞，B错误；植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向，外植体经诱导形成愈伤组织的过程需要控制生长素与细胞分裂素的比例，C正确；根据用紫外线分别照射30 s、1 min、2 min，可判断自变量是紫外线处理时间(剂量)，故该过程还探究了紫外线处理时间(剂量)对供体染色体断裂程度的影响，D正确。]
6．(2024·江苏南通二模)人参和西洋参是五加科人参属的药用植物，它们含有的人参皂苷具有抗肿瘤等作用。科研人员选用人参和西洋参有性杂交获得的杂种胚细胞以及人参种子胚、西洋参种子胚的愈伤组织进行悬浮细胞培养，建立其单细胞株系并对三者的部分特性进行比较研究，如图1、2所示，其中Re具有治疗心肌缺血的功能，Rg3具有抗癌作用。据题分析，下列说法正确的有( )
A．人参皂苷不是人参和西洋参生长和生存所必需的，其药用价值体现生物多样性的直接价值
B．图1所示过程主要依据植物细胞的全能性
C．图1中过程②为再分化，过程④中蔗糖浓度过低、过高都不利于悬浮细胞的培养
D．杂种胚中的大多数种类皂苷含量均高于其他两种，应作为抗癌药物的优先选择
A [人参皂苷是次生代谢物，不是人参和西洋参生长和生存所必需的，其药用价值体现生物多样性的直接价值，A正确；图1所示过程，不体现植物细胞的全能性，B错误；图1中过程②是进行悬浮细胞培养，C错误；杂种胚中的大多数种类的皂苷的含量均高于其他两种，这体现了杂种优势，图中可知，Rg3具有抗癌作用，若要获得具有抗癌作用的药物应优先选择人参(种子胚)的愈伤组织，D错误。]
7．(2024·广东湛江二模)通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外诱导发育成特定的组织器官，然后再移植回患者体内。图1和图2 表示利用自身细胞进行器官移植的两种方法，其中诱导多能干细胞(iPS 细胞)类似于人类的胚胎干细胞。下列叙述正确的是( )
A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应
C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox基因、c-Myc 基因和Klf基因导入成纤维细胞
D．图2中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可整个注入去核的卵母细胞中
D [两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有 95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中，A错误；图1所示方法导入了Oct3/4基因、Sox基因、c-Myc基因和Klf基因，图2中提供质遗传物质的卵母细胞的来源未知，因此两种方法所获得的组织器官的遗传物质均可能和患者的不完全相同，B错误；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，C错误；核移植的过程中，卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中，D正确。]
8．(2024·北京西城一模)下图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
A．PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导启动子，将减少细胞物质和能量浪费
C [PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点，A正确；由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题意可知，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色，而重组质粒中没有GUS基因，故用农杆菌转化植物愈伤组织后，导入重组质粒的愈伤组织没有GUS基因，不会呈蓝色，C错误；启动子若为除草剂诱导启动子，则可以通过该启动子控制外源基因在特定环境中表达，将减少细胞物质和能量浪费，D正确。]
9．(2024·湖北襄阳一模)噬菌体展示技术是将外源蛋白基因插入噬菌体外壳蛋白基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白基因的表达而表达，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术(如图所示)。下列叙述错误的是( )
A．噬菌体抗体展示过程，抗体的合成场所一定是受体细胞的核糖体
B．噬菌体展示库的构建需将特定的基因片段拼接重组在噬菌体载体上并转染受体细胞
C．建立噬菌体展示库需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶
D．通过图中诱变处理及筛选，最终可能筛选出与某种抗原亲和力更强的抗体及其基因
C [噬菌体作为病毒不具有独立的代谢功能，为专性寄生物，因此，噬菌体抗体展示过程中抗体作为蛋白质，其合成场所一定是受体细胞的核糖体，A正确；噬菌体展示库的构建需将特定的基因片段拼接重组在噬菌体载体上并转染到受体细胞中，随着受体细胞DNA复制而复制，B正确；建立噬菌体展示库需要切割目的基因和病毒载体，然后将二者连接起来，需要限制酶和DNA连接酶等，该过程中不需要RNA聚合酶，C错误；诱变的原理是基因突变，具有不定向性，所以通过图中诱变处理及筛选最终可获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因，D正确。]
10．(2024·山东淄博二模)dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3′碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲～丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP(记作ddATP＋)和DNA模板链。PCR完成后，经电泳(分子量小的DNA在电场中移动快)将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列说法正确的是( )
A．ddATP＋中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端
B．甲体系中除含ddATP＋外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP
C．新掺入的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的5′端
D．模板DNA的碱基序列为3′-CTGGACTGACAT-5′
D [由于ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3′碳位为-H且不能与磷酸形成化学键，因此ddATP＋中的放射性磷酸基团不应位于ddATP的末端，A错误；甲体系中除含ddATP＋外，还应含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，B错误；PCR扩增时，由5′端向3′端延伸，则新掺入的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的3′端，C错误；当 ddNTP 结合时，DNA 合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处，根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列，PCR扩增时，由5′端向3′端延伸，则根据电泳图及分子量小的DNA在电场中移动快可知，该DNA片段的待测碱基序列为5′-GACCTGACTGTA-3′，因此模板DNA的碱基序列为3′-CTGGACTGACAT-5′，D正确。]
11．(不定项)(2024·山东德州二模)科研人员成功培育了能分泌含卵泡刺激素(FSH)乳汁的转基因山羊，其基本流程为含FSH基因表达载体→导入山羊成纤维细胞→核移植→重构胚→检测并获得转基因山羊。下列说法错误的是( )
A．需将转基因成纤维细胞的细胞核移入MⅡ期的去核卵母细胞中
B．采用电融合法激活重构胚后才能将其移入代孕母羊体内
C．悬浮培养成纤维细胞及重构胚时因无接触抑制现象，细胞会持续增殖
D．需根据山羊胚胎的早期发育特点确定重构胚的胚胎移植时期
BC [作为核移植受体细胞的去核卵母细胞一般处于MⅡ期，利用显微操作去核法，将细胞核和第一极体一并吸出，然后将转基因成纤维细胞的细胞核移入MⅡ期的去核卵母细胞中，A正确；可通过电刺激法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，B错误；悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，不会持续增殖，需要进行分瓶处理，C错误；需根据山羊胚胎的早期发育特点确定重构胚的胚胎移植时期，一般是将胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D正确。]
12．(不定项) (2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
AC [利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A，另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，若对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C，因此对照个体的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，患者的测序结果为5′-CTACCTGTGAT-3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。]
二、非选择题
13．(2024·湖南衡阳模拟)赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，机体不能自身合成，必须从食物中补充。在谷类食物如高粱中赖氨酸含量很低。天冬氨酸激酶(AK)和二氢吡啶羧酸合酶(DHPS)是赖氨酸合成途径中两种重要的酶，并协同控制植物中游离赖氨酸的合成速率。图1为野生高粱细胞内赖氨酸合成与分解的部分过程，其中LKR和SDH是赖氨酸分解代谢的关键酶。回答下列问题：
(1)全世界每年对赖氨酸有巨大的需求，主要利用谷氨酸棒状杆菌等微生物通过发酵工程生产。除了优化菌种外，控制_________________________________等适宜的条件也能有效提高赖氨酸产量。
(2)请结合图1和题干等相关知识，从基因工程或蛋白质工程方面考虑，再提出一种提高高粱赖氨酸含量的思路：______________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
在培养谷氨酸棒状杆菌过程中发现A细菌对谷氨酸棒状杆菌有抑制作用。为探究此菌抑制谷氨酸棒状杆菌生长的原理，实验组将A细菌接种在A1平板上，B1平板中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落，把两个培养皿对扣，菌株无接触，5 d后观察菌株生长情况，结果如图2。
(3)对照组处理为A2平板__________________________，B2平板____________________________________________。
(4)根据实验结果推测，A菌可能产生某种挥发性物质抑制谷氨酸棒状杆菌的生长，作出此判断的理由是______________________________________________
____________________________________________________________________。
(5)除上述原因外，研究人员认为A细菌的发酵液中可能也存在抑制谷氨酸棒状杆菌生长的物质。他们将A细菌发酵液离心后，取上清液过滤，获得无菌滤液进行如下实验。
组别 实验处理 接种 检测
甲组 a 将直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落接种在平板中心，在恒温培养箱内培养 测量b，计算抑菌率
乙组 无菌水＋固体培养基
请补充完善该实验方案。A．__________________________；B．_______________________________________。
[解析] (1)谷氨酸棒状杆菌是一种异养需氧型微生物，温度、pH和溶解氧都会影响其代谢，而搅拌的速度会影响谷氨酸棒状杆菌与溶解氧和营养物质的接触。因此除了优化菌种外，控制搅拌速度、温度、pH、营养物浓度和溶解氧等适宜的条件也能有效提高赖氨酸产量。(2)结合图1和题干等相关知识，改造或敲除高粱细胞内控制LKR合成的相关基因，从而抑制赖氨酸的分解过程，进而提高赖氨酸的含量，或者直接改造高粱细胞内AK和DHPS基因，使合成的AK和DHPS对赖氨酸浓度不敏感，从而解除因赖氨酸达到一定浓度而对AK和DHPS活性的抑制，进而提高赖氨酸的含量。(3)实验目的是探究A细菌抑制谷氨酸棒状杆菌生长的原理，实验遵循单一变量原则，A1组接种A细菌，则A2组不接种微生物(接种无菌水)；B1组平板中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落，则B2组平板中央也应接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落。(4)实验组和对照组内两培养皿菌株均无接触，对照组谷氨酸棒状杆菌菌落直径明显大于实验组，据此可推测A细菌可能产生某种挥发性物质抑制谷氨酸棒状杆菌的生长。(5)实验的目的是证明A细菌的发酵液中可能也存在抑制谷氨酸棒状杆菌生长的物质，实验遵循单一变量原则，a应为无菌滤液＋固体培养基。因变量为抑菌率，则实验中要测量甲、乙两组中谷氨酸棒状杆菌的菌落直径，以计算抑菌率。
[答案] (1)搅拌速度、温度、pH、营养物浓度和溶解氧 (2)改造或敲除高粱细胞内控制LKR合成的相关基因，从而抑制赖氨酸的分解过程，进而提高赖氨酸的含量(或者直接改造高粱细胞内AK和DHPS基因，使合成的AK和DHPS对赖氨酸浓度不敏感，从而解除因赖氨酸达到一定浓度而对AK和DHPS活性的抑制，进而提高赖氨酸的含量) (3)不接种微生物(接种无菌水) 中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落 (4)实验组和对照组内两培养皿菌株均无接触，对照组谷氨酸棒状杆菌菌落直径明显大于实验组 (5)无菌滤液＋固体培养基 甲、乙两组谷氨酸棒状杆菌的菌落直径
14．(2024·河北唐山二模)诱导干细胞定向分化具有重要的医学价值。Pdx1基因在胰腺发育阶段的胰腺组织中大量表达，对胰腺定向发育和成熟有重要作用。研究者将Pdx1基因构建到含Tet诱导型启动子的基因表达载体(GV347)中，转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，以期实现Pdx1基因在胚胎干细胞中的定时和定量表达。回答下列问题：
(1)培养ES细胞时，应将ES细胞置于含有95%________和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养。CO2的主要作用是____________________________________________________________________。
(2)提取胰腺细胞的总mRNA，经过________过程可获得cDNA。为特异性的扩增Pdx1基因的cDNA，引物设计的依据是________________________________
____________________________________________________________________。
为使基因表达载体能成功表达Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白，应将________(填“含”或“不含”)终止子的cDNA插入GV347的限制酶切割位点(如下图)。
注：Tet诱导的启动子是在四环素存在条件下，可以激活基因表达。嘌呤霉素可抑制翻译过程。
(3)将重组载体导入ES细胞，然后将细胞置于含有____________的培养基内培养，以筛选出成功导入载体的细胞。当四环素存在时，有利于_____________与Tet诱导的启动子结合，驱动下游序列转录出mRNA。可通过显微镜检测______________________________________来确定目的基因是否翻译。
(4)研究者检测了不同条件处理下的Pdx1表达量(如下表所示)，证明转基因细胞能定时表达Pdx1。下表中①②③应分别为________、________、__________。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白表达量 － ＋＋＋＋ － －
注：ES为非转基因的胚胎干细胞；PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞：“＋”越多表示表达量越高，“－”表示未表达。
(5)为验证可通过改变四环素浓度实现对Pdx1表达量的控制，研究者用一系列浓度梯度的四环素溶液处理PDX1＋。预期结果是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[解析] (1)95%空气可以为动物细胞提供氧气，有利于其呼吸；5%CO2可以维持培养液中的pH稳定。(2)mRNA经过逆转录可以得到cDNA；引物需要与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对；Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白共用一个启动子和终止子，因此Pdx1基因的cDNA应不含终止子，否则绿色荧光蛋白基因无法表达。(3)载体上含有嘌呤霉素抗性基因，应将细胞置于含有嘌呤霉素的培养基上进行培养和筛选；RNA聚合酶与启动子结合，启动基因的转录；由于目的基因与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，因此可通过显微镜检测是否发出绿色荧光来反映目的基因是否翻译。(4)PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞，①表达融合蛋白，①为PDX1＋，因此②为四环素，有利于基因的表达；③为无四环素，则组别4的结果无相应蛋白的表达。(5)由于四环素可以促进基因的表达，因此一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高。
[答案] (1)空气 维持培养液的pH (2)逆转录 与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对 不含 (3)嘌呤霉素 RNA聚合酶 是否发出绿色荧光 (4)PDX1＋ 有 无 (5)一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高
15．(2024·湖北武汉二模)瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白(GFP)基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。回答下列问题：
(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的________(填“5′”或“3′”)端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、_______________________________，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
(2)已知HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是_____________________________________________________________
____________________________________________________________________。
本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是______________________________(答出2种)。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行_________________。
[解析] (1)引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，因此引物1左侧为5′端，DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，因此与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的3′端。构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、HindⅢ和BamHⅠ的切割位点。(2)由于HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近，因此用HindⅢ、BamHⅠ对P载体进行切割后，会形成一个大片段，接近4 700 bp，一个超小片段可忽略，即对P载体酶切产物电泳后，只出现接近4 700 bp的条带。若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用HindⅢ、BamHⅠ对重组质粒切割后，会出现两个片段，一个是瘦素基因，一个是近4 700 bp的片段，则电泳结果会出现两个条带，如图(略)，见答案所示。 (3)Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同)，因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。本实验中受体细胞为小鼠成纤维细胞，为真核细胞，则Kanr/Neor在真核细胞中表达具有新霉素抗性，为筛选转化的细胞，应在培养基中添加新霉素，能存活的细胞为导入重组质粒的受体细胞。(4)瘦素基因表达产物为蛋白质，因此可以用抗原—抗体杂交技术进行检测瘦素基因是否成功表达，同时目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况，即可以检测绿色荧光的强弱。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行动物细胞培养。
[答案] (1)3′ HindⅢ和BamHⅠ的切割位点
(2)
(3)Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同) 新霉素 (4)抗原—抗体杂交技术、检测绿色荧光强弱 动物细胞培养
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长句表述训练(五)
专题五 生物技术与工程
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1．事实概述类
(1)黄酒发酵通常选择在较寒冷的冬天进行，实践证明，若选在夏天酿制黄酒，即便严格密封也会出现黄酒变酸的现象，原因可能是___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：发酵液中混有醋酸菌，在温度升高、缺少糖源时，醋酸菌将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸
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(2)划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条划线上无菌落，其他划线上有菌落。造成第一条划线无菌落的错误操作可能是_____________________
___________________________________________________________。
提示：接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始
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2．判断依据类
(1)蓝莓含有丰富的维生素、多酚等天然活性成分，被赞为浆果之王。某生物学兴趣小组以蓝莓为原料，尝试发酵制作蓝莓酒，兴趣小组有三位同学设计的酿蓝莓酒的装置如下图所示，其中最合理的是瓶________，其判断依据是____________________________________。
提示：乙 果酒发酵过程是无氧条件，且出气口不能没入发酵液，发酵液不能装太满
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(2)在细胞内DNA合成一般有两条途径。主要途径(途径一)是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断此途径，另一辅助途径(途径二)是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。根据这样的原理，向经诱导后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合培养液中添加氨基蝶呤能筛选杂交瘤细胞，其判断依据是____________。
提示：杂交瘤细胞能通过途径一和途径二合成DNA，而骨髓瘤细胞只能通过途径一合成DNA，而B淋巴细胞不能无限增殖，所以加入氨基蝶呤阻断途径一后，只有杂交瘤细胞能利用途径二进行增殖
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3．原因分析类
(1)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是___________________________________________。
提示：琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
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(2)重组疫苗是一种基因工程疫苗，该疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因_________。
提示：重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统
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(3)某课题组用生物技术制备转基因小鼠，通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_________。
提示：雄原核较大，更容易容纳外源DNA
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4．判断依据类
(1)EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。抗原的选择和制备过程为：将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1和VP2、非EV71蛋白注射到小鼠体内，多次免疫后，取上述各组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，
结果如下图所示。
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EV71免疫的小鼠血清抗体________(填“是”或“不是”)单一抗体，据图分析判断依据是________________________________。
提示：不是 用EV71免疫的小鼠血清的抗体与VP1和VP2抗原的结合强度都较高
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(2)为了解乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式是抑制细菌生长、溶菌性杀死细菌(细胞破裂)还是非溶菌性杀死细菌，科研人员将乳链菌肽加入革兰氏阳性菌菌液中，随着发酵时间的延长，检测革兰氏阳性菌的活菌数、除去菌体的上清液中核酸含量，实验结果如下图所示。
题号
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以上实验表明乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式为________________，其判断依据是_________。
提示：非溶菌性杀死细菌 曲线3活菌数降为零，说明是杀死细菌；除去菌体的上清液中核酸含量没有明显变化，说明不是溶菌
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5．实验思路类
(1)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________________________。
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提示：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置后，统计三支试管中血液凝固所需时间
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(2)URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
__________________________________________________________。
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提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组质粒，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况
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6．结果预期类
(1)在探究菌株A对金黄色葡萄球菌的抑菌机理时，该研究人员作出了这样的假设：菌株A通过分泌某种化学物质来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。请利用以下材料设计实验证明该假设成立。
实验材料设备：含菌株A的发酵液、无菌水、含金黄色葡萄球菌的指示培养基(已打有大小相同的两个孔)、离心机等。
①完善实验思路：用离心机____________________________，取适量且等量的________________，分别接种到含有金黄色葡萄球菌的指示培养基的两个孔中，一段时间后，观察是否出现抑菌圈。
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②预期结果：______________________________。
提示：①对含菌株A的发酵液进行离心 上清液和无菌水 ②若加有上清液的小孔周围出现抑菌圈，则证明菌株A通过分泌某种化学物质来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖
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(2)葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。____________________。(简要写出实验步骤和预期结果)
提示：实验步骤：将平板置于无氧环境下继续培养，观察菌落形态和透明圈大小；预期结果：若菌落继续生长，且透明圈增大，则为厌氧型的乳酸菌菌落，若菌落不能继续生长，透明圈不再扩大，则为醋酸菌菌落
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7．分析评价类
(1)红酸汤是我国西南地区独特的民间饮食文化，“三天不吃酸，走路打蹿蹿”，反映了当地老百姓对红酸汤的喜爱。如图为某兴趣小组对红酸汤制作过程中发酵液的pH和亚硝酸盐含量的检测结果，据图说明取用红酸汤的最佳时间，
并作出合理解释。
________________________。
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提示：建议发酵14 d后取食，取食过早发酵时间太短，红酸汤不够酸，风味不佳，另外亚硝酸盐含量高影响身体健康。14 d以后pH呈酸性、亚硝酸盐含量大大降低，更适合食用
(2)黄酒中的低聚糖能促进肠道内乳酸杆菌等益生菌的增殖。某同学认为有氧环境下乳酸杆菌在MRS培养基(乳酸杆菌能溶解MRS培养基中的碳酸钙而使菌落周围形成溶钙圈)上增殖的速度会加快，你是否同意该同学的观点。 请写出实验探究方案以证明你的观点。
___________________________________________________________。
提示：不同意。实验设计思路：将生活状态良好的乳酸杆菌随机分为甲、乙两组，甲组在有氧条件下接种于MRS培养基上，乙组在无氧条件下接种于相同的培养基上，在适宜条件下培养一段时间后观察溶钙圈的形成情况；预期实验结果：甲组无溶钙圈形成或溶钙圈较小，乙组溶钙圈显著大于甲组
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8．开放思维类
黄酮类化合物是广泛分布于植物体内的次生代谢物。某同学认为利用细胞产物的工厂化生产黄酮类化合物主要是利用促进细胞生长的培养条件，来提高单个细胞中黄酮类化合物的含量，你同意该同学的观点吗，并说明相应的理由。
_________________________________________________________。
提示：不同意。植物细胞的次生代谢物含量很低，利用细胞产物的工厂化生产黄酮类化合物主要是通过增加细胞数量从而增加黄酮类化合物的含量
专题限时集训(五) 生物技术与工程
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(建议用时：40分钟)
一、选择题
1．(2024·湖北十堰模拟)酱油起源于我国，至今已有数千年历史。参与酱油酿造过程的微生物主要有米曲霉、酵母菌和乳酸菌等，在众多微生物及其酶系的作用下，大豆、小麦中的蛋白质、脂肪等有机物被分解，最终形成具有特殊色泽和良好风味的酱油。酱油的制作流程及发酵过程中主要微生物的数量变化如图1、图2所示。下列说法错误的是( )
A．米曲霉发酵的主要目的是使米曲霉
充分生长繁殖，分泌制作酱油所需的蛋
白酶、脂肪酶等
B．已知发酵池发酵阶段是密封进行的，
此时酵母菌与乳酸菌对氧气的代谢方式
可能相同
C．乳酸菌发酵产生的乳酸能抑制杂菌生长，与酵母菌表现为原始合作关系
D．发酵池中加入食盐的主要作用之一是抑制部分有害微生物的生长
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√
C [米曲霉发酵的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，分泌制作酱油所需的蛋白酶、脂肪酶等，A正确；由于发酵阶段是密封进行的，此时酵母菌与乳酸菌都只进行无氧呼吸，代谢方式相同，B正确；分析图2可知，发酵过程中乳酸菌数量减少时，酵母菌的数量在增加，由此可知两者不是原始合作关系，C错误；抑制杂菌污染和繁殖是保证酱油质量的重要因素，发酵池中加入食盐可抑制部分有害微生物的生长，D正确。]
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2．(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是( )
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
√
D [由图可知，②中拨出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。综上所述，①③④⑤正确，故选D。]
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3．(2024·山东潍坊期末)植物根际促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用。某研究团队从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮菌时，筛选出一株分解淀粉芽孢杆菌H，其产生的抗菌肽抑菌效果如表所示。下列说法正确的是( )
测试菌 抗菌肽浓度/(μg·mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
甲 － － － － － ＋ ＋
注：“＋”表示出现菌落，“－”表示不出现菌落。
测试菌 抗菌肽浓度/(μg·mL-1)
55.20 27.60 13.80 6.90 3.45 1.73 0.86
乙 － － － － － ＋ ＋
丙 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
丁 － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
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A．筛选固氮细菌时，培养基的主要营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源
B．若统计平板上分解淀粉的固氮菌数量，则菌落数往往比活菌数多
C．该抗菌肽对丙菌和丁菌的抑制效果较好
D．要确定对甲菌抑制效果的最低浓度，需在1.73～3.45 μg·mL-1区间进一步实验
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D [固氮细菌能够自身固氮，培养基中不需要氮源，因此其培养基的主要营养物质包括水、无机盐和碳源，A错误；由于连在一起的细菌形成一个菌落，对固氮菌进行计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，B错误；由题表可知，在抗菌肽浓度为3.45～55.20 μg·mL-1范围内，甲菌和乙菌均不能生长，表明该抗菌肽对甲菌和乙菌的抑菌效果较好，C错误；要确定对甲菌抑制效果的最低浓度，需在1.73～3.45 μg·mL-1区间进一步实验，D正确。]
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4．(2024·吉林长春模拟)研究人员将粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞进行融合培育出新的烟草品种，其大致过程为：制备原生质体→促进原生质体融合→融合细胞→愈伤组织→烟草幼苗。同时研究人员探究了PEG 对原生质体融合的影响，结果如下表所示。下列相关叙述正确的是( )
编号 PEG用量/μL PEG：原生质体悬浮液 融合率/% 细胞碎片
1 20 1∶5 6.5 ＋
注：原生质体悬浮液用量100 μL，融合25 min。“＋”表示很少；“＋＋”表示少量；“＋＋＋”表示较多。
编号 PEG用量/μL PEG：原生质体悬浮液 融合率/% 细胞碎片
2 40 2∶5 15.5 ＋
3 60 3∶5 19.4 ＋
4 80 4∶5 20.4 ＋＋
5 100 1∶1 21.6 ＋＋＋
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A．制备原生质体时需用含纤维素酶和果胶酶的低渗溶液处理细胞
B．若PEG对原生质体处理时间远长于25 min，则融合率会提高
C．由实验结果可知，促进原生质体融合的较适PEG用量为60 μL
D．细胞融合完成的标志是再生出细胞壁，其经再分化形成愈伤组织
题号
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C [制备原生质体时需用含纤维素酶和果胶酶的等渗溶液处理细胞，以维持原生质体正常的形态和功能，A错误；题中只探究了PEG对原生质体处理时间25 min时的融合率，若处理时间长于
25 min，则融合率如何变化未知，B错误；PEG用量为60 μL时，融合率较高且细胞碎片很少，故促进原生质体融合的较适PEG用量为60 μL，C正确；细胞融合完成的标志是再生出细胞壁，其经脱分化形成愈伤组织，D错误。]
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5．(2024·广东广州模拟)普通六倍体小麦(6n＝42)的基因组庞大，其研究工作相对困难；拟南芥(2n＝10)是应用广泛的模式植物，其基因组测序已完成，遗传背景相对清晰。以普通小麦胚性愈伤组织来源的原生质体为供体，用紫外线分别照射30 s、1 min、2 min后，再与拟南芥原生质体进行融合，希望将小麦染色体小片段插入拟南芥基因组，从而借助其清晰的遗传背景对小麦基因组进行研究。下列相关说法错误的是( )
A．可用聚乙二醇或高Ca2+—高pH融合法等化学方法诱导原生质体融合
B．原生质体融合后，应进一步筛选染色体数为52的细胞来对小麦进行研究
C．外植体经诱导形成愈伤组织的过程需要控制生长素与细胞分裂素的比例
D．该过程还探究了紫外线处理时间(剂量)对供体染色体断裂程度的影响
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B [诱导植物细胞原生质体融合时，可用聚乙二醇或高Ca2+—高pH融合法等化学方法，A正确；本实验中，细胞融合的目的是将小麦染色体小片段插入拟南芥基因组，从而借助其清晰的遗传背景对小麦基因组进行研究，而不是单纯得到两细胞核融合的细胞，B错误；植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素，它们的浓度、比例等都会影响植物细胞的发育方向，外植体经诱导形成愈伤组织的过程需要控制生长素与细胞分裂素的比例，C正确；根据用紫外线分别照射30 s、1 min、2 min，可判断自变量是紫外线处理时间(剂量)，故该过程还探究了紫外线处理时间(剂量)对供体染色体断裂程度的影响，D正确。]
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6．(2024·江苏南通二模)人参和西洋参是五加科人参属的药用植物，它们含有的人参皂苷具有抗肿瘤等作用。科研人员选用人参和西洋参有性杂交获得的杂种胚细胞以及人参种子胚、西洋参种子胚的愈伤组织进行悬浮细胞培养，建立其单细胞株系并对三者的部分特性进行比较研究，如图1、2所示，其中Re具有治疗心肌缺血的功能，Rg3具有抗癌作用。据题分析，
下列说法正确的有( )
A．人参皂苷不是人参和西洋参生长和生存所必需的，其药用价值体现生物多样性的直接价值
B．图1所示过程主要依据植物细胞的全能性
C．图1中过程②为再分化，过程④中蔗糖浓度过低、过高都不利于悬浮细胞的培养
D．杂种胚中的大多数种类皂苷含量均高于其他两种，应作为抗癌药物的优先选择
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A [人参皂苷是次生代谢物，不是人参和西洋参生长和生存所必需的，其药用价值体现生物多样性的直接价值，A正确；图1所示过程，不体现植物细胞的全能性，B错误；图1中过程②是进行悬浮细胞培养，C错误；杂种胚中的大多数种类的皂苷的含量均高于其他两种，这体现了杂种优势，图中可知，Rg3具有抗癌作用，若要获得具有抗癌作用的药物应优先选择人参(种子胚)的愈伤组织，D错误。]
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7．(2024·广东湛江二模)通过动物细胞工程技术，可以利用患者自身的细胞在体外诱导发育成特定的组织器官，然后再移植回患者体内。图1和图2 表示利用自身细胞进行器官移植的两种方法，其中诱导多能干细胞(iPS 细胞)类似于人类的胚胎干细胞。下列叙述正确的是( )
A．两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有95%O2和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中
B．利用两种方法所获得的组织器官的遗传物质均与患者的完全相同，因此移植后不会发生免疫排斥反应
C．可利用农杆菌转化法或显微注射法将Oct3/4 基因、Sox基因、c-Myc 基因和Klf基因导入成纤维细胞
D．图2中卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可整个注入去核的卵母细胞中
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D [两种方法都需要运用动物细胞培养技术，需要将细胞置于含有 95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中，A错误；图1所示方法导入了Oct3/4基因、Sox基因、c-Myc基因和Klf基因，图2中提供质遗传物质的卵母细胞的来源未知，因此两种方法所获得的组织器官的遗传物质均可能和患者的不完全相同，B错误；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，C错误；核移植的过程中，卵母细胞去核实际去除的是纺锤体—染色体复合物，核移植时供体细胞不用去核，可将整个供体细胞注入去核的卵母细胞中，D正确。]
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8．(2024·北京西城一模)下图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
A．PCR扩增A时可在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点
B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养
D．启动子若为除草剂诱导启动子，将减少细胞物质和能量浪费
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C [PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点，A正确；由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题意可知，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色，而重组质粒中没有GUS基因，故用农杆菌转化植物愈伤组织后，导入重组质粒的愈伤组织没有GUS基因，不会呈蓝色，C错误；启动子若为除草剂诱导启动子，则可以通过该启动子控制外源基因在特定环境中表达，将减少细胞物质和能量浪费，D正确。]
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9．(2024·湖北襄阳一模)噬菌体展示技术是将外源蛋白基因插入噬菌体外壳蛋白基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白基因的表达而表达，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术(如图所示)。下列叙述错误的是( )
A．噬菌体抗体展示过程，抗体的
合成场所一定是受体细胞的核糖体
B．噬菌体展示库的构建需将特定
的基因片段拼接重组在噬菌体载体上并转染受体细胞
C．建立噬菌体展示库需要的工具酶有限制酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶
D．通过图中诱变处理及筛选，最终可能筛选出与某种抗原亲和力更强的抗体及其基因
题号
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C [噬菌体作为病毒不具有独立的代谢功能，为专性寄生物，因此，噬菌体抗体展示过程中抗体作为蛋白质，其合成场所一定是受体细胞的核糖体，A正确；噬菌体展示库的构建需将特定的基因片段拼接重组在噬菌体载体上并转染到受体细胞中，随着受体细胞DNA复制而复制，B正确；建立噬菌体展示库需要切割目的基因和病毒载体，然后将二者连接起来，需要限制酶和DNA连接酶等，该过程中不需要RNA聚合酶，C错误；诱变的原理是基因突变，具有不定向性，所以通过图中诱变处理及筛选最终可获得与抗原亲和力更强的抗体及其基因，D正确。]
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10．(2024·山东淄博二模)dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)的结构与ATP类似，除碱基不同外，dNTP含有脱氧核糖。与dNTP相比，ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3′碳位为-H且不能与磷酸形成化学键。现有甲～丁四个PCR反应体系，甲体系中含有放射性磷标记的ddATP(记作ddATP＋)和DNA模板链。PCR完成后，经电泳(分子量小的DNA在电场中移动快)将甲体系中一组长度不等的DNA单链分离。丙、乙、丁三个PCR体系与甲相似，分别用于检测T、C、G的碱基序列，检测结果如图。下列说法正确的是( )
A．ddATP＋中的放射性磷酸基团应位于ddATP的末端
B．甲体系中除含ddATP＋外，还应含有dTTP、dGTP、dCTP
C．新掺入的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的5′端
D．模板DNA的碱基序列为3′-CTGGACTGACAT-5′
题号
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D [由于ddNTP的五碳糖为双脱氧核糖，其3′碳位为-H且不能与磷酸形成化学键，因此ddATP＋中的放射性磷酸基团不应位于ddATP的末端，A错误；甲体系中除含ddATP＋外，还应含有dATP、dTTP、dGTP、dCTP，B错误；PCR扩增时，由5′端向3′端延伸，则新掺入的脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接在子链的3′端，C错误；当 ddNTP 结合时，DNA 合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处，根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列，PCR扩增时，由5′端向3′端延伸，则根据电泳图及分子量小的DNA在电场中移动快可知，该DNA片段的待测碱基序列为5′-GACCTGACTGTA-3′，因此模板DNA的碱基序列为3′-CTGGACTGACAT-5′，D正确。]
题号
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11．(不定项)(2024·山东德州二模)科研人员成功培育了能分泌含卵泡刺激素(FSH)乳汁的转基因山羊，其基本流程为含FSH基因表达载体→导入山羊成纤维细胞→核移植→重构胚→检测并获得转基因山羊。下列说法错误的是( )
A．需将转基因成纤维细胞的细胞核移入MⅡ期的去核卵母细胞中
B．采用电融合法激活重构胚后才能将其移入代孕母羊体内
C．悬浮培养成纤维细胞及重构胚时因无接触抑制现象，细胞会持续增殖
D．需根据山羊胚胎的早期发育特点确定重构胚的胚胎移植时期
√
√
BC [作为核移植受体细胞的去核卵母细胞一般处于MⅡ期，利用显微操作去核法，将细胞核和第一极体一并吸出，然后将转基因成纤维细胞的细胞核移入MⅡ期的去核卵母细胞中，A正确；可通过电刺激法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程，B错误；悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，不会持续增殖，需要进行分瓶处理，C错误；需根据山羊胚胎的早期发育特点确定重构胚的胚胎移植时期，一般是将胚胎发育至桑葚胚或囊胚阶段，D正确。]
题号
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12．(不定项) (2024·湖南卷)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是( )
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
题号
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√
AC [利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A，另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，若对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C，因此对照个体的测序结果为5′-CTACCCGTGAT-3′，患者的测序结果为5′-CTACCTGTGAT-3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。]
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二、非选择题
13．(2024·湖南衡阳模拟)赖氨酸是人类和哺乳动物的必需氨基酸之一，机体不能自身合成，必须从食物中补充。在谷类食物如高粱中赖氨酸含量很低。天冬氨酸激酶(AK)和二氢吡啶羧酸合酶(DHPS)是赖氨酸合成途径中两种重要的酶，并协同控制植物中游离赖氨酸的合成速率。图1为野生高粱细胞内赖氨酸合成与分解的部分过程，其中LKR和SDH是赖氨酸分解代谢的关键酶。回答下列问题：
(1)全世界每年对赖氨酸有巨大的需求，主要利用谷氨酸棒状杆菌等微生物通过发酵工程生产。除了优化菌种外，控制______________
______________________________等适宜的条件也能有效提高赖氨酸产量。
搅拌速度、温
度、pH、营养物浓度和溶解氧
(2)请结合图1和题干等相关知识，从基因工程或蛋白质工程方面考虑，再提出一种提高高粱赖氨酸含量的思路：__________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________。
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改造或敲除高粱细胞
内控制LKR合成的相关基因，从而抑制赖氨酸的分解过程，进而提
高赖氨酸的含量(或者直接改造高粱细胞内AK和DHPS基因，使合成
的AK和DHPS对赖氨酸浓度不敏感，从而解除因赖氨酸达到一定浓
度而对AK和DHPS活性的抑制，进而提高赖氨酸的含量)
在培养谷氨酸棒状杆菌过程中发现A细菌对谷氨酸棒状杆菌有抑制作用。为探究此菌抑制谷氨酸棒状杆菌生长的原理，实验组将A细菌接种在A1平板上，B1平板中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落，把两个培养皿对扣，菌株无接触，5 d后观察菌株生长情况，结果如图2。
题号
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(3)对照组处理为A2平板__________________________，B2平板____________________________________________。
(4)根据实验结果推测，A菌可能产生某种挥发性物质抑制谷氨酸棒状杆菌的生长，作出此判断的理由是_________________________
__________________________________________________________。
题号
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不接种微生物(接种无菌水)
中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落
实验组和对照组内两培养皿
菌株均无接触，对照组谷氨酸棒状杆菌菌落直径明显大于实验组
(5)除上述原因外，研究人员认为A细菌的发酵液中可能也存在抑制谷氨酸棒状杆菌生长的物质。他们将A细菌发酵液离心后，取上清液过滤，获得无菌滤液进行如下实验。
组别 实验处理 接种 检测
甲组 a 将直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落接种在平板中心，在恒温培养箱内培养 测量b，计算抑菌率
乙组 无菌水＋固体培养基
请补充完善该实验方案。A．_______________________；B．___________________
_____________________。
题号
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无菌滤液＋固体培养基
甲、乙两组谷氨酸
棒状杆菌的菌落直径
[解析] (1)谷氨酸棒状杆菌是一种异养需氧型微生物，温度、pH和溶解氧都会影响其代谢，而搅拌的速度会影响谷氨酸棒状杆菌与溶解氧和营养物质的接触。因此除了优化菌种外，控制搅拌速度、温度、pH、营养物浓度和溶解氧等适宜的条件也能有效提高赖氨酸产量。
(2)结合图1和题干等相关知识，改造或敲除高粱细胞内控制LKR合成的相关基因，从而抑制赖氨酸的分解过程，进而提高赖氨酸的含量，或者直接改造高粱细胞内AK和DHPS基因，使合成的AK和DHPS对赖氨酸浓度不敏感，从而解除因赖氨酸达到一定浓度而对AK和DHPS活性的抑制，进而提高赖氨酸的含量。
题号
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(3)实验目的是探究A细菌抑制谷氨酸棒状杆菌生长的原理，实验遵循单一变量原则，A1组接种A细菌，则A2组不接种微生物(接种无菌水)；B1组平板中央接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落，则B2组平板中央也应接种直径为0.5 cm的谷氨酸棒状杆菌菌落。
(4)实验组和对照组内两培养皿菌株均无接触，对照组谷氨酸棒状杆菌菌落直径明显大于实验组，据此可推测A细菌可能产生某种挥发性物质抑制谷氨酸棒状杆菌的生长。
(5)实验的目的是证明A细菌的发酵液中可能也存在抑制谷氨酸棒状杆菌生长的物质，实验遵循单一变量原则，a应为无菌滤液＋固体培养基。因变量为抑菌率，则实验中要测量甲、乙两组中谷氨酸棒状杆菌的菌落直径，以计算抑菌率。
题号
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14．(2024·河北唐山二模)诱导干细胞定向分化具有重要的医学价值。Pdx1基因在胰腺发育阶段的胰腺组织中大量表达，对胰腺定向发育和成熟有重要作用。研究者将Pdx1基因构建到含Tet诱导型启动子的基因表达载体(GV347)中，转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)，以期实现Pdx1基因在胚胎干细胞中的定时和定量表达。回答下列问题：
(1)培养ES细胞时，应将ES细胞置于含有95%________和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养。CO2的主要作用是_________________。
空气
维持培养液的pH
(2)提取胰腺细胞的总mRNA，经过________过程可获得cDNA。为特异性的扩增Pdx1基因的cDNA，引物设计的依据是_____________
_______________________________。
为使基因表达载体能成功表达Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白，应将________(填“含”或“不含”)终止子的cDNA插入GV347的限制酶切割位点(如下图)。
注：Tet诱导的启动子是在四环素存在条件下，可以激活基因表达。嘌呤霉素可抑制翻译过程。
题号
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逆转录
与Pdx1基因
cDNA的3′端碱基序列互补配对
不含
(3)将重组载体导入ES细胞，然后将细胞置于含有____________的培养基内培养，以筛选出成功导入载体的细胞。当四环素存在时，有利于_____________与Tet诱导的启动子结合，驱动下游序列转录出mRNA。可通过显微镜检测___________________来确定目的基因是否翻译。
(4)研究者检测了不同条件处理下的Pdx1表达量(如下表所示)，证明转基因细胞能定时表达Pdx1。下表中①②③应分别为________、______、_____。
题号
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嘌呤霉素
RNA聚合酶
是否发出绿色荧光
PDX1＋
有
无
注：ES为非转基因的胚胎干细胞；PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞：“＋”越多表示表达量越高，“－”表示未表达。
组别 1 2 3 4
细胞类型 ES ① ES PDX1＋
四环素 有 ② 无 ③
融合蛋白表达量 － ＋＋＋＋ － －
题号
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(5)为验证可通过改变四环素浓度实现对Pdx1表达量的控制，研究者用一系列浓度梯度的四环素溶液处理PDX1＋。预期结果是__________________________________________________。
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一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高
[解析] (1)95%空气可以为动物细胞提供氧气，有利于其呼吸；5%CO2可以维持培养液中的pH稳定。
(2)mRNA经过逆转录可以得到cDNA；引物需要与Pdx1基因cDNA的3′端碱基序列互补配对；Pdx1蛋白和绿色荧光蛋白共用一个启动子和终止子，因此Pdx1基因的cDNA应不含终止子，否则绿色荧光蛋白基因无法表达。
(3)载体上含有嘌呤霉素抗性基因，应将细胞置于含有嘌呤霉素的培养基上进行培养和筛选；RNA聚合酶与启动子结合，启动基因的转录；由于目的基因与绿色荧光蛋白基因形成融合基因，因此可通过显微镜检测是否发出绿色荧光来反映目的基因是否翻译。
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(4)PDX1＋为转入表达载体的胚胎干细胞，①表达融合蛋白，①为PDX1＋，因此②为四环素，有利于基因的表达；③为无四环素，则组别4的结果无相应蛋白的表达。
(5)由于四环素可以促进基因的表达，因此一定浓度范围内，Pdx1表达量随着Tet浓度增加而升高。
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15．(2024·湖北武汉二模)瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白(GFP)基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。回答下列问题：
(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的________(填“5′”或“3′”)端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、___________
______________________，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
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3′
HindⅢ和
BamHⅠ的切割位点
(2)已知HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用HindⅢ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
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(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是____________________________
___________________________________________________________。
本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是____________
__________________________(答出2种)。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行_________________。
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Kanr/Neor抗性基因在真核与原
核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同)
新霉素
抗原—抗体杂
交技术、检测绿色荧光强弱
动物细胞培养
[解析] (1)引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，因此引物1左侧为5′端，DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，因此与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的3′端。构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、HindⅢ和BamHⅠ的切割位点。
(2)由于HindⅢ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近，因此用HindⅢ、BamHⅠ对P载体进行切割后，会形成一个大片段，接近4 700 bp，一个超小片段可忽略，即对P载体酶切产物电泳后，只出现接近
4 700 bp的条带。若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用HindⅢ、BamHⅠ对重组质粒切割后，会出现两个片段，一个是瘦素基因，一个是近4 700 bp的片段，则电泳结果会出现两个条带，如图(略)，见答案所示。
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(3)Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同)，因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。本实验中受体细胞为小鼠成纤维细胞，为真核细胞，则Kanr/Neor在真核细胞中表达具有新霉素抗性，为筛选转化的细胞，应在培养基中添加新霉素，能存活的细胞为导入重组质粒的受体细胞。
(4)瘦素基因表达产物为蛋白质，因此可以用抗原—抗体杂交技术进行检测瘦素基因是否成功表达，同时目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况，即可以检测绿色荧光的强弱。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行动物细胞培养。
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151．事实概述类
(1)黄酒发酵通常选择在较寒冷的冬天进行，实践证明，若选在夏天酿制黄酒，即便严格密封也会出现黄酒变酸的现象，原因可能是________________________
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(2)划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条划线上无菌落，其他划线上有菌落。造成第一条划线无菌落的错误操作可能是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．判断依据类
(1)蓝莓含有丰富的维生素、多酚等天然活性成分，被赞为浆果之王。某生物学兴趣小组以蓝莓为原料，尝试发酵制作蓝莓酒，兴趣小组有三位同学设计的酿蓝莓酒的装置如下图所示，其中最合理的是瓶________，其判断依据是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)在细胞内DNA合成一般有两条途径。主要途径(途径一)是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断此途径，另一辅助途径(途径二)是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶催化合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。根据这样的原理，向经诱导后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合培养液中添加氨基蝶呤能筛选杂交瘤细胞，其判断依据是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
3．原因分析类
(1)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)重组疫苗是一种基因工程疫苗，该疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(3)某课题组用生物技术制备转基因小鼠，通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_____________________________________
_____________________________________________________________________。
4．判断依据类
(1)EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。抗原的选择和制备过程为：将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1和VP2、非EV71蛋白注射到小鼠体内，多次免疫后，取上述各组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，结果如下图所示。
EV71免疫的小鼠血清抗体________(填“是”或“不是”)单一抗体，据图分析判断依据是___________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)为了解乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式是抑制细菌生长、溶菌性杀死细菌(细胞破裂)还是非溶菌性杀死细菌，科研人员将乳链菌肽加入革兰氏阳性菌菌液中，随着发酵时间的延长，检测革兰氏阳性菌的活菌数、除去菌体的上清液中核酸含量，实验结果如下图所示。
以上实验表明乳链菌肽对革兰氏阳性菌的作用方式为________________，其判断依据是_______________________________________________________________
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5．实验思路类
(1)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
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_____________________________________________________________________。
6．结果预期类
(1)在探究菌株A对金黄色葡萄球菌的抑菌机理时，该研究人员作出了这样的假设：菌株A通过分泌某种化学物质来抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖。请利用以下材料设计实验证明该假设成立。
实验材料设备：含菌株A的发酵液、无菌水、含金黄色葡萄球菌的指示培养基(已打有大小相同的两个孔)、离心机等。
①完善实验思路：用离心机______________，取适量且等量的____________，分别接种到含有金黄色葡萄球菌的指示培养基的两个孔中，一段时间后，观察是否出现抑菌圈。
②预期结果：_________________________________________________________
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(2)葡萄酒生产过程中会产生大量的酿酒残渣(皮渣)。皮渣堆积过程中也会积累某些兼性厌氧型乳酸菌。初筛醋酸菌时，乳酸菌有可能混入其中，且两者菌落形态相似。请设计一个简单实验，区分筛选平板上的醋酸菌和乳酸菌。
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_____________________________________________________________________。(简要写出实验步骤和预期结果)
7．分析评价类
(1)红酸汤是我国西南地区独特的民间饮食文化，“三天不吃酸，走路打蹿蹿”，反映了当地老百姓对红酸汤的喜爱。如图为某兴趣小组对红酸汤制作过程中发酵液的pH和亚硝酸盐含量的检测结果，据图说明取用红酸汤的最佳时间，并作出合理解释。
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(2)黄酒中的低聚糖能促进肠道内乳酸杆菌等益生菌的增殖。某同学认为有氧环境下乳酸杆菌在MRS培养基(乳酸杆菌能溶解MRS培养基中的碳酸钙而使菌落周围形成溶钙圈)上增殖的速度会加快，你是否同意该同学的观点。 请写出实验探究方案以证明你的观点。
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8．开放思维类
黄酮类化合物是广泛分布于植物体内的次生代谢物。某同学认为利用细胞产物的工厂化生产黄酮类化合物主要是利用促进细胞生长的培养条件，来提高单个细胞中黄酮类化合物的含量，你同意该同学的观点吗，并说明相应的理由。
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