第58讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
一、选择题
1.（2025·江苏南通统考）如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamH Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是（ ）
A.三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
B.这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C.BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
D.图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
2.（2025·吉林四平高三联考）科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒HPV-16L1基因，构建了含HPV-16L1基因的表达载体pBI-L1，经根瘤农杆菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反应器，生产出了纯度较高的HPV-16L1蛋白。下列说法错误的是（ ）
A.利用PCR扩增HPV-16L1基因的前提是已知该基因的一段碱基序列
B.构建表达载体pBI-L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
C.必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
D.可以用抗原—抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白
3.（2025·山东聊城一模）下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳鉴定的叙述，正确的是（ ）
A.利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可将DNA进一步纯化分离
B.在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA
C.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液不能没过凝胶
4.（2025·辽宁沈阳模拟）农杆菌转化法是植物转基因技术中常用的转化方法之一。下列与该方法相关的叙述，错误的是（ ）
A.土壤农杆菌是重组质粒的受体细胞
B.T-DNA是拟核DNA上的一段序列
C.农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物
D.新鲜叶圆片与农杆菌在适宜条件下共培养，部分细胞会被转化
5.（2025·广东深圳光明区高三检测）如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是（ ）
A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C.为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ
D.受体细胞能在含青霉素的培养基中生长，表明目的基因已成功导入该细胞
6.（2025·广东梅州联考）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（ ）
A.图示环节所需的温度比上一个环节的低
B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端
C.Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成
D.经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同
7.（2025·广东肇庆调研）在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是（ ）
A.该载体最可能为环形DNA分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C.限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp
D.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
8.（2025·湖南衡阳月考）戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白（pORF2）位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述错误的是（ ）
A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B.重组基因表达载体上的启动子需来源于大肠杆菌
C.过程⑤需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
9.图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是（ ）
A.若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c
B.构建表达载体时可选用BclⅠ和BamHⅠ这两种限制酶
C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌
D.只利用含四环素的培养基就不能直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞
二、非选择题
10.（2025·广东湛江高三一模）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。回答下列相关问题：
（1）利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是 ，该过程需要选择 限制酶切割甜蛋白基因。
（2）Ti质粒上的启动子是 识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为 。
（3）农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是 ，该过程发生的变异类型为 。然后在添加 （填物质）的培养基中培养番茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。
（4）若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，若子代表型及比例为 ，则说明2个甜蛋白基因插入两对同源染色体上（含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同）。
第58讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.C 根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，且长度大小相同，A、B正确；用BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端，故BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接，C错误；图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D正确。
2.C 利用PCR扩增HPV-16L1基因的前提是已知该基因的一段碱基序列，根据该序列制作引物，A正确；用两种不同限制酶，可保证目的基因和载体定向连接，且不发生自身环化，B正确；除选用烟草的受精卵作为受体细胞外，也可选用烟草的根尖分生区细胞作为受体细胞，然后通过植物组织培养使每个细胞中均含有目的基因，C错误；分子水平对目的基因进行检测，可根据抗原—抗体杂交技术检测相应蛋白质，D正确。
3.A DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用这个特性将DNA与蛋白质分离，A正确；在提取白色丝状物时用玻璃棒轻轻单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA，B错误；PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，C错误；通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物时，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜，D错误。
4.B 将目的基因与载体相连形成重组质粒后，要导入土壤农杆菌内，再让农杆菌去侵染植物细胞，A正确；T-DNA是位于Ti质粒中的一段序列，不位于拟核，B错误；农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，C正确；农杆菌转化法的转化效率不是100％，因此适宜条件下，新鲜叶圆片与农杆菌共培养后，部分细胞会被转化，D正确。
5.C 根据题意可知，目的基因的两端有EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcoR Ⅰ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcoR Ⅰ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA，因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误。DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割后的质粒两端形成的末端也不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确。导入普通质粒的受体细胞和导入重组质粒的受体细胞都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。
6.D 题图中环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度（50 ℃左右）比变性的温度（90 ℃以上）低，A正确；在PCR扩增中，子链延伸的方向是从5'端到3'端，所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B正确；Taq DNA聚合酶能催化磷酸二酯键的形成，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不一定相同，一般PCR第三轮才可以扩增出双链脱氧核苷酸数量相同的子代DNA，D错误。
7.D 单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列（两种限制酶切割产生的DNA片段等长），可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D错误。
8.A 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A错误；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种的启动子，B正确；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确。
9.B 根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B错误；由于选择BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D正确。
10.（1）基因表达载体的构建 Xba Ⅰ和Hind Ⅲ （2）RNA聚合酶 番茄细胞中能表达的基因的启动子 （3）携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上 基因重组 卡那霉素 （4）超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
解析：（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；切割目的基因时，不能选择限制酶BamHⅠ，因为其会破坏目的基因，故目的基因左侧应选择限制酶Xba Ⅰ切割，目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，故不能选择限制酶SalⅠ，综合考虑，目的基因右侧应选择限制酶Hind Ⅲ切割（Hind Ⅲ靠近终止子，而EcoR Ⅰ靠近启动子）。（2）Ti质粒上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动子具有组织特异性，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为番茄细胞中能表达的基因的启动子。（3）农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程使受体细胞发生了基因重组。由于重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，因此在添加卡那霉素的培养基中培养番茄细胞，筛选出导入甜蛋白基因的细胞，进而可获得转化成功的愈伤组织。（4）若2个甜蛋白基因插入两对同源染色体上，即相当于双杂合类型，遗传上遵循基因的自由组合定律，则让其自交，后代中只要含有甜蛋白基因，其性状就表现为超甜，则其自交产生的后代的表型及比例为超甜番茄∶普通番茄＝15∶1。
2 / 3第58讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
课程标准
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
3.DNA的粗提取与鉴定实验。
4.利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
提醒 基因工程的理论基础
2.基因工程的基本工具
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）
提醒 ①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（2）DNA连接酶
【教材拾遗】 （选择性必修3 P72旁栏思考）DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
（3）基因进入受体细胞的载体
1.（选择性必修3 P71正文）切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 （ ）
2.（选择性必修3 P71正文）限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。（ ）
3.（选择性必修3 P71正文）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 （ ）
4.（选择性必修3 P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制酶、DNA连接酶、载体。（ ）
5.（选择性必修3 P72正文）质粒上标记基因的存在，是便于重组DNA分子的筛选。（ ）
1.（2024·江西上饶期末）基因工程是在DNA分子水平上进行的操作，需要有专门的工具。下列关于基因工程所需基本工具的叙述，错误的是（ ）
A.用不同的限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒可能产生相同的末端
B.T4 DNA连接酶可以催化磷酸二酯键形成进而连接黏性末端或平末端
C.作为载体的质粒上通常有抗生素合成基因作为标记基因，以便于重组DNA的筛选
D.原核细胞内的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割细菌自身的DNA分子
2.（2025·山东济南高三期末）下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，正确的是（ ）
A.DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合
B.用限制性内切核酸酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子
C.利用PCR仪扩增DNA分子时常用一种耐高温的DNA连接酶
D.在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果
题后归纳
与DNA有关的几种酶的比较
3.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
C.E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指 的基因。
②筛选目的基因的方法
（2）利用PCR获取和扩增目的基因
提醒 ①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合；温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建（核心）
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞
提醒 ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
1.（选择性必修3 P77正文）目的基因一定是编码蛋白质的基因。（ ）
2.（选择性必修3 P77相关信息）利用PCR扩增目的基因时，要用2种不同但能够互补配对的引物。（ ）
3.（选择性必修3 P79旁栏思考）PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，该技术既可以扩增DNA又可以扩增mRNA。（ ）
4.（选择性必修3 P80正文）基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。（ ）
5.（选择性必修3 P80旁栏思考）生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。（ ）
6.（选择性必修3 P81资料卡）Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因进入宿主细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。（ ）
7.（选择性必修3 P83练习与应用）应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因是否存在及其是否表达。（ ）
1.（2024·重庆期末）利用PCR技术可以获取如图中的目的基因。下列叙述正确的是（ ）
A.用图中引物②和引物⑤至少要经过3次循环才能获得目的基因
B.用图中引物③和引物④至少要经过2次循环才能获得目的基因
C.合成新链是从引物的5'开始延伸
D.用图中引物①和引物⑤经过2次循环可获得4种双链DNA分子
题后归纳
PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A（或B）的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
2.（2024·福建厦门期末）研究人员拟利用下图所示的目的基因片段和质粒构建基因表达载体。下列相关叙述错误的是（ ）
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G
AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA AGATC↑T
A.应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒
B.应选用T4 DNA连接酶连接目的基因与质粒
C.重组表达载体能被XbalⅠ识别并切割
D.目的基因以β链为模板链进行转录
题后归纳
限制酶的选择
（1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”（即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选）。
（3）善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向（或描述为“RNA聚合酶的移动方向”）必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
（4）巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
3.（2025·广东广州一模）为使玉米获得抗除草剂性状，科研人员进行了相关操作（如图所示）。含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，其正确表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（ ）
A.T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B.利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C.利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D.愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
归纳总结
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的菌落，如图中1、5 菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
（1）实验原理
（2）实验步骤
提醒 ①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。
③DNA的粗提取实验中过滤不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2.DNA片段的扩增与电泳鉴定
（1）实验基础
（2）PCR实验操作步骤
（3）DNA的电泳鉴定
1.（选择性必修3 P74正文）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度大。（ ）
2.（选择性必修3 P74正文）可用滤纸过滤洋葱研磨液以除去其中的杂质。（ ）
3.（选择性必修3 P84正文）在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。（ ）
4.（选择性必修3 P85正文）进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存。（ ）
5.（选择性必修3 P85正文）为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换。 （ ）
1.（2023·广东高考11题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2.（2025·山东日照高三模拟）某生物兴趣小组利用苹果进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验，下列操作正确的是（ ）
A.苹果组织研磨前经冷冻处理可以提高DNA的提取量
B.研磨液离心，保留沉淀物并加入酒精去除蛋白质等杂质
C.将预冷酒精溶液加入上清液，搅拌后可析出纯净的DNA
D.将丝状物溶于NaCl溶液，加入二苯胺试剂振荡后呈蓝色
3.（2025·江苏淮安期中）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述错误的是（ ）
A.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来
B.微量离心管、蒸馏水和移液器在使用前均需进行高压蒸汽灭菌处理
C.DNA向着与其所带电荷相反的电极移动，迁移速率与凝胶浓度、DNA的大小和构象有关
D.PCR所用的缓冲液从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，目的是不破坏稳定性较差的成分
1.（2024·湖南高考5题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（ ）
A.限制酶失活，更换新的限制酶
B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.（2024·安徽高考14题）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
溯源教材
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（见选择性必修3 P74正文）
（2）DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。（见选择性必修3 P74正文）
（3）在一定温度下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。（见选择性必修3 P74正文）
3.（2024·黑吉辽高考7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是（ ）
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
4.（2024·江西高考12题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是（ ）
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
5.（2024·全国甲卷38题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在 （答出2点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是 。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是 。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
6.（2024·新课标卷35题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是 。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和 。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是
。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 （答出2点即可）。
（1）通过基因工程技术引入外源基因可改变中国水仙花色。 （2024·福建高考）（ ）
（2）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 （2024·贵州高考）（ ）
（3）PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。 （2022·辽宁高考）（ ）
（4）粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。 （2022·山东高考）（ ）
（5）动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 （2022·湖北高考）（ ）
第58讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
【破考点·抓必备】
考点一
知识梳理夯基
1.基因重组 分子
2.（1） 原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 磷酸二酯键 （3） 环状双链DNA分子 噬菌体 自我复制 受体DNA 标记
概念检测
1.× 提示：不同种类限制酶识别序列不同。
2.√ 3.√
4.× 提示：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。
5.√
典题演练应用
1.C 不同限制酶识别的碱基序列一般不同，但切割后所产生的黏性末端可能是一样的，像这种能切割不同的DNA 片段但产生相同黏性末端的一类限制酶称为同尾酶，A正确；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，也可以连接双链DNA片段的平末端，催化磷酸二酯键形成，B正确；作为载体的质粒上通常有抗生素抗性基因作为标记基因，以便于重组DNA的筛选，不是抗生素合成基因，C错误；原核生物内的限制酶可切割入侵的DNA分子而保护自身，一般不切割自身的DNA分子，D正确。
2.B 黏性末端与黏性末端之间的互补配对的碱基自动形成氢键，DNA连接酶催化形成磷酸二酯键，A错误；切下一个目的基因需要打开2个切口，水解4个磷酸二酯键，故需消耗4个水分子，B正确；利用PCR仪扩增DNA分子时常用耐高温的DNA聚合酶，C错误；对根尖分生区细胞进行解离时用解离液处理，不需要纤维素酶，D错误。
3.A 限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，A正确；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，B错误；E.coli DNA连接酶能连接黏性末端，也能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。
考点二
知识梳理夯基
1.（1）①编码蛋白质 ②人工合成目的基因 基因文库 （2） 引物 脱氧核苷酸 耐高温 温度 两种引物 耐高温的DNA聚合酶 指数形式 琼脂糖凝胶电泳
2.RNA聚合酶 受体细胞中是否含有目的基因
3. 目的基因 子房中 T-DNA 染色体 显微注射 受精卵
4. PCR 目的基因 转录出了mRNA 抗原—抗体杂交
概念检测
1.× 提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.× 提示：PCR扩增目的基因时，2种不同的引物不能互补配对。
3.×
4.× 提示：启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
5.× 6.√ 7.×
典题演练应用
1.A 用图中引物②和引物⑤经过1次循环能获得含母链和引物②、母链和引物⑤的两种双链DNA，经过2次循环能获得一条链为目的基因的碱基序列的双链DNA，经过3次循环能获得两条链均为目的基因的DNA片段，A正确；用图中引物③和引物④循环不能获得目的基因，因为合成的新链是从引物的3'开始延伸，用引物③和引物④延伸不包含目的基因的碱基序列，B错误；合成新链是从引物的3'开始延伸，C错误；用图中引物①和引物⑤经过2次循环可获得3种双链DNA分子，D错误。
2.C 据表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可产生相同的黏性末端，由图可知，为了保证目的基因能正向接入载体，应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒，A正确；图中用SmaⅠ切割后产生平末端，用AvrⅡ和XbalⅠ切割后产生黏性末端，所以应用T4 DNA连接酶目的基因与质粒，B正确；重组表达载体序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ识别，不能被二者切割，C错误；转录的方向为5'→3'端，据图可知，目的基因以β链为模板链进行转录，D正确。
3.B 将目的基因（基因G）插入Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上，A正确；含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，农杆菌属于原核生物，无法正确表达出产物，也就无法催化无色物质K呈现蓝色，B错误；含有内含子的报告基因的产物在愈伤组织细胞中能催化无色物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；植物组织培养过程需要添加植物激素诱导愈伤组织重新分化为芽、根等器官，D正确。
考点三
知识梳理夯基
1.（1）酒精 蓝色 （2）冷却后
2.（1）相反 凝胶的浓度 大小和构象 （3）紫外灯
概念检测
1.√ 2.×
3.× 提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
4.× 提示：缓冲液和酶应在－20 ℃条件下储存。
5.× 提示：移液器上的枪头在实验过程中必须更换，避免试剂的污染。
典题演练应用
1.D 裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
2.A 由于冷冻后的细胞易破碎，所以将苹果组织研磨前经液氮冷冻处理，可以提高DNA的提取量，A正确。提取DNA时，研磨液离心，过滤并取滤液。由于DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，在滤液中加入酒精去除蛋白质等杂质，B错误。DNA不溶于酒精，因此可用体积分数为95％的冷酒精析出DNA，静置2～3分钟，可见丝状物即为DNA的粗提取物，C错误。鉴定DNA时，应将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂并进行沸水浴，冷却后才可出现蓝色，D错误。
3.B PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，B错误。
【研真题·扣教材】
1.B 限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法对质粒DNA进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
2.D 研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
3.A 应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8％～1.2％的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段（带负电）越长，DNA向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
4.D 不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；由题意知L-谷氨酸钠是合成γ-氨基丁酸的底物，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸盐）脱羧（谷氨酸→氨基丁酸＋CO2）生产γ-氨基丁酸，该过程L-谷氨酸钠的作用是底物而不是供能，B错误；菌株E.coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），不能表达产生L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.coli B中导下L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）表达产生L-谷氨酸脱羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还有其他的限制酶可选，D正确。
5.（1）变性 氢键 （2）用酶a和酶b双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反向连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率 T4 DNA连接酶 （3）能吸收周围环境中DNA分子 将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒（合理即可） （4）甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸
解析：（1）PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。（2）用酶a和酶b双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反向连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率。使用酶c单酶切只能形成平末端，T4 DNA连接酶可以“缝合”双链DNA片段的平末端。（3）感受态细胞的特点是能吸收周围环境中DNA分子。欲验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒。（4）依据DNA分子模板链和编码链的碱基配对情况、转录过程的碱基配对情况，可推出转录形成的mRNA上的碱基序列和编码链相近，只存在T和U的差别，即正常mRNA碱基序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，编码序列缺失第一个核苷酸G后，产生的异常mRNA碱基序列为GGCCCAAGCUGAGAUGA，对应的密码子依次是GGC（甘氨酸）、CCA（脯氨酸）、AGC（丝氨酸）、UGA（终止密码子），即突变后相应肽链的序列是甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸。
6.（1）磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达 （2）C—G、U—A、A—T （3）N基因的两条链 无扩增产物 （4）实现废物利用，减少环境污染
解析：（1）限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，且不破坏N基因，从而使N基因能在菌株B2中表达。（2）向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。（3）由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为N基因的两条链。结合题图分析可知，P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故N基因的两条链为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。（4）焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。
真题重组练
（1）√ （2）√
（3）× 提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸过程需要引物参与。
（4）√
（5）× 提示：动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。
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第58讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
高中总复习·生物
课程标准
1. 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和
载体三种基本工具。
2. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基
因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴
定等步骤。
3. DNA的粗提取与鉴定实验。
4. 利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软
件进行虚拟PCR实验。
1. 破考点·抓必备
2. 研真题·扣教材
3. 验收效·提能力
目录
Contents
01
破考点·抓必备
梳理归纳， 巩固基本知识
考点一 基因工程的基本工具
1. 基因工程的概念
c
c
提醒 基因工程的理论基础
2. 基因工程的基本工具
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）
c
c
c
c
提醒 ①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性
末端或平末端。
②原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在
该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（2）DNA连接酶
【教材拾遗】 （选择性必修3 P72旁栏思考）DNA连接酶和DNA聚合酶不
是一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶
是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时
需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
（3）基因进入受体细胞的载体
c
c
c
c
c
1. （选择性必修3 P71正文）切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地
识别6个核苷酸序列。 （ × ）
提示：不同种类限制酶识别序列不同。
×
2. （选择性必修3 P71正文）限制酶在识别序列中心轴线两侧将DNA分子
的两条链分别切开形成的是黏性末端，在识别序列中心轴线处切开形成的
是平末端。 （ √ ）
√
3. （选择性必修3 P71正文）E. coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连
接黏性末端。 （ √ ）
4. （选择性必修3 P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制酶、
DNA连接酶、载体。 （ × ）
提示：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工
具，前两者属于工具酶，质粒属于载体。
5. （选择性必修3 P72正文）质粒上标记基因的存在，是便于重组DNA分
子的筛选。 （ √ ）
√
×
√
1. （2024·江西上饶期末）基因工程是在DNA分子水平上进行的操作，需要有专门的工具。下列关于基因工程所需基本工具的叙述，错误的是（ ）
A. 用不同的限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒可能产生相同的末端
B. T4 DNA连接酶可以催化磷酸二酯键形成进而连接黏性末端或平末端
C. 作为载体的质粒上通常有抗生素合成基因作为标记基因，以便于重组
DNA的筛选
D. 原核细胞内的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割细菌自身的
DNA分子
√
解析： 不同限制酶识别的碱基序列一般不同，但切割后所产生的黏
性末端可能是一样的，像这种能切割不同的DNA 片段但产生相同黏性
末端的一类限制酶称为同尾酶，A正确；T4 DNA连接酶既可以连接双
链DNA片段互补的黏性末端，也可以连接双链DNA片段的平末端，催
化磷酸二酯键形成，B正确；作为载体的质粒上通常有抗生素抗性基因
作为标记基因，以便于重组DNA的筛选，不是抗生素合成基因，C错
误；原核生物内的限制酶可切割入侵的DNA分子而保护自身，一般不
切割自身的DNA分子，D正确。
2. （2025·山东济南高三期末）下列关于生物学中常见的几种酶的叙述，
正确的是（ ）
A. DNA连接酶将目的基因的黏性末端与载体的黏性末端之间的碱基黏合
B. 用限制性内切核酸酶从质粒上切下一个目的基因需消耗4个水分子
C. 利用PCR仪扩增DNA分子时常用一种耐高温的DNA连接酶
D. 在解离根尖分生区细胞时加入纤维素酶有利于提高解离的效果
√
解析： 黏性末端与黏性末端之间的互补配对的碱基自动形成氢键，
DNA连接酶催化形成磷酸二酯键，A错误；切下一个目的基因需要打开2个
切口，水解4个磷酸二酯键，故需消耗4个水分子，B正确；利用PCR仪扩
增DNA分子时常用耐高温的DNA聚合酶，C错误；对根尖分生区细胞进行
解离时用解离液处理，不需要纤维素酶，D错误。
题后归纳
与DNA有关的几种酶的比较
3. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
B. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
C. E. coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
解析： 限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能
切割，A正确；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，B错误；E. coli DNA
连接酶能连接黏性末端，也能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生
物中分离纯化而来，但是因为原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列
或识别序列已经被修饰，所以不能剪切自身的DNA，D错误。
√
考点二 基因工程的基本操作程序
1. 目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因
①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得
预期表达产物等的基因。主要是指 的基因。
②筛选目的基因的方法
编码蛋白质
c
c
（2）利用PCR获取和扩增目的基因
提醒 ①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、
dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作
为新子链的合成起点，只能结合在母链的3'端，使DNA聚合酶能够从引物
的3'端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合；温度过低则易使两条母链配
对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液
中一般要添加Mg2＋。
2. 基因表达载体的构建（核心）
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3. 将目的基因导入受体细胞
c
c
c
c
c
c
c
提醒 ①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因
拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因
的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含
目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基
因的T-DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。
存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物
中，造成“基因污染”。
4. 目的基因的检测与鉴定
c
c
c
c
c
c
1. （选择性必修3 P77正文）目的基因一定是编码蛋白质的基因。
（ × ）
提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用
的因子。
2. （选择性必修3 P77相关信息）利用PCR扩增目的基因时，要用2种不同
但能够互补配对的引物。 （ × ）
提示：PCR扩增目的基因时，2种不同的引物不能互补配对。
×
×
3. （选择性必修3 P79旁栏思考）PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的
全部序列，该技术既可以扩增DNA又可以扩增mRNA。 （ × ）
4. （选择性必修3 P80正文）基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻
译的开始与结束。 （ × ）
提示：启动子和终止子决定着转录的开始与结束。
×
×
5. （选择性必修3 P80旁栏思考）生物的所有DNA通过注射或花粉管通道
法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。
（ × ）
6. （选择性必修3 P81资料卡）Ti质粒上的T-DNA可携带目的基因进入宿主
细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。 （ √ ）
7. （选择性必修3 P83练习与应用）应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番
茄植株中目的基因是否存在及其是否表达。 （ × ）
×
√
×
1. （2024·重庆期末）利用PCR技术可以获取如图中的目的基因。下列叙
述正确的是（ ）
A. 用图中引物②和引物⑤至少要经过3次循环才能获得目的基因
B. 用图中引物③和引物④至少要经过2次循环才能获得目的基因
C. 合成新链是从引物的5'开始延伸
D. 用图中引物①和引物⑤经过2次循环可获得4种双链DNA分子
√
解析： 用图中引物②和引物⑤经过1次循环能获得含母链和引物②、母
链和引物⑤的两种双链DNA，经过2次循环能获得一条链为目的基因的碱
基序列的双链DNA，经过3次循环能获得两条链均为目的基因的DNA片
段，A正确；用图中引物③和引物④循环不能获得目的基因，因为合成的
新链是从引物的3'开始延伸，用引物③和引物④延伸不包含目的基因的碱
基序列，B错误；合成新链是从引物的3'开始延伸，C错误；用图中引物①
和引物⑤经过2次循环可获得3种双链DNA分子，D错误。
题后归纳
PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A（或B）的
DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、B的
DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－
2 2n＋1－2
2. （2024·福建厦门期末）研究人员拟利用如图所示的目的基因片段和质
粒构建基因表达载体。下列相关叙述错误的是（ ）
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
SmaⅠ CCC↓GGG GGG↑CCC EcoRⅠ G↓AATTC
CTTAA↑G
AvrⅡ C↓CTAGG GGATC↑C XbalⅠ T↓CTAGA
AGATC↑T
A. 应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒
B. 应选用T4 DNA连接酶连接目的基因与质粒
C. 重组表达载体能被XbalⅠ识别并切割
D. 目的基因以β链为模板链进行转录
√
解析： 据表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可产生相同的黏性末端，由图可
知，为了保证目的基因能正向接入载体，应选用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基
因，SmaⅠ和AvrⅡ切割质粒，A正确；图中用SmaⅠ切割后产生平末端，用
AvrⅡ和XbalⅠ切割后产生黏性末端，所以应用T4 DNA连接酶目的基因与质
粒，B正确；重组表达载体序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ识别，不能被二者切
割，C错误；转录的方向为5'→3'端，据图可知，目的基因以β链为模板链
进行转录，D正确。
题后归纳
限制酶的选择
（1）不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
（2）保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必
须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选
择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基
因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有
一个标记基因时出现的“假阳性”（即未成功导入目的基因的载体也能正
常表达标记基因，造成无效筛选）。
（3）善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多
种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位
点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶
切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体
反向连接，即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载
体启动子的方向（或描述为“RNA聚合酶的移动方向”）必须是相同的，
否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两
种限制酶。
（4）巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限
制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏
性末端。
3. （2025·广东广州一模）为使玉米获得
抗除草剂性状，科研人员进行了相关操
作（如图所示）。含有内含子的报告基
因不能在原核生物中正确表达，其正确
表达产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。下列叙述错误的是（ ）
A. T-DNA可将基因G转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上
B. 利用物质K和抗生素进行筛选1，可获得农杆菌的蓝色菌落
C. 利用物质K和除草剂进行筛选2，更易于获得抗除草剂的转基因植株
D. 愈伤组织重新分化为芽、根等器官的过程中，需要添加植物激素
√
解析： 将目的基因（基因G）插入Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转
化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈伤组织细胞的染色体DNA
上，A正确；含有内含子的报告基因不能在原核生物中正确表达，农杆菌
属于原核生物，无法正确表达出产物，也就无法催化无色物质K呈现蓝
色，B错误；含有内含子的报告基因的产物在愈伤组织细胞中能催化无色
物质K呈现蓝色，而愈伤组织表面残留的农杆菌，会导致未转化的愈伤组
织可能在含除草剂的培养基中生长，因此利用物质K和除草剂进行筛选2，
更易于获得抗除草剂的转基因植株，C正确；植物组织培养过程需要添加
植物激素诱导愈伤组织重新分化为芽、根等器官，D正确。
归纳总结
如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目
的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。
如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含
质粒的细菌。
（3）筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的
是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利
用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、
4，则在含四环素培养基上不生长的即含有目的基因的菌落，如图中1、5
菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1. DNA的粗提取与鉴定
（1）实验原理
c
c
（2）实验步骤
c
提醒 ①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断
裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成
熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。
③DNA的粗提取实验中过滤不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤
纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2. DNA片段的扩增与电泳鉴定
（1）实验基础
c
c
c
c
（2）PCR实验操作步骤
（3）DNA的电泳鉴定
c
1. （选择性必修3 P74正文）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度大。
（ √ ）
2. （选择性必修3 P74正文）可用滤纸过滤洋葱研磨液以除去其中的杂
质。 （ × ）
3. （选择性必修3 P84正文）在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子
的大小相关。 （ × ）
提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象
等有关。
√
×
×
4. （选择性必修3 P85正文）进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的
缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存。 （ × ）
提示：缓冲液和酶应在－20 ℃条件下储存。
5. （选择性必修3 P85正文）为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程
中不必更换。 （ × ）
提示：移液器上的枪头在实验过程中必须更换，避免试剂的污染。
×
×
1. （2023·广东高考11题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂
解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A. 裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B. 分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C. 沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D. 鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
√
解析： 裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA
不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA
与蛋白质等，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B正
确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度
去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以
使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
2. （2025·山东日照高三模拟）某生物兴趣小组利用苹果进行“DNA的粗
提取与鉴定”的实验，下列操作正确的是（ ）
A. 苹果组织研磨前经冷冻处理可以提高DNA的提取量
B. 研磨液离心，保留沉淀物并加入酒精去除蛋白质等杂质
C. 将预冷酒精溶液加入上清液，搅拌后可析出纯净的DNA
D. 将丝状物溶于NaCl溶液，加入二苯胺试剂振荡后呈蓝色
√
解析： 由于冷冻后的细胞易破碎，所以将苹果组织研磨前经液氮冷
冻处理，可以提高DNA的提取量，A正确。提取DNA时，研磨液离
心，过滤并取滤液。由于DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋
白质则溶于酒精，在滤液中加入酒精去除蛋白质等杂质，B错误。
DNA不溶于酒精，因此可用体积分数为95％的冷酒精析出DNA，静置
2～3分钟，可见丝状物即为DNA的粗提取物，C错误。鉴定DNA时，
应将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂并进行沸水
浴，冷却后才可出现蓝色，D错误。
3. （2025·江苏淮安期中）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下
列相关叙述错误的是（ ）
A. 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来
B. 微量离心管、蒸馏水和移液器在使用前均需进行高压蒸汽灭菌处理
C. DNA向着与其所带电荷相反的电极移动，迁移速率与凝胶浓度、DNA
的大小和构象有关
D. PCR所用的缓冲液从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，目的是不
破坏稳定性较差的成分
解析： PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须
进行高压蒸汽灭菌处理，移液器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，B错误。
√
02
研真题·扣教材
探究分析， 培养核心技能
1. （2024·湖南高考5题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA
完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是
（ ）
A. 限制酶失活，更换新的限制酶
B. 酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C. 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D. 酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
√
解析： 限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，
A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和
pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别
位点缺失，进而造成限制酶无法对质粒DNA进行切割，此时应更换为正常
质粒DNA，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲
基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制
酶，D正确。
2. （2024·安徽高考14题）下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，
错误的是（ ）
A. 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B. 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C. DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D. 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白
质杂质
√
解析： 研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降
低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可
初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化
而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸
水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，
D错误。
溯源教材
（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （见选择性必修3 P74
正文）
（2）DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L的NaCl溶
液。 （见选择性必修3 P74正文）
（3）在一定温度下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。 （见选择性必修3
P74正文）
3. （2024·黑吉辽高考7题）关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实
验，下列叙述正确的是（ ）
A. 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B. 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C. 在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D. 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
√
解析： 应根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶
液，一般配制质量体积比为0.8％～1.2％的琼脂糖溶液，A正确；凝胶载
样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体
位置，B错误；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的
大小和构象等有关，在同一电场作用下，DNA片段（带负电）越长，DNA
向正极迁移的速率越慢，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波
长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
4. （2024·江西高考12题）γ-氨基丁酸在医药等
领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶
（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基
丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法
将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E. coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E. coli B。
下列叙述正确的是（ ）
A. 上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B. E. coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C. E. coli A和E. coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
解析： 不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得
到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基
因，需要进行PCR，A错误；由题意知L-谷氨酸钠是合成γ-氨基丁酸的底
物，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸盐）脱羧（谷
氨酸→氨基丁酸＋CO2）生产γ-氨基丁酸，该过程L-谷氨酸钠的作用是底物
而不是供能，B错误；菌株E. coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），不能表达产生L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E. coli B中导下L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）
表达产生L-谷氨酸脱羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁
酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克
隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还
有其他的限制酶可选，D正确。
5. （2024·全国甲卷38题）某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋
白E。回答下列问题。
（1）该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延
伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ，引物与模板
DNA链碱基之间的化学键是 。
解析：PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
变性
氢键
（2）质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所
示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现
在
（答出2点即可）；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
用酶a和酶b双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反
向连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率
T4 DNA连接酶
解析：用酶a和酶b双酶切可防止载体和目的基因自身环化以及目的基因的反向连接，保证目的基因和载体正确连接，从而提高重组率。使用酶c单酶切只能形成平末端，T4 DNA连接酶可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
（3）将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感
受态细胞的特点是 。若要验证转化的大肠
杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是
。
能吸收周围环境中DNA分子
将转化的大肠杆菌
的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等
作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就
表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒（合理即可）
解析：感受态细胞的特点是能吸收周围环境中DNA分子。欲验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可将转化的大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示杂交带，就表明转化的大肠杆菌中含有重组质粒。
（4）蛋白E基因中的一段DNA编码序列（与模板链互补）是
GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第
一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是 。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸
解析：依据DNA分子模板链和编码链的碱基配对情况、转录过程的碱基配对情况，可推出转录形成的mRNA上的碱基序列和编码链相近，只存在T和U的差别，即正常mRNA碱基序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，编码序列缺失第一个核苷酸G后，产生的异常mRNA碱基序列为GGCCCAAGCUGAGAUGA，对应的密码子依次是GGC（甘氨酸）、CCA（脯氨酸）、AGC（丝氨酸）、UGA（终止密码子），即突变后相应肽链的序列是甘氨酸—脯氨酸—丝氨酸。
6. （2024·新课标卷35题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌
（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N
基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基
因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑
技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ～Ⅳ）、引物
（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方
向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中
表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ
酶切位点之间，原因是 。
解析： 限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，且不破坏N基因，从而使N基因能在菌株B2中表达。
磷酸二酯键
不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的
DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C
和 。
解析： 向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。
C—G、U—A、A—T
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的
模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结
果是 。
解析： 由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入
B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入
了细菌B1基因组所用的模板为N基因的两条链。结合题图分析可知，P4是
以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故N基因的两条链为模板，以P3
和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。
N基因的两条链
无扩增产物
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点
是 （答出2点即可）。
解析： 焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆
可实现废物利用，减少环境污染。
实现废物利用，减少环境污染
（1）通过基因工程技术引入外源基因可改变中国水仙花色。 （2024·福
建高考） （ √ ）
（2）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。 （2024·贵州高考）
（ √ ）
（3）PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。
（2022·辽宁高考） （ × ）
提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，只能催化单个的脱氧核苷酸
添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸过程需要引物参与。
√
√
×
（4）粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA
降解。 （2022·山东高考） （ √ ）
（5）动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。 （2022·湖北高
考） （ × ）
提示：动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。
√
×
03
验收效·提能力
跟踪训练，检验学习效果
一、选择题
1. （2025·江苏南通统考）如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamH
Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是
（ ）
A. 三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同
B. 这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C. BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
D. 图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
√
解析： 根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切
割后形成的都是黏性末端，且长度大小相同，A、B正确；用BamH Ⅰ和
Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端，故BamH Ⅰ和Sau3AⅠ切割
DNA片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接，C错误；图中的DNA
片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸
基团，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2. （2025·吉林四平高三联考）科学家利用PCR技术扩增人乳头瘤病毒
HPV-16L1基因，构建了含HPV-16L1基因的表达载体pBI-L1，经根瘤农杆
菌介导转化，获得了转基因烟草植株。该技术利用转基因烟草作为生物反
应器，生产出了纯度较高的HPV-16L1蛋白。下列说法错误的是（ ）
A. 利用PCR扩增HPV-16L1基因的前提是已知该基因的一段碱基序列
B. 构建表达载体pBI-L1时可使用两种不同限制酶以确保正确连接
C. 必须选用烟草的受精卵作为受体细胞才能保证每个细胞中含有目的基因
D. 可以用抗原—抗体杂交法检测再生植株是否表达出HPV-16L1蛋白
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
解析： 利用PCR扩增HPV-16L1基因的前提是已知该基因的一段碱基序
列，根据该序列制作引物，A正确；用两种不同限制酶，可保证目的基因
和载体定向连接，且不发生自身环化，B正确；除选用烟草的受精卵作为
受体细胞外，也可选用烟草的根尖分生区细胞作为受体细胞，然后通过植
物组织培养使每个细胞中均含有目的基因，C错误；分子水平对目的基因
进行检测，可根据抗原—抗体杂交技术检测相应蛋白质，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3. （2025·山东聊城一模）下列关于DNA的提取和DNA片段的扩增及电泳
鉴定的叙述，正确的是（ ）
A. 利用DNA和蛋白质在冷酒精中溶解性的差异可将DNA进一步纯化分离
B. 在提取白色丝状物时双向搅拌比单向搅拌更有利于获得结构完整的
DNA
C. PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必
须进行高压蒸汽灭菌处理
D. PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，电泳时电泳缓冲液不能没
过凝胶
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
解析： DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利
用这个特性将DNA与蛋白质分离，A正确；在提取白色丝状物时用玻璃棒
轻轻单向搅拌更有利于获得结构完整的DNA，B错误；PCR实验中使用的
微量离心管、枪头、蒸馏水在使用前都必须进行高压蒸汽灭菌处理，移液
器不需要进行高压蒸汽灭菌处理，C错误；通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
PCR的产物时，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜，D错误。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
4. （2025·辽宁沈阳模拟）农杆菌转化法是植物转基因技术中常用的转化
方法之一。下列与该方法相关的叙述，错误的是（ ）
A. 土壤农杆菌是重组质粒的受体细胞
B. T-DNA是拟核DNA上的一段序列
C. 农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物
D. 新鲜叶圆片与农杆菌在适宜条件下共培养，部分细胞会被转化
√
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
解析： 将目的基因与载体相连形成重组质粒后，要导入土壤农杆菌
内，再让农杆菌去侵染植物细胞，A正确；T-DNA是位于Ti质粒中的一段
序列，不位于拟核，B错误；农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸
子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力，C正确；农杆菌转化法的转
化效率不是100％，因此适宜条件下，新鲜叶圆片与农杆菌共培养后，部
分细胞会被转化，D正确。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
5. （2025·广东深圳光明区高三检测）如图为某种质粒的简图，小箭头所
指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动
部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无
任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是（ ）
A. 将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶
切，在DNA连接酶作用下，生成的由两个DNA片
段连接形成的产物有两种
B. DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连
接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C. 为了防止目的基因反向连接和质粒自身环化，酶切
时可选用的酶是EcoRⅠ和BamH Ⅰ
D. 受体细胞能在含青霉素的培养基中生长，表明目
的基因已成功导入该细胞
√
1
2
3
4
5
6
7
8
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解析： 根据题意可知，目的基因的两端有EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位
点，将含有目的基因的DNA用EcoR Ⅰ酶切，会得到目的基因片段；根据质
粒的简图可知，将质粒用EcoR Ⅰ酶切，会得到与质粒周长等长的链状
DNA，因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，在DNA连
接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质
粒—质粒片段三种产物，A错误。DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏
性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误。EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选
用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割后的质粒
两端形成的末端也不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连
接和质粒自身环化，C正确。导入普通质粒的受体细胞和导入重组质粒的
受体细胞都能在含青霉素的培养基中生长，因此能在含青霉素的培养基中
生长的受体细胞不一定含有目的基因，D错误。
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6. （2025·广东梅州联考）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无
严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP（四种脱氧核苷三磷酸）
是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是（ ）
A. 图示环节所需的温度比上一个环节的低
B. dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端
C. Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成
D. 经过1个循环后，获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同
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解析： 题图中环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，
复性的上一环节为变性，复性的温度（50 ℃左右）比变性的温度（90 ℃
以上）低，A正确；在PCR扩增中，子链延伸的方向是从5'端到3'端，所以
dNTP作为扩增的原料会依次连接到3'端，B正确；Taq DNA聚合酶能催化
磷酸二酯键的形成，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一
个循环后，得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不一定相同，一般
PCR第三轮才可以扩增出双链脱氧核苷酸数量相同的子代DNA，D错误。
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7. （2025·广东肇庆调研）在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不
同序列的限制酶（R1和R2）处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是（ ）
A. 该载体最可能为环形DNA分子
B. 两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C. 限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp
D. 限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
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解析： 单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列（两种限制酶切割产
生的DNA片段等长），可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1
和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体
上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA
分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正
确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定
核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
断裂，D错误。
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8. （2025·湖南衡阳月考）戊型肝炎病毒
是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构
蛋白（pORF2）位于病毒表面，构成病毒
的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，
在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述错误的是（ ）
A. 过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B. 重组基因表达载体上的启动子需来源于大肠杆菌
C. 过程⑤需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中
DNA分子的生理状态
D. 过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
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解析： 戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A错误；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种的启动子，B正确；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确。
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9. 图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA
序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是（ ）
A. 若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c
B. 构建表达载体时可选用BclⅠ和BamHⅠ这两种限制酶
C. 若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌
D. 只利用含四环素的培养基就不能直接筛选出成功导入表达载体的受体
细胞
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解析： 根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，B错误；由于选择BclⅠ和Hind Ⅲ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D正确。
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二、非选择题
10. （2025·广东湛江高三一模）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜
蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。如图
是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。回答下列相关问题：
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（1）利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是
，该过程需要选择 限制酶切割甜蛋白基因。
解析： 基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；切割目的基因时，不能选择限制酶BamHⅠ，因为其会破坏目的基因，故目的基因左侧应选择限制酶Xba Ⅰ切割，目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，故不能选择限制酶SalⅠ，综合考虑，目的基因右侧应选择限制酶Hind Ⅲ切割（Hind Ⅲ靠近终止子，而EcoR Ⅰ靠近启动子）。
基因表达载体的构
建
Xba Ⅰ和Hind Ⅲ
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（2）Ti质粒上的启动子是 识别和结合的位点，为了保证
甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为
。
解析：Ti质粒上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，启动子具有组织特异性，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为番茄细胞中能表达的基因的启动子。
RNA聚合酶
番茄
细胞中能表达的基因的启动子
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（3）农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是
，该过程发生的变异类型
为 。然后在添加 （填物质）的培养基中培养番
茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。
解析：农杆菌转化番茄细胞时，T-DNA的作用是携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程使受体细胞发生了基因重组。由于重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，因此在添加卡那霉素的培养基中培养番茄细胞，筛选出导入甜蛋白基因的细胞，进而可获得转化成功的愈伤组织。
携带目的基因进入受体
细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上
基因重组
卡那霉素
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（4）若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，
若子代表型及比例为 ，则说明2个甜蛋白
基因插入两对同源染色体上（含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同）。
解析：若2个甜蛋白基因插入两对同源染色体上，即相当于双杂合类型，遗传上遵循基因的自由组合定律，则让其自交，后代中只要含有甜蛋白基因，其性状就表现为超甜，则其自交产生的后代的表型及比例为超甜番茄∶普通番茄＝15∶1。
超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
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谢谢观看！
