PCR技术和基因编辑技术
1.RT-PCR（逆转录PCR）
常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。首先，由逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA（cDNA），再通过常规PCR和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
2.反向PCR
反向PCR是克隆基因组已知序列旁侧序列的一种方法。其原理是选取已知序列中不存在的内切酶对基因组进行酶切，使已知序列和待检测的旁侧序列位于同一片段被切下，然后对该片段进行自身环化。以该环化DNA作为模板，根据已知序列设计一对反向引物进行扩增，从而获得所需的未知序列信息。利用该技术也可以实现对现有的环状DNA（如质粒）的线性化。
3.不对称PCR
不对称PCR是利用不等量的一对引物经PCR扩增后产生大量的单链DNA的过程，这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，两条引物的比例通常为100∶1，这样随着PCR反应的进行，浓度低的引物很快被消耗光，高浓度引物随即产生大量的目的单链DNA。低浓度引物的加入保证了扩增过程具有足够多的模板，而高浓度引物则保证了单链DNA的大量合成。
4.荧光定量PCR
（1）荧光染料
荧光染料与DNA双链结合时发出荧光信号，不掺入链中的（游离的）染料不会发出任何荧光信号。
（2）水解探针，以TaqMan探针为代表。
①水解探针的组成
②水解探针（TaqMan）工作原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。图示如下：
5.巢式PCR
巢式PCR先用待扩增DNA外侧的一对引物完成一次PCR，再将其作为模板，根据原来引物内侧的序列设置新的引物，再次完成第二次PCR。由于第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以减少第一次扩增中出现的非特异性扩增片段，提升扩增的精确性。但由于操作过程中的开盖处理，会增加产物污染的概率。图示如下：
6.重叠延伸PCR
重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
（1）上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是引物A、引物C。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为引物C、引物D。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5'→3'，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
（2）为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因（该基因序列不含图中限制酶的识别序列）能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5'端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位点。
7.基因编辑技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
1.（2024·江苏南京调研）下图是快速RT-PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列叙述错误的是（ ）
A.逆转录酶具有DNA聚合酶能力
B.③PCR过程只需要引物b
C.RT-PCR可检测基因表达水平
D.RT-PCR可检测合胞病毒等RNA病毒
2.（2024·山东潍坊质检）反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5'—AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGTAGCCTCT—3'”。下列叙述错误的是（ ）
A.Ⅰ酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未知序列形成相同的黏性末端
B.Ⅱ连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键
C.设计的两种引物分别是“5'—AACTATGCGCTCATGA—3'”和“5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'”
D.对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可能为“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”
3.不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是（ ）
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
4.（2024·河北正定一中高三月考）人类猴痘由Yaba猴病毒（双链DNA病毒）引起，实时荧光定量PCR（qPCR）可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系加入 TaqMan探针，TaqMan探针两端连有荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团（Q），完整的TaqMan探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光（如图所示），随循环次数的增加，荧光信号强度增加。
（1）采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的 溶液中才能进行，反应体系中还需提供DNA模板、原料、 、TaqMan探针、TaqDNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过程中，Taq DNA 聚合酶的两个作用是 。
（2）qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反应体系中加入的 和 有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果。可能的原因有 （答出两点）。
（3）在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是 。为了探究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出的结论有 。
5.（2024·江苏如皋模拟）巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片段（中间产物）长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图所示。请回答下列问题。
（1）巢式PCR反应体系中需加入DNA模板、 、 、引物、Mg2＋、缓冲液等。
（2）巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行，可防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
（3）若直接用图中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会 （填“上升”或“下降”），不易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 （填“高”或“低”）。
6.（2024·江苏常州模拟）重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基因中核苷酸序列（或基因片段）设计出多对具有互补末端的引物，先分段对模板进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源的扩增片段重叠拼接起来的目的，如图1所示。请分析并回答下列问题：
（1）图1中的过程②在 个反应体系中进行，原因是 。经过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需DNA的方法是 。①中引物2和引物3的游离部分分别与 的部分序列同源。
（2）图1中的过程⑥ （填“需要”或“不需要”）另加引物，原因是 。进行②⑥⑧⑩过程时，需要在一定的缓冲溶液中进行，⑩过程除图示条件还需要加入 。
（3）重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的基因（如图2蛋白A基因）的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物（图2中的引物A→D），原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进行PCR2反应，然后将需要的两个片段混合、延伸并大量扩增。图2引物B和引物C中的∧、∨代表 ，引物B和引物C碱基序列间存在的关系是 。
7.（2021·海南选择考）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
（3）过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9蛋白可切割 序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程： 。
拓展微课7 PCR技术和基因编辑技术
针对训练用活
1.B ③PCR过程需要一对引物，B错误。
2.C 由图可知，经过Ⅰ酶切过程后，由于用一种限制酶切割DNA，从而使两端未知序列形成相同的黏性末端，A正确；Ⅱ过程是将DNA片段连接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，B正确；设计的两种引物需要与已知序列发生碱基互补配对，而后向两侧延伸合成未知序列，因此合成的引物分别是“5'—TCATGAGCGCATAGTT—3'”和“5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'”，C错误；对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未知序列，根据限制酶产生的黏性末端，推测该DNA单链序列可能为“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”，D正确。
3.C 不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。
4.（1）缓冲 引物 催化合成DNA子链；催化探针水解 （2）引物 探针 取样不规范；取样所获样本量不足；病毒发生了基因突变 （3）TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活 在不含 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法扩增；在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM 为最佳浓度
5.（1）耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 原料（4种脱氧核苷酸） （2）复性 内引物 （3）上升 高
解析：（1）PCR（聚合酶链式反应）反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、TaqDNA聚合酶、原料（4种脱氧核苷酸）、模板DNA、Mg2＋。（2）PCR过程包括过程高温变性、低温复性、中温延伸。故巢式PCR过程中反应温度最低的一步是复性。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要原因是防止内引物在第一阶段PCR中与模板结合。（3）巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更高。若直接用图中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会上升，不易得到目标产物。
6.（1）2 引物互补影响PCR结果 （琼脂糖凝胶）电泳分离 外显子B、外显子A （2）不需要 两条DNA的交错部分即可作为其延伸的引物 原料（四种脱氧核苷酸）、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） （3）突变碱基 互补
解析：（1）分析题图1可知，扩增外显子A需要用引物1和引物2，扩增外显子B需要引物3和引物4，由于引物2和引物3互补，所以需要在两个反应体系中进行。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应，具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。由图1可知，①中引物2和引物3的游离部分分别与外显子B、外显子A的部分序列同源。（2）由于引物2有一部分与外显子A重叠，还有一部分与外显子B重叠，可作为其延伸的引物，故图1中的过程⑥不需要另加引物。进行②⑥⑧过程就属于DNA分子的复制了，所以DNA分子复制时需要四种脱氧核苷酸，由于整个过程在PCR仪器中，所以需要耐高温的DNA聚合酶。（3）基因定点突变是根据目的基因的序列，使基因上的某碱基缺失、增添或替换，故图2引物B和引物C中的“A”代表突变碱基，分析图2可知，引物B和引物C碱基序列间存在的关系互补。
7.（1）DNA连接酶 （2）感受态细胞法 （3）碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸 （4）DNA分子杂交技术 不出现杂交带 （5）CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中
解析：（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（3）根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9蛋白切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因是sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。（4）可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若不出现杂交带，则说明基因敲除成功。（5）根据题图可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。
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拓展微课7
PCR技术和基因编辑技术
高中总复习·生物
1. RT-PCR（逆转录PCR）
常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，
而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。首先，由
逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA（cDNA），再通过常规PCR
和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一
种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊
断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
2. 反向PCR
反向PCR是克隆基因组已知序列旁侧序列的一种方法。其原理是选取已知
序列中不存在的内切酶对基因组进行酶切，使已知序列和待检测的旁侧序
列位于同一片段被切下，然后对该片段进行自身环化。以该环化DNA作为
模板，根据已知序列设计一对反向引物进行扩增，从而获得所需的未知序
列信息。利用该技术也可以实现对现有的环状DNA（如质粒）的线性化。
3. 不对称PCR
不对称PCR是利用不等量的一对引物经PCR扩增后产生大量的单链DNA的
过程，这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，两条引物的比例通
常为100∶1，这样随着PCR反应的进行，浓度低的引物很快被消耗光，高
浓度引物随即产生大量的目的单链DNA。低浓度引物的加入保证了扩增过
程具有足够多的模板，而高浓度引物则保证了单链DNA的大量合成。
4. 荧光定量PCR
（1）荧光染料
荧光染料与DNA双链结合时发出荧光信号，不掺入链中的（游离的）染料
不会发出任何荧光信号。
（2）水解探针，以TaqMan探针为代表。
①水解探针的组成
②水解探针（TaqMan）工作原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探
针为寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基
团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩
增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和
荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增
一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR
产物形成完全同步。图示如下：
5. 巢式PCR
巢式PCR先用待扩增DNA外侧的一对引物完成一次PCR，再将其作为模
板，根据原来引物内侧的序列设置新的引物，再次完成第二次PCR。由于
第二次PCR的模板DNA片段更短，引物更小因此可以减少第一次扩增中出
现的非特异性扩增片段，提升扩增的精确性。但由于操作过程中的开盖处
理，会增加产物污染的概率。图示如下：
6. 重叠延伸PCR
重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
（1）上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是引物A、引物C。
PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为引物C、引物D。PCR3
时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5'→3'，
以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
（2）为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因（该基因序列不含图中限制
酶的识别序列）能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5'
端分别添加限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ的酶切位点。
7. 基因编辑技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链
向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割
（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基
因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在
特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其
明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入
宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因
治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用
前景。
1. （2024·江苏南京调研）如图是快速RT-PCR过程示意图，①和②为逆转
录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列叙述错误的是
（ ）
A. 逆转录酶具有DNA聚合酶能力
B. ③PCR过程只需要引物b
C. RT-PCR可检测基因表达水平
D. RT-PCR可检测合胞病毒等RNA病毒
解析： ③PCR过程需要一对引物，B错误。
√
2. （2024·山东潍坊质检）反向PCR流程如图所示，该技术可利用一段已知DNA序列设计合理的引物，扩增已知序列两端的未知序列。图中已知序列一条链的碱基排列顺序为“5'—AACTATGCGCTCATGAGCAATGCGT
AGCCTCT—3'”。下列叙述错误的是（ ）
A. Ⅰ酶切：用一种限制酶切割DNA，以使两端未
知序列形成相同的黏性末端
B. Ⅱ连接：使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间
形成磷酸二酯键
C. 设计的两种引物分别是“5'—AACTATGCGCTCA
TGA—3'”和“5'—AGAGGCTACGCATTGC—3'”
D. 对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。该DNA单链序列可
能为“5'—AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”
√
解析： 由图可知，经过Ⅰ酶切过程后，由于用一种限制酶切割DNA，从
而使两端未知序列形成相同的黏性末端，A正确；Ⅱ过程是将DNA片段连
接起来，该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键，
B正确；设计的两种引物需要与已知序列发生碱基互补配对，而后向两侧
延伸合成未知序列，因此合成的引物分别是“5'—
TCATGAGCGCATAGTT—3'”和“5'—GCAATGCGTAGCCTCT—3'”，C
错误；对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列，由于F序列是未
知序列，根据限制酶产生的黏性末端，推测该DNA单链序列可能为“5'—
AATTCCAGT—……—CTGAATT—3'”，D正确。
3. 不对称PCR是利用不等量的一对引
物来产生大量单链DNA（ssDNA）的
方法，如图所示。不对称PCR中加入
的一对引物中含量较少的被称为限制
性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，
PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），
但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的
是（ ）
A. 用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B. 进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C. 最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D. 因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
√
解析： 不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引
物，非限制性引物是与乙链结合，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱
基序列一致，C错误。
4. （2024·河北正定一中高三月考）人类猴
痘由Yaba猴病毒（双链DNA病毒）引起，实
时荧光定量PCR（qPCR）可用于Yaba 猴病
毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系
加入 TaqMan探针，TaqMan探针两端连有
荧光基团（R）和抑制荧光发出的淬灭基团
（Q），完整的TaqMan探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光（如图所示），随循环次数的增加，荧光信号强度增加。
（1）采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的 溶液中才能进行，
反应体系中还需提供DNA模板、原料、 、TaqMan探针、
TaqDNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过程中，Taq DNA 聚合酶的两个作用
是 。
缓冲
引物
催化合成DNA子链；催化探针水解
（2）qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反
应体系中加入的 和 有关。但有时也可能会出现“假阴
性”的结果。可能的原因有
（答出两点）。
引物
探针
取样不规范；取样所获样本量不足；病毒发
生了基因突变
（3）在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是
。为了探究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR
反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出
的结论有
。
TaqDNA聚合酶需
要Mg2＋激活
在不含 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法扩增；在不同浓度的
Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM 为最佳浓度
5. （2024·江苏如皋模拟）巢式PCR是一种特殊的聚合酶链式反应，使用
两组不同的引物实现目标DNA片段的扩增。第一组外引物扩增出的DNA片
段（中间产物）长度超出目标区域，第二组内引物称为巢式引物，其结合
部位在中间产物内部的目标区域，从而扩增出目标产物，具体过程如图所
示。请回答下列问题。
（1）巢式PCR反应体系中需加入DNA模板、
、 、引物、Mg2＋、缓
冲液等。
解析：PCR（聚合酶链式反应）反应包括三个基本步骤，即：模板DNA的变性、模板DNA与引物的复性、引物的延伸。PCR反应体系包括5种基本成分，依次为：引物、TaqDNA聚合酶、原料（4种脱氧核苷酸）、模板DNA、Mg2＋。
耐高温的DNA聚合酶
（TaqDNA聚合酶）
原料（4种脱氧核苷酸）
（2）巢式PCR过程中反应温度最低的一步是 。巢式PCR中外引物
的第一阶段扩增和内引物的第二阶段扩增通常在不同的离心管中进行，可
防止 在第一阶段PCR中与模板结合。
解析： PCR过程包括过程高温变性、低温复性、中温延伸。故巢式PCR过程中反应温度最低的一步是复性。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的，因此两个阶段反应不在同一试管完成的主要原因是防止内引物在第一阶段PCR中与模板结合。
复性
内引物
（3）若直接用图中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标
区域进行碱基互补配对的概率会 （填“上升”或“下降”），不
易得到目标产物。巢式PCR获得的产物特异性 （填“高”或“低”）。
解析：巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性获得的产物特异性更高。若直接用图中的内引物对模板DNA扩增，则内引物与模板的非目标区域进行碱基互补配对的概率会上升，不易得到目标产物。
上升
高
6. （2024·江苏常州模拟）重叠延伸PCR技
术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连
接的基因中核苷酸序列（或基因片段）设计
出多对具有互补末端的引物，先分段对模板
进行扩增，再将PCR产物混合，其中的重叠
链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现
不同来源的扩增片段重叠拼
接起来的目的，如图1所示。
请分析并回答下列问题：
（1）图1中的过程②在 个反应体系中进行，原因是
。经过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需
DNA的方法是 。①中引物2和引物3的游离部
分分别与 的部分序列同源。
解析：分析题图1可知，扩增外显子A需要用引物1和引物2，扩增外
显子B需要引物3和引物4，由于引物2和引物3互补，所以需要在两个反应
体系中进行。DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应，具有
不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。相对分子
质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。由图1可知，①中引
物2和引物3的游离部分分别与外显子B、外显子A的部分序列同源。
2
引物互补影响
PCR结果
（琼脂糖凝胶）电泳分离
外显子B、外显子A
（2）图1中的过程⑥ （填“需要”或“不需要”）另加引物，
原因是 。进行②⑥⑧⑩过
程时，需要在一定的缓冲溶液中进行，⑩过程除图示条件还需要加入
。
解析： 由于引物2有一部分与外显子A重叠，还有一部分与外显子B重
叠，可作为其延伸的引物，故图1中的过程⑥不需要另加引物。进行②⑥
⑧⑩过程就属于DNA分子的复制了，所以DNA分子复制时需要四种脱氧核
苷酸，由于整个过程在PCR仪器中，所以需要耐高温的DNA聚合酶。
不需要
两条DNA的交错部分即可作为其延伸的引物
原
料（四种脱氧核苷酸）、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的
基因（如图2蛋白A基因）的序列，设计4条单链寡核苷酸片段为引物（图2
中的引物A→D），原理是取引物A、B进行PCR1反应，以及引物C、D进
行PCR2反应，然后将需要的两个片段混合、延伸并大量扩增。图2引物B
和引物C中的∧、∨代表 ，引物B和引物C碱基序列间存在的关
系是 。
解析： 基因定点突变是根据目的基因的序列，使基因上的某碱基缺
失、增添或替换，故图2引物B和引物C中的“A”代表突变碱基，分析图2
可知，引物B和引物C碱基序列间存在的关系互补。
突变碱基
互补
7. （2021·海南选择考）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9
基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引
导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因
编辑技术的工作原理如图所示。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码
序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，
插入时所需要的酶是 。
解析：过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定
sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过
的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
解析：大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物
细胞的方法是感受态细胞法。
DNA连接酶
感受态细胞法
（3）过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的
sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则
是 。随后，Cas9蛋白可切割
序列。
碱基互补配对原则
目标DNA特定的核
苷酸
解析： 根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA
是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9蛋白切割与sgRNA配对
的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异
性结合的原因是sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序
列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定
识别，进而定位；由此可见，Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割
目标DNA特定的核苷酸序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在
DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是 。
解析： 可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，若不出现杂交带，则说明基因敲除成功。
DNA分子杂交技术
不出现杂交带
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因
插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细
胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量
分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，
将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：
。
CRISPR/Cas9重组质粒
在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9
蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特
异性结合，从而插入到基因组DNA中
解析： 根据题图可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录
和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合
体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入
到基因组DNA中。
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