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第55讲 重组DNA技术的基本工具
选择性必修3 生物技术与工程
第九单元 生物技术与工程
1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2．实验：DNA的粗提取与鉴定。
一、基因工程的概念
考点1 重组DNA技术的基本工具
DNA分子
转基因
遗传特性
生物类型
基因重组
二、基因工程的诞生和发展
1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间____。
2．DNA双螺旋结构的提出和__________的证明。
3．中心法则的确立。
4．________的破译。
转移
半保留复制
遗传密码
5．基因转移载体的发现。_____________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
6．_____体外重组的实现。
7．重组DNA表达实验的成功。
8．DNA测序和合成技术的发明。
9．_____技术的发明。
10．__________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
限制酶、DNA连接酶和逆转录酶
DNA
PCR
基因组编辑
三、重组DNA技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
原核生物
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
1．(人教版选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害
2．(人教版选择性必修3 P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是___________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接
2．DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
黏性末端和平末端
3．载体
噬菌体
一个至多个
自我复制
受体DNA
标记
3．(人教版选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于_________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上
4．(人教版选择性必修3 P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是___________________________________________________________。
提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害
限制酶的选择要求
1．位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。
[深化拓展]
2．酶切要求
(1)单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。
(2)双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
3．数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
4．特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。
1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 ( )
提示：此变异是定向的。
2．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 ( )
提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
×
×
3．限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4 000。 ( )
4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 ( )
5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ( )
√
√
√
我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。
(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端、N端添加的限制酶识别序列分别是________。
提示：BglⅠ、EcoRⅤ
(2)经过酶切的重组DNA分子和 Ti质粒进行连接时，选用________________(填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)连接效率较高。
提示：T4 DNA连接酶
(3)在ictB基因表达载体的构建中不宜选用Ti质粒作为载体，原因是
___________________________________________________________。
提示：质粒大，难以进行插入外源基因的构建，以及酶切位点受限
考向1 基因工程工具酶的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P73思考·讨论)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
√
B [由于引物只能引导子链从5′到3′，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶可以连接DNA片段的黏性末端，D正确。]
2．(链接人教版选择性必修3 P75拓展应用T2)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是( )
A．可以避免质粒或者目的基因自身环化
B．可以避免目的基因与质粒反向连接
C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
D．可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来
√
D [两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免质粒或者目的基因自身环化，也不能避免目的基因与质粒反向连接，A、B错误；两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因，C错误；若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接，质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切位点处连接，则正好将目的基因正向连接，这样的重组质粒，既无EcoRⅠ识别位点，又无MfeⅠ识别位点，相当于将基因“焊死”在质粒上，故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来，D正确。]
考向2 基因工程载体的应用
3．(链接人教版选择性必修3 P72图3-4、正文)如图为外源DNA、大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________________(写中文名称)，________________________________________，构成人类的胰岛素基因和质粒的基本骨架。
(2)将人的胰岛素基因导入质粒构建基因表达载体时，所需的酶是______________________________；基因表达载体应具有的基本条件有________________________________________________(答2点)。
脱氧核糖核酸
磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧
限制性内切核酸酶和DNA连接酶
能自我复制、具有标记基因、具有启动子和终止子等
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为____________，其作用是_________________________________________________________。
(4)将剪切后的人胰岛素基因和剪切后的质粒混合进行连接反应，得到重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用________处理，使其能吸收周围的DNA。
标记基因
用于鉴定目的基因(或重组质粒)是否导入受体细胞
Ca2+
[解析] (1)a表示大肠杆菌拟核中的大型环状DNA，质粒是大肠杆菌细胞中的小型环状DNA，二者都是脱氧核糖核酸。人类的胰岛素基因和质粒都是DNA，磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧，构成DNA的基本骨架。(2)构建基因表达载体时，需要将目的基因和质粒进行切割，需要用到限制性内切核酸酶，同时需要将二者进行连接，需要用到DNA连接酶；基因表达载体应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因、具有启动子和终止子等。(3)氨苄青霉素抗性基因是质粒DNA上的标记基因，用于鉴定目的基因(或重组质粒)是否导入受体细胞。(4)将目的基因导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用Ca2+处理，使得大肠杆菌细胞处于感受态，便于周围DNA进入细胞。
一、实验原理
考点2 DNA的粗提取与鉴定
酒精
2 mol/L
蓝色
二、实验步骤
白色丝状物
二苯胺
1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
1．(链接人教版选择性必修3 P75图示信息)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
√
D [动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。]
2．(链接人教版选择性必修3 P74－75探究·实践)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
√
D [裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。]
体验真题 感悟高考 · 有章可循
√
1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
2．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E．coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E．coli DNA连接酶连接
√
C [酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此基因表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
3．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
√
D [研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，无法检测蛋白质，D错误。]
1．(2024·广东实验中学期中)在基因工程的操作中，需要三种工具，分别是“分子手术刀”“分子缝合针”和“分子运输车”，下列关于这三种工具的叙述，不正确的是( )
A．“分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶，可以断开 DNA 的磷酸二酯键
B．“分子缝合针”指的是 DNA 聚合酶，可以催化生成断裂的磷酸二酯键
C．“分子运输车”指的是载体，常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等
D．“分子手术刀”主要来自原核生物，它一般不会切割该生物自己的 DNA
课时数智作业(五十五) 重组DNA技术的基本工具
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
√
B [“分子手术刀”是限制性内切核酸酶(限制酶)，能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割使磷酸二酯键断裂，A正确；“分子缝合针”是DNA连接酶，能将具有相同末端的DNA片段连接起来，B错误；基因工程中的“分子运输车”即载体，有质粒、动植物病毒、噬菌体等，其中质粒是基因工程中最常用的载体，C正确；“分子手术刀”主要来自原核生物，它一般不会切割该生物自己的DNA，可能是该生物不含有该序列或者含有该序列，但被修饰了的，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
2．(2024·广东肇庆期中)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别为—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶 MunⅠ切割质粒
B．构建重组质粒时，会形成不止一种脱氧核苷酸序列(考虑DNA片段两两连接)
C．将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的 DNA 片段
D．标记基因一般是抗生素基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D [由题图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确；构建重组质粒时，考虑DNA片段两两连接，会形成不止一种脱氧核苷酸序列，B正确；限制酶MunⅠ切割质粒后与目的基因连接形成重组质粒，连接处形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被 2 种限制酶识别、切割，但EcoRⅠ能识别标记基因的相应序列并切割， 使环状重组质粒断裂形成1种长度的DNA片段，C正确；标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选，D错误。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
3．(2024·四川成都列五中学月考)研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．使用Hind Ⅲ和XbaⅠ进行酶切能避免基因X与质粒反向连接
B．目的基因X与质粒连接可使用E．coli DNA连接酶
C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞
D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
C [分析题图可知，使用Hind Ⅲ和XbaⅠ进行酶切会产生不同的黏性末端，故能避免基因X与质粒反向连接，A正确；目的基因X与质粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切会产生黏性末端，E．coli DNA连接酶可连接黏性末端，故目的基因X与质粒连接可使用E．coli DNA 连接酶，B正确；用Ca2+处理大肠杆菌，能提高细胞膜的通透性，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒导入受体细胞，C错误；分析题图可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，故含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
4．(2024·广东佛山期中)“DNA的粗提取与鉴定”的实验步骤是：研磨→去杂质→析出→鉴定；某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如表所示。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
去杂质方式 沉淀质量(g) DNA浓度 (ng/μL) OD260/OD280 二苯胺
鉴定
离心 0.068 81.5 1.53 蓝色
4 ℃冰 箱静置 0.1028 336.4 1.41
注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．离心或沉淀后应取上清液进一步提取DNA
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
B [DNA的粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；离心或沉淀后应取上清液进一步提取DNA，D正确。]
c
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
5．(2024·湖北武汉期末)某植物的野生型和突变型植株杂交，F1均为野生型，F1自交所得F2中绝大部分植株与野生型相似(包括野生型、介于野生型与突变型之间的“过渡类型”)，以＋表示，少部分植株与突变型相似，以P表示。研究发现，两表型相关基因的碱基序列一致，长度均为2.4 kb，将此片段用限制酶PstⅠ完全酶切结果如下图。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．据题意推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感
B．2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物
C．图2中P的①②位点可能均发生了甲基化
D．该植株的表观遗传现象是可以稳定遗传的
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
√
D [据题意可知，突变型与野生型基因长度相同，突变型基因序列不能被限制酶PstⅠ酶切，由此推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感，A正确；据题图可知，野生型基因序列酶切产物是1.5 kb和0.7 kb，因此2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物，B正确；突变型基因序列不能够被限制酶PstⅠ酶切，图2中P的①②位点可能均发生了甲基化，C正确；根据题意无法判断该植株的表观遗传现象是否可以稳定遗传的，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
6．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D [若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中只含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
7．(2024·广东佛山三模)图1表示基因工程中用到的质粒，其中PstⅠ是目的基因插入位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。图2表示筛选出导入重组质粒的受体菌的方法(四环素和氨苄青霉素在高温下不稳定易失效)。下列说法正确的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
A．构建重组DNA分子用到的工具酶有限制酶和质粒
B．图2所用培养基应加入抗生素并调好pH后再灭菌处理
C．图2中利用绒布接种的方法为稀释涂布平板法
D．原板上的甲、乙菌落中，甲菌落是成功导入重组质粒的受体菌
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
D [构建重组DNA分子用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，质粒为载体，A错误；由于四环素和氨苄青霉素在高温下不稳定易失效，因此应在灭菌后再加入抗生素，B错误；图2中利用绒布接种的方法为影印法，不改变菌落的位置，C错误；原板上的甲、乙菌落中，甲菌落在含四环素的培养基上能生存，在含氨苄青霉素的培养基上不能生存，说明甲菌落中质粒的氨苄青霉素抗性基因被破坏，说明其是成功导入重组质粒的受体菌，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
8．(14分)(2024·广东湛江期末)限制酶是基因工程的基本工具之一。同尾酶指来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的黏性末端的限制酶，在基因工程中应用较为广泛。几种常见的限制酶的切割位点如表所示。回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
限制酶 BamH Ⅰ Sal Ⅰ Bgl Ⅱ XhoⅠ
识别序列及切割位点
(1)表中两组同尾酶分别是__________________和________________。表中限制酶切割出的为黏性末端，若限制酶切割出的为平末端，则用_______________(填“E．coli DNA连接酶”“T4 DNA连接酶”或“E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶”)效率更高。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
BamHⅠ、BglⅡ
SalⅠ、XhoⅠ
T4 DNA连接酶
(2)某限制酶的识别序列及切割位点为↓GATC，某DNA分子上有4个该限制酶的识别位点，用该限制酶切割该DNA分子，会生成4个片段。若用BamHⅠ切割该DNA分子会生成2个片段，则该DNA分子为________(填“环”或“链”)状结构。若用2种酶同时处理该DNA分子，则会生成______个片段。
(3)限制酶的切割位点是____________(填化学键名称)。在基因工程中，与使用一种限制酶相比，同时使用2种同尾酶进行切割的优点有_________________________________(写出1个)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
环
4
磷酸二酯键
一定程度上防止重组质粒再次被切割
[解析] (1)表中两组同尾酶分别是BamHⅠ与BglⅡ，SalⅠ与XhoⅠ。由表分析，BamHⅠ和BglⅡ或SalⅠ和XhoⅠ可以切割出相同的黏性末端。平末端可以用T4 DNA连接酶连接效率更高。(2)该限制酶的识别序列及切割位点为↓GATC，该DNA分子上有4个该限制酶的识别位点。用该限制酶切割该DNA分子，生成4个片段，若用BamHⅠ切割该DNA分子会生成2个片段，说明该DNA分子为环状结构；若用两种酶同时处理该DNA分子，则会生成4个片段。(3)在基因工程中，与使用一种限制酶相比，若同时使用2种同尾酶进行切割，则切割后的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能被原来的限制酶所识别，从而一定程度上防止重组质粒再次被切割。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
(教师用书独具)
1．(2024·广东珠海期末)科学家把兔子的血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于该技术的理论依据，不正确的是( )
A．兔子与大肠杆菌共用一套遗传密码
B．兔子的血红蛋白基因能控制蛋白质的合成
C．兔子与大肠杆菌都遵循相同的碱基互补配对原则
D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
√
D [根据题干信息“把兔子的血红蛋白基因导入大肠杆菌中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白”可知，说明兔子和大肠杆菌共用一套密码子，兔子的血红蛋白基因能控制蛋白质的合成，A、B正确；兔子与大肠杆菌都具有细胞结构，细胞内含有DNA和RNA，都以DNA作为遗传物质，故二者都遵循相同的碱基互补配对原则，C正确；把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中进行表达利用了重组DNA技术，生物之间是否有共同的原始祖先与重组DNA技术之间没有必然关系，D错误。]
2．(2024·广东实验中学期中)现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性 DNA 分子，用限制酶酶切后进行凝胶电泳，使产物分开。用酶 H 单独酶切、用酶 B 单独酶切、用酶 H 和酶 B 同时酶切，结果如图(灰色条带表示产物，不同分子量的 DNA 片段位于不同条带)。下列相关叙述正确的是
( )
A．酶B和酶H没有相同的识别位点和切割位点
B．酶H有2个识别位点和切割位点
C．酶B有3个识别位点和切割位点
D．酶B和酶H同时酶切时，得到3个DNA片段
√
A [由题分析可知，酶H单独酶切出现2 000 kb和1 000 kb 2个片段，说明DNA分子上有一个酶切位点，酶B单独酶切出现2 000 kb、600 kb、400 kb 3个片段，说明DNA分子上有2个酶切位点，而用酶 B 和酶 H 同时酶切时，得到 4 个 DNA 片段，分别是1个1 400 kb片段、2个600 kb片段、1个400 kb片段，说明有3个识别位点和切割位点，因此酶B和酶H没有相同的识别位点和切割位点，A正确，B、C、D错误。]
3．(2024·辽宁部分学校模拟)为了提高构建基因表达载体的效率，通常会运用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，图1、图2表示含有目的基因的DNA片段和质粒上限制酶的识别位点，表中为各种限制酶的识别序列和切割位点。同尾酶是指它们切割不同的DNA片段但产生相同的黏性末端的一类限制酶。下列叙述错误的是( )
限制酶种类 BamHⅠ BclⅠ HindⅢ EcoRⅠ
识别序列及 切割位点 ↓ GGATCC ↓ TGATCA ↓ AAGCTT ↓
GAATTC
A．对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和Hind Ⅲ进行切割以获取目的基因
B．BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位点不同
C．图中启动子的作用是作为DNA 聚合酶识别和结合部位
D．将该重组质粒导入动物细胞常用显微注射法
√
C [由图1可知，目的基因的内部有BclⅠ和EcoRⅠ这两种限制酶的切割位点，对于含有目的基因的DNA 片段最好用BamHⅠ和HindⅢ进行切割以获取目的基因，A正确；由表格可知，BamHⅠ和BclⅠ切割形成的黏性末端相同，BamHⅠ和BclⅠ是同尾酶，二者的切割位点不同，BamHⅠ识别的序列为-GGATCC-，切割位点在GG之间，BclⅠ识别序列为TGATCA-，切割位点在TG之间，B正确；启动子的作用是作为RNA 聚合酶识别和结合部位，是转录的起点，C错误；将重组质粒导入动物细胞常用的方法为显微注射法，D正确。]
4．(2024·甘肃白银阶段练习)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．选用菜花、大蒜等植物材料提取DNA时，应该先用蛋白酶溶解细胞壁
B．在不同浓度的NaCl溶液中反复溶解析出DNA，能够提高DNA的纯度
C．新鲜的猪血是良好的DNA提取材料，经过蒸馏水处理后其中的血细胞破裂
D．用冷却的酒精溶液可溶解蛋白质并析出DNA，DNA与二苯胺试剂经沸水浴后呈紫色
√
B [选用菜花、大蒜等植物材料提取DNA时，应该先用洗涤剂溶解细胞膜，A错误；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，因此在不同浓度的NaCl溶液中反复溶解析出DNA，能够去除杂质，提高DNA的纯度，B正确；DNA主要分布在细胞核中，新鲜的猪血中的成熟红细胞无细胞核和其他的细胞器，因此新鲜的猪血不能作为提取DNA的材料，C错误；用冷却的酒精溶液可溶解蛋白质并析出DNA，再用2 mol/L的NaCl溶液将DNA溶解后，加入二苯胺试剂经沸水浴冷却后呈蓝色，D错误。]
谢 谢 ！第55讲 重组DNA技术的基本工具
1．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2．实验：DNA的粗提取与鉴定。
考点1 重组DNA技术的基本工具
一、基因工程的概念
二、基因工程的诞生和发展
1．肺炎链球菌转化实验不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间____________。
2．DNA双螺旋结构的提出和____________的证明。
3．中心法则的确立。
4．____________的破译。
5．基因转移载体的发现。____________________________________的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
6．__________体外重组的实现。
7．重组DNA表达实验的成功。
8．DNA测序和合成技术的发明。
9．__________技术的发明。
10．____________技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
三、重组DNA技术的基本工具
1．限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
1．(人教版选择性必修3 P71旁栏思考)存在于原核生物中的限制酶的作用是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．(人教版选择性必修3 P71正文)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
2．DNA连接酶
3．载体
3．(人教版选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要区别在于_____________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
4．(人教版选择性必修3 P73正文)实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是_____________________
____________________________________________________________________。
[深化拓展]
限制酶的选择要求
1．位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间，若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个，用于重组DNA的鉴定和筛选。另外，目的基因上如果有该酶的酶切位点，不能选择。
2．酶切要求
(1)单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图，选用XhoⅠ)，但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接，还可造成目的基因的多拷贝插入。
(2)双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如：不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外，不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，因MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
3．数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如选择SmaⅠ进行酶切，则切割重组后会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
4．特殊要求：例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶，假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均不宜选取，丙质粒宜选取。
1．基因工程的原理是基因重组，此变异是不定向的。 ( )
2．DNA连接酶“缝合”目的基因与载体之间的氢键。 ( )
3．限制性内切核酸酶EcoRⅠ识别并切割双链DNA，用EcoRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为
4 000。 ( )
4．大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。 ( )
5．作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ( )
我国科学家将蓝细菌ictB蛋白(能高效转运和浓缩CO2)的基因(ictB基因)与水稻叶绿体基因组中PSbA基因的启动子(叶片特异性表达)连接成重组DNA，然后将重组DNA与Ti质粒构建成表达载体，再导入水稻叶肉细胞的叶绿体中，最终成功获得了转ictB基因水稻，提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含PSbA启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图所示。
(1)为使重组DNA分子能定向插入Ti质粒的相应区段中，可在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端、N端添加的限制酶识别序列分别是 。
(2)经过酶切的重组DNA分子和 Ti质粒进行连接时，选用 (填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)连接效率较高。
(3)在ictB基因表达载体的构建中不宜选用Ti质粒作为载体，原因是
。
基因工程工具酶的应用
1．(链接人教版选择性必修3 P73思考·讨论)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
2．(链接人教版选择性必修3 P75拓展应用T2)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中的实践中，某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述，正确的是( )
A．可以避免质粒或者目的基因自身环化
B．可以避免目的基因与质粒反向连接
C．可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
D．可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来
基因工程载体的应用
3．(链接人教版选择性必修3 P72图3-4、正文)如图为外源DNA、大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质相同，都是________________(写中文名称)，________________________________________，构成人类的胰岛素基因和质粒的基本骨架。
(2)将人的胰岛素基因导入质粒构建基因表达载体时，所需的酶是____________________________________；基因表达载体应具有的基本条件有______________________________(答2点)。
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为____________，其作用是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(4)将剪切后的人胰岛素基因和剪切后的质粒混合进行连接反应，得到重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌时，大肠杆菌应先用________处理，使其能吸收周围的DNA。
考点2 DNA的粗提取与鉴定
一、实验原理
二、实验步骤
1．本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
4．提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
5．在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。
1．(链接人教版选择性必修3 P75图示信息)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )
A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
2．(链接人教版选择性必修3 P74－75探究·实践)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，需更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建基因表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列基因表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
3．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
[夯实必备知识]自主诊断
考点1
一、DNA分子 转基因 遗传特性 生物类型 基因重组
二、1．转移 2．半保留复制 4．遗传密码 5．限制酶、DNA连接酶和逆转录酶 6．DNA 9．PCR 10．基因组编辑
三、1．原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 2．磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端和平末端 3．噬菌体 一个至多个 自我复制 受体DNA 标记
[落实实验基础]自主诊断
考点2
一、酒精 2 mol/L 蓝色
二、白色丝状物 二苯胺
第55讲 重组DNA技术的基本工具
考点1
教材隐性知识
1．提示：切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害
2．提示：防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接
3．提示：DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上
4．提示：对靶细胞具有较高的转化效率；不能增殖，对细胞无害
澄清概念
1．×提示：此变异是定向的。
2．×提示：DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
3．√ 4．√ 5．√
达成学科素养
提示：(1)BglⅠ、EcoRⅤ
(2)T4 DNA连接酶
(3)质粒大，难以进行插入外源基因的构建，以及酶切位点受限
评价迁移应用
1．B [由于引物只能引导子链从5′到3′，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′ TGCGCAGT 3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确；E．coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶可以连接DNA片段的黏性末端，D正确。]
2．D [两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免质粒或者目的基因自身环化，也不能避免目的基因与质粒反向连接，A、B错误；两种限制酶切割后得到的黏性末端一致，不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因，C错误；若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接，质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切位点处连接，则正好将目的基因正向连接，这样的重组质粒，既无EcoRⅠ识别位点，又无MfeⅠ识别位点，相当于将基因“焊死”在质粒上，故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将重组质粒中的目的基因切割下来，D正确。]
3．(1)脱氧核糖核酸 磷酸和脱氧核糖交替连接，排列在外侧 (2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶 能自我复制、具有标记基因、具有启动子和终止子等 (3)标记基因 用于鉴定目的基因(或重组质粒)是否导入受体细胞 (4)Ca2+
考点2
评价迁移应用
1．D [动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。]
2．D [裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 mol/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶于2 mol/L的NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。]
体验真题
1．B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
2．C [酶3切割后得到的是平末端，E．coli DNA连接酶连接平末端的效率要远远低于T4 DNA连接酶，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到的是平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此基因表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。]
3．D [研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，无法检测蛋白质，D错误。]
10 / 10课时数智作业(五十五) 重组DNA技术的基本工具
1．(2024·广东实验中学期中)在基因工程的操作中，需要三种工具，分别是“分子手术刀”“分子缝合针”和“分子运输车”，下列关于这三种工具的叙述，不正确的是( )
A．“分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶，可以断开 DNA 的磷酸二酯键
B．“分子缝合针”指的是 DNA 聚合酶，可以催化生成断裂的磷酸二酯键
C．“分子运输车”指的是载体，常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体等
D．“分子手术刀”主要来自原核生物，它一般不会切割该生物自己的 DNA
2．(2024·广东肇庆期中)限制酶MunⅠ和限制酶 EcoRⅠ的识别序列及其切割位点分别为—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示某一目的基因片段与质粒拼接形成重组质粒的过程，下列叙述错误的是( )
A．用限制酶 EcoRⅠ切割目的基因，同时用限制酶 MunⅠ切割质粒
B．构建重组质粒时，会形成不止一种脱氧核苷酸序列(考虑DNA片段两两连接)
C．将重组质粒同时用以上2种限制酶切割则会再形成1种长度的 DNA 片段
D．标记基因一般是抗生素基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选
3．(2024·四川成都列五中学月考)研究人员欲将某动物体内基因X导入大肠杆菌的质粒中保存，质粒含有抗性基因与酶切位点，目的基因两端酶切位点如下图所示，下列叙述错误的是( )
A．使用Hind Ⅲ和XbaⅠ进行酶切能避免基因X与质粒反向连接
B．目的基因X与质粒连接可使用E.coli DNA连接酶
C．Ca2+处理大肠杆菌能降低细胞膜通透性，有利于重组质粒导入受体细胞
D．含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长
4．(2024·广东佛山期中)“DNA的粗提取与鉴定”的实验步骤是：研磨→去杂质→析出→鉴定；某研究小组欲探究不同的去杂质方法对实验结果的影响，实验结果如表所示。下列叙述错误的是( )
去杂质 方式 沉淀质 量(g) DNA浓度 (ng/μL) OD260/OD280 二苯胺 鉴定
离心 0.068 81.5 1.53 蓝色
4 ℃冰 箱静置 0.1028 336.4 1.41
注：OD260与OD280的比值可检查DNA纯度。纯DNA的OD260/OD280为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。
A．猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料
B．对研磨液进行离心是为了加速DNA的沉淀
C．离心法可以获得更高纯度的DNA
D．离心或沉淀后应取上清液进一步提取DNA
5．(2024·湖北武汉期末)某植物的野生型和突变型植株杂交，F1均为野生型，F1自交所得F2中绝大部分植株与野生型相似(包括野生型、介于野生型与突变型之间的“过渡类型”)，以＋表示，少部分植株与突变型相似，以P表示。研究发现，两表型相关基因的碱基序列一致，长度均为2.4 kb，将此片段用限制酶PstⅠ完全酶切结果如下图。下列叙述错误的是( )
A．据题意推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感
B．2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物
C．图2中P的①②位点可能均发生了甲基化
D．该植株的表观遗传现象是可以稳定遗传的
6．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
7．(2024·广东佛山三模)图1表示基因工程中用到的质粒，其中PstⅠ是目的基因插入位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。图2表示筛选出导入重组质粒的受体菌的方法(四环素和氨苄青霉素在高温下不稳定易失效)。下列说法正确的是( )
A．构建重组DNA分子用到的工具酶有限制酶和质粒
B．图2所用培养基应加入抗生素并调好pH后再灭菌处理
C．图2中利用绒布接种的方法为稀释涂布平板法
D．原板上的甲、乙菌落中，甲菌落是成功导入重组质粒的受体菌
8．(14分)(2024·广东湛江期末)限制酶是基因工程的基本工具之一。同尾酶指来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的黏性末端的限制酶，在基因工程中应用较为广泛。几种常见的限制酶的切割位点如表所示。回答下列问题：
限制酶 BamHⅠ SalⅠ BglⅡ XhoⅠ
识别 序列 及切 割位 点
(1)表中两组同尾酶分别是__________________和__________________。表中限制酶切割出的为黏性末端，若限制酶切割出的为平末端，则用________________(填“E.coli DNA连接酶”“T4 DNA连接酶”或“E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶”)效率更高。
(2)某限制酶的识别序列及切割位点为↓GATC，某DNA分子上有4个该限制酶的识别位点，用该限制酶切割该DNA分子，会生成4个片段。若用BamHⅠ切割该DNA分子会生成2个片段，则该DNA分子为________(填“环”或“链”)状结构。若用2种酶同时处理该DNA分子，则会生成______个片段。
(3)限制酶的切割位点是____________(填化学键名称)。在基因工程中，与使用一种限制酶相比，同时使用2种同尾酶进行切割的优点有________________________________(写出1个)。
课时数智作业(五十五)
1．B [“分子手术刀”是限制性内切核酸酶(限制酶)，能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割使磷酸二酯键断裂，A正确；“分子缝合针”是DNA连接酶，能将具有相同末端的DNA片段连接起来，B错误；基因工程中的“分子运输车”即载体，有质粒、动植物病毒、噬菌体等，其中质粒是基因工程中最常用的载体，C正确；“分子手术刀”主要来自原核生物，它一般不会切割该生物自己的DNA，可能是该生物不含有该序列或者含有该序列，但被修饰了的，D正确。]
2．D [由题图可知，目的基因两侧都是限制酶EcoRⅠ的切割位点，因此应选用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子，质粒中含有限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的切割位点，但EcoRⅠ的切割位点位于标记基因中，用其切割会破坏标记基因，因此为保证重组质粒表达载体的准确构建，应选用限制酶MunⅠ切割质粒，A正确；构建重组质粒时，考虑DNA片段两两连接，会形成不止一种脱氧核苷酸序列，B正确；限制酶MunⅠ切割质粒后与目的基因连接形成重组质粒，连接处形成—CAATTC—和—GAATTG—的新序列，都不能被 2 种限制酶识别、切割，但EcoRⅠ能识别标记基因的相应序列并切割， 使环状重组质粒断裂形成1种长度的DNA片段，C正确；标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光标记基因，便于目的基因的筛选，D错误。]
3．C [分析题图可知，使用Hind Ⅲ和XbaⅠ进行酶切会产生不同的黏性末端，故能避免基因X与质粒反向连接，A正确；目的基因X与质粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切会产生黏性末端，E．coli DNA连接酶可连接黏性末端，故目的基因X与质粒连接可使用E．coli DNA 连接酶，B正确；用Ca2+处理大肠杆菌，能提高细胞膜的通透性，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒导入受体细胞，C错误；分析题图可知，重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，故含有基因X的大肠杆菌能在氨苄青霉素选择培养基中生长，D正确。]
4．B [DNA的粗提取与鉴定的实验中，应选择富含DNA的材料，猪肝和菜花均可作为提取DNA的材料，A正确；离心研磨液的目的是加速沉淀，离心能够加速细胞膜、细胞器、一些较大杂质的沉淀，离心法可以获得更高纯度的DNA，B错误，C正确；离心或沉淀后应取上清液进一步提取DNA，D正确。]
5．D [据题意可知，突变型与野生型基因长度相同，突变型基因序列不能被限制酶PstⅠ酶切，由此推测，限制酶PstⅠ可能对甲基化敏感，A正确；据题图可知，野生型基因序列酶切产物是1.5 kb和0.7 kb，因此2.2 kb和0.9 kb条带是“过渡类型”的酶切产物，B正确；突变型基因序列不能够被限制酶PstⅠ酶切，图2中P的①②位点可能均发生了甲基化，C正确；根据题意无法判断该植株的表观遗传现象是否可以稳定遗传的，D错误。]
6．D [若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中只含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
7．D [构建重组DNA分子用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，质粒为载体，A错误；由于四环素和氨苄青霉素在高温下不稳定易失效，因此应在灭菌后再加入抗生素，B错误；图2中利用绒布接种的方法为影印法，不改变菌落的位置，C错误；原板上的甲、乙菌落中，甲菌落在含四环素的培养基上能生存，在含氨苄青霉素的培养基上不能生存，说明甲菌落中质粒的氨苄青霉素抗性基因被破坏，说明其是成功导入重组质粒的受体菌，D正确。]
8．(每空2分，共14分)(1)BamHⅠ、BglⅡ SalⅠ、XhoⅠ T4 DNA连接酶 (2)环 4 (3)磷酸二酯键 一定程度上防止重组质粒再次被切割
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