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第56讲 基因工程的基本操作程序
选择性必修3 生物技术与工程
第九单元 生物技术与工程
1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变____________或获得____________等的基因。主要是指__________的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知__________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
考点1 基因工程的基本操作程序
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
结构和功能
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件
①一定的缓冲液、DNA模板、_______、4种脱氧核苷酸和___________________。
②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
2种引物
耐高温的DNA聚合酶
(3)过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用______________来鉴定。
琼脂糖凝胶电泳
50 ℃
72 ℃
1．(人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_____________________________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________。
提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中________，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够____和发挥作用。
稳定存在
表达
2．基因表达载体的组成
RNA聚合酶
转录
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
花粉管通道
T-DNA
染色
体DNA
显微注射
受精卵
Ca2+
四、目的基因的检测与鉴定
染色
体DNA
目的基因
mRNA
抗原—抗体
2．(人教版选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有____________________、__________________________________。
提示：抗原—抗体杂交 采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
筛选含有重组质粒的受体细胞的方法
1．用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞
(1)将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。
[深化拓展]
(2)再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
(3)最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2．用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。
2．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 ( )
提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
3．Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 ( )
×
√
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 ( )
4．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )
√
√
1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。
(1)第1组：_________________________________________________
__________________________________________________________。
(2)第2组：___________________________________________________________________________________________________________。
提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 (2)不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组载体，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况
考向1 PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。采用PCR方法进行研究，其反应程序如图所示。下列叙述不正确的是( )
A．PCR 反应中的每次循环的变性、复性、延伸过程，都涉及氢键的形成或断裂
B．延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
C．PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合
D．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
√
B [PCR 反应中的每次循环的变性过程DNA分子双链解螺旋，氢键断裂；复性时，引物与模板链通过形成氢键相结合；延伸过程中，游离的脱氧核苷酸与模板链通过形成氢键相结合。每次循环的变性、复性、延伸过程都重复以上过程，因此，都涉及氢键的形成或断裂，A正确。PCR技术合成的是DNA分子，因此，延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸，不需要ATP(四种dNTP即可以提供能量又可以提供原料)，B错误。PCR技术中所使用的引物是根据一段已知的病原菌的基因序列合成的，因此，PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物能与病原菌的两条单链DNA特异性结合，C正确。后延伸过程是为了让引物延伸完全并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。]
考向2 基因工程的操作程序
2．(2024·广东佛山期中)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述正确的是( )
A．用PCR仪扩增固氮基因时设置90 ℃以上变性，72 ℃左右复性，50 ℃左右延伸
B．将固氮基因导入水稻细胞可以用农杆菌转化法
C．可用PCR技术检测固氮基因在水稻细胞内是否表达
D．若检测到固氮基因表达产物，即说明转基因固氮水稻培育成功
√
B [用PCR仪扩增固氮基因时设置90 ℃以上变性，50 ℃左右复性，72 ℃左右延伸，A错误；将目的基因导入植物细胞可以用农杆菌转化法，B正确；检测固氮基因在水稻细胞内是否表达应用抗原—抗体杂交的方法，C错误；若检测到固氮基因表达产物不一定能够固氮，若要检测转基因固氮水稻是否培育成功，应将种子种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，D错误。]
3．(2025·云南昆明月考)甘薯是一种重要的粮食作物，对低温敏感，极不耐霜冻。当温度低于10 ℃时，甘薯的储藏性能降低。科研人员欲将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP导入甘薯细胞中培育抗冻甘薯新品种，主要技术路线如图1所示，相关限制酶切割位点如图2所示(箭头表示切割位点)。
据图回答问题。
(1)若要利用PCR技术获取并克隆TmAFP基因，需要设计________种引物，引物的碱基序列不能互补，以免发生____________。PCR反应中________过程所需温度最低。
(2)图1中①是指____________________，这一步是培育转基因抗冻甘薯的核心工作。为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，最好选用限制酶______________切割质粒P1。
引物自身结合
复性
2
基因表达载体的构建
SmaⅠ、XbaⅠ
(3)采用农杆菌转化法将TmAFP基因导入甘薯细胞，农杆菌细胞中T- DNA的作用是_________________________________________________________________________________________________________。
(4)图1中⑤和⑥分别为________________过程，可用_____________技术检测转基因甘薯愈伤组织中是否产生抗冻蛋白。
携带目的基因进入甘薯细胞，并整合到甘薯细胞的染色体DNA上
脱分化、再分化
抗原—抗体杂交
[解析] (1)若要利用PCR技术获取并克隆TmAFP基因，由于PCR技术需要一对引物来启动和扩增目的基因，因此需要设计2种引物。引物的碱基序列不能互补，以免在PCR反应过程中引物自身结合，形成“引物二聚体”，从而影响目的基因的扩增。在PCR反应中，①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，因此复性过程所需温度最低。(2) 图1中①是指将目的基因(TmAFP基因)与运载体(质粒P1)结合，形成重组质粒的过程，是基因表达载体的构建，这一步是培育转基因抗冻甘薯的核心工作。据图1可知，为了目的基因能表达出蛋白质，目
的基因应插入启动子和终止子之间，该位置有三种酶(SmaⅠ、XbaⅠ和HindⅢ)识别序列，据图2可知，SmaⅠ和EcoR Ⅴ切割产生平末端，XbaⅠ和Spe Ⅰ产生相同的黏性末端，因此根据目的基因两端的序列，为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，最好选用限制酶SmaⅠ、XbaⅠ切割质粒P1。(3)采用农杆菌转化法将TmAFP基因导入甘薯细胞时，农杆菌细胞中的T-DNA能转移并整合到甘薯细胞的染色体DNA上。因此，T-DNA的作用是作为运输目的基因(TmAFP基因)的工具，将其导入甘薯细胞并
整合到其基因组中。(4) 图1中⑤和⑥分别为脱分化和再分化过程。为了检测转基因甘薯愈伤组织中是否产生抗冻蛋白，可以采用抗原—抗体杂交技术，该技术利用抗原与抗体之间的特异性结合原理，可以准确地检测出目标蛋白(即抗冻蛋白)的存在。
1．PCR原理：利用了_____________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__________等有关。
考点2 DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA的热变性
相反
大小和构象
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
微量移液器
微量离心管
使反应液集中在管的底部
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用__________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在______或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
电泳缓冲液
沸水浴
核酸染料
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入______内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶_______为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用__________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
电泳槽
1 mm
微量移液器
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( )
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
√
A [琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。]
2．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)基因工程中PCR扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列关于PCR 及电泳鉴定的叙述，错误的是( )
A．PCR通过调节温度来控制DNA 双链的解聚及模板与引物的结合
B．DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度有关，与DNA分子的大小和构象无关
C．因 DNA分子在凝胶载样缓冲液中带有电荷，可用于电泳
D．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，若每个DNA分子的每条链都作模板，则第n次循环共需要引物2n个
√
B [PCR通过调节温度来控制DNA 双链的解聚及模板与引物的结合，如PCR通过90 ℃以上的高温解旋，50 ℃左右的温度下模板与引物结合，A正确；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，B错误；DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C正确；PCR技术大量扩增目的基因时，第n－1次生成2n-1个DNA分子，第n次复制形成2n个DNA，所以需要的引物数目为(2n－2n-1)×2＝2n，D正确。]
体验真题 感悟高考 · 有章可循
1．(2023·浙江6月卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
√
B [分析图甲可知，启动子在左侧，Gata3-GFP基因在右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向为从左向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，不能更好地区分杂合子和纯合子，D错误。]
2．(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
变性
氢键
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在_____________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。
避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和
质粒的自身环化
T4 DNA连接酶
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________________________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是___________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________
___________________________________________________________。
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生
利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
理状态
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸
[解析] (1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。(2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，T4 DNA连接酶连接平末端效率较高，需用T4 DNA连接酶连接。(3)用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌
的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸。
3．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是__________________________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据上图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是___________________________________________________________________________。
脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
EcoR Ⅰ
酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段
与载体定向连接
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有___________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。
酶切后的空载体片段，启动子D＋
PCR
基因S片段
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是________________________________________
__________________________________________________________。
品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
[解析] (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏。根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片
段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功，可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)据题分析可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。
1．(2024·广东茂名高三联考)用PCR检测某转基因植株是否导入目的基因时，电泳鉴定时发现扩增出多条条带，其原因最可能是( )
A．引物长度过短 B．引物之间发生配对
C．体系中Mg2+浓度过低 D．电泳时凝胶浓度过高
课时数智作业(五十六) 基因工程的基本操作程序
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
√
A [引物长度过短可能会导致特异性降低，从而结合到非目的基因的区域进行扩增，出现多条条带，A正确；如果引物之间发生配对，则引物与模板DNA结合比例降低，从而影响PCR反应的效率，B错误；体系中Mg2+浓度过低会影响DNA 聚合酶的活性，可能导致扩增效率降低甚至扩增失败，C错误；电泳时凝胶浓度过高主要影响的是DNA条带的迁移速度，而不是导致出现多条条带的原因，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
2．(2024·广东梅州诊断)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。下列有关说法错误的是( )
A．大肠杆菌转化实验中可使用Ca2+处理以提高转化效率
B．目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体以便稳定存在
C．将DNA溶液滴加在授粉后的花柱切面上，可以使目的基因进入胚囊
D．农杆菌转化法中需要进行两次体外拼接和一次导入
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
√
D [可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组的基因表达载体导入其中，提高转化效率，A正确。将目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体，这是基因工程的核心步骤，B正确。花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，C正确。农杆菌转化法总体上有两次的拼接过程，发生在Ti质粒与目的基因之间(体外拼接)、携带目的基因的T-DNA与植物细胞的染色体DNA之间(体内拼接)；两次的导入过程即基因表达载体导入农杆菌、农杆菌T-DNA导入植物细胞，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
3．(2024·广东揭阳调研)利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR
C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度
D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
A [引物结合在模板链的3′端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2 和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低 PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
4．(2024·江苏盐城模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切割位点等序列。下列相关叙述错误的是( )
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
10
11
√
D [耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，B正确；经过5次循环后会产生25＝32个DNA分子，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段有32－10＝22个，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。]
题号
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5．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是( )
A．表达质粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切
B．dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
题号
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√
D [dTCTP基因经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，因此需要相同的限制酶切割载体，产生相同的黏性末端，A正确；由题意可知，从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，最终获得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是该项研究中的目的基因，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，C正确；利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，构建基因表达载体，D错误。]
题号
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6．(2024·广东深圳期末)研究者欲将X基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落为白色)，其结构如下图所示。下列叙述错误的是( )
题号
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A．电泳时，X基因和重组质粒在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同
B．导入重组质粒前通常需用适宜浓度的Ca2+溶液处理大肠杆菌
C．应在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌
D．成功导入X基因的细菌在含X-gal的培养基上的菌落呈蓝色
√
题号
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D [在琼脂糖凝胶中的迁移速率最终取决于分子的大小，X基因和重组质粒分子大小不同，所以迁移速率不同，A正确；将重组质粒导入大肠杆菌前，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以导入并表达成功后的大肠杆菌会对氨苄青霉素有抗性、菌落中出现特定颜色，所以在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌，C正确；导入X基因会使LacZ基因被破坏，使其不能产生正常的表达产物，所以在含X-gal的培养基上的菌落呈白色，D错误。]
题号
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7．(2024·广东佛山阶段测试)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。
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注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。
下列关于该实验的叙述，不正确的是( )
A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可从水稻体细胞和精子中提取RNA合成cDNA来获得B基因中编码蛋白的序列
C．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
D．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上
√
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D [启动子是与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因获取途径之一就是从cDNA文库中获得，故可从水稻体细胞和精子中提取RNA合成cDNA来获得B基因中编码蛋白的序列，B正确；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，C正确；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，故不能用卡那霉素检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应用潮霉素，D错误。]
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8．(2024·广东中山期末)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述错误的是( )
题号
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A．电泳是带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。本实验中，带电分子会向着电荷相反的电极移动
B．该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1和R2的酶切位点最短相距约200 bp，最长相距约600 bp
D．需将扩增得到的PCR 产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样
√
题号
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D [电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，这两种限制酶切割产生的DNA片段等长，且只有1个DNA片段，当使用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，故该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由题可知，两种限制酶同时切割时，产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200 bp，最长相距约600 bp，C正确；将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，D错误。]
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9．(2024·广东中山期末)双向启动子可同时结合两个RNA 聚合酶来驱动下游基因的表达；研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是( )
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A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞
D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
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√
D [将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，B正确；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，D错误。]
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10．(14分)(2024·吉林、黑龙江适应性测试)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于细胞膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是__________________________。
(2)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
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需要能量、需要载体蛋白
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过______________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为______%。
题号
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逆转录
47
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用________________两种限制酶对载体酶切。
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Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ
Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ
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(3)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是__________________________________
___________________________________________________________。
(4)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是__________________________
___________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________。
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将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况
水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加
[解析] (1)由题干信息“在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外”可知，植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外是逆浓度梯度的运输，因此运输方式为主动运输，特点是需要载体蛋白，需要能量。(2)①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。②SOS1基因编码序列中A＋T含量占53%，则G＋C含量为47%。③由图可知，荧光蛋白基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶识别序列，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，并且不能选择限制酶SmaⅠ，否则会导致
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载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能正确表达，故选择XbaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对载体酶切，由于SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，故不能选择限制酶XbaⅠ对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在SOS1基因两端分别添加SpeⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列。(3)鉴定水稻抗盐能力是否增强，采取的操作是将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况。(4)水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加。
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11．(14分)(2024·广东湛江期末)研究人员将抗盐基因转入普通烟草培育出了抗盐烟草。实验过程中所用的Ti质粒与含抗盐基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。Ti质粒上的T-DNA能被转移到被侵染的细胞中并被整合到该细胞的染色体DNA上。
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请根据图示回答有关问题：
(1)利用PCR技术大量扩增抗盐基因时，在反应体系中要加入含抗盐基因的DNA片段、4种脱氧核苷酸、________________________________、引物等物质，以提供DNA复制所需的基本条件；PCR反应依次经过______、复性和延伸三步，并重复循环多次。
(2)在构建基因表达载体时，选用的Ti质粒除了以上结构外，还应有____________(填“复制原点”“起始密码子”或“终止密码子”)，切割Ti质粒和含抗盐基因的DNA最好选用__________________(限制酶的名称)。
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耐高温的DNA聚合酶(和缓冲溶液)
变性
复制
BamHⅠ和Sau3AⅠ
原点
(3)利用微生物培养技术筛选获得含抗盐基因表达载体的农杆菌：将转入目的基因的农杆菌接种到含某种抗生素的培养基上进行培养，结果如下图所示，当同时出现______________________这两组结果时，可确定农杆菌中已含抗盐基因表达载体；然后用该农杆菌去侵染植物细胞。
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甲、丁(或抗X、不抗Y)
(4)有人认为利用上述方法进行育种有助于降低X抗生素抗性基因转移到其他植物的风险，理由是该质粒只有_________(结构)整合到受体细胞的染色体DNA上，_________抗性基因不会转移整合到受体细胞的染色体DNA上。
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T-DNA
X抗生素
[解析] (1)PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。利用PCR技术大量扩增抗盐基因时，在反应体系中要加入目的基因(含抗盐基因的DNA片段)、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)、缓冲液(含Mg2+)、引物等物质，以提供DNA复制所需的基本条件；PCR反应依次经过变性、复性、延伸三步，并重复循环多次。(2)在构建基因表达载体时，选用的Ti质粒除了以上结构外，还应有复制原点，保证其能在受体细胞中进行自我复制。选择限制酶切割质粒和目的基因时，最好选用两种不
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同的限制酶进行切割，防止目的基因和载体自身环化或反向连接，且目的基因应插入到启动子和终止子之间，以保证目的基因能正常的转录，根据图中限制酶分布情况，切割Ti质粒和含抗盐基因的DNA最好选用限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ。(3)切割Ti质粒和含抗盐基因的DNA选用BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，构建好的表达载体中Y抗生素抗性基因被破坏，不能正常表达，但X抗生素抗性基因能正常表达，所以含有目的基因的农杆菌能在含有X抗生素的培养基上生长，不能在含有Y抗生素的培养基上生长，对应图中甲、
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丁这两组结果，然后可以用该农杆菌去侵染植物细胞。(4)有人认为利用题述方法进行育种有助于降低X抗生素抗性基因转移到其他植物的风险，理由是Ti质粒只有T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，而位于T-DNA之外的X抗生素抗性基因不会转移整合到受体细胞的染色体DNA上。
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(教师用书独具)
1．(2024·广东湛江二模)研究发现，若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸 PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“·”代表突变位点。改造过程中 PCR2所使用的引物组合为( )
A．引物1和引物4 B．引物2和引物6
C．引物2和引物4 D．引物3和引物5
√
B [利用重叠延伸PCR技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3′端结合，因此引物 d 的序列为5′GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c的碱基序列为5′CCTGTTAT，引物6符合该序列。]
2．(2024·广东梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入到棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列相关叙述正确的是( )
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
√
C [由图可知：构建基因表达载体时，应选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，若用BamHⅠ，则目的基会因为产生相同的末端而出现自身环化的现象且会将质粒上的两个标记基因均破坏掉，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温(第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸)和一次降温(使目的基因复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因在目的基因表达载体中存在，因此在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。]
谢 谢 ！第56讲 基因工程的基本操作程序
1．阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 2．实验：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点1 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取
1．筛选合适的目的基因
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变________________或获得____________等的基因。主要是指________________的基因。
(2)筛选目的基因的方法：从相关的已知______________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
2．利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理：DNA半保留复制。
(2)条件
①一定的缓冲液、DNA模板、____________、4种脱氧核苷酸和____________________。
②通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(3)过程
(4)PCR产物的鉴定：常采用______________来鉴定。
1．(人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR反应体系中需要同时加入两种引物的原因是_______________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中____________，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够__________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建过程
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定
2．(人教版选择性必修3 P82正文)转基因抗虫棉培育过程中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有____________________、___________________________。
[深化拓展]
筛选含有重组质粒的受体细胞的方法
1．用“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞
(1)将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落。
(2)再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
(3)最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2．用“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色，即在筛选平板上含有重组质粒的菌落呈白色。
1．目的基因主要指编码蛋白质的基因。 ( )
2．DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸。 ( )
3．Ti质粒上的T-DNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。 ( )
4．检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )
1．设计引物是PCR技术成功的关键步骤之一。下图为某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，请判断是否合理并说明理由。
(1)第1组：
。
(2)第2组：
。
2．URA3基因位于酵母菌5号染色体上，编码的酶参与酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人员利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以获得尿嘧啶营养缺陷型酵母菌。从获得的转基因酵母菌中筛选出了多株尿嘧啶营养缺陷型，现需验证这些菌株是因URA3基因缺失而导致的。选择实验材料写出实验设计思路。
实验材料：转基因酵母菌、完全培养基、尿嘧啶缺陷型培养基、含URA3基因的重组质粒、不含URA3基因的空质粒。
。
PCR技术及应用
1．(链接人教版选择性必修3 P78图3-5)PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。采用PCR方法进行研究，其反应程序如图所示。下列叙述不正确的是( )
A．PCR 反应中的每次循环的变性、复性、延伸过程，都涉及氢键的形成或断裂
B．延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
C．PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合
D．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
基因工程的操作程序
2．(2024·广东佛山期中)水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，减少使用氮肥的成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述正确的是( )
A．用PCR仪扩增固氮基因时设置90 ℃以上变性，72 ℃左右复性，50 ℃左右延伸
B．将固氮基因导入水稻细胞可以用农杆菌转化法
C．可用PCR技术检测固氮基因在水稻细胞内是否表达
D．若检测到固氮基因表达产物，即说明转基因固氮水稻培育成功
3．(2025·云南昆明月考)甘薯是一种重要的粮食作物，对低温敏感，极不耐霜冻。当温度低于10 ℃时，甘薯的储藏性能降低。科研人员欲将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP导入甘薯细胞中培育抗冻甘薯新品种，主要技术路线如图1所示，相关限制酶切割位点如图2所示(箭头表示切割位点)。
据图回答问题。
(1)若要利用PCR技术获取并克隆TmAFP基因，需要设计________种引物，引物的碱基序列不能互补，以免发生______________。PCR反应中________过程所需温度最低。
(2)图1中①是指____________________，这一步是培育转基因抗冻甘薯的核心工作。为了成功得到重组质粒P2，确保TmAFP基因插入载体中的方向正确，最好选用限制酶______________切割质粒P1。
(3)采用农杆菌转化法将TmAFP基因导入甘薯细胞，农杆菌细胞中T-DNA的作用是_________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)图1中⑤和⑥分别为________________过程，可用______________技术检测转基因甘薯愈伤组织中是否产生抗冻蛋白。
考点2 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．PCR原理：利用了________________原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2．电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷____________的电极移动，这个过程就是电泳。
3．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的____________等有关。
4．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)DNA片段的电泳鉴定
①根据待分离DNA片段的大小，用______________配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在____________或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的____________混匀。
②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
③待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入____________内。
④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶____________为宜。
⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用____________将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
⑥接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
⑦取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2．缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4．在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
1．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( )
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
2．(链接人教版选择性必修3 P84－85探究·实践)基因工程中PCR扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。下列关于PCR 及电泳鉴定的叙述，错误的是( )
A．PCR通过调节温度来控制DNA 双链的解聚及模板与引物的结合
B．DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度有关，与DNA分子的大小和构象无关
C．因 DNA分子在凝胶载样缓冲液中带有电荷，可用于电泳
D．采用PCR技术对一个DNA进行扩增，若每个DNA分子的每条链都作模板，则第n次循环共需要引物2n个
1．(2023·浙江6月卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
2．(2024·全国甲卷)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是________________________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是_______________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是________________________。
氨基酸 赖氨酸 精氨酸 丝氨酸 脯氨酸 亮氨酸 甘氨酸 终止
密码子 AAG AGA AGC CCA CCC CUG GGC GGG UGA
3．(2024·重庆卷)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是__________________________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据上图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有__________________________________________________________________。
经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从
TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_______
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
[夯实必备知识]自主诊断
考点1
一、1．(1)受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 (2)结构和功能 2．(2)2种引物 耐高温的DNA聚合酶 (3)50 ℃ 72 ℃ (4)琼脂糖凝胶电泳
二、1．(1)稳定存在 (2)表达 2．RNA聚合酶 转录
三、花粉管通道 T-DNA 染色体DNA 显微注射 受精卵 Ca2+
四、染色体DNA 目的基因 mRNA 抗原—抗体
[落实实验基础]自主诊断
考点2
1．DNA的热变性 2．相反 3．大小和构象
4．(1)微量移液器 微量离心管 使反应液集中在管的底部 (2)电泳缓冲液 沸水浴 核酸染料 电泳槽 1 mm 微量移液器
第56讲 基因工程的基本操作程序
考点1
教材隐性知识
1．提示：DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链，且DNA两条单链的序列不同，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
2．提示：抗原—抗体杂交 采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫
澄清概念
1．√
2．×提示：DNA复制的引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
3．√ 4．√
达成学科素养
1．提示：(1)不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 (2)不合理，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2．提示：将转基因酵母菌随机分为两组，一组导入含有URA3基因的重组载体，一组导入不含URA3基因的空质粒，再将两组酵母菌接种到尿嘧啶缺陷型培养基，观察生长的状况
评价迁移应用
1．B [PCR 反应中的每次循环的变性过程DNA分子双链解螺旋，氢键断裂；复性时，引物与模板链通过形成氢键相结合；延伸过程中，游离的脱氧核苷酸与模板链通过形成氢键相结合。每次循环的变性、复性、延伸过程都重复以上过程，因此，都涉及氢键的形成或断裂，A正确。PCR技术合成的是DNA分子，因此，延伸和后延伸过程中需要DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸，不需要ATP(四种dNTP即可以提供能量又可以提供原料)，B错误。PCR技术中所使用的引物是根据一段已知的病原菌的基因序列合成的，因此，PCR应用于临床病原菌检测，所用的引物能与病原菌的两条单链DNA特异性结合，C正确。后延伸过程是为了让引物延伸完全并让单链产物完全复性形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，D正确。]
2．B [用PCR仪扩增固氮基因时设置90 ℃以上变性，50 ℃左右复性，72 ℃左右延伸，A错误；将目的基因导入植物细胞可以用农杆菌转化法，B正确；检测固氮基因在水稻细胞内是否表达应用抗原—抗体杂交的方法，C错误；若检测到固氮基因表达产物不一定能够固氮，若要检测转基因固氮水稻是否培育成功，应将种子种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，D错误。]
3．(1)2 引物自身结合 复性 (2)基因表达载体的构建 SmaⅠ、XbaⅠ (3)携带目的基因进入甘薯细胞，并整合到甘薯细胞的染色体DNA上 (4)脱分化、再分化 抗原—抗体杂交
考点2
评价迁移应用
1．A [琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确。凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的进度，而不是指示DNA分子的具体位置，B错误。在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误。琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。]
2．B [PCR通过调节温度来控制DNA 双链的解聚及模板与引物的结合，如PCR通过90 ℃以上的高温解旋，50 ℃左右的温度下模板与引物结合，A正确；在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，B错误；DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，C正确；PCR技术大量扩增目的基因时，第n－1次生成2n-1个DNA分子，第n次复制形成2n个DNA，所以需要的引物数目为(2n－2n-1)×2＝2n，D正确。]
体验真题
1．B [分析图甲可知，启动子在左侧，Gata3 GFP基因在右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向为从左向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3 GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，不能更好地区分杂合子和纯合子，D错误。]
2．(1)变性 氢键 (2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4 DNA连接酶 (3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒 (4)甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸
3．(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接 (3)酶切后的空载体片段，启动子D＋基因S片段 PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
12 / 12课时数智作业(五十六) 基因工程的基本操作程序
1．(2024·广东茂名高三联考)用PCR检测某转基因植株是否导入目的基因时，电泳鉴定时发现扩增出多条条带，其原因最可能是( )
A．引物长度过短 B．引物之间发生配对
C．体系中Mg2+浓度过低 D．电泳时凝胶浓度过高
2．(2024·广东梅州诊断)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。下列有关说法错误的是( )
A．大肠杆菌转化实验中可使用Ca2+处理以提高转化效率
B．目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体以便稳定存在
C．将DNA溶液滴加在授粉后的花柱切面上，可以使目的基因进入胚囊
D．农杆菌转化法中需要进行两次体外拼接和一次导入
3．(2024·广东揭阳调研)利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR
C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度
D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
4．(2024·江苏盐城模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切割位点等序列。下列相关叙述错误的是( )
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
5．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是( )
A．表达质粒pGEX-4T-2需要用限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切
B． dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
6．(2024·广东深圳期末)研究者欲将X基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因(表达产物可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色；否则菌落为白色)，其结构如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．电泳时，X基因和重组质粒在琼脂糖凝胶中的迁移速率不同
B．导入重组质粒前通常需用适宜浓度的Ca2+溶液处理大肠杆菌
C．应在添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选大肠杆菌
D．成功导入X基因的细菌在含X-gal的培养基上的菌落呈蓝色
7．(2024·广东佛山阶段测试)B基因存在于水稻基因组中，仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验来获取能够在卵细胞中表达B基因的转基因植株。
注：启动子*指可在水稻卵细胞中启动转录的启动子；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光。
下列关于该实验的叙述，不正确的是( )
A．B基因在水稻卵细胞中不转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录
B．可从水稻体细胞和精子中提取RNA合成cDNA来获得B基因中编码蛋白的序列
C．在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光
D．过程②在培养基中应加入卡那霉素以检测T-DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上
8．(2024·广东中山期末)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述错误的是( )
A．电泳是带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。本实验中，带电分子会向着电荷相反的电极移动
B．该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1和R2的酶切位点最短相距约200 bp，最长相距约600 bp
D．需将扩增得到的PCR 产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样
9．(2024·广东中山期末)双向启动子可同时结合两个RNA 聚合酶来驱动下游基因的表达；研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是( )
A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞
B．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用
C．在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞
D．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒
10．(14分)(2024·吉林、黑龙江适应性测试)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于细胞膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是________________________。
(2)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过______________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为______%。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用________________两种限制酶对载体酶切。
(3)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是_________________________________________________________
____________________________________________________________________。
(4)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是_______________________________________________
____________________________________________________________________。
11．(14分)(2024·广东湛江期末)研究人员将抗盐基因转入普通烟草培育出了抗盐烟草。实验过程中所用的Ti质粒与含抗盐基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。Ti质粒上的T-DNA能被转移到被侵染的细胞中并被整合到该细胞的染色体DNA上。
请根据图示回答有关问题：
(1)利用PCR技术大量扩增抗盐基因时，在反应体系中要加入含抗盐基因的DNA片段、4种脱氧核苷酸、________________________________、引物等物质，以提供DNA复制所需的基本条件；PCR反应依次经过________、复性和延伸三步，并重复循环多次。
(2)在构建基因表达载体时，选用的Ti质粒除了以上结构外，还应有____________(填“复制原点”“起始密码子”或“终止密码子”)，切割Ti质粒和含抗盐基因的DNA最好选用____________________________(限制酶的名称)。
(3)利用微生物培养技术筛选获得含抗盐基因表达载体的农杆菌：将转入目的基因的农杆菌接种到含某种抗生素的培养基上进行培养，结果如下图所示，当同时出现______________________这两组结果时，可确定农杆菌中已含抗盐基因表达载体；然后用该农杆菌去侵染植物细胞。
(4)有人认为利用上述方法进行育种有助于降低X抗生素抗性基因转移到其他植物的风险，理由是该质粒只有______________(结构)整合到受体细胞的染色体DNA上，________________抗性基因不会转移整合到受体细胞的染色体DNA上。
课时数智作业(五十六)
1．A [引物长度过短可能会导致特异性降低，从而结合到非目的基因的区域进行扩增，出现多条条带，A正确；如果引物之间发生配对，则引物与模板DNA结合比例降低，从而影响PCR反应的效率，B错误；体系中Mg2+浓度过低会影响DNA 聚合酶的活性，可能导致扩增效率降低甚至扩增失败，C错误；电泳时凝胶浓度过高主要影响的是DNA条带的迁移速度，而不是导致出现多条条带的原因，D错误。]
2．D [可以用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组的基因表达载体导入其中，提高转化效率，A正确。将目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体，这是基因工程的核心步骤，B正确。花粉管通道法：可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊，C正确。农杆菌转化法总体上有两次的拼接过程，发生在Ti质粒与目的基因之间(体外拼接)、携带目的基因的T DNA与植物细胞的染色体DNA之间(体内拼接)；两次的导入过程即基因表达载体导入农杆菌、农杆菌T DNA导入植物细胞，D错误。]
3．A [引物结合在模板链的3′端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确；引物结合在模板链的3′端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2 和引物4进行PCR，B错误；若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低 PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误；DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3′端连接脱氧核苷酸，D错误。]
4．D [耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，B正确；经过5次循环后会产生25＝32个DNA分子，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段有32－10＝22个，C正确；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。]
5．D [dTCTP基因经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，因此需要相同的限制酶切割载体，产生相同的黏性末端，A正确；由题意可知，从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，最终获得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是该项研究中的目的基因，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，C正确；利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，构建基因表达载体，D错误。]
6．D [在琼脂糖凝胶中的迁移速率最终取决于分子的大小，X基因和重组质粒分子大小不同，所以迁移速率不同，A正确；将重组质粒导入大肠杆菌前，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)和LacZ基因，所以导入并表达成功后的大肠杆菌会对氨苄青霉素有抗性、菌落中出现特定颜色，所以在添加了氨苄青霉素和X gal的培养基上筛选大肠杆菌，C正确；导入X基因会使LacZ基因被破坏，使其不能产生正常的表达产物，所以在含X gal的培养基上的菌落呈白色，D错误。]
7．D [启动子是与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列，所以B基因在水稻卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中无法启动转录，A正确；目的基因获取途径之一就是从cDNA文库中获得，故可从水稻体细胞和精子中提取RNA合成cDNA来获得B基因中编码蛋白的序列，B正确；由于基因表达载体上有Luc基因，其表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，所以在鉴定和筛选转基因植株时，可以检测加入荧光素的该植株卵细胞中是否发出荧光，C正确；卡那霉素抗性基因不在T DNA上，故不能用卡那霉素检测T DNA是否整合到水稻细胞染色体DNA上，应用潮霉素，D错误。]
8．D [电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，这两种限制酶切割产生的DNA片段等长，且只有1个DNA片段，当使用两种限制酶同时切割时，产生两种长度的DNA片段，故该载体最可能是环状DNA，两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由题可知，两种限制酶同时切割时，产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200 bp，最长相距约600 bp，C正确；将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，D错误。]
9．D [将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β 葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，B正确；如果成功导入含有壮观霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗壮观霉素的能力，在含有壮观霉素的培养基上能生存，因此可以筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，D错误。]
10．(每空2分，共14分)(1)需要能量、需要载体蛋白 (2)逆转录 47 Spe Ⅰ、EcoR Ⅰ Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ (3)将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况 (4)水稻细胞内SOS3和SOS2的含量并未增加，转运蛋白SOS1的含量增多，但激活的SOS1数量并未明显增多，SOS1通过SOS信号通路与细胞质内Na＋结合并转运的量没有明显增加
11．(每空2分，共14分)(1)耐高温的DNA聚合酶(和缓冲溶液) 变性 (2)复制原点 BamHⅠ和Sau3AⅠ (3)甲、丁(或抗X、不抗Y) (4)T DNA X抗生素
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