【高考押题卷】2025年高考生物高频易错考前冲刺 基因工程（含解析）
文档属性
| 名称 | 【高考押题卷】2025年高考生物高频易错考前冲刺 基因工程（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.5MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-05-29 11:26:04 | ||
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文档简介
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高考生物考前冲刺押题预测 基因工程
一．选择题（共15小题）
1．（2025 四川模拟）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒
B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株
C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接
D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用Ca2+处理以增大其对周围DNA的吸收
2．下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol L﹣1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至1.14mol L﹣1，用单层滤纸过滤获取析出物
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
3．（2025 广西模拟）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（ ）
A．引物1+引物3 B．引物1+引物2
C．引物2+引物3 D．引物3+引物4
4．（2025 厦门模拟）基因芯片的测序原理是：先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定在玻片的方格中，再与带荧光标记的待测DNA单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列，推出待测序列，如图所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'
5．（2025 浙江模拟）双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'﹣TAGTGCCCATC﹣3'为对照个体的一段序列
B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶
C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
6．（2025 永州模拟）下列有关生物学实验的叙述正确的是（ ）
A．DNA的粗提取与鉴定实验，在常温下DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
B．拜尔实验证明尖端产生的生长素在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长
C．32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳均会被标记
D．电泳鉴定PCR产物时，将电泳缓冲液加入电泳槽要没过凝胶1cm
7．（2025 海陵区校级模拟）研究发现，骨形态发生蛋白2（BMP2）基因的表达与下游一段高度保守的2.1kb调控片段有关。为探究这段2.1kb序列的功能，研究人员设计3个截断体BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3对这段区域进行了全面覆盖，成功构建了含有不同目的片段的重组载体，导入相关受体并检测相关基因的表达活性，结果如图。下列分析不合理的是（ ）
A．BMP2﹣2.1kb的DNA片段中缺乏促进BMP2表达的相关碱基序列
B．调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的
C．BMP2﹣2.1kb的DNA片段不具有增强BMP2基因表达的功能
D．BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均具有增强BMP2表达的功能
8．（2025 河南模拟）表格是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sa3AⅠ
识别序列及切割位点 5′﹣GTY↓RAC﹣3′ 5′﹣AG↓CT﹣3′ 5′﹣G↓GATCC﹣3′ 5′﹣↓GATC﹣3′
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
9．（2025 马鞍山模拟）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
A．T﹣DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
10．（2025 未央区校级一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
11．（2025 宝鸡模拟）水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（ ）
A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异
B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种
C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因
D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组
12．（2025 遵义模拟）生物学相关技术在农牧业、医药卫生和食品工业方面应用广泛。下列相关说法错误的是（ ）
A．将药用蛋白基因导入奶牛乳腺细胞可构建乳腺生物反应器
B．植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作
C．可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞
D．可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞
13．（2025 邵阳模拟）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3﹣GFP基因纯合子小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．在基因表达过程中，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链
B．转录时mRNA的延伸方向从右向左，翻译时先合成GFP蛋白
C．DNA或构成染色体的组蛋白的甲基插入后化等修饰都会影响基因的表达
D．若用引物1和引物3进行PCR，不能鉴定子代是杂合子还是纯合子
14．（2025 广西模拟）通过蛋白质工程可以改造蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因
B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率
15．（2025 浙江模拟）经典的CRISPR﹣Cas9系统可以通过敲除基因实现基因沉默。近日研究人员基于CRISPR系统开发了一个名为CRISPRoff的新型编辑器，可以将甲基（Me）添加在DNA链的特定位点上；研究人员还创建了功能相反的编辑器—CRISPRon，它能逆转基因沉默。下列叙述正确的是（ ）
A．新型编辑器对染色体DNA的效果强于染色质DNA
B．CRISPRoff利用基因突变来实现基因沉默
C．CRISPRoff对基因的影响不能遗传给后代
D．CRISPRon有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达
二．解答题（共5小题）
16．（2025 喀什地区一模）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5'→3'方向，■代表突变碱基。
回答下列问题。
（1）以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是 、 。
（2）步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是 ，原因是 。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为 。
（4）上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→ →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或 →获得所需要的蛋白质。
17．（2025 日照模拟）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y可将磷酸化的M蛋白去磷酸化。为筛选更高效的酶Y，研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）拼接出3种融合基因如图1，分别导入大肠杆菌（同时缺失X基因和Y基因）后构建代谢通路。
（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，其原因可能是 。
（2）用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从具有 特征的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，然后在不同泳道中添加相关物质，添加情况与X蛋白的表达情况如图2所示。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道 （填图中序号）是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y，原因是 。
18．（2025 安阳一模）外泌体是一种大小为30～100nm的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如图所示（AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63﹣iRFP682基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63﹣iRFP682基因、质粒分别用 、 酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是 。
（2）PCR扩增CD63﹣iRFP682基因的过程中，设计的引物序列为 、 。若将该基因片段扩增6次，则消耗 个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH为 。检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是 。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是 。
19．（2025 渭南模拟）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶（增大蛋白质的溶解性）的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：
（1）过程①应用了PCR技术，利用PCR技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2+，其原因是 。PCR反应过程可在PCR扩增仪中自动完成，而后常用 来鉴定PCR的产物。
（2）完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K质粒重组，这个过程称为 。据图分析，该过程中最好选择限制酶 切割。
（3）结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。
（4）研究人员最终选择酵母菌作为重组质粒的受体细胞来生产PG酶，原因是酵母菌含有 （答出2种）等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是 。
20．（2025 东湖区校级一模）血清白蛋白（HSA）由肝细胞合成并分泌入血，可作为血浆容量扩充剂，常用于烫伤烧伤、失血过多而休克、癌症、手术后的输液等。我国科研团队利用转基因水稻生产的人血清白蛋白，已获批准进入临床研究阶段。回答下列问题：
（1）研究发现，HSA基因中仅有极少部分序列用于HSA的表达，因此可以从 中提取总mRNA，利用 酶获得cDNA并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在获得的cDNA转录所用模板链的5'端和3'端方向分别添加 和 。
（2）科研团队利用农杆菌转化法将上述添加好的HSA基因导入水稻愈伤组织，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的 中，该部位按顺时针方向分别有HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点（两酶切割后所得黏性末端不同）。但所获HSA基因中不含这两种酶的酶切位点，为了便于和载体的连接，还需要在HSA基因首尾两端添加相应序列，下列添加方法正确的是 ，并说明理由： 。
A．HSA基因首尾两端都添加HindⅢ或EcoRⅠ的识别序列
B．在HSA基因首尾两端分别添加HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．在HSA基因首尾两端分别添加EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列
D．选项B和C两种添加方法都可以
高考生物考前冲刺押题预测 基因工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共15小题）
1．（2025 四川模拟）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒
B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株
C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接
D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用Ca2+处理以增大其对周围DNA的吸收
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、若用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，会破使质粒上的启动子被切除，使目的基因无法正常表达，所以不能用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，A错误；
B、从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株，可能是导入了普通质粒（不含目的基因）的菌株，不一定是导入了重组质粒（含有目的基因）的目的菌株，还需要进一步鉴定，B错误；
C、E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能防止目的基因的反向连接，C错误；
D、将重组质粒导入细菌（如大肠杆菌）的过程中，用Ca2+处理细菌，可使其成为感受态细胞，增大其对周围DNA的吸收能力，有利于重组质粒进入细菌细胞，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
2．下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol L﹣1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至1.14mol L﹣1，用单层滤纸过滤获取析出物
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
【考点】DNA的粗提取与鉴定．
【专题】提取类实验；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】A
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理：①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度变化而改变的，当NaCl的浓度为0.14mol L﹣1时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出；②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液，利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；③DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同：洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对DNA没有影响，蛋白质不能耐受较高温度，在81℃条件下会变性，而DNA对温度的耐受性较高；⑤DNA的鉴定：DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【解答】解：A、2mol L﹣1NaCl溶液溶解DNA，缓缓加入蒸馏水使得NaCl溶液浓度降低，则DNA不断析出，DNA丝状物不再增加时，此时NaCl溶液的浓度为0.14 mol L﹣1；如继续加蒸馏水，DNA的溶解度增加，DNA丝状物量减少，故粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是蒸馏水加多了，A正确；
B、在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，DNA溶解在滤液中，过滤后不能丢弃滤液，B错误；
C、用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol L﹣1的浓度，此时DNA溶解度最低，DNA大量析出，过滤时应该用纱布，不能用滤纸，C错误；
D、将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，需要水浴加热观察染色变化，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查DNA的粗提取和鉴定，要求学生能结合所学知识正确作答。
3．（2025 广西模拟）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（ ）
A．引物1+引物3 B．引物1+引物2
C．引物2+引物3 D．引物3+引物4
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；PCR技术；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应该是扩增包括XplA 和 XplB 基因和两侧T﹣DNA基因片段。
【解答】解：ABCD、分析题图，根据启动子的位置，若相关的基因正确插入，模板链应为甲图中的下链，则引物1应与下链的3'端结合，引物3可以结合甲图中上链的3'端；若XplA和XplB正确插入，则使用引物1+引物3可通过PCR扩增出XplA和XplB基因融合片段；若Xp1A和XplB其中一个或两个反向连接，则通过PCR均无法扩增出Xp1A和XplB融合片段。综上所述，使用引物1+引物3通过PCR可检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的Xp1A和XplB基因，A正确；BCD错误。
故选：A。
【点评】本题考查PCR技术与基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。
4．（2025 厦门模拟）基因芯片的测序原理是：先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定在玻片的方格中，再与带荧光标记的待测DNA单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列，推出待测序列，如图所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；
2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定；
3、题意分析：题干信息：基因芯片测序原理是将已知序列的八核苷酸探针固定在玻片方格中，与带荧光标记的待测DNA单链杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列推出待测序列。
【解答】解：A、上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的原因是已知序列的探针可以与待测DNA单链杂交，A正确；
B、由题干可知是给待测DNA单链标记荧光，若给探针标记荧光，也可通过杂交后检测荧光来确定序列，能达到同样效果，B正确；
C、若不洗去未与探针结合的待测DNA分子，会干扰对与探针结合的待测DNA分子的荧光检测，所以应洗去未结合的，C正确；
D、根据图示，从左到右依次是5号、3号、1号探针与待测DNA单链结合，所以待测序列应该是5'﹣ATACGTTAG﹣3'，而不是5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'，D错误。
故选：D。
【点评】本题结合题图考查基因工程的相关知识，意在考查考生分析题图提取有效信息的能力；能运用所学知识要点，把握知识间内在联系的能力。
5．（2025 浙江模拟）双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'﹣TAGTGCCCATC﹣3'为对照个体的一段序列
B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶
C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术；理解能力．
【答案】A
【分析】依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基。
【解答】解：A、图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'﹣CTACCCGTGAT﹣3'，A错误；
B、PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要解旋酶，高温变性解旋，不需要DNA连接酶，两条链都是连续合成，B正确；
C、在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，C正确；
D、患者的测序结果为5'﹣CTACCTGTGAT﹣3'，对照个体的测序结果为5'﹣CTACCCGTGAT﹣3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查PCR的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
6．（2025 永州模拟）下列有关生物学实验的叙述正确的是（ ）
A．DNA的粗提取与鉴定实验，在常温下DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
B．拜尔实验证明尖端产生的生长素在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长
C．32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳均会被标记
D．电泳鉴定PCR产物时，将电泳缓冲液加入电泳槽要没过凝胶1cm
【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定；噬菌体侵染细菌实验；植物生长素的发现过程．
【专题】正推法；DNA分子结构和复制；从生物材料提取特定成分；PCR技术；理解能力．
【答案】C
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【解答】解：A、DNA与二苯胺试剂在沸水浴条件下呈现蓝色，A错误；
B、拜尔的实验证明胚芽鞘的弯曲生长是“刺激”在尖端下部分布不均匀造成的，没有证明尖端产生了生长素，B错误；
C、32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳（合成的原料氨基酸来源于大肠杆菌）均会被标记，C正确；
D、电泳鉴定PCR产物实验中，电泳时电泳缓冲液一般没过凝胶1mm为宜，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查生物学实验的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
7．（2025 海陵区校级模拟）研究发现，骨形态发生蛋白2（BMP2）基因的表达与下游一段高度保守的2.1kb调控片段有关。为探究这段2.1kb序列的功能，研究人员设计3个截断体BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3对这段区域进行了全面覆盖，成功构建了含有不同目的片段的重组载体，导入相关受体并检测相关基因的表达活性，结果如图。下列分析不合理的是（ ）
A．BMP2﹣2.1kb的DNA片段中缺乏促进BMP2表达的相关碱基序列
B．调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的
C．BMP2﹣2.1kb的DNA片段不具有增强BMP2基因表达的功能
D．BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均具有增强BMP2表达的功能
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；遗传信息的转录和翻译．
【专题】坐标曲线图；遗传信息的转录和翻译；解决问题能力．
【答案】A
【分析】基因的表达即基因控制蛋白质的合成过程包括两个阶段：一是转录，转录是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程；二是翻译，翻译是指以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸排列顺序的蛋白质的过程。
【解答】解：A、3个截断体对2.1kb这段区域进行了全面覆盖，说明BMP2﹣2.1kb的DNA片段中包含了截断片段的所有碱基序列，由截断的片段可以表达说明其含有促进BMP2表达的相关碱基序列，则BMP2﹣2.1kb的DNA片段没有缺乏相关序列，A错误；
B、从截断的片段可以增加表达，而完整片段无法增加表达，说明调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的，B正确；
C、BMP2﹣2.1kb的DNA片段与对照无效片段的结果相似，不具有增强BMP2基因表达的功能，C正确；
D、据图分析，BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均提高了BMP2基因的表达活性，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查基因表达的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
8．（2025 河南模拟）表格是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sa3AⅠ
识别序列及切割位点 5′﹣GTY↓RAC﹣3′ 5′﹣AG↓CT﹣3′ 5′﹣G↓GATCC﹣3′ 5′﹣↓GATC﹣3′
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
【考点】限制性内切核酸酶；DNA连接酶．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】限制酶的特点：识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末端或平末端。
【解答】解：A、限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，形成2个新的游离的磷酸基团，A正确；
B、一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B错误；
C、用AluⅠ切割得到的是平末端，E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接平末端的DNA片段，C错误；
D、BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并切割重组片段，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
9．（2025 马鞍山模拟）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
A．T﹣DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、T﹣DNA插入到水稻染色体DNA中的位置是随机的，可能会破坏原有基因结构，影响该基因表达，A正确；
B、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，据图可知卡那霉素抗性基因在载体的非T﹣DNA区域，即使T﹣DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，B错误；
C、酶都具有专一性，DNA连接酶只能连接两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，因此具有专一性，C错误；
D、目的基因整合到叶绿体中，避免了目的基因通过花粉（有细胞核，不含叶绿体）转移到近缘植物，D错误。
故选：A。
【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握的能力，难度适中。
10．（2025 未央区校级一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】A
【分析】DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60﹣80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
【解答】解：A、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关，A正确；
B、鉴定DNA时，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，B错误；
C、研磨后用单层尼龙纱布过滤，C错误；
D、琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的负极，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
11．（2025 宝鸡模拟）水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（ ）
A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异
B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种
C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因
D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【解答】解：A、真菌为真核生物，能发生基因突变、基因重组和染色体变异，A错误；
B、可以利用基因工程培育具有新性状的生物类型，但不能培育新物种，B错误；
C、变异是不定向的，真菌的持续感染对花生的抗性起到选择作用，不是导致产生了S基因，C错误；
D、利用基因工程技术将S基因的重组DNA导入水稻细胞，经组织培养获得抗病植株，属于基因工程，基因工程的原理是基因重组，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
12．（2025 遵义模拟）生物学相关技术在农牧业、医药卫生和食品工业方面应用广泛。下列相关说法错误的是（ ）
A．将药用蛋白基因导入奶牛乳腺细胞可构建乳腺生物反应器
B．植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作
C．可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞
D．可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、通过显微注射的方法将基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中，构建乳腺生物反应器，A错误；
B、为避免杂菌污染，植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作，B正确；
C、可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞，该过程遵循碱基互补配对原则，C正确；
D、将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法，可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
13．（2025 邵阳模拟）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3﹣GFP基因纯合子小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．在基因表达过程中，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链
B．转录时mRNA的延伸方向从右向左，翻译时先合成GFP蛋白
C．DNA或构成染色体的组蛋白的甲基插入后化等修饰都会影响基因的表达
D．若用引物1和引物3进行PCR，不能鉴定子代是杂合子还是纯合子
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；遗传信息的转录和翻译；表观遗传．
【专题】正推法；遗传信息的转录和翻译；PCR技术；理解能力．
【答案】B
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【解答】解：A、mRNA的延伸方向是5'→3'方向延伸，则转录时mRNA的延伸方向是从左向右，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链，翻译时先合成Gata3蛋白，A正确，B错误；
C、DNA或构成染色体的组蛋白的甲基化等修饰都属于表观遗传的一种方式，都会影响基因的表达，C正确；
D、若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3﹣GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂合子和纯合子，D正确。
故选：B。
【点评】本题考查基因表达和PCR技术的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
14．（2025 广西模拟）通过蛋白质工程可以改造蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因
B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率
【考点】蛋白质工程基本原理．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】1、蛋白质工程的操作过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质。
2、基因工程与蛋白质工程的联系：①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
【解答】解：A、蛋白质工程是通过对基因的改造来实现对蛋白质的改造，并非只改造蛋白质；基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，定向改造生物的遗传性状，A错误；
B、天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的过程与中心法则相反，B错误；
C、蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过改造基因来改造蛋白质，同时也不需要改造所有的氨基酸序列，C错误；
D、蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率，D正确。
故选：D。
【点评】本题主要考查蛋白质工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
15．（2025 浙江模拟）经典的CRISPR﹣Cas9系统可以通过敲除基因实现基因沉默。近日研究人员基于CRISPR系统开发了一个名为CRISPRoff的新型编辑器，可以将甲基（Me）添加在DNA链的特定位点上；研究人员还创建了功能相反的编辑器—CRISPRon，它能逆转基因沉默。下列叙述正确的是（ ）
A．新型编辑器对染色体DNA的效果强于染色质DNA
B．CRISPRoff利用基因突变来实现基因沉默
C．CRISPRoff对基因的影响不能遗传给后代
D．CRISPRon有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；遗传信息的转录和翻译．
【专题】模式图；遗传信息的转录和翻译；理解能力．
【答案】D
【分析】表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表现型却发生了改变，如DNA的甲基化，甲基化的基因不能与RNA聚合酶结合，故无法进行转录产生mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。
【解答】解：A、新型编辑器可将甲基添加在DNA链的特定位点上，而由于染色体螺旋化程度高，故新型编辑器对染色体DNA的效果低于染色质DNA，A错误；
B、CRISPRoff没有导致碱基对增添、替换或缺失，其引起的改变不属于基因突变，B错误；
C、RISPRoff对基因的影响属于表观遗传，能够遗传给后代，C错误；
D、CRISPRon能逆转基因沉默，即有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因表达的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
二．解答题（共5小题）
16．（2025 喀什地区一模）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5'→3'方向，■代表突变碱基。
回答下列问题。
（1）以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是 a和c 、 b和d 。
（2）步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是 Y ，原因是 DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链 。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为 a和d 。
（4）上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→ 推测应有的氨基酸序列 →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或 合成新的基因 →获得所需要的蛋白质。
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；蛋白质工程基本原理．
【专题】图文信息类简答题；PCR技术；理解能力．
【答案】（1）a和c b和d
（2）Y DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链
（3）a和d
（4）推测应有的氨基酸序列 合成新的基因
【分析】PCR技术，需要一对引物，三个步骤循环主要控制的是温度，控制温度的目的是为了控制解旋、复性、延伸过程，以及保证酶活性。
【解答】解：（1）DNA子链的延伸方向为5'→3'，DNA聚合酶从引物的3'方向开始连接脱氧核苷酸，以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应，若经步骤①获得乙片段，则需要在步骤①时加入引物说明a和c，若惊步骤②获得片段丙，则需要在步骤②时加入引物b和d。
（2）DNA聚合酶只能从引物的3'方向开始连接脱氧核苷酸，即DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链，对比X和Y的方向可知，DNA聚合酶能从Y的右侧继续催化延伸子链形成DNA片段丁。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因（与丁相同）时，应选用a和d作为PCR引物才能扩增出完整的丁片段。
（4）蛋白质工程技术的基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，蛋白质工程又被称为“第二代基因工程”。
故答案为：
（1）a和c b和d
（2）Y DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链
（3）a和d
（4）推测应有的氨基酸序列 合成新的基因
【点评】本题考查PCR技术的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
17．（2025 日照模拟）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y可将磷酸化的M蛋白去磷酸化。为筛选更高效的酶Y，研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）拼接出3种融合基因如图1，分别导入大肠杆菌（同时缺失X基因和Y基因）后构建代谢通路。
（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 4 。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，其原因可能是 融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况 。
（2）用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从具有 绿色荧光 特征的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，然后在不同泳道中添加相关物质，添加情况与X蛋白的表达情况如图2所示。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道 ① （填图中序号）是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 ③ 区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y，原因是 表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快） 。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；理解能力．
【答案】（1）4；融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况
（2）绿色荧光；①
（3）③；表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取
方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建
是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为4，这4种分别为引物1和2、引物1和4、引物3和2、引物3和4扩增出来的DNA片段。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，则原因可能是融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况，即正向连接和反向连接导致的PCR结果不同。
（2）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，因此，用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从表现绿色荧光的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，因为带有绿色荧光的大肠杆菌是成功导入目的基因的大肠杆菌。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道①是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性，因为酶X在消耗ATP的情况下会使M蛋白磷酸化。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，导入融合基因b会导致细菌生长被抑制，因而对应①，导入融合基因b的大肠杆菌和导入空白质粒的大肠杆菌表现为正常生长，菌落较大，位于②或④区域，导入融合基因a的大肠杆菌，由于同时导入基因X和Y，由于Y基因编码的酶Y会使磷酸化的M蛋白去磷酸化，因而对大肠杆菌的生长抑制有所缓解，因而对应图中的③，即导入融合基因a的工程菌被接种在图中的③区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好，菌落较大，因此应从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y。
故答案为：
（1）4；融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况
（2）绿色荧光；①
（3）③；表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快）
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
18．（2025 安阳一模）外泌体是一种大小为30～100nm的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如图所示（AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63﹣iRFP682基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63﹣iRFP682基因、质粒分别用 BamHⅠ、EcoRⅠ 、 BglⅡ、EcoRⅠ 酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是 与RNA聚合酶结合，驱动转录 。
（2）PCR扩增CD63﹣iRFP682基因的过程中，设计的引物序列为 5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3' 、 5'﹣AGATCTGAATTC﹣3' 。若将该基因片段扩增6次，则消耗 126 个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH为 7.2～7.4 。检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是 在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光 。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是 抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合） 。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）BamHⅠ、EcoRⅠ；BglⅡ、EcoRⅠ；与RNA聚合酶结合，驱动转录
（2）5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'；5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；126
（3）7.2～7.4；在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光
（4）抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合）
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；启动子：启动转录，终止子：终止转录。
【解答】解：（1）NotⅠ位于目的基因内部，用NotⅠ会破坏目的基因，不能选，为了避免目的基因及质粒自连，选用不同的黏性末端的酶来切目的基因和质粒，故切割质粒的酶只能选为BglⅢ和EcoRⅠ。由于BamHⅠ和BglⅢ产生的的黏性末端相同，不能选BglⅢ，因此选用BamHⅠ和EcoRⅠ来切割目的基因。启动子具有调控基因转录的功能，能与RNA聚合酶结合，驱动转录。
（2）引物是人们根据已知的DNA序列人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与目的基因一条DNA模板链的3'端互补，另一个引物与目的基因另一条DNA模板链的3'端互补，即引物为5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'、5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；采用PCR技术扩增CBHⅡ基因时需要根据CBHⅡ基因两端的碱基（核苷酸）序列设计2种引物，假设DNA复制6轮，子代DNA共有2n+1条链，因亲代DNA的两条母链不需要引物，故需要引物2n+1﹣2＝27﹣2＝126个。
（3）动物细胞培养的pH为7.2﹣7.4，因此癌细胞培养过程中的pH为7.2﹣7.4；含有近红外荧光蛋白iRFP682基因能表达出红外荧光蛋白，因此检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是在近红外灯下观家细胞是否出现红色荧光。
（4）若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，会形成相应的蛋白质，该蛋白质作为抗原注入兔子体内，会使兔子分泌相应的抗体，而该抗体会与该蛋白质发生抗原﹣抗体结合反应，形成特异性条带。
故答案为：
（1）BamHⅠ、EcoRⅠ；BglⅡ、EcoRⅠ；与RNA聚合酶结合，驱动转录
（2）5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'；5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；126
（3）7.2～7.4；在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光
（4）抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合）
【点评】本题主要考查了基因工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
19．（2025 渭南模拟）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶（增大蛋白质的溶解性）的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：
（1）过程①应用了PCR技术，利用PCR技术扩增时，需要 2 种引物，引物的作用是 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2+，其原因是 DNA聚合酶需要Mg2+激活 。PCR反应过程可在PCR扩增仪中自动完成，而后常用 琼脂糖凝胶电泳 来鉴定PCR的产物。
（2）完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K质粒重组，这个过程称为 基因表达载体的构建 。据图分析，该过程中最好选择限制酶 BglⅠ和NotI 切割。
（3）结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。
（4）研究人员最终选择酵母菌作为重组质粒的受体细胞来生产PG酶，原因是酵母菌含有 内质网和高尔基体 （答出2种）等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是 发酵罐内发酵 。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；理解能力．
【答案】（1）2 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶需要Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳
（2）基因表达载体的构建 BglⅠ和NotI
（3）利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒
（4）内质网和高尔基体 发酵罐内发酵
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：（1）利用PCR技术扩增时，DNA聚合酶不能从DNA链的一端直接开始合成子链，需要在反应体系中添加2种引物，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶需要Mg2+激活，故一般还需要往PCR反应缓冲液中加入适量的Mg2+。PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，PCR的产物的分子量大小等不同，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
（2）过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在此之前需要先构建基因表达载体，即将PG酶基因与pPIC9K质粒重组。在构建基因表达载体时，需要用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割质粒和目的基因，根据图1和图2分析，PG酶基因两端序列分别含有BglⅠ和NotI识别位点，故最好选择限制酶BglⅠ和Notl切割能产生和目的基因相同的末端。
（3）大肠杆菌繁殖速度快，将重组质粒导入大肠杆菌内，短时间内可获取大量的重组质粒。
（4）分泌蛋白合成加工过程涉及到的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体和线粒体。酵母菌是真核生物，含有内质网和高尔基体等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵。
故答案为：
（1）2 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶需要Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳
（2）基因表达载体的构建 BglⅠ和NotI
（3）利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒
（4）内质网和高尔基体 发酵罐内发酵
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
20．（2025 东湖区校级一模）血清白蛋白（HSA）由肝细胞合成并分泌入血，可作为血浆容量扩充剂，常用于烫伤烧伤、失血过多而休克、癌症、手术后的输液等。我国科研团队利用转基因水稻生产的人血清白蛋白，已获批准进入临床研究阶段。回答下列问题：
（1）研究发现，HSA基因中仅有极少部分序列用于HSA的表达，因此可以从 肝细胞 中提取总mRNA，利用 逆转录 酶获得cDNA并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在获得的cDNA转录所用模板链的5'端和3'端方向分别添加 终止子 和 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子 。
（2）科研团队利用农杆菌转化法将上述添加好的HSA基因导入水稻愈伤组织，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的 T﹣DNA 中，该部位按顺时针方向分别有HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点（两酶切割后所得黏性末端不同）。但所获HSA基因中不含这两种酶的酶切位点，为了便于和载体的连接，还需要在HSA基因首尾两端添加相应序列，下列添加方法正确的是 D ，并说明理由： 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达 。
A．HSA基因首尾两端都添加HindⅢ或EcoRⅠ的识别序列
B．在HSA基因首尾两端分别添加HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．在HSA基因首尾两端分别添加EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列
D．选项B和C两种添加方法都可以
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）肝细胞 逆转录 终止子 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子
（2）T﹣DNA D 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达
【分析】基因工程的操作步骤：
（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【解答】解：（1）HSA由肝细胞合成，因此可以从肝细胞中提取总mRNA，利用逆转录酶获得cDNA，并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。该方法获得的基因不含启动子和终止子，因此为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在cDNA转录时所用模板链的5'端和3'端分别添加终止子和水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子，因为转录时mRNA延伸方向为5'端到3'端，和模板链反向，RNA聚合酶结合位点（启动子）应位于模板链的3'端。
（2）T﹣DNA是可转移的DNA，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的T﹣DNA中。在HSA基因首尾两端需添加不同限制酶识别序列，酶切形成不同的黏性末端，以防止目的基因的自身环化。因上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达，所以EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列可以任意连接到HSA基因首尾两端，D正确，ABC错误。
故选：D。
故答案为：
（1）肝细胞 逆转录 终止子 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子
（2）T﹣DNA D 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
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高考生物考前冲刺押题预测 基因工程
一．选择题（共15小题）
1．（2025 四川模拟）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒
B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株
C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接
D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用Ca2+处理以增大其对周围DNA的吸收
2．下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol L﹣1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至1.14mol L﹣1，用单层滤纸过滤获取析出物
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
3．（2025 广西模拟）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（ ）
A．引物1+引物3 B．引物1+引物2
C．引物2+引物3 D．引物3+引物4
4．（2025 厦门模拟）基因芯片的测序原理是：先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定在玻片的方格中，再与带荧光标记的待测DNA单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列，推出待测序列，如图所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'
5．（2025 浙江模拟）双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'﹣TAGTGCCCATC﹣3'为对照个体的一段序列
B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶
C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
6．（2025 永州模拟）下列有关生物学实验的叙述正确的是（ ）
A．DNA的粗提取与鉴定实验，在常温下DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
B．拜尔实验证明尖端产生的生长素在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长
C．32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳均会被标记
D．电泳鉴定PCR产物时，将电泳缓冲液加入电泳槽要没过凝胶1cm
7．（2025 海陵区校级模拟）研究发现，骨形态发生蛋白2（BMP2）基因的表达与下游一段高度保守的2.1kb调控片段有关。为探究这段2.1kb序列的功能，研究人员设计3个截断体BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3对这段区域进行了全面覆盖，成功构建了含有不同目的片段的重组载体，导入相关受体并检测相关基因的表达活性，结果如图。下列分析不合理的是（ ）
A．BMP2﹣2.1kb的DNA片段中缺乏促进BMP2表达的相关碱基序列
B．调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的
C．BMP2﹣2.1kb的DNA片段不具有增强BMP2基因表达的功能
D．BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均具有增强BMP2表达的功能
8．（2025 河南模拟）表格是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sa3AⅠ
识别序列及切割位点 5′﹣GTY↓RAC﹣3′ 5′﹣AG↓CT﹣3′ 5′﹣G↓GATCC﹣3′ 5′﹣↓GATC﹣3′
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
9．（2025 马鞍山模拟）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
A．T﹣DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
10．（2025 未央区校级一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
11．（2025 宝鸡模拟）水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（ ）
A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异
B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种
C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因
D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组
12．（2025 遵义模拟）生物学相关技术在农牧业、医药卫生和食品工业方面应用广泛。下列相关说法错误的是（ ）
A．将药用蛋白基因导入奶牛乳腺细胞可构建乳腺生物反应器
B．植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作
C．可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞
D．可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞
13．（2025 邵阳模拟）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3﹣GFP基因纯合子小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．在基因表达过程中，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链
B．转录时mRNA的延伸方向从右向左，翻译时先合成GFP蛋白
C．DNA或构成染色体的组蛋白的甲基插入后化等修饰都会影响基因的表达
D．若用引物1和引物3进行PCR，不能鉴定子代是杂合子还是纯合子
14．（2025 广西模拟）通过蛋白质工程可以改造蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因
B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率
15．（2025 浙江模拟）经典的CRISPR﹣Cas9系统可以通过敲除基因实现基因沉默。近日研究人员基于CRISPR系统开发了一个名为CRISPRoff的新型编辑器，可以将甲基（Me）添加在DNA链的特定位点上；研究人员还创建了功能相反的编辑器—CRISPRon，它能逆转基因沉默。下列叙述正确的是（ ）
A．新型编辑器对染色体DNA的效果强于染色质DNA
B．CRISPRoff利用基因突变来实现基因沉默
C．CRISPRoff对基因的影响不能遗传给后代
D．CRISPRon有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达
二．解答题（共5小题）
16．（2025 喀什地区一模）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5'→3'方向，■代表突变碱基。
回答下列问题。
（1）以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是 、 。
（2）步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是 ，原因是 。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为 。
（4）上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→ →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或 →获得所需要的蛋白质。
17．（2025 日照模拟）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y可将磷酸化的M蛋白去磷酸化。为筛选更高效的酶Y，研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）拼接出3种融合基因如图1，分别导入大肠杆菌（同时缺失X基因和Y基因）后构建代谢通路。
（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，其原因可能是 。
（2）用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从具有 特征的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，然后在不同泳道中添加相关物质，添加情况与X蛋白的表达情况如图2所示。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道 （填图中序号）是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y，原因是 。
18．（2025 安阳一模）外泌体是一种大小为30～100nm的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如图所示（AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63﹣iRFP682基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63﹣iRFP682基因、质粒分别用 、 酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是 。
（2）PCR扩增CD63﹣iRFP682基因的过程中，设计的引物序列为 、 。若将该基因片段扩增6次，则消耗 个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH为 。检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是 。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是 。
19．（2025 渭南模拟）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶（增大蛋白质的溶解性）的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：
（1）过程①应用了PCR技术，利用PCR技术扩增时，需要 种引物，引物的作用是 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2+，其原因是 。PCR反应过程可在PCR扩增仪中自动完成，而后常用 来鉴定PCR的产物。
（2）完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K质粒重组，这个过程称为 。据图分析，该过程中最好选择限制酶 切割。
（3）结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。
（4）研究人员最终选择酵母菌作为重组质粒的受体细胞来生产PG酶，原因是酵母菌含有 （答出2种）等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是 。
20．（2025 东湖区校级一模）血清白蛋白（HSA）由肝细胞合成并分泌入血，可作为血浆容量扩充剂，常用于烫伤烧伤、失血过多而休克、癌症、手术后的输液等。我国科研团队利用转基因水稻生产的人血清白蛋白，已获批准进入临床研究阶段。回答下列问题：
（1）研究发现，HSA基因中仅有极少部分序列用于HSA的表达，因此可以从 中提取总mRNA，利用 酶获得cDNA并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在获得的cDNA转录所用模板链的5'端和3'端方向分别添加 和 。
（2）科研团队利用农杆菌转化法将上述添加好的HSA基因导入水稻愈伤组织，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的 中，该部位按顺时针方向分别有HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点（两酶切割后所得黏性末端不同）。但所获HSA基因中不含这两种酶的酶切位点，为了便于和载体的连接，还需要在HSA基因首尾两端添加相应序列，下列添加方法正确的是 ，并说明理由： 。
A．HSA基因首尾两端都添加HindⅢ或EcoRⅠ的识别序列
B．在HSA基因首尾两端分别添加HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．在HSA基因首尾两端分别添加EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列
D．选项B和C两种添加方法都可以
高考生物考前冲刺押题预测 基因工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共15小题）
1．（2025 四川模拟）幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性参与调控其致病性。为了研究MreB基因对脲酶活性的具体影响，科学家将该基因导入能合成脲酶且无抗生素抗性的另一种细菌中，所用质粒和目的基因如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．为了将MreB基因定向插入到质粒中，可选SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒
B．从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株即为目的菌株
C．用E.coliDNA连接酶构建重组载体能有效防止目的基因的反向连接
D．将重组质粒导入细菌的过程中，需用Ca2+处理以增大其对周围DNA的吸收
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、若用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，会破使质粒上的启动子被切除，使目的基因无法正常表达，所以不能用SamⅠ和EcoRⅠ切割质粒，A错误；
B、从卡那霉素选择培养基上生长的菌落中挑取的菌株，可能是导入了普通质粒（不含目的基因）的菌株，不一定是导入了重组质粒（含有目的基因）的目的菌株，还需要进一步鉴定，B错误；
C、E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能防止目的基因的反向连接，C错误；
D、将重组质粒导入细菌（如大肠杆菌）的过程中，用Ca2+处理细菌，可使其成为感受态细胞，增大其对周围DNA的吸收能力，有利于重组质粒进入细菌细胞，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
2．下列利用菜花进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是向2mol L﹣1NaCl溶液中加入蒸馏水过多
B．在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，过滤后弃去滤液
C．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至1.14mol L﹣1，用单层滤纸过滤获取析出物
D．将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化
【考点】DNA的粗提取与鉴定．
【专题】提取类实验；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】A
【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理：①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度变化而改变的，当NaCl的浓度为0.14mol L﹣1时，DNA的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出；②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液，利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA；③DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同：洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对DNA没有影响，蛋白质不能耐受较高温度，在81℃条件下会变性，而DNA对温度的耐受性较高；⑤DNA的鉴定：DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
【解答】解：A、2mol L﹣1NaCl溶液溶解DNA，缓缓加入蒸馏水使得NaCl溶液浓度降低，则DNA不断析出，DNA丝状物不再增加时，此时NaCl溶液的浓度为0.14 mol L﹣1；如继续加蒸馏水，DNA的溶解度增加，DNA丝状物量减少，故粗提取DNA时观察到丝状物偏少，可能是蒸馏水加多了，A正确；
B、在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，充分研磨，DNA溶解在滤液中，过滤后不能丢弃滤液，B错误；
C、用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol L﹣1的浓度，此时DNA溶解度最低，DNA大量析出，过滤时应该用纱布，不能用滤纸，C错误；
D、将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，需要水浴加热观察染色变化，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查DNA的粗提取和鉴定，要求学生能结合所学知识正确作答。
3．（2025 广西模拟）现将XplA和XplB两种能降解弹药使用后残留的危险污染物的基因转入实弹射击场的柳枝稷草中。若要通过PCR检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA和XplB基因，应选择的引物组合是（ ）
A．引物1+引物3 B．引物1+引物2
C．引物2+引物3 D．引物3+引物4
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；PCR技术；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的XplA 和 XplB 基因，应该是扩增包括XplA 和 XplB 基因和两侧T﹣DNA基因片段。
【解答】解：ABCD、分析题图，根据启动子的位置，若相关的基因正确插入，模板链应为甲图中的下链，则引物1应与下链的3'端结合，引物3可以结合甲图中上链的3'端；若XplA和XplB正确插入，则使用引物1+引物3可通过PCR扩增出XplA和XplB基因融合片段；若Xp1A和XplB其中一个或两个反向连接，则通过PCR均无法扩增出Xp1A和XplB融合片段。综上所述，使用引物1+引物3通过PCR可检测所获转基因柳枝稷草中是否含有正确插入的Xp1A和XplB基因，A正确；BCD错误。
故选：A。
【点评】本题考查PCR技术与基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。
4．（2025 厦门模拟）基因芯片的测序原理是：先将各不相同的已知序列的八核苷酸探针分别固定在玻片的方格中，再与带荧光标记的待测DNA单链进行杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列，推出待测序列，如图所示。
下列叙述错误的是（ ）
A．上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的
B．通过给探针标记荧光也可达到与上图同样的效果
C．应洗去未与探针结合的待测DNA分子后再检测荧光
D．根据图示结果可推出待测序列为5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】1、基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品；
2、基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定；
3、题意分析：题干信息：基因芯片测序原理是将已知序列的八核苷酸探针固定在玻片方格中，与带荧光标记的待测DNA单链杂交，通过确定荧光强度最强的探针位置与对应序列推出待测序列。
【解答】解：A、上述测序方法是基于DNA﹣DNA分子杂交实现的原因是已知序列的探针可以与待测DNA单链杂交，A正确；
B、由题干可知是给待测DNA单链标记荧光，若给探针标记荧光，也可通过杂交后检测荧光来确定序列，能达到同样效果，B正确；
C、若不洗去未与探针结合的待测DNA分子，会干扰对与探针结合的待测DNA分子的荧光检测，所以应洗去未结合的，C正确；
D、根据图示，从左到右依次是5号、3号、1号探针与待测DNA单链结合，所以待测序列应该是5'﹣ATACGTTAG﹣3'，而不是5'﹣GATCTAACGTAT﹣3'，D错误。
故选：D。
【点评】本题结合题图考查基因工程的相关知识，意在考查考生分析题图提取有效信息的能力；能运用所学知识要点，把握知识间内在联系的能力。
5．（2025 浙江模拟）双脱氧测序法（Sangtr法）是第一代DNA测序方法。在4支试管中分别加入4种dNTP和少量的1种ddNTP进行PCR，再把PCR产物变性，利用电泳进行分离，根据结果确定特定碱基的位置。通过该方法测定并比较某疾病患者与对照个体DNA模板链的一段碱基序列，结果如图所示。下列叙述错误的是（ ）
注：dNTP是PCR的四种原料；双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）有ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP四种；在DNA聚合酶作用下，ddNTP与dNTP竞争核苷酸链延长位点，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为dATP，继续延伸
A．5'﹣TAGTGCCCATC﹣3'为对照个体的一段序列
B．PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要DNA解旋酶和DNA连接酶
C．上述PCR反应体系中模板链需要足够多
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术；理解能力．
【答案】A
【分析】依据双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带（DNA片段）的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带（DNA片段）的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基。
【解答】解：A、图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5'﹣CTACCCGTGAT﹣3'，A错误；
B、PCR过程中需要DNA聚合酶，不需要解旋酶，高温变性解旋，不需要DNA连接酶，两条链都是连续合成，B正确；
C、在进行序列时，模板量的数量需要足够多，以确保测序的准确性和可测性。如果模板DNA量不足，可能会导致测序结果不准确或无法进行，C正确；
D、患者的测序结果为5'﹣CTACCTGTGAT﹣3'，对照个体的测序结果为5'﹣CTACCCGTGAT﹣3'，对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查PCR的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
6．（2025 永州模拟）下列有关生物学实验的叙述正确的是（ ）
A．DNA的粗提取与鉴定实验，在常温下DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
B．拜尔实验证明尖端产生的生长素在其下部分布不均匀造成胚芽鞘弯曲生长
C．32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳均会被标记
D．电泳鉴定PCR产物时，将电泳缓冲液加入电泳槽要没过凝胶1cm
【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定；噬菌体侵染细菌实验；植物生长素的发现过程．
【专题】正推法；DNA分子结构和复制；从生物材料提取特定成分；PCR技术；理解能力．
【答案】C
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【解答】解：A、DNA与二苯胺试剂在沸水浴条件下呈现蓝色，A错误；
B、拜尔的实验证明胚芽鞘的弯曲生长是“刺激”在尖端下部分布不均匀造成的，没有证明尖端产生了生长素，B错误；
C、32P标记的T2噬菌体侵染35S标记的大肠杆菌后，子代噬菌体的蛋白质外壳（合成的原料氨基酸来源于大肠杆菌）均会被标记，C正确；
D、电泳鉴定PCR产物实验中，电泳时电泳缓冲液一般没过凝胶1mm为宜，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查生物学实验的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
7．（2025 海陵区校级模拟）研究发现，骨形态发生蛋白2（BMP2）基因的表达与下游一段高度保守的2.1kb调控片段有关。为探究这段2.1kb序列的功能，研究人员设计3个截断体BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3对这段区域进行了全面覆盖，成功构建了含有不同目的片段的重组载体，导入相关受体并检测相关基因的表达活性，结果如图。下列分析不合理的是（ ）
A．BMP2﹣2.1kb的DNA片段中缺乏促进BMP2表达的相关碱基序列
B．调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的
C．BMP2﹣2.1kb的DNA片段不具有增强BMP2基因表达的功能
D．BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均具有增强BMP2表达的功能
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；遗传信息的转录和翻译．
【专题】坐标曲线图；遗传信息的转录和翻译；解决问题能力．
【答案】A
【分析】基因的表达即基因控制蛋白质的合成过程包括两个阶段：一是转录，转录是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程；二是翻译，翻译是指以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸排列顺序的蛋白质的过程。
【解答】解：A、3个截断体对2.1kb这段区域进行了全面覆盖，说明BMP2﹣2.1kb的DNA片段中包含了截断片段的所有碱基序列，由截断的片段可以表达说明其含有促进BMP2表达的相关碱基序列，则BMP2﹣2.1kb的DNA片段没有缺乏相关序列，A错误；
B、从截断的片段可以增加表达，而完整片段无法增加表达，说明调控区不同长度的片段对BMP2表达调控的效果可能是相反的，B正确；
C、BMP2﹣2.1kb的DNA片段与对照无效片段的结果相似，不具有增强BMP2基因表达的功能，C正确；
D、据图分析，BMP2﹣1、BMP2﹣2和BMP2﹣3的DNA片段均提高了BMP2基因的表达活性，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查基因表达的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
8．（2025 河南模拟）表格是几种限制酶的识别序列及切割位点（Y＝C或T，R＝A或G）。下列相关叙述正确的是（ ）
限制酶 HindⅡ AluⅠ BamHⅠ Sa3AⅠ
识别序列及切割位点 5′﹣GTY↓RAC﹣3′ 5′﹣AG↓CT﹣3′ 5′﹣G↓GATCC﹣3′ 5′﹣↓GATC﹣3′
A．限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，增加2个游离的磷酸基团
B．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列，并在特定位点切割
C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA连接酶连接
D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能识别并切割
【考点】限制性内切核酸酶；DNA连接酶．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】限制酶的特点：识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的位点进行切割，切割后可能形成黏性末端或平末端。
【解答】解：A、限制酶切割一次需切断2个磷酸二酯键，形成2个新的游离的磷酸基团，A正确；
B、一种限制酶不一定只识别一种核苷酸序列，如HindⅡ，B错误；
C、用AluⅠ切割得到的是平末端，E.coliDNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接平末端的DNA片段，C错误；
D、BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段进行重组后，BamHⅠ不能识别并切割重组片段，而Sau3AⅠ可识别并切割重组片段，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
9．（2025 马鞍山模拟）为提高水稻的产量，科研人员将四种基因（EcCAT、OsGLO1、EcGCL、TSR）与叶绿体转运肽基因连接，构建多基因表达载体，引导合成的蛋白质定向运输至叶绿体，从而在水稻叶绿体内构建了一条新的代谢途径。下列说法正确的是（ ）
A．T﹣DNA插入到水稻的染色体DNA中可能会影响水稻自身基因的表达
B．含卡那霉素的培养基上不能存活的水稻细胞未成功导入四种目的基因
C．限制酶识别特定的序列具有专一性，DNA连接酶不具有专一性
D．目的基因产物转运至叶绿体，避免了目的基因通过花粉转移到近缘植物
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、T﹣DNA插入到水稻染色体DNA中的位置是随机的，可能会破坏原有基因结构，影响该基因表达，A正确；
B、含卡那霉素的培养基上不能存活的植物受体细胞可能未成功导入载体，但不能确定未成功导入四种目的基因，据图可知卡那霉素抗性基因在载体的非T﹣DNA区域，即使T﹣DNA携带目的基因导入成功，卡那霉素抗性基因也不会导入，B错误；
C、酶都具有专一性，DNA连接酶只能连接两个DNA片段，催化形成磷酸二酯键，因此具有专一性，C错误；
D、目的基因整合到叶绿体中，避免了目的基因通过花粉（有细胞核，不含叶绿体）转移到近缘植物，D错误。
故选：A。
【点评】本题主要考查的是基因工程的操作的相关知识，意在考查学生对基础知识的理解掌握的能力，难度适中。
10．（2025 未央区校级一模）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A．在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象有关
B．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中进行沸水浴
C．选用植物细胞提取DNA时，研磨后用滤纸进行过滤
D．琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的正极
【考点】DNA的粗提取与鉴定；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】A
【分析】DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60﹣80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
【解答】解：A、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关，A正确；
B、鉴定DNA时，将丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，B错误；
C、研磨后用单层尼龙纱布过滤，C错误；
D、琼脂糖凝胶加样孔一端朝向电泳槽的负极，D错误。
故选：A。
【点评】本题考查“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
11．（2025 宝鸡模拟）水稻易被某种真菌感染导致生长不良，有研究发现花生细胞的S基因在抗真菌类病害中发挥着重要作用，这为水稻的改良提供了新的思路。以下叙述正确的是（ ）
A．该种真菌只能发生基因突变和基因重组两种变异
B．利用基因工程改良水稻可产生抗真菌的水稻新物种
C．该种真菌对花生的持续感染导致其产生了S基因
D．将S基因导入水稻使其获得抗病能力属于基因重组
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【解答】解：A、真菌为真核生物，能发生基因突变、基因重组和染色体变异，A错误；
B、可以利用基因工程培育具有新性状的生物类型，但不能培育新物种，B错误；
C、变异是不定向的，真菌的持续感染对花生的抗性起到选择作用，不是导致产生了S基因，C错误；
D、利用基因工程技术将S基因的重组DNA导入水稻细胞，经组织培养获得抗病植株，属于基因工程，基因工程的原理是基因重组，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
12．（2025 遵义模拟）生物学相关技术在农牧业、医药卫生和食品工业方面应用广泛。下列相关说法错误的是（ ）
A．将药用蛋白基因导入奶牛乳腺细胞可构建乳腺生物反应器
B．植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作
C．可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞
D．可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：A、通过显微注射的方法将基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中，构建乳腺生物反应器，A错误；
B、为避免杂菌污染，植物组织培养、动物细胞培养和PCR实验中均需无菌操作，B正确；
C、可用PCR等技术检测编码牛凝乳酶的基因是否导入受体细胞，该过程遵循碱基互补配对原则，C正确；
D、将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法，可采用农杆菌转化法将抗某种除草剂的基因导入农作物细胞，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
13．（2025 邵阳模拟）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3﹣GFP基因纯合子小鼠。下列叙述错误的是（ ）
A．在基因表达过程中，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链
B．转录时mRNA的延伸方向从右向左，翻译时先合成GFP蛋白
C．DNA或构成染色体的组蛋白的甲基插入后化等修饰都会影响基因的表达
D．若用引物1和引物3进行PCR，不能鉴定子代是杂合子还是纯合子
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；遗传信息的转录和翻译；表观遗传．
【专题】正推法；遗传信息的转录和翻译；PCR技术；理解能力．
【答案】B
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【解答】解：A、mRNA的延伸方向是5'→3'方向延伸，则转录时mRNA的延伸方向是从左向右，Gata3基因和GFP基因共用一条模板链，翻译时先合成Gata3蛋白，A正确，B错误；
C、DNA或构成染色体的组蛋白的甲基化等修饰都属于表观遗传的一种方式，都会影响基因的表达，C正确；
D、若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3﹣GFP基因纯合子都能扩增出相应的片段则不能区分杂合子和纯合子，D正确。
故选：B。
【点评】本题考查基因表达和PCR技术的相关内容，要求学生能结合所学知识正确作答。
14．（2025 广西模拟）通过蛋白质工程可以改造蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。下列叙述正确的是（ ）
A．蛋白质工程只需要改造蛋白质，基因工程只需要改造基因
B．天然蛋白质的合成过程与蛋白质工程的过程完全相同
C．蛋白质工程要改造蛋白质所有的氨基酸序列
D．蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率
【考点】蛋白质工程基本原理．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】D
【分析】1、蛋白质工程的操作过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质。
2、基因工程与蛋白质工程的联系：①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
【解答】解：A、蛋白质工程是通过对基因的改造来实现对蛋白质的改造，并非只改造蛋白质；基因工程是将一种生物的基因转移到另一种生物体内，定向改造生物的遗传性状，A错误；
B、天然蛋白质的合成过程是按照中心法则进行的，蛋白质工程的过程与中心法则相反，B错误；
C、蛋白质工程不是对蛋白质分子的直接改造，而是通过改造基因来改造蛋白质，同时也不需要改造所有的氨基酸序列，C错误；
D、蛋白质工程可以通过改造蛋白质，改变酶的催化效率，D正确。
故选：D。
【点评】本题主要考查蛋白质工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
15．（2025 浙江模拟）经典的CRISPR﹣Cas9系统可以通过敲除基因实现基因沉默。近日研究人员基于CRISPR系统开发了一个名为CRISPRoff的新型编辑器，可以将甲基（Me）添加在DNA链的特定位点上；研究人员还创建了功能相反的编辑器—CRISPRon，它能逆转基因沉默。下列叙述正确的是（ ）
A．新型编辑器对染色体DNA的效果强于染色质DNA
B．CRISPRoff利用基因突变来实现基因沉默
C．CRISPRoff对基因的影响不能遗传给后代
D．CRISPRon有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；遗传信息的转录和翻译．
【专题】模式图；遗传信息的转录和翻译；理解能力．
【答案】D
【分析】表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表现型却发生了改变，如DNA的甲基化，甲基化的基因不能与RNA聚合酶结合，故无法进行转录产生mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。
【解答】解：A、新型编辑器可将甲基添加在DNA链的特定位点上，而由于染色体螺旋化程度高，故新型编辑器对染色体DNA的效果低于染色质DNA，A错误；
B、CRISPRoff没有导致碱基对增添、替换或缺失，其引起的改变不属于基因突变，B错误；
C、RISPRoff对基因的影响属于表观遗传，能够遗传给后代，C错误；
D、CRISPRon能逆转基因沉默，即有助于基因与RNA聚合酶结合以恢复表达，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因表达的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
二．解答题（共5小题）
16．（2025 喀什地区一模）绿色荧光蛋白（GFP）是由一条肽链组成的蛋白质，通过蛋白质工程技术可获得增强型荧光蛋白。某研究人员设计引物，通过3次PCR反应（一次PCR反应包括多轮循环）将一对突变碱基引入编码GFP的DNA片段（片段甲），获得了编码增强型荧光蛋白的DNA片段（目的基因）。实验过程如图所示，图中a、b、c、d表示引物，→表示5'→3'方向，■代表突变碱基。
回答下列问题。
（1）以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应（步骤①和步骤②在不同的试管中进行）分别获得DNA片段乙和丙，步骤①和步骤②所用的引物对分别是 a和c 、 b和d 。
（2）步骤③是将纯化的DNA片段乙和丙混合，经热变性、退火，得到产物X和Y；步骤④是在DNA聚合酶的催化下进行的延伸反应。步骤③的产物中能形成DNA片段丁的是 Y ，原因是 DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链 。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因时，所选用的PCR引物为 a和d 。
（4）上述获得增强型荧光蛋白的过程利用了蛋白质工程技术，其基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→ 推测应有的氨基酸序列 →找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或 合成新的基因 →获得所需要的蛋白质。
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定；蛋白质工程基本原理．
【专题】图文信息类简答题；PCR技术；理解能力．
【答案】（1）a和c b和d
（2）Y DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链
（3）a和d
（4）推测应有的氨基酸序列 合成新的基因
【分析】PCR技术，需要一对引物，三个步骤循环主要控制的是温度，控制温度的目的是为了控制解旋、复性、延伸过程，以及保证酶活性。
【解答】解：（1）DNA子链的延伸方向为5'→3'，DNA聚合酶从引物的3'方向开始连接脱氧核苷酸，以片段甲为模板，通过两次独立的PCR反应，若经步骤①获得乙片段，则需要在步骤①时加入引物说明a和c，若惊步骤②获得片段丙，则需要在步骤②时加入引物b和d。
（2）DNA聚合酶只能从引物的3'方向开始连接脱氧核苷酸，即DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链，对比X和Y的方向可知，DNA聚合酶能从Y的右侧继续催化延伸子链形成DNA片段丁。
（3）以DNA片段丁为模板，通过PCR反应扩增目的基因（与丁相同）时，应选用a和d作为PCR引物才能扩增出完整的丁片段。
（4）蛋白质工程技术的基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质，蛋白质工程又被称为“第二代基因工程”。
故答案为：
（1）a和c b和d
（2）Y DNA聚合酶只能从有模板的3'端延伸DNA链
（3）a和d
（4）推测应有的氨基酸序列 合成新的基因
【点评】本题考查PCR技术的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
17．（2025 日照模拟）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，酶Y可将磷酸化的M蛋白去磷酸化。为筛选更高效的酶Y，研究人员用X基因（编码酶X）、Y基因（编码酶Y）和GFP基因（编码绿色荧光蛋白）拼接出3种融合基因如图1，分别导入大肠杆菌（同时缺失X基因和Y基因）后构建代谢通路。
（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为 4 。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，其原因可能是 融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况 。
（2）用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从具有 绿色荧光 特征的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，然后在不同泳道中添加相关物质，添加情况与X蛋白的表达情况如图2所示。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道 ① （填图中序号）是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，推测导入融合基因a的工程菌被接种在图中的 ③ 区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y，原因是 表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快） 。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；理解能力．
【答案】（1）4；融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况
（2）绿色荧光；①
（3）③；表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快）
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取
方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建
是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因—PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA—PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）以融合基因a和质粒构建基因表达载体导入大肠杆菌后，在含卡那霉素的培养基上筛选到多个抗性菌落，为检测菌落中是否携带融合基因a，将图中4种引物共同加入反应体系后，分别以抗性菌落的DNA为模板进行PCR扩增。理论上携带正确重组质粒的PCR产物电泳结果应出现的条带数目为4，这4种分别为引物1和2、引物1和4、引物3和2、引物3和4扩增出来的DNA片段。结果显示，有两个菌落中的PCR产物的电泳条带数均为上述结果，但其中2条带的位置不同，则原因可能是融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况，即正向连接和反向连接导致的PCR结果不同。
（2）细菌中的酶X感受外界刺激后，利用ATP将参与细菌正常代谢的M蛋白磷酸化，磷酸化的M蛋白积累会抑制细菌的生长，因此，用融合基因b转化大肠杆菌后，为检测获得的工程菌内融合基因b是否完整表达以及X蛋白的活性，首先从表现绿色荧光的菌落中提取蛋白质并检测X蛋白，因为带有绿色荧光的大肠杆菌是成功导入目的基因的大肠杆菌。后续实验用磷酸化抗体（特异性识别磷酸化的M蛋白）检测，通过泳道①是否出现阳性结果来判断X蛋白的活性，因为酶X在消耗ATP的情况下会使M蛋白磷酸化。
（3）用3种融合基因分别转化大肠杆菌，将获得的3种工程菌与未导入目的基因的大肠杆菌涂布在同一平板的①～④区域，一段时间后，菌落生长状况如图3所示，导入融合基因b会导致细菌生长被抑制，因而对应①，导入融合基因b的大肠杆菌和导入空白质粒的大肠杆菌表现为正常生长，菌落较大，位于②或④区域，导入融合基因a的大肠杆菌，由于同时导入基因X和Y，由于Y基因编码的酶Y会使磷酸化的M蛋白去磷酸化，因而对大肠杆菌的生长抑制有所缓解，因而对应图中的③，即导入融合基因a的工程菌被接种在图中的③区域。为筛选更高效的酶Y，科研人员利用多种突变的Y基因构建成融合基因a，分别导入大肠杆菌后涂布在同一平板的不同区域。表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好，菌落较大，因此应从较大的菌落中能够筛选出活性较高的酶Y。
故答案为：
（1）4；融合基因a与质粒存在正向和反向连接两种情况
（2）绿色荧光；①
（3）③；表达高效活性酶Y的菌落生长状况更好（酶Y活性越高，能使M蛋白高效去磷酸化，因而表现为生长较快）
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
18．（2025 安阳一模）外泌体是一种大小为30～100nm的细胞外膜囊泡，尤其在癌症的诊断及治疗等领域发挥重要作用。研究人员构建了含有近红外荧光蛋白iRFP682基因和外泌体标记蛋白CD63基因的表达载体。载体构建过程中用到的限制酶的切割位点及部分过程如图所示（AmpR表示氨苄青霉素抗性基因）。请回答下列问题：
（1）为将CD63﹣iRFP682基因与质粒进行准确和高效地连接，对CD63﹣iRFP682基因、质粒分别用 BamHⅠ、EcoRⅠ 、 BglⅡ、EcoRⅠ 酶进行切割。基因表达载体中启动子的功能是 与RNA聚合酶结合，驱动转录 。
（2）PCR扩增CD63﹣iRFP682基因的过程中，设计的引物序列为 5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3' 、 5'﹣AGATCTGAATTC﹣3' 。若将该基因片段扩增6次，则消耗 126 个引物分子。
（3）将构建好的基因表达载体通过适当的方式导入癌细胞。癌细胞培养过程中的pH为 7.2～7.4 。检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是 在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光 。
（4）将目的基因导入大肠杆菌，提取其体内蛋白质注入兔子体内，进一步提取兔子体内的抗体，再与提取的转基因癌细胞外泌体中的蛋白质进行杂交，然后进行电泳。若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，电泳结果会出现特异性条带，此过程依据的原理是 抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合） 。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）BamHⅠ、EcoRⅠ；BglⅡ、EcoRⅠ；与RNA聚合酶结合，驱动转录
（2）5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'；5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；126
（3）7.2～7.4；在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光
（4）抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合）
【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；启动子：启动转录，终止子：终止转录。
【解答】解：（1）NotⅠ位于目的基因内部，用NotⅠ会破坏目的基因，不能选，为了避免目的基因及质粒自连，选用不同的黏性末端的酶来切目的基因和质粒，故切割质粒的酶只能选为BglⅢ和EcoRⅠ。由于BamHⅠ和BglⅢ产生的的黏性末端相同，不能选BglⅢ，因此选用BamHⅠ和EcoRⅠ来切割目的基因。启动子具有调控基因转录的功能，能与RNA聚合酶结合，驱动转录。
（2）引物是人们根据已知的DNA序列人工合成的两段核苷酸序列，一个引物与目的基因一条DNA模板链的3'端互补，另一个引物与目的基因另一条DNA模板链的3'端互补，即引物为5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'、5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；采用PCR技术扩增CBHⅡ基因时需要根据CBHⅡ基因两端的碱基（核苷酸）序列设计2种引物，假设DNA复制6轮，子代DNA共有2n+1条链，因亲代DNA的两条母链不需要引物，故需要引物2n+1﹣2＝27﹣2＝126个。
（3）动物细胞培养的pH为7.2﹣7.4，因此癌细胞培养过程中的pH为7.2﹣7.4；含有近红外荧光蛋白iRFP682基因能表达出红外荧光蛋白，因此检测该基因表达载体是否成功导入受体细胞的便捷方法是在近红外灯下观家细胞是否出现红色荧光。
（4）若CD63﹣iRFP682基因在癌细胞内表达，会形成相应的蛋白质，该蛋白质作为抗原注入兔子体内，会使兔子分泌相应的抗体，而该抗体会与该蛋白质发生抗原﹣抗体结合反应，形成特异性条带。
故答案为：
（1）BamHⅠ、EcoRⅠ；BglⅡ、EcoRⅠ；与RNA聚合酶结合，驱动转录
（2）5'﹣TCCTCCGGATCC﹣3'；5'﹣AGATCTGAATTC﹣3'；126
（3）7.2～7.4；在近红外灯下观察细胞是否出现红色荧光
（4）抗原﹣抗体杂交（或抗原抗体特异性结合）
【点评】本题主要考查了基因工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
19．（2025 渭南模拟）酵母细胞表达系统是一种利用酵母菌作为宿主来生产重组蛋白的技术平台。土壤中存在产PG酶（增大蛋白质的溶解性）的金黄杆菌，研究人员设计了利用基因工程高效生产PG酶的方案，流程如图1所示，相关限制性内切核酸酶的识别和切割位点如图2所示。回答下列问题：
（1）过程①应用了PCR技术，利用PCR技术扩增时，需要 2 种引物，引物的作用是 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 。一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2+，其原因是 DNA聚合酶需要Mg2+激活 。PCR反应过程可在PCR扩增仪中自动完成，而后常用 琼脂糖凝胶电泳 来鉴定PCR的产物。
（2）完成过程②需要先将PG酶基因与pPIC9K质粒重组，这个过程称为 基因表达载体的构建 。据图分析，该过程中最好选择限制酶 BglⅠ和NotI 切割。
（3）结合图中过程③分析，将重组质粒导入大肠杆菌内的目的是 利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒 。过程④中将重组质粒酶切后，整合在酵母菌染色体上。
（4）研究人员最终选择酵母菌作为重组质粒的受体细胞来生产PG酶，原因是酵母菌含有 内质网和高尔基体 （答出2种）等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是 发酵罐内发酵 。
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；理解能力．
【答案】（1）2 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶需要Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳
（2）基因表达载体的构建 BglⅠ和NotI
（3）利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒
（4）内质网和高尔基体 发酵罐内发酵
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。
（4）目的基因的检测与鉴定。
【解答】解：（1）利用PCR技术扩增时，DNA聚合酶不能从DNA链的一端直接开始合成子链，需要在反应体系中添加2种引物，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA聚合酶需要Mg2+激活，故一般还需要往PCR反应缓冲液中加入适量的Mg2+。PCR反应过程可以在PCR扩增仪中自动完成，PCR的产物的分子量大小等不同，常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
（2）过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在此之前需要先构建基因表达载体，即将PG酶基因与pPIC9K质粒重组。在构建基因表达载体时，需要用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶分别切割质粒和目的基因，根据图1和图2分析，PG酶基因两端序列分别含有BglⅠ和NotI识别位点，故最好选择限制酶BglⅠ和Notl切割能产生和目的基因相同的末端。
（3）大肠杆菌繁殖速度快，将重组质粒导入大肠杆菌内，短时间内可获取大量的重组质粒。
（4）分泌蛋白合成加工过程涉及到的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体和线粒体。酵母菌是真核生物，含有内质网和高尔基体等细胞器，可将肽链进行加工为分泌蛋白，便于提取。获得的酵母菌将用于发酵工程，发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵。
故答案为：
（1）2 使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶需要Mg2+激活 琼脂糖凝胶电泳
（2）基因表达载体的构建 BglⅠ和NotI
（3）利用大肠杆菌繁殖速度快的特点，短时间内可获取大量的重组质粒
（4）内质网和高尔基体 发酵罐内发酵
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
20．（2025 东湖区校级一模）血清白蛋白（HSA）由肝细胞合成并分泌入血，可作为血浆容量扩充剂，常用于烫伤烧伤、失血过多而休克、癌症、手术后的输液等。我国科研团队利用转基因水稻生产的人血清白蛋白，已获批准进入临床研究阶段。回答下列问题：
（1）研究发现，HSA基因中仅有极少部分序列用于HSA的表达，因此可以从 肝细胞 中提取总mRNA，利用 逆转录 酶获得cDNA并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在获得的cDNA转录所用模板链的5'端和3'端方向分别添加 终止子 和 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子 。
（2）科研团队利用农杆菌转化法将上述添加好的HSA基因导入水稻愈伤组织，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的 T﹣DNA 中，该部位按顺时针方向分别有HindⅢ及EcoRⅠ酶切位点（两酶切割后所得黏性末端不同）。但所获HSA基因中不含这两种酶的酶切位点，为了便于和载体的连接，还需要在HSA基因首尾两端添加相应序列，下列添加方法正确的是 D ，并说明理由： 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达 。
A．HSA基因首尾两端都添加HindⅢ或EcoRⅠ的识别序列
B．在HSA基因首尾两端分别添加HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．在HSA基因首尾两端分别添加EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列
D．选项B和C两种添加方法都可以
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）肝细胞 逆转录 终止子 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子
（2）T﹣DNA D 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达
【分析】基因工程的操作步骤：
（1）目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；
（3）将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。
【解答】解：（1）HSA由肝细胞合成，因此可以从肝细胞中提取总mRNA，利用逆转录酶获得cDNA，并进一步筛选得到基因工程所用的HSA基因。该方法获得的基因不含启动子和终止子，因此为使该基因仅在水稻胚乳细胞中表达，应在cDNA转录时所用模板链的5'端和3'端分别添加终止子和水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子，因为转录时mRNA延伸方向为5'端到3'端，和模板链反向，RNA聚合酶结合位点（启动子）应位于模板链的3'端。
（2）T﹣DNA是可转移的DNA，HSA基因应插入到农杆菌Ti质粒的T﹣DNA中。在HSA基因首尾两端需添加不同限制酶识别序列，酶切形成不同的黏性末端，以防止目的基因的自身环化。因上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达，所以EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列可以任意连接到HSA基因首尾两端，D正确，ABC错误。
故选：D。
故答案为：
（1）肝细胞 逆转录 终止子 能在水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子
（2）T﹣DNA D 上述过程所获HSA基因中已经包含启动子和终止子，连接方式不会影响该基因的表达
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
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