【高考押题卷】2025年高考生物核心考点考前冲刺 基因工程（含解析）
文档属性
| 名称 | 【高考押题卷】2025年高考生物核心考点考前冲刺 基因工程（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 2.6MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-06-01 11:20:53 | ||
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文档简介
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高考冲刺押题预测 基因工程
一．选择题（共16小题）
1．（2024秋 白银期末）天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
2．（2024秋 朝阳区期末）高中生物学实验中经常使用动物的血液作为材料，以下实验难以达成目的的是（ ）
A．粗提取小鼠血红细胞中的DNA
B．观察鱼血液中红细胞的细胞核
C．观察小鼠血液离体后的分层现象
D．比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用
3．（2024 盐城模拟）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（ ）
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
4．（2024 牡丹江校级模拟）下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（ ）
A．应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜
B．可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开
C．研磨材料得到的滤液应在4℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作
D．向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量
5．（2024 湖北模拟）某些神经元过度兴奋会导致癫痫。研究人员将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A下游，然后利用改造的腺病毒AAV9作为载体，将目的基因导入癫痫模型小鼠的脑部，以探究基因疗法的可行性。下列分析正确的是（ ）
A．该疗法的原理可能是加快钾离子内流以减弱异常神经元的过度兴奋
B．启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达
C．改造的AAV9既可特异性侵染神经元，又可通过裂解宿主细胞实现增殖
D．对照组目的基因的处理可能是将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A上游
6．（2023秋 雁塔区校级期末）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是（ ）
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
7．（2024 吴川市校级模拟）我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼的受精卵并整合到染色体DNA上，培育出转基因鲤鱼。与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快。下列叙述正确的是（ ）
A．外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后没有定向改变性状
B．转基因鲤鱼的外源生长激素基因的表达都在细胞核进行
C．转基因鲤鱼的外源生长激素基因遗传时不遵循遗传定律
D．外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录
8．（2024 威海模拟）ω﹣3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA﹣合成酶基因（fat﹣1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat﹣1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（ ）
A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为
C．由图乙可知，只有2组转染成功
D．若fat﹣1基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
9．（2023秋 费县期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B内制备“工程菌”的过程。下列说法正确的是（ ）
A．将人的生长激素基因导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只有导入了普通质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因
10．（2023秋 隆阳区期末）如图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoRⅠ：﹣G↓AATTC﹣；BamHⅠ：﹣G↓GATCC﹣；BclⅠ：﹣T↓GATCA﹣；Sau3AⅠ：﹣↓GATC﹣；SmaⅠ：﹣CCC↓GGG﹣。
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaⅠ，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaⅠ，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
11．（2024秋 无锡月考）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序
D．应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶
12．（2023秋 青岛期末）为获得Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是（ ）
A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠
C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为
13．（2024 朝阳区一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5′端添加与线性化载体两端相同的DNA序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
14．（2024 福建）中国水仙是一种三倍体观赏花卉。传统生产采用分球茎繁殖方式，不仅周期长、产率低、花色单调，还易积累病毒。下列措施无法达到改良目的的是（ ）
A．用水仙鳞片进行植物组织培养以提高产率
B．利用单倍体育种对中国水仙进行品种选育
C．选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗
D．通过基因工程技术引入外源基因改变花色
15．（2024 汕头二模）当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度将Na+排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是（ ）
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na+运输到细胞外
B．将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1﹣GFP基因的纯合子
16．（2024秋 重庆月考）东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用如图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
二．解答题（共4小题）
17．（2024秋 常州期末）目前检测SARS﹣Cov﹣2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT﹣PCR（RT﹣qPCR）该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题：
（1）RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA。
（2）PCR时，需加入荧光染料（如图1中的SYBRGreenⅠ）。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。
（3）科研人员通过实时荧光RT﹣PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。
①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。
②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。
③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。
（4）科研人员又发明了一种无逆转录﹣指数扩增反应技术（RTF﹣EXPAR），该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS﹣Cov﹣2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA﹣X“含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA﹣X”可与两个重复序列（X'和X'）结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。
①模板链X'﹣X'的序列为：
其中的5'﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开的是 键。“触发DNA﹣X”的序列是5' 3'。
②RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。
③尽管RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。
18．（2025 内蒙古模拟）在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β﹣半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：
（1）使用限制酶 和 对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是 。
（4）将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X﹣gal的培养基中培养，若观察到 色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是 。
（5）溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 。
19．（2024秋 朝阳区期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
工程菌检测癌基因
贝氏不动杆菌（B菌）是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移（HGT）。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。
为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞（R1细胞）染色体上部分DNA序列和转基因B菌（B1菌）拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。
结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统由Cas蛋白与gRNA构成，其工作原理如图2目标DNA被Cas蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。
研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。
（1）图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的 过程机制相似，都属于基因重组。
（2）成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是 。
（3）对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是 （多选）。
A.CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对
B.Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键
C.B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的
D.利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑
（4）B2菌中重组DNA的设计方案如图3，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入图3相应的方框中。① ；② ；③
a.持续启动基因表达的强启动子
b.卡那霉素诱导型启动子
c.突变K基因
d.正常K基因
e.壮观霉素抗性基因
f.卡那霉素抗性基因
20．（2025 浙江模拟）东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题：
（1）研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。
①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是 （选填字母）。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加 ，其作用是 。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是 。
②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接 序列，构建含融合基因1的表达载体。
③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的 （填受体细胞名称）中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的 （填字母序号）。
（2）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的 ，再经定点突变获得融合基因2（如图3所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果 ，要求标明每条链的5'端和3'端。
②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作：
i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。
iv：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。
高考冲刺押题预测 基因工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共16小题）
1．（2024秋 白银期末）天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
【考点】蛋白质工程基本原理．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
【解答】解：A、该工程通过对天然β﹣淀粉酶的氨基酸序列进行改造，属于蛋白质工程，改造后生产的蛋白质是自然界不存在的，A错误；
B、蛋白质工程遵循结构与功能相适应的原理，首先预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，然后推测应有的氨基酸序列，进而找到对应的脱氧核苷酸序列，最后合成或改造基因，B正确；
C、由于密码子的简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子，所以根据中心法则推出的新的天然β﹣淀粉酶的脱氧核苷酸序列不是唯一的，C错误；
D、该改造过程是在分子层次上进行的，但不是直接对天然β﹣淀粉酶的氨基酸序列进行改造，而是通过改造基因来实现对蛋白质的改造，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查蛋白质工程的基本原理，意在考查考生对蛋白质工程概念、流程及特点的理解，特别是对中心法则、密码子简并性等知识在蛋白质工程中的应用的理解。
2．（2024秋 朝阳区期末）高中生物学实验中经常使用动物的血液作为材料，以下实验难以达成目的的是（ ）
A．粗提取小鼠血红细胞中的DNA
B．观察鱼血液中红细胞的细胞核
C．观察小鼠血液离体后的分层现象
D．比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用
【考点】DNA的粗提取与鉴定；细胞的吸水和失水；生物体维持pH稳定的机制实验．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，几乎不含DNA。
【解答】解：A、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，所以小鼠血红细胞中几乎不含DNA，难以粗提取DNA，A正确；
B、鱼类等动物的红细胞有细胞核，可以通过制作血涂片等方式观察鱼血液中红细胞的细胞核，B错误；
C、小鼠血液中含有血细胞和血浆等成分，通过离心等操作可以观察到血液离体后的分层现象，C错误；
D、可以通过实验比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用，D错误。
故选：A。
【点评】本题主要考查动物的血液作为材料的实验等知识，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
3．（2024 盐城模拟）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（ ）
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术；理解能力．
【答案】D
【分析】PCR技术：
1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
2、原理：DNA复制。
3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。
4、过程：高温变性、低温复性、中温延伸。
【解答】解：A、TaqDNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；
B、图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC含量越高，则复性的温度设置越高，B正确；
C、经过5次循环后会产生25＝32个，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段32﹣10＝22个，C正确；
D、PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查PCR技术的相关知识，学生要正确理解PCR技术的原理和过程等，结合题目信息，综合分析解答。
4．（2024 牡丹江校级模拟）下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（ ）
A．应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜
B．可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开
C．研磨材料得到的滤液应在4℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作
D．向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量
【考点】DNA的粗提取与鉴定．
【专题】实验原理；从生物材料提取特定成分；实验探究能力．
【答案】C
【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液中。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
【解答】解：A、鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜等材料中DNA含量较高，可作为该实验材料，A正确；
B、在不同浓度的NaCl溶液中，DNA和蛋白质的溶解度不同，如DNA可溶于2mol/LNaCl溶液中，蛋白质则不能，B正确；
C、为防止DNA断裂，应将研磨液在4℃冰箱中静置或离心，但要取滤液进行后续操作，C错误；
D、经酒精处理得到的白色丝状物中含有一定的蛋白质杂质，可加入蛋白酶，去除蛋白质杂质，提高DNA的相对含量，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查DNA的粗提取和鉴定，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验现象及结论等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
5．（2024 湖北模拟）某些神经元过度兴奋会导致癫痫。研究人员将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A下游，然后利用改造的腺病毒AAV9作为载体，将目的基因导入癫痫模型小鼠的脑部，以探究基因疗法的可行性。下列分析正确的是（ ）
A．该疗法的原理可能是加快钾离子内流以减弱异常神经元的过度兴奋
B．启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达
C．改造的AAV9既可特异性侵染神经元，又可通过裂解宿主细胞实现增殖
D．对照组目的基因的处理可能是将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A上游
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】归纳推理；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】在神经细胞中，动作电位的传导使得神经信号能够快速传递。当神经细胞的某一部位受到刺激产生动作电位后，会迅速向两侧传导，从而实现信息的传递。动作电位在神经传导、肌肉收缩等生理过程中起着至关重要的作用，其异常可能会导致神经系统疾病等问题。
【解答】解：A、减弱异常神经元的过度兴奋需要加快钾离子外流，A错误；
B、外源钾离子通道基因需要在异常神经元特异性表达，故启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达，B正确；
C、改造的AAV9可以特异性侵染神经元，但不能通过裂解宿主细胞实现增殖，否则会导致神经元因感染而死亡，C错误；
D、实验的自变量是是否转入外源钾离子通道基因，故对照组应转入空载体，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查了基因工程的应用，需要学生掌握基因工程的基本操作流程，分析题干答题。
6．（2023秋 雁塔区校级期末）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是（ ）
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】检测转基因抗冻番茄是否培育成功的最简便方法是在个体水平上进行抗性鉴定，即观察其是否能在相对寒冷的环境中生长。
【解答】解：A、基因表达载体的构建是培育转基因生物的核心工作，A错误；
B、实验目的是获得抗冻的番茄品种，因此抗冻蛋白基因afp属于目的基因，B正确；
C、构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶，不需要解旋酶，C错误；
D、只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，意在考查学生运用所学知识正确作答的能力。
7．（2024 吴川市校级模拟）我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼的受精卵并整合到染色体DNA上，培育出转基因鲤鱼。与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快。下列叙述正确的是（ ）
A．外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后没有定向改变性状
B．转基因鲤鱼的外源生长激素基因的表达都在细胞核进行
C．转基因鲤鱼的外源生长激素基因遗传时不遵循遗传定律
D．外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录
【考点】将目的基因导入受体细胞．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，该步骤需要限制酶和DNA连接酶。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【解答】解：A、将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后发现与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快，说明鲤鱼有定向改变性状，A错误；
B、基因的表达包括转录和翻译，转录发生在细胞核中，翻译发生在细胞质基质中的核糖体上，B错误；
C、由于转基因鲤鱼的外源生长激素基因整合到染色体DNA上，因此遵循遗传定律，C错误；
D、外源生长激素基因的复制或转录均需要解旋断开氢键，因此外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
8．（2024 威海模拟）ω﹣3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA﹣合成酶基因（fat﹣1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat﹣1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（ ）
A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为
C．由图乙可知，只有2组转染成功
D．若fat﹣1基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术；基因工程；实验探究能力．
【答案】A
【分析】1、PCR扩增：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
【解答】解：A、农杆菌转化法适用于植物细胞，对于动物细胞受精卵而言应采用显微注射法导入目的基因，A错误；
B、PCR扩增3轮后，共得到8个DNA分子，只有最原始的1个DNA分子的两条链不含引物，导致含有这两条链的2个DNA分子只含有其中一种引物，其余6个DNA分子均含有2种引物，故PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为，B正确；
C、据图分析，M2组和1组没有扩增出DNA片段，故细胞内不存在目的基因，即可能是细胞内导入PEB质粒或者未成功转染，而M2组是PEB质粒转染细胞PCR产物，故1组是未转染细胞PCR产物，2组出现一条DNA条带，即为目的基因条带，则1组是未成功转染细胞PCR产物；2组是成功转染细胞PCR产物，C正确；
D、若fat﹣l基因单点插入，相应的基因型表示为FO，则转基因小鼠相互交配后代基因型为1FF、2FO、1OO，即产生的大多数后代体内能合成LCPUFA，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查学生从题中获取相关信息，并结合所学DNA片段的扩增与电泳鉴定以及基因工程的知识作出正确判断，属于识记和理解层次的内容，难度适中。
9．（2023秋 费县期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B内制备“工程菌”的过程。下列说法正确的是（ ）
A．将人的生长激素基因导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只有导入了普通质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】质粒上的标记基因可用于筛选含有重组质粒的受体细胞。将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，导入植物细胞常用农杆菌转化法。
【解答】解：A、将重组DNA分子导入细菌B之前，一般要先用氯化钙处理细胞，农杆菌转化法是将重组DNA 分子导入植物细胞时常用的方法，A错误；
B、由于重组质粒中的抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，B正确；
C、质粒A中含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，而重组质粒中含抗氨苄青霉素基因，则含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入了质粒A或重组质粒的细菌，而其他的细菌则不能生长，C错误；
D、目的基因（人的生长激素基因）成功表达的标志是受体细胞能产生出人的生长激素，D错误。
故选：B。
【点评】本题主要考查基因工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
10．（2023秋 隆阳区期末）如图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoRⅠ：﹣G↓AATTC﹣；BamHⅠ：﹣G↓GATCC﹣；BclⅠ：﹣T↓GATCA﹣；Sau3AⅠ：﹣↓GATC﹣；SmaⅠ：﹣CCC↓GGG﹣。
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaⅠ，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaⅠ，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
【考点】基因表达载体的构建．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】C
【分析】“限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【解答】解：A、用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相同，A正确；
B、若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长，B正确；
C、若选择BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因：能在四环素培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒，也有可能获得的是普通质粒，C错误；
D、含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列，不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段，但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ相同，故若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则需用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查基因表达载体等相关知识点，旨在考查学生理解所学知识的要点，把握知识的内在联系并应用相关知识综合解答问题的能力。
11．（2024秋 无锡月考）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序
D．应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术．
【答案】B
【分析】PCR的三个步骤分别是：①变性：利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链；②退火：低温（经常是50℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；③延伸：当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成互补链。
【解答】解：A、在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为加入了与特定部位结合的引物，引物可以通过碱基互补配对特异性结合到模板DNA的相应位置，复性过程中引物结合到互补链DNA上，故不同反应体系PCR的温度差别主要表现为退火温度的差异，A错误；
B、若退火温度低，引物较短时，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，可能形成大量非特异性扩增产物，B正确；
C、镰状细胞贫血患者的红细胞呈镰状，但其为哺乳动物成熟的红细胞，不含细胞核，不含核基因，因此无法利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序，C错误；
D、应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶有耐高温DNA聚合酶、逆转录酶，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查PCR技术等相关知识，考查考生的理解能力和综合分析能力。
12．（2023秋 青岛期末）为获得Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是（ ）
A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠
C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术．
【答案】C
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【解答】解：A、Gata3﹣GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小。用引物1和引物3进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物。选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，没有整合，则片段较小，因此，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2，A错误；
B、Gata3﹣GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小，选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3﹣GFP融合基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B错误；
C、图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动Gata3和GFP基因的转录，进而可编码相应的蛋白质，C正确；
D、若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，获得的DNA片段总数为24＝16个，其中等长片段的数目为24﹣2×4＝8个，可见其所占的比例为，D错误；
故选：C。
【点评】本题考查PCR的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
13．（2024 朝阳区一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5′端添加与线性化载体两端相同的DNA序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程．
【答案】B
【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。
【解答】解：A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A正确；
B、该方法需利用DNA连接酶实现目的基因与载体的连接，限制酶用于切割目的基因和质粒，B错误；
C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物目的基因配对，C正确；
D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D正确。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生对相关知识的理解和识记能力。
14．（2024 福建）中国水仙是一种三倍体观赏花卉。传统生产采用分球茎繁殖方式，不仅周期长、产率低、花色单调，还易积累病毒。下列措施无法达到改良目的的是（ ）
A．用水仙鳞片进行植物组织培养以提高产率
B．利用单倍体育种对中国水仙进行品种选育
C．选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗
D．通过基因工程技术引入外源基因改变花色
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；单倍体及多倍体育种；植物的组织培养．
【专题】正推法；育种；理解能力．
【答案】B
【分析】1、杂交育种的原理是基因重组；其优点是可以将不同个体的优良性状集中于同一个体上，且方法简单，可预见强。
2、诱变育种的原理是基因突变；方法是用物理因素（如X射线、γ射线、紫外线、激光等）或化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）来处理生物，使其在细胞分裂间期DNA复制时发生差错，从而引起基因突变；其优点是可提高变异频率，出现新性状，大幅度改良某些性状，加速育种进程。
3、单倍体育种的原理是染色体变异；方法是用花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩短育种年限。
4、多倍体育种的原理是染色体变异；方法是利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；优点是茎秆粗壮，叶片、果实和种子都比较大，糖类和蛋白质等营养物质的含量都有所增加。
5、基因工程育种的原理是基因重组；优点是能按照人们的意愿定向改造生物的性状。
【解答】解：A、用水仙鳞片进行植物组织培养，可以快速繁殖，提高产率，可以达到改良目的，A正确；
B、中国水仙是三倍体，在减数分裂过程中会发生联会紊乱，不能产生正常的配子，所以无法利用单倍体育种对其进行品种选育，B错误；
C、选用水仙幼嫩组织作为外植体进行植物组织培养，可以获得脱毒苗，可以达到改良目的，C正确；
D、通过基因工程技术引入外源基因可以改变花色，可以达到改良目的，D正确。
故选：B。
【点评】本题主要考查生物育种的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
15．（2024 汕头二模）当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度将Na+排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是（ ）
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na+运输到细胞外
B．将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1﹣GFP基因的纯合子
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程．
【答案】D
【分析】当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度以主动运输的方式将Na+排到细胞外。
【解答】解：A、由题意可知，当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度以主动运输的方式将Na+排到细胞外，A正确；
B、SOS1基因含有BanmHI、SmaI和EcoRI，所以将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaI和EcoRI，B正确；
C、检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2或F2和R1进行扩增，C正确；
D、F2和R2为绿色荧光蛋白基因（GFP）的引物，无法检测到是否含有SOS1基因，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
16．（2024秋 重庆月考）东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用如图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；
B、用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；
C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；
D、用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或不含重组质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。
二．解答题（共4小题）
17．（2024秋 常州期末）目前检测SARS﹣Cov﹣2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT﹣PCR（RT﹣qPCR）该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题：
（1）RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 逆转录 酶作用生成cDNA。
（2）PCR时，需加入荧光染料（如图1中的SYBRGreenⅠ）。进行阶段2时，引物与cDNA按照 碱基互补配对 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 酶催化子链的合成。
（3）科研人员通过实时荧光RT﹣PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。
①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降 。
②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 越小 。
③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 阳性 。
（4）科研人员又发明了一种无逆转录﹣指数扩增反应技术（RTF﹣EXPAR），该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS﹣Cov﹣2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA﹣X“含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA﹣X”可与两个重复序列（X'和X'）结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。
①模板链X'﹣X'的序列为：
其中的5'﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开的是 磷酸二酯 键。“触发DNA﹣X”的序列是5' AGGGTAAACCAAATACC 3'。
②RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小 。
③尽管RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交 ，导致扩增效率降低。
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术；理解能力．
【答案】（1）逆转录
（2）碱基互补配对；耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降；越小；阳性
（4）磷酸二酯；AGGGTAAACCAAATACC；避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小；触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交
【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
【解答】解：（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
（2）PCR是一项根据DNA双链复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此进行阶段②时，引物与cDNA按照碱基互补配对原则进行特异性结合。在PCR循环的③延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成。
（3）平台期目的基因的数量几乎不再增长，有可能是引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降导致的。样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct值就越低。据图2可知荧光阈值大概是36，病毒核酸检测结果应判定为阳性。
（4）根据题意可知切口酶是将DNA链切断，因此该酶破坏的是磷酸二酯键，根据题意可知5﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开，所以可推测“触发DNA﹣X”的序列是5'﹣AGGGTAAACCAAATACC﹣3。据图可知RTF﹣EXPAR的过程避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小，因此RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR能更快速地检测病毒RNA。RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中触发DNA﹣X不可避免地与模板的5端杂交，导致扩增效率低。
故答案为：
（1）逆转录
（2）碱基互补配对；耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降；越小；阳性
（4）磷酸二酯；AGGGTAAACCAAATACC；避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小；触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交
【点评】本题考查PCR技术等知识，意在考查考生对相关生物技术流程和原理的理解掌握程度。
18．（2025 内蒙古模拟）在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β﹣半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：
（1）使用限制酶 HindⅢ 和 BamHⅠ 对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是 启动子 。
（4）将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X﹣gal的培养基中培养，若观察到 蓝 色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是 大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是 目的基导入不成功 。
（5）溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 保证目的基因与质粒的连接 。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；解决问题能力．
【答案】（1）HindⅢ；BamHⅠ
（2）Ca2+
（3）启动子
（4）蓝；大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；目的基导入不成功
（5）保证目的基因与质粒的连接
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取
方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建
是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）据图分析，EcoRⅠ和EcoRⅤ都会破坏目的基因，故不能选择，且SacI会破坏复制原点，也不能选择，则目的基因左侧只能选择BamHⅠ，右侧应选择与质粒共同的酶，即HindⅢ，故使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可用于驱动基因的转录，故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。
（4）分析题意，大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，若导入成功，则重组质粒中含有β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；另一种颜色（白色）的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是导入率并非100%，故可能是因为导入不成功。
（5）分析题意，溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是保证目的基因与质粒的正确连接。
故答案为：
（1）HindⅢ；BamHⅠ
（2）Ca2+
（3）启动子
（4）蓝；大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；目的基导入不成功
（5）保证目的基因与质粒的连接
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
19．（2024秋 朝阳区期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
工程菌检测癌基因
贝氏不动杆菌（B菌）是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移（HGT）。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。
为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞（R1细胞）染色体上部分DNA序列和转基因B菌（B1菌）拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。
结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统由Cas蛋白与gRNA构成，其工作原理如图2目标DNA被Cas蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。
研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。
（1）图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的 非姐妹染色单体交换片段 过程机制相似，都属于基因重组。
（2）成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是 有、无 。
（3）对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是 CD （多选）。
A.CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对
B.Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键
C.B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的
D.利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑
（4）B2菌中重组DNA的设计方案如图3，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入图3相应的方框中。① a ；② f ；③ d
a.持续启动基因表达的强启动子
b.卡那霉素诱导型启动子
c.突变K基因
d.正常K基因
e.壮观霉素抗性基因
f.卡那霉素抗性基因
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）非姐妹染色单体交换片段
（2）有、无
（3）CD
（4）①a；②f；③d
【分析】CRISPR/Cas基因编辑技术可简单准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。
【解答】解：（1）据图1可知，两个不同DNA片段由于两端具有同源序列而发生了中间相应基因的互换，与减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间片段的互换类似，都属于基因重组。
（2）据图1可知，经过同源序列之间的片段互换后，B1菌中的DNA上含有了卡那霉素抗性基因，失去了壮观霉素抗性基因，因此成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素的培养基上能够生长，但在含壮观霉素的平板上不能生长，即成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是有和无。
（3）A、据图可知，CRISPR序列中的经加工后插入到细胞基因组的噬菌体DNA转录形成的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对，A错误；
B、Cas蛋白不能识别特定DNA序列，gRNA可识别特定的DNA序列，B错误；
C、B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的，因此转录形成的gRNA可识别噬菌体不同的DNA序列从而实现从不同位点切割，C正确；
D、由于CRISPR/Cas系统中的gRNA可识别特定的DNA序列，而Cas蛋白可切割DNA，因此利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑，D正确。
故选：CD。
（4）根据题意可知，构建的B2菌能捕获诱发结肠癌的突变K基因，并能在CRISPR/Cas系统的作用下对其特异性切割，因此③应为正常K基因，其转录的gRNA能特异性识别正常K基因的特定碱基序列，又知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性，因此需要TetR基因持续表达，故①为持续启动基因表达的强启动子，结合题意B，菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活，可知②为卡那霉素抗性基因，故①②③依次为a、f、d。
故答案为：
（1）非姐妹染色单体交换片段
（2）有、无
（3）CD
（4）①a；②f；③d
【点评】本题考查基因编辑的相关知识点，意在考查考生对基因编辑技术应用，引导考生关注生物技术与社会的关系。
20．（2025 浙江模拟）东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题：
（1）研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。
①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是 ad （选填字母）。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加 Mg2+ ，其作用是 激活DNA聚合酶的活性 。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是 形成加样孔 。
②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接 雌性特异性剪切识别 序列，构建含融合基因1的表达载体。
③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的 受精卵 （填受体细胞名称）中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的 C （填字母序号）。
（2）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的 基因碱基序列 ，再经定点突变获得融合基因2（如图3所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果 ，要求标明每条链的5'端和3'端。
②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作：
i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组 ，则说明G1具有cs效应。
iv：在 18 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】（1）①ad；Mg2+；激活DNA聚合酶的活性；形成加样孔
②雌性特异性剪切识别
③受精卵 C
②雌性特异性剪切识别
③受精卵；C
（2）①基因碱基序列
②18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组；18
【分析】（1）PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。
（2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：（1）①PCR扩增时一对引物需要与模板的3'端结合，是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad；PCR是体外扩增DNA技术，缓冲液中一般需要添加Mg2+中，Mg2+作为DNA聚合酶的激活剂，使酶激活。为了形成加样孔，所以制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子。
②据图可知，融合基因包括RTA基因和dsx内含子序列，故将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接雌性特异性剪切识别序列。
③将目的基因导入动物细胞通常用受精卵作为对象；RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。
（2）①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，可通过蛋白质工程实现，该技术中需根据氨基酸的序列推测对应的脱氧核苷酸序列，经定点突变获得融合基因2。图中虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3'端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：。
②将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雌性个体不会致死，雄性个体所占比例小于29℃组。在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。
故答案为：
（1）①ad；Mg2+；激活DNA聚合酶的活性；形成加样孔
②雌性特异性剪切识别
③受精卵 C
②雌性特异性剪切识别
③受精卵；C
（2）①基因碱基序列
②18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组；18
【点评】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能运用所学知识，对生物学问题作出准确的解答。
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高考冲刺押题预测 基因工程
一．选择题（共16小题）
1．（2024秋 白银期末）天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
2．（2024秋 朝阳区期末）高中生物学实验中经常使用动物的血液作为材料，以下实验难以达成目的的是（ ）
A．粗提取小鼠血红细胞中的DNA
B．观察鱼血液中红细胞的细胞核
C．观察小鼠血液离体后的分层现象
D．比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用
3．（2024 盐城模拟）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（ ）
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
4．（2024 牡丹江校级模拟）下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（ ）
A．应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜
B．可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开
C．研磨材料得到的滤液应在4℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作
D．向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量
5．（2024 湖北模拟）某些神经元过度兴奋会导致癫痫。研究人员将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A下游，然后利用改造的腺病毒AAV9作为载体，将目的基因导入癫痫模型小鼠的脑部，以探究基因疗法的可行性。下列分析正确的是（ ）
A．该疗法的原理可能是加快钾离子内流以减弱异常神经元的过度兴奋
B．启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达
C．改造的AAV9既可特异性侵染神经元，又可通过裂解宿主细胞实现增殖
D．对照组目的基因的处理可能是将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A上游
6．（2023秋 雁塔区校级期末）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是（ ）
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
7．（2024 吴川市校级模拟）我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼的受精卵并整合到染色体DNA上，培育出转基因鲤鱼。与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快。下列叙述正确的是（ ）
A．外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后没有定向改变性状
B．转基因鲤鱼的外源生长激素基因的表达都在细胞核进行
C．转基因鲤鱼的外源生长激素基因遗传时不遵循遗传定律
D．外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录
8．（2024 威海模拟）ω﹣3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA﹣合成酶基因（fat﹣1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat﹣1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（ ）
A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为
C．由图乙可知，只有2组转染成功
D．若fat﹣1基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
9．（2023秋 费县期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B内制备“工程菌”的过程。下列说法正确的是（ ）
A．将人的生长激素基因导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只有导入了普通质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因
10．（2023秋 隆阳区期末）如图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoRⅠ：﹣G↓AATTC﹣；BamHⅠ：﹣G↓GATCC﹣；BclⅠ：﹣T↓GATCA﹣；Sau3AⅠ：﹣↓GATC﹣；SmaⅠ：﹣CCC↓GGG﹣。
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaⅠ，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaⅠ，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
11．（2024秋 无锡月考）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序
D．应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶
12．（2023秋 青岛期末）为获得Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是（ ）
A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠
C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为
13．（2024 朝阳区一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5′端添加与线性化载体两端相同的DNA序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
14．（2024 福建）中国水仙是一种三倍体观赏花卉。传统生产采用分球茎繁殖方式，不仅周期长、产率低、花色单调，还易积累病毒。下列措施无法达到改良目的的是（ ）
A．用水仙鳞片进行植物组织培养以提高产率
B．利用单倍体育种对中国水仙进行品种选育
C．选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗
D．通过基因工程技术引入外源基因改变花色
15．（2024 汕头二模）当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度将Na+排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是（ ）
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na+运输到细胞外
B．将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1﹣GFP基因的纯合子
16．（2024秋 重庆月考）东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用如图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
二．解答题（共4小题）
17．（2024秋 常州期末）目前检测SARS﹣Cov﹣2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT﹣PCR（RT﹣qPCR）该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题：
（1）RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 酶作用生成cDNA。
（2）PCR时，需加入荧光染料（如图1中的SYBRGreenⅠ）。进行阶段2时，引物与cDNA按照 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 酶催化子链的合成。
（3）科研人员通过实时荧光RT﹣PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。
①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 。
②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 。
③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 。
（4）科研人员又发明了一种无逆转录﹣指数扩增反应技术（RTF﹣EXPAR），该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS﹣Cov﹣2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA﹣X“含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA﹣X”可与两个重复序列（X'和X'）结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。
①模板链X'﹣X'的序列为：
其中的5'﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开的是 键。“触发DNA﹣X”的序列是5' 3'。
②RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 。
③尽管RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 ，导致扩增效率降低。
18．（2025 内蒙古模拟）在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β﹣半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：
（1）使用限制酶 和 对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是 。
（4）将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X﹣gal的培养基中培养，若观察到 色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是 。
（5）溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 。
19．（2024秋 朝阳区期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
工程菌检测癌基因
贝氏不动杆菌（B菌）是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移（HGT）。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。
为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞（R1细胞）染色体上部分DNA序列和转基因B菌（B1菌）拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。
结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统由Cas蛋白与gRNA构成，其工作原理如图2目标DNA被Cas蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。
研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。
（1）图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的 过程机制相似，都属于基因重组。
（2）成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是 。
（3）对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是 （多选）。
A.CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对
B.Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键
C.B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的
D.利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑
（4）B2菌中重组DNA的设计方案如图3，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入图3相应的方框中。① ；② ；③
a.持续启动基因表达的强启动子
b.卡那霉素诱导型启动子
c.突变K基因
d.正常K基因
e.壮观霉素抗性基因
f.卡那霉素抗性基因
20．（2025 浙江模拟）东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题：
（1）研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。
①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是 （选填字母）。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加 ，其作用是 。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是 。
②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接 序列，构建含融合基因1的表达载体。
③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的 （填受体细胞名称）中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的 （填字母序号）。
（2）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的 ，再经定点突变获得融合基因2（如图3所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果 ，要求标明每条链的5'端和3'端。
②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作：
i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 ，则说明G1具有cs效应。
iv：在 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。
高考冲刺押题预测 基因工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共16小题）
1．（2024秋 白银期末）天然β淀粉酶耐热性差，不利于工业化应用。研究人员将某种天然β淀粉酶的第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺后，其耐热性明显提升。下列叙述正确的是（ ）
A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质
B．该改造首先要预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，这是因为结构与功能相适应
C．该工程根据中心法则推断出的新的天然β淀粉酶的脱氧核苷酸序列是唯一的
D．该改造过程是在分子层次上进行的，要对天然β淀粉酶的氨基酸序列进行直接改造
【考点】蛋白质工程基本原理．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】蛋白质工程：指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
【解答】解：A、该工程通过对天然β﹣淀粉酶的氨基酸序列进行改造，属于蛋白质工程，改造后生产的蛋白质是自然界不存在的，A错误；
B、蛋白质工程遵循结构与功能相适应的原理，首先预期蛋白质功能，再设计蛋白质结构，然后推测应有的氨基酸序列，进而找到对应的脱氧核苷酸序列，最后合成或改造基因，B正确；
C、由于密码子的简并性，一种氨基酸可能对应多种密码子，所以根据中心法则推出的新的天然β﹣淀粉酶的脱氧核苷酸序列不是唯一的，C错误；
D、该改造过程是在分子层次上进行的，但不是直接对天然β﹣淀粉酶的氨基酸序列进行改造，而是通过改造基因来实现对蛋白质的改造，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查蛋白质工程的基本原理，意在考查考生对蛋白质工程概念、流程及特点的理解，特别是对中心法则、密码子简并性等知识在蛋白质工程中的应用的理解。
2．（2024秋 朝阳区期末）高中生物学实验中经常使用动物的血液作为材料，以下实验难以达成目的的是（ ）
A．粗提取小鼠血红细胞中的DNA
B．观察鱼血液中红细胞的细胞核
C．观察小鼠血液离体后的分层现象
D．比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用
【考点】DNA的粗提取与鉴定；细胞的吸水和失水；生物体维持pH稳定的机制实验．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】A
【分析】哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，几乎不含DNA。
【解答】解：A、哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，所以小鼠血红细胞中几乎不含DNA，难以粗提取DNA，A正确；
B、鱼类等动物的红细胞有细胞核，可以通过制作血涂片等方式观察鱼血液中红细胞的细胞核，B错误；
C、小鼠血液中含有血细胞和血浆等成分，通过离心等操作可以观察到血液离体后的分层现象，C错误；
D、可以通过实验比较清水、缓冲液和血浆对pH变化的调节作用，D错误。
故选：A。
【点评】本题主要考查动物的血液作为材料的实验等知识，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
3．（2024 盐城模拟）PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是（ ）
A．图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
B．图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C．用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D．PCR每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术；理解能力．
【答案】D
【分析】PCR技术：
1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。
2、原理：DNA复制。
3、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。
4、过程：高温变性、低温复性、中温延伸。
【解答】解：A、TaqDNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链，所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸，A正确；
B、图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关，引物长度越长或者GC含量越高，则复性的温度设置越高，B正确；
C、经过5次循环后会产生25＝32个，其中只有2个DNA分子含有最初的模板链，另仅含有第一次复制产生的单链参与形成的DNA分子有8个，因此经过5次复制产生等长的目的基因片段32﹣10＝22个，C正确；
D、PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查PCR技术的相关知识，学生要正确理解PCR技术的原理和过程等，结合题目信息，综合分析解答。
4．（2024 牡丹江校级模拟）下列关于“DNA粗提取”的相关操作，错误的是（ ）
A．应选用DNA含量相对较高的材料，如鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜
B．可利用DNA和蛋白质在不同浓度NaCl溶液中溶解度的不同，将两者分开
C．研磨材料得到的滤液应在4℃冰箱中静置或离心，取沉淀进行后续操作
D．向经酒精处理得到的白色丝状物中加入蛋白酶，可提高DNA的相对含量
【考点】DNA的粗提取与鉴定．
【专题】实验原理；从生物材料提取特定成分；实验探究能力．
【答案】C
【分析】DNA的粗提取和鉴定的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液中。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
【解答】解：A、鸡血、洋葱、菜花、香蕉、菠菜等材料中DNA含量较高，可作为该实验材料，A正确；
B、在不同浓度的NaCl溶液中，DNA和蛋白质的溶解度不同，如DNA可溶于2mol/LNaCl溶液中，蛋白质则不能，B正确；
C、为防止DNA断裂，应将研磨液在4℃冰箱中静置或离心，但要取滤液进行后续操作，C错误；
D、经酒精处理得到的白色丝状物中含有一定的蛋白质杂质，可加入蛋白酶，去除蛋白质杂质，提高DNA的相对含量，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查DNA的粗提取和鉴定，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验现象及结论等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。
5．（2024 湖北模拟）某些神经元过度兴奋会导致癫痫。研究人员将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A下游，然后利用改造的腺病毒AAV9作为载体，将目的基因导入癫痫模型小鼠的脑部，以探究基因疗法的可行性。下列分析正确的是（ ）
A．该疗法的原理可能是加快钾离子内流以减弱异常神经元的过度兴奋
B．启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达
C．改造的AAV9既可特异性侵染神经元，又可通过裂解宿主细胞实现增殖
D．对照组目的基因的处理可能是将钾离子通道基因拼接在启动子CAMK2A上游
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】归纳推理；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】在神经细胞中，动作电位的传导使得神经信号能够快速传递。当神经细胞的某一部位受到刺激产生动作电位后，会迅速向两侧传导，从而实现信息的传递。动作电位在神经传导、肌肉收缩等生理过程中起着至关重要的作用，其异常可能会导致神经系统疾病等问题。
【解答】解：A、减弱异常神经元的过度兴奋需要加快钾离子外流，A错误；
B、外源钾离子通道基因需要在异常神经元特异性表达，故启动子CAMK2A可能可以控制其下游基因在神经细胞中特异性表达，B正确；
C、改造的AAV9可以特异性侵染神经元，但不能通过裂解宿主细胞实现增殖，否则会导致神经元因感染而死亡，C错误；
D、实验的自变量是是否转入外源钾离子通道基因，故对照组应转入空载体，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查了基因工程的应用，需要学生掌握基因工程的基本操作流程，分析题干答题。
6．（2023秋 雁塔区校级期末）研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。以下说法正确的是（ ）
A．目的基因的筛选与获取是培育转基因生物的核心工作
B．海鱼的抗冻蛋白基因afp是培育抗冻番茄用到的目的基因
C．构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和解旋酶
D．只要检测出番茄细胞中含有afp基因就代表抗冻番茄培育成功
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】检测转基因抗冻番茄是否培育成功的最简便方法是在个体水平上进行抗性鉴定，即观察其是否能在相对寒冷的环境中生长。
【解答】解：A、基因表达载体的构建是培育转基因生物的核心工作，A错误；
B、实验目的是获得抗冻的番茄品种，因此抗冻蛋白基因afp属于目的基因，B正确；
C、构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶，不需要解旋酶，C错误；
D、只有番茄具有抗冻性才能代表抗冻番茄培育成功，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关内容，意在考查学生运用所学知识正确作答的能力。
7．（2024 吴川市校级模拟）我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼的受精卵并整合到染色体DNA上，培育出转基因鲤鱼。与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快。下列叙述正确的是（ ）
A．外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后没有定向改变性状
B．转基因鲤鱼的外源生长激素基因的表达都在细胞核进行
C．转基因鲤鱼的外源生长激素基因遗传时不遵循遗传定律
D．外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录
【考点】将目的基因导入受体细胞．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】D
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，该步骤需要限制酶和DNA连接酶。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
【解答】解：A、将外源生长激素基因导入鲤鱼受精卵后发现与普通鲤鱼相比，转基因鲤鱼的生长速率加快，说明鲤鱼有定向改变性状，A错误；
B、基因的表达包括转录和翻译，转录发生在细胞核中，翻译发生在细胞质基质中的核糖体上，B错误；
C、由于转基因鲤鱼的外源生长激素基因整合到染色体DNA上，因此遵循遗传定律，C错误；
D、外源生长激素基因的复制或转录均需要解旋断开氢键，因此外源生长激素基因的氢键断裂后利于该基因复制或转录，D正确。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
8．（2024 威海模拟）ω﹣3多不饱和脂肪酸（LCPUFA）有预防心血管疾病的作用，但大多数动物体内不能合成。科研人员利用转染技术（将外源DNA转入受体细胞的技术）将LCPUFA﹣合成酶基因（fat﹣1基因，含1229bp）导入小鼠受精卵，培育出转基因小鼠，基本流程如图甲所示。图乙表示提取不同实验组别小鼠受精卵DNA后，利用fat﹣1基因的引物进行PCR扩增后电泳的结果。下列说法错误的是（ ）
A．采用农杆菌转化法可确保图甲中转染的效果
B．PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为
C．由图乙可知，只有2组转染成功
D．若fat﹣1基因单点插入，则转基因小鼠相互交配产生的大多数后代体内能合成LCPUFA
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术；基因工程；实验探究能力．
【答案】A
【分析】1、PCR扩增：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此循环多次。
2、选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因；③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。
【解答】解：A、农杆菌转化法适用于植物细胞，对于动物细胞受精卵而言应采用显微注射法导入目的基因，A错误；
B、PCR扩增3轮后，共得到8个DNA分子，只有最原始的1个DNA分子的两条链不含引物，导致含有这两条链的2个DNA分子只含有其中一种引物，其余6个DNA分子均含有2种引物，故PCR扩增3轮后，只含一种引物的DNA分子的比例为，B正确；
C、据图分析，M2组和1组没有扩增出DNA片段，故细胞内不存在目的基因，即可能是细胞内导入PEB质粒或者未成功转染，而M2组是PEB质粒转染细胞PCR产物，故1组是未转染细胞PCR产物，2组出现一条DNA条带，即为目的基因条带，则1组是未成功转染细胞PCR产物；2组是成功转染细胞PCR产物，C正确；
D、若fat﹣l基因单点插入，相应的基因型表示为FO，则转基因小鼠相互交配后代基因型为1FF、2FO、1OO，即产生的大多数后代体内能合成LCPUFA，D正确。
故选：A。
【点评】本题考查学生从题中获取相关信息，并结合所学DNA片段的扩增与电泳鉴定以及基因工程的知识作出正确判断，属于识记和理解层次的内容，难度适中。
9．（2023秋 费县期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B内制备“工程菌”的过程。下列说法正确的是（ ）
A．将人的生长激素基因导入细菌B常用的方法是农杆菌转化法
B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只有导入了普通质粒的细菌
C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只有导入了重组质粒的细菌
D．目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】B
【分析】质粒上的标记基因可用于筛选含有重组质粒的受体细胞。将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，导入植物细胞常用农杆菌转化法。
【解答】解：A、将重组DNA分子导入细菌B之前，一般要先用氯化钙处理细胞，农杆菌转化法是将重组DNA 分子导入植物细胞时常用的方法，A错误；
B、由于重组质粒中的抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，B正确；
C、质粒A中含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，而重组质粒中含抗氨苄青霉素基因，则含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入了质粒A或重组质粒的细菌，而其他的细菌则不能生长，C错误；
D、目的基因（人的生长激素基因）成功表达的标志是受体细胞能产生出人的生长激素，D错误。
故选：B。
【点评】本题主要考查基因工程等相关知识点，意在考查学生对相关知识点的理解和熟练应用的能力。
10．（2023秋 隆阳区期末）如图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点为EcoRⅠ：﹣G↓AATTC﹣；BamHⅠ：﹣G↓GATCC﹣；BclⅠ：﹣T↓GATCA﹣；Sau3AⅠ：﹣↓GATC﹣；SmaⅠ：﹣CCC↓GGG﹣。
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的是（ ）
A．若单独使用SmaⅠ，则目的基因表达的产物可能不相同
B．若单独使用SmaⅠ，则含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长
C．若选择BamHⅠ和SmaⅠ，能在四环素培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D．若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA
【考点】基因表达载体的构建．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】C
【分析】“限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端。
【解答】解：A、用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后，目的基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相同，A正确；
B、若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不能在氨苄青霉素培养基中生长，B正确；
C、若选择BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段，重组质粒上含有正常的四环素抗性基因：能在四环素培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒，也有可能获得的是普通质粒，C错误；
D、含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列，不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段，但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ相同，故若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒，则需用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查基因表达载体等相关知识点，旨在考查学生理解所学知识的要点，把握知识的内在联系并应用相关知识综合解答问题的能力。
11．（2024秋 无锡月考）下列有关PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
B．引物较短以及退火温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
C．利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序
D．应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶仅有耐高温DNA聚合酶
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术．
【答案】B
【分析】PCR的三个步骤分别是：①变性：利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链；②退火：低温（经常是50℃左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；③延伸：当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向合成互补链。
【解答】解：A、在设定的PCR体系下可以特异性扩增目标DNA片段，主要是因为加入了与特定部位结合的引物，引物可以通过碱基互补配对特异性结合到模板DNA的相应位置，复性过程中引物结合到互补链DNA上，故不同反应体系PCR的温度差别主要表现为退火温度的差异，A错误；
B、若退火温度低，引物较短时，引物和模板匹配低时，也能稳定存在，那么模板上可能存在很多区域能和引物上的少量碱基匹配，可能形成大量非特异性扩增产物，B正确；
C、镰状细胞贫血患者的红细胞呈镰状，但其为哺乳动物成熟的红细胞，不含细胞核，不含核基因，因此无法利用重叠延伸PCR技术和凝胶电泳技术对镰状细胞贫血致病基因进行测序，C错误；
D、应用RT﹣PCR技术检测新冠病毒，反应体系中的酶有耐高温DNA聚合酶、逆转录酶，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查PCR技术等相关知识，考查考生的理解能力和综合分析能力。
12．（2023秋 青岛期末）为获得Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠，某科研小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合雌、雄小鼠各1只，交配后获得了4只新生小鼠。为了鉴定4只新生小鼠的基因型，科研人员设计了引物1、引物2和引物3用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列分析正确的是（ ）
A．据图分析，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物3
B．分析图乙可知，4号小鼠为Gata3﹣GFP融合基因纯合小鼠
C．图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动GFP基因的转录
D．若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，产物中等长片段所占的比例为
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】模式图；PCR技术．
【答案】C
【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
【解答】解：A、Gata3﹣GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小。用引物1和引物3进行PCR扩增，若小鼠无GFP基因，则无PCR产物。选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，没有整合，则片段较小，因此，PCR扩增时选择的引物组合是引物1和引物2，A错误；
B、Gata3﹣GFP融合基因电泳后的DNA片段较大，Gata3基因电泳后的DNA片段较小，选择引物1和引物2进行扩增，整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以2号个体是Gata3﹣GFP融合基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，B错误；
C、图甲中启动子区是RNA聚合酶识别和结合的位点，能够驱动Gata3和GFP基因的转录，进而可编码相应的蛋白质，C正确；
D、若用引物1和引物3扩增甲图中插入后的片段，循环4次后，获得的DNA片段总数为24＝16个，其中等长片段的数目为24﹣2×4＝8个，可见其所占的比例为，D错误；
故选：C。
【点评】本题考查PCR的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
13．（2024 朝阳区一模）为了构建可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌，研究人员构建基因表达载体（如图所示），并导入不能合成尿嘧啶的酵母菌。
下列相关分析不正确的是（ ）
A．尿嘧啶合成基因可以作为表达载体上的标记基因
B．该方法需利用限制酶和DNA连接酶实现目的基因与载体的连接
C．扩增目的基因时应在引物的5′端添加与线性化载体两端相同的DNA序列
D．在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程．
【答案】B
【分析】基因工程中常用限制酶切割目的基因和质粒（载体），用DNA连接酶连接目的基因和载体。
【解答】解：A、由题意可知，表达载体导入不能合成尿嘧啶的酵母菌，所以可将尿嘧啶合成基因作为表达载体上的标记基因，若导入表达载体后酵母菌能产生尿嘧啶，说明导入成功，A正确；
B、该方法需利用DNA连接酶实现目的基因与载体的连接，限制酶用于切割目的基因和质粒，B错误；
C、扩增目的基因时应在引物的5'端添加与线性化载体两端相同的DNA序列，以便引物目的基因配对，C正确；
D、在以纤维素为唯一碳源的液体培养基中检测酒精含量确定工程菌发酵效果，若能利用纤维素发酵，则证明转基因成功，D正确。
故选：B。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查考生对相关知识的理解和识记能力。
14．（2024 福建）中国水仙是一种三倍体观赏花卉。传统生产采用分球茎繁殖方式，不仅周期长、产率低、花色单调，还易积累病毒。下列措施无法达到改良目的的是（ ）
A．用水仙鳞片进行植物组织培养以提高产率
B．利用单倍体育种对中国水仙进行品种选育
C．选用水仙幼嫩组织作为外植体获得脱毒苗
D．通过基因工程技术引入外源基因改变花色
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用；单倍体及多倍体育种；植物的组织培养．
【专题】正推法；育种；理解能力．
【答案】B
【分析】1、杂交育种的原理是基因重组；其优点是可以将不同个体的优良性状集中于同一个体上，且方法简单，可预见强。
2、诱变育种的原理是基因突变；方法是用物理因素（如X射线、γ射线、紫外线、激光等）或化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）来处理生物，使其在细胞分裂间期DNA复制时发生差错，从而引起基因突变；其优点是可提高变异频率，出现新性状，大幅度改良某些性状，加速育种进程。
3、单倍体育种的原理是染色体变异；方法是用花药离体培养获得单倍体植株，再人工诱导染色体数目加倍；优点是纯合体自交后代不发生性状分离，因而能明显缩短育种年限。
4、多倍体育种的原理是染色体变异；方法是利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗；优点是茎秆粗壮，叶片、果实和种子都比较大，糖类和蛋白质等营养物质的含量都有所增加。
5、基因工程育种的原理是基因重组；优点是能按照人们的意愿定向改造生物的性状。
【解答】解：A、用水仙鳞片进行植物组织培养，可以快速繁殖，提高产率，可以达到改良目的，A正确；
B、中国水仙是三倍体，在减数分裂过程中会发生联会紊乱，不能产生正常的配子，所以无法利用单倍体育种对其进行品种选育，B错误；
C、选用水仙幼嫩组织作为外植体进行植物组织培养，可以获得脱毒苗，可以达到改良目的，C正确；
D、通过基因工程技术引入外源基因可以改变花色，可以达到改良目的，D正确。
故选：B。
【点评】本题主要考查生物育种的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
15．（2024 汕头二模）当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度将Na+排到细胞外。某研究团队拟构建SOS1基因和绿色荧光蛋白基因（GFP）的融合基因转入水稻基因组，以期增强水稻的抗盐能力。下列叙述错误的是（ ）
A．水稻通过转运蛋白SOS1以主动运输的方式将Na+运输到细胞外
B．将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaⅠ和EcoRⅠ
C．检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2进行扩增
D．检测F2和R2的扩增结果能确定水稻是否为SOS1﹣GFP基因的纯合子
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】模式图；基因工程．
【答案】D
【分析】当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度以主动运输的方式将Na+排到细胞外。
【解答】解：A、由题意可知，当水稻处于高Na+环境时，细胞膜上的转运蛋白SOS1可借助膜两侧的H+浓度梯度以主动运输的方式将Na+排到细胞外，A正确；
B、SOS1基因含有BanmHI、SmaI和EcoRI，所以将SOS1基因插入到表达载体中不可选用限制酶SmaI和EcoRI，B正确；
C、检测GFP基因是否以正确方向连接到质粒可用引物F1和R2或F2和R1进行扩增，C正确；
D、F2和R2为绿色荧光蛋白基因（GFP）的引物，无法检测到是否含有SOS1基因，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
16．（2024秋 重庆月考）东南景天中的HMA3基因能编码Cd（镉）转运蛋白，Cd转运蛋白能将土壤中的Cd吸收进体内，现欲将东南景天中的HMA3基因转入栾树，以增强栾树对Cd的富集能力，从而有效治理Cd污染，科研人员利用如图结构构建重组DNA，图1为HMA3基因所在DNA示意图，图2为质粒结构示意图，下列叙述正确的是（ ）
A．欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少2轮获得
B．用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可得3条条带
C．构建含HMA3和GFP基因的重组质粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列
D．用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒的受体细胞
【考点】基因工程的操作过程综合；DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【答案】C
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：A、欲获取HMA3基因，可用引物1、引物2进行PCR循环至少3轮获得，A错误；
B、用凝胶电泳鉴定PCR产物，引物1、引物2扩增的产物可能会得到引物带、引物二聚体带、目的扩增产物带和非目的扩增产物带等多条不同的条带，B错误；
C、构建含HMA3和GFP基因的重组质粒时，需要有启动子和终止子序列，又不破坏GFP基因，因此需要在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的识别序列，C正确；
D、用含潮霉素的培养基筛选受体细胞，能生长的为含重组质粒或不含重组质粒的受体细胞，这两种都有可能，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查基因工程的相关知识，要求考生理解识记有关技术的原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行迁移应用。
二．解答题（共4小题）
17．（2024秋 常州期末）目前检测SARS﹣Cov﹣2病毒RNA最有效的方法是实时荧光RT﹣PCR（RT﹣qPCR）该方法检测一个样品需要超过60分钟。图1为以cDNA为模板进行实时荧光PCR的示意图。请回答下列问题：
（1）RT时，需从样本中提取病毒RNA，经 逆转录 酶作用生成cDNA。
（2）PCR时，需加入荧光染料（如图1中的SYBRGreenⅠ）。进行阶段2时，引物与cDNA按照 碱基互补配对 原则进行特异性结合。进行阶段③时， 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 酶催化子链的合成。
（3）科研人员通过实时荧光RT﹣PCR检测病毒RNA时，荧光强度的变化如图2所示。
①平台期目的基因的数量几乎不再增长，原因可能是 引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降 。
②Ct值的含义是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就 越小 。
③病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图2所示病毒核酸检测结果应判定为 阳性 。
（4）科研人员又发明了一种无逆转录﹣指数扩增反应技术（RTF﹣EXPAR），该技术可在10分钟内准确检测到低浓度SARS﹣Cov﹣2病毒RNA，反应机理如图3所示。研究人员设计的“结合DNA﹣X“含有切口酶识别位点以及与病毒基因组的保守基因Orflab的互补序列。若样本中存在该病毒，在切口酶的作用下生成的“触发DNA﹣X”可与两个重复序列（X'和X'）结合，该重复序列以切口酶识别序列分隔。
①模板链X'﹣X'的序列为：
其中的5'﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开的是 磷酸二酯 键。“触发DNA﹣X”的序列是5' AGGGTAAACCAAATACC 3'。
②RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR更快速地检测病毒RNA的原因有 避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小 。
③尽管RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中 触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交 ，导致扩增效率降低。
【考点】DNA片段的扩增与电泳鉴定．
【专题】正推法；PCR技术；理解能力．
【答案】（1）逆转录
（2）碱基互补配对；耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降；越小；阳性
（4）磷酸二酯；AGGGTAAACCAAATACC；避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小；触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交
【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
【解答】解：（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
（2）PCR是一项根据DNA双链复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，因此进行阶段②时，引物与cDNA按照碱基互补配对原则进行特异性结合。在PCR循环的③延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成。
（3）平台期目的基因的数量几乎不再增长，有可能是引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降导致的。样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct值就越低。据图2可知荧光阈值大概是36，病毒核酸检测结果应判定为阳性。
（4）根据题意可知切口酶是将DNA链切断，因此该酶破坏的是磷酸二酯键，根据题意可知5﹣GACTC﹣3'是切口酶特异性识别的序列，切口酶从其后4个碱基处将“触发DNA﹣X“延伸的DNA链切断切口酶切开，所以可推测“触发DNA﹣X”的序列是5'﹣AGGGTAAACCAAATACC﹣3。据图可知RTF﹣EXPAR的过程避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小，因此RTF﹣EXPAR比RT﹣qPCR能更快速地检测病毒RNA。RTF﹣EXPAR在核酸检测的速度方面有优势，但仍存在一些局限性，例如由于模板是对称的，扩增过程中触发DNA﹣X不可避免地与模板的5端杂交，导致扩增效率低。
故答案为：
（1）逆转录
（2）碱基互补配对；耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
（3）引物浓度下降、TaqDNA聚合酶的活性下降、原料dNTP浓度下降；越小；阳性
（4）磷酸二酯；AGGGTAAACCAAATACC；避免耗时的逆转录步骤、避免了耗时的加热和冷却步骤、扩增的链相比RT﹣qPCR更小；触发DNA﹣X不可避免地与模板的5'端杂交
【点评】本题考查PCR技术等知识，意在考查考生对相关生物技术流程和原理的理解掌握程度。
18．（2025 内蒙古模拟）在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β﹣半乳糖苷酶基因（不含终止编码序列）末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌（缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因），经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题：
（1）使用限制酶 HindⅢ 和 BamHⅠ 对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用 Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是 启动子 。
（4）将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X﹣gal的培养基中培养，若观察到 蓝 色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是 大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色 。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是 目的基导入不成功 。
（5）溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 保证目的基因与质粒的连接 。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；基因工程；解决问题能力．
【答案】（1）HindⅢ；BamHⅠ
（2）Ca2+
（3）启动子
（4）蓝；大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；目的基导入不成功
（5）保证目的基因与质粒的连接
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取
方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建
是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。
（3）将目的基因导入受体细胞
根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。
（4）目的基因的检测与鉴定
分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原﹣抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】解：（1）据图分析，EcoRⅠ和EcoRⅤ都会破坏目的基因，故不能选择，且SacI会破坏复制原点，也不能选择，则目的基因左侧只能选择BamHⅠ，右侧应选择与质粒共同的酶，即HindⅢ，故使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ对质粒和插入DNA片段进行切割。
（2）在转化大肠杆菌前，一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
（3）启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可用于驱动基因的转录，故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。
（4）分析题意，大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，若导入成功，则重组质粒中含有β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；另一种颜色（白色）的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是导入率并非100%，故可能是因为导入不成功。
（5）分析题意，溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是保证目的基因与质粒的正确连接。
故答案为：
（1）HindⅢ；BamHⅠ
（2）Ca2+
（3）启动子
（4）蓝；大肠杆菌缺失内源性β﹣半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β﹣半乳糖苷酶基因，表达出的β﹣半乳糖苷酶分解X﹣gal产生蓝色；目的基导入不成功
（5）保证目的基因与质粒的连接
【点评】本题考查基因工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，学生具备运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
19．（2024秋 朝阳区期末）学习以下材料，回答（1）～（4）题。
工程菌检测癌基因
贝氏不动杆菌（B菌）是一种能在肠道定植且对人体健康无害的细菌。B菌可吸收环境中的DNA片段，并将其整合至自身基因组，该过程称为水平基因转移（HGT）。研究者改造B菌，借助其HGT捕获诱发结肠癌的突变K基因，以辅助诊断结肠癌。
为鉴定B菌捕获K基因的HGT能力，研究者制备两种转基因细胞。转基因结肠癌细胞（R1细胞）染色体上部分DNA序列和转基因B菌（B1菌）拟核上部分DNA序列如图1。当细菌细胞中两个DNA分子的两端具有同源序列时，可发生同源序列之间的片段互换。将B1菌与R1细胞裂解液混合一段时间，再把B1菌接种至含有卡那霉素或壮观霉素的平板上，根据菌落生成情况，确认其具有捕获K基因的HGT能力。
结肠癌细胞以及正常结肠细胞死亡后会将其DNA释放至肠腔中。为进一步获得能够区分突变K基因和正常K基因的B菌，需对其进行优化。B菌中天然存在用于防御噬菌体的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统由Cas蛋白与gRNA构成，其工作原理如图2目标DNA被Cas蛋白切断后，会在细菌细胞中被降解。研究者利用这一机制，构建相关重组DNA并导入B菌，获得B2菌。B2菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活。
研究者对B菌的工程改造策略为检测突变基因提供了新的思路，未来可能会有广泛用途。
（1）图1中B1菌的HGT过程与减数分裂中的 非姐妹染色单体交换片段 过程机制相似，都属于基因重组。
（2）成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是 有、无 。
（3）对文中CRISPR/Cas系统的理解，正确的是 CD （多选）。
A.CRISPR序列中的重复序列编码的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对
B.Cas蛋白能独立识别特定DNA序列并断开磷酸二酯键
C.B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的
D.利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑
（4）B2菌中重组DNA的设计方案如图3，已知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性。请将选项的序号填入图3相应的方框中。① a ；② f ；③ d
a.持续启动基因表达的强启动子
b.卡那霉素诱导型启动子
c.突变K基因
d.正常K基因
e.壮观霉素抗性基因
f.卡那霉素抗性基因
【考点】基因工程在农牧、医疗、食品等方面的应用．
【专题】正推法；基因工程；理解能力．
【答案】（1）非姐妹染色单体交换片段
（2）有、无
（3）CD
（4）①a；②f；③d
【分析】CRISPR/Cas基因编辑技术可简单准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。
【解答】解：（1）据图1可知，两个不同DNA片段由于两端具有同源序列而发生了中间相应基因的互换，与减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间片段的互换类似，都属于基因重组。
（2）据图1可知，经过同源序列之间的片段互换后，B1菌中的DNA上含有了卡那霉素抗性基因，失去了壮观霉素抗性基因，因此成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素的培养基上能够生长，但在含壮观霉素的平板上不能生长，即成功捕获K基因的B1菌在含卡那霉素或壮观霉素的平板上的菌落生成情况分别是有和无。
（3）A、据图可知，CRISPR序列中的经加工后插入到细胞基因组的噬菌体DNA转录形成的RNA序列能与噬菌体DNA碱基互补配对，A错误；
B、Cas蛋白不能识别特定DNA序列，gRNA可识别特定的DNA序列，B错误；
C、B菌的不同菌株中CRISPR序列可能是有差异的，因此转录形成的gRNA可识别噬菌体不同的DNA序列从而实现从不同位点切割，C正确；
D、由于CRISPR/Cas系统中的gRNA可识别特定的DNA序列，而Cas蛋白可切割DNA，因此利用人工改造后的CRISPR/Cas系统可实现对细胞内基因的编辑，D正确。
故选：CD。
（4）根据题意可知，构建的B2菌能捕获诱发结肠癌的突变K基因，并能在CRISPR/Cas系统的作用下对其特异性切割，因此③应为正常K基因，其转录的gRNA能特异性识别正常K基因的特定碱基序列，又知TetR基因的表达产物可抑制P启动子的转录活性，因此需要TetR基因持续表达，故①为持续启动基因表达的强启动子，结合题意B，菌仅在捕获突变K基因后才能在含有卡那霉素的平板上存活，可知②为卡那霉素抗性基因，故①②③依次为a、f、d。
故答案为：
（1）非姐妹染色单体交换片段
（2）有、无
（3）CD
（4）①a；②f；③d
【点评】本题考查基因编辑的相关知识点，意在考查考生对基因编辑技术应用，引导考生关注生物技术与社会的关系。
20．（2025 浙江模拟）东方果蝇繁殖力强，雌蝇产卵于果皮下，幼虫孵化后钻入果肉中蛀食，造成水果腐烂失去商品价值。研究发现，东方果蝇中dsx基因转录出的前体RNA在加工过程中具有独特的性别选择性剪接机制，仅雌果蝇的dsx基因转录出的前体RNA中内含子转录序列会被剪切掉。蓖麻毒素（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡。利用以上信息研发雌性特异性致死基因系统来控制雌蝇的危害，请回答下列问题：
（1）研究者获得如图1所示的融合基因1，进而得到转基因果蝇。
①首先，用PCR技术扩增dsx内含子，应选择图1中的引物是 ad （选填字母）。在PCR反应体系中除了添加模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种dNTP外，缓冲液中一般需要添加 Mg2+ ，其作用是 激活DNA聚合酶的活性 。获得PCR产物后需要进行琼脂糖凝胶电泳实验以便进行相关基因测序。制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，目的是 形成加样孔 。
②然后将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接 雌性特异性剪切识别 序列，构建含融合基因1的表达载体。
③最后将含融合基因1的表达载体导入东方果蝇的 受精卵 （填受体细胞名称）中进一步获得转基因果蝇。判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为图2中的 C （填字母序号）。
（2）研究发现，RTA蛋白第212位甘氨酸替换为精氨酸会出现冷敏感效应（cs），即当温度由29℃变为18℃时，可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用。利用此特性培育纯合转基因果蝇。
①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，先要推测对应的 基因碱基序列 ，再经定点突变获得融合基因2（如图3所示）。请在方框中画出可继续延伸的复性结果 ，要求标明每条链的5'端和3'端。
②对转入融合基因2的果蝇进行以下操作：
i：在29℃收集雄性果蝇（G0）。
ii：G0与野生型果蝇杂交，筛选出转基因受精卵（G1）。
iii：将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若 18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组 ，则说明G1具有cs效应。
iv：在 18 ℃继续培养具有cs效应的G1果蝇，并使其连续多代相互交配，得到转基因纯合子。
【考点】基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；基因工程．
【答案】（1）①ad；Mg2+；激活DNA聚合酶的活性；形成加样孔
②雌性特异性剪切识别
③受精卵 C
②雌性特异性剪切识别
③受精卵；C
（2）①基因碱基序列
②18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组；18
【分析】（1）PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。
（2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：（1）①PCR扩增时一对引物需要与模板的3'端结合，是根据一段已知目的基因的核苷酸序列来设计的，这一对引物位于基因上游和下游，根据图1，扩增dsx内含子应选择的引物是ad；PCR是体外扩增DNA技术，缓冲液中一般需要添加Mg2+中，Mg2+作为DNA聚合酶的激活剂，使酶激活。为了形成加样孔，所以制作凝胶时，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子。
②据图可知，融合基因包括RTA基因和dsx内含子序列，故将扩增的dsx内含子序列插入RTA基因的内部，再连接雌性特异性剪切识别序列。
③将目的基因导入动物细胞通常用受精卵作为对象；RTA基因表达出的蓖麻毒素A（RTA）可通过破坏核糖体导致细胞死亡，由此可知，雌蝇特异性致死的原因是转基因雌蝇个体中含有完整的RTA基因，能成功表达出蓖麻毒素A（RTA），由此判断转基因雌蝇中的成熟mRNA为C。
（2）①欲得到具有cs效应的RTAcs蛋白，可通过蛋白质工程实现，该技术中需根据氨基酸的序列推测对应的脱氧核苷酸序列，经定点突变获得融合基因2。图中虚线方框中的两条链在延伸过程中，既可作为模板又可以起到相当于引物的作用，使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3'端开始连接脱氧核苷酸，继续延伸的复性结果如下：。
②将每对亲本的受精卵（G1）均分为两组，分别在18℃和29℃孵化培养，统计两组中雄性个体所占比例，若G1具有cs效应，则18℃组雌性个体不会致死，雄性个体所占比例小于29℃组。在18℃时可抑制RTA蛋白对细胞的致死作用，为通过多代自交得到转基因纯合子，应在18℃继续培养具有cs效应的G1果蝇。
故答案为：
（1）①ad；Mg2+；激活DNA聚合酶的活性；形成加样孔
②雌性特异性剪切识别
③受精卵 C
②雌性特异性剪切识别
③受精卵；C
（2）①基因碱基序列
②18℃组雄性个体所占比例小于 29℃组；18
【点评】本题考查了基因工程的相关知识，要求考生能运用所学知识，对生物学问题作出准确的解答。
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