2025秋高考生物复习选择性必修3生物技术与工程第十四单元 热点专题13PCR技术及其应用课件(共27张PPT)

(共27张PPT)
热点专题13　PCR技术及其应用
［热点归纳］
1.概念
PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA。
2.PCR的原理
（1）DNA分子的热变性原理。
当温度超过90 ℃时，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。温度缓慢降低到50 ℃左右时，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性。
DNA双链 DNA单链
（2）耐高温的DNA聚合酶。
高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。
（3）关于引物。
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20~30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
（4）PCR（体外的DNA复制）的条件。
①控制温度，但不需解旋酶。
②DNA模板。
③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，还提供能量。
④耐高温的DNA聚合酶。
⑤分别与两条模板链相结合的两种引物。
⑥需要在一定的缓冲液中进行。
3.PCR的过程
（1）一般情况下，DNA模板链较长，需要PCR扩增的基因只是DNA模板链的一段。
（2）第一轮循环，两引物与模板链互补，DNA分子模板链最长，新合成的DNA单链（含有引物的链）较短。
（3）第二轮循环，以含有引物的母链为模板合成的DNA分子，会出现含有引物的DNA，其中新合成的单链b会比母链量更短，其实b就是我们所需扩增的目的基因的长度，只是b为单链。
（4）第三轮循环，以b为模板合成的DNA片段就是目的基因片段的长度。
（5）结果分析。
①两条单链等长DNA（目的基因）从第三轮循环开始出现（甲、乙）。随循环次数的增加，目的基因含量会不断增加。
②通过以上分析可知，PCR反应的产物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，还会存在四种类型的DNA分子（这四种类型同第二轮循环产生的4个DNA分子）。
③DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA（目的基因）从第三轮循环开始出现，随着循环次数的增多，呈指数扩增。
4.PCR的应用
现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序等。
【典例】如果已知一小段 DNA 的序列，可采用 PCR 的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图（以EcoRⅠ酶切为例）：
请据图回答问题。
（1）步骤Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于　　　　生物中，限制酶存在于该类生物中的主要作用是 　 。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的 3'-羟基与 5'-磷酸间形成　　　　　　 ；PCR 每次循环一般可分为　　　　　　　　 （按顺序书写）三步，其中第二步的目的是　　　　　　　　　　　　　　　。
原核
切割外源DNA，保证自身安全
磷酸二酯键
变性、复性、延伸
引物与两条模板DNA单链结合
（3）若下表所列为已知的 DNA 序列和设计的一些 PCR 引物，步骤Ⅲ选用的 PCR 引物必须是　　　　（从引物①②③④中选择，填编号）。
项目 DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知
序列
PCR
引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'
②5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'
③5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'
④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
③④
（4）对 PCR 产物测序，经分析得到了片段 F 的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是　　　。
A.5'-AACTATGCG …… AGCCCTT-3'
B.5'-TTGATACGC …… CGAGTAC-3'
C.5'-GCAATGCGT …… TCGGGAA-3'
D.5'-AATTCCATG …… CTGAATT-3'
D
【解析】（1）步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制酶，主要存在于原核生物中，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，进而在特定部位将双链DNA切开，显然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保证自身安全。（2）步骤Ⅱ用的是 DNA 连接酶，DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键，即催化相邻核苷酸之间的 3'-羟基与 5'-磷酸间形成磷酸二酯键；PCR循环包括变性、复性和延伸三步，该过程中升温到95 ℃是为了使DNA变性解旋，进而获得DNA单链，其中第二步复性是指引物与两条模板DNA单链结合，进而为后续的延伸做准备。
（3）由于DNA聚合酶只能从5'→3'方向催化子链延伸，根据碱基互补配对原则可知，引物①是以目的基因下边那条链的左端为模板向右侧延伸，引物②是以目的基因上边那条链为模板的右端向左侧延伸，引物③是以目的基因下边那条链的右端为模板向右侧延伸，引物④是以目的基因上边那条链的左端为模板向左侧延伸，本题的目的是要扩增已知序列两侧的未知序列，因此，应该选择引物③和④。（4）选项中，A、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要测定的是未知序列，故选D。
解题指导
熟知PCR扩增技术的原理、步骤和相关的技术流程是解答本题的关键，正确分析图示的信息是解答本题的前提，明确题意是解答本题的基础，掌握碱基互补配对原则是解答本题的法宝。
［高考试练］
1.（2024年四川部分学校一模）人们所需要的大部分核酸的碱基对数量远远超过DNA合成仪可以合成的最长核酸链的碱基对数量，而这种大片段基因的人工合成则可以利用重叠延伸PCR的方法（合成过程如图所示）。据图分析回答下列问题。
（1）利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要设计n条单链寡核苷酸片段作为引物（如图中P1~P15），合成这些引物的前提是已知_______
　　　　　　　　　 　。根据图示分析，相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列　　　 ，若第1轮循环需要加入引物P6~P9，请在下图中标注出每个引物的位置。
一段
目的基因的核苷酸序列
重叠
（2）第1轮循环　　　 （填“需要”或“不需要”）添加模板；第2轮循环选择Px和Py分别对应引物　　 　。图示多轮循环　　　 （填“能”或“不能”）在同一个PCR体系中完成，原因是_____________________________
　 。
（3）利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因相对于普通PCR还需要用到
　　　　　　酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有______
　 。
需要
P7、P4
不能
引物之间存在重叠区域，在同
一个PCR体系中引物之间会因为发生碱基互补配对而无法完成PCR扩增
DNA连接
可以
实现基因的定点突变、定点敲除
【解析】（1）PCR过程中需要有一对引物，引物设计的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列；根据图示分析，相邻近的每2条引物之间均有15~25bp的序列存在重叠区域；若第1轮循环需要加入引物P6~P9，结合图示可知， 引物的位置可标注如下： 。（2）PCR扩增时需要模板，故第一轮循环也需要加入模板；引物需要与模板的3'端结合，结合图示箭头方向可知，第2轮循环选择Px和Py分别对应引物是P7、P4；由于引物之间存在重叠区域，在同一个PCR体系中引物之间会因为发生碱基互补配对而无法完成PCR扩增，故图示多轮循环不能在同一个PCR体系中完成。（3）利用重叠延伸PCR人工合成大片段基因需要连接不同的DNA片段，故相对于普通PCR还需要用到DNA连接酶；结合上述内容分析利用该技术合成基因的优势有可以实现基因的定点突变、定点敲除。
2.（2025年湖南长沙阶段练习）猪大肠杆菌会引起仔猪发生肠炎、肠毒血症等疾病。LTB和ST1是猪源大肠杆菌肠毒素基因。研究人员通过重组PCR技术构建了LTB-ST1融合基因，其表达产物LTB-ST1融合蛋白可有效预防仔猪黄痢，该融合基因构建过程如图所示。请回答下列问题：
（1）重组PCR技术依据的生物学原理是　　　　　　　　　　　。
（2）PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行的，两个反应体系中加入的物质中不同的是　　　　　　　。PCR1和PCR2的目的是__________
　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　，从而有利于LTB基因和ST1基因融合。
（3）在②过程中，PCR1和PCR2产物的作用是作为　　　　　　　。
DNA的半保留复制
模板、引物
扩增出
末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链
模板、引物
（4）引物的作用是_______________________________________________
　　　　　　　　　。
（5）定点突变是指使基因特定位点发生碱基对的增添、缺失或者替换。重组PCR技术不仅可用于构建融合基因，还可用于基因定点突变。请结合下图，说明利用重组PCR技术进行基因内部定点突变的方法：__________
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　。
使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接
脱氧核苷酸
根据突变
位点的碱基序列设计引物b和引物c，进行重组PCR
【解析】（1）PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（2）PCR1和PCR2是在两个不同反应体系中进行，扩增的是两个不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同；由图可知，PCR1和PCR2的目的是扩增出末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链，以便于将两个基因单链根据碱基互补配对接到一起，再以剩下的单链部分互为模板扩增出LTB—ST1融合基因。（3）PCR1和PCR2的产物是末端部分碱基序列互补配对的LTB和ST1单链，以便于将两个基因连接到一起，所以PCR1和PCR2产物碱基互补序列可起到引物的作用，剩余未互补序列可作为PCR扩增的模板。
（4）（耐高温的）DNA聚合酶不能从头开始将脱氧核苷酸聚合为核苷酸单链，只能在已有的核酸片段的3'端开始延伸，因此引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。（5）利用重组PCR技术进行基因定点突变，可以把突变位点设计在引物上，从而加到新合成的DNA上。据图，利用重组PCR技术进行基因内部定点突变多方法是：根据突变位点的碱基序列设计引物b和c，然后分别利用引物a和b、引物c和d进行PCR获得相应的产物，再按图中①②步骤获得含突变位点的基因，接着用引物a和d进行PCR扩增完整含有突变位点的基因。