2025秋高考生物复习选择性必修3生物技术与工程第十四单元基因工程生物技术的安全性与伦理问题课件(共110张PPT)
文档属性
| 名称 | 2025秋高考生物复习选择性必修3生物技术与工程第十四单元基因工程生物技术的安全性与伦理问题课件(共110张PPT) |  | |
| 格式 | ppt | ||
| 文件大小 | 28.0MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-06-12 11:06:53 | ||
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文档简介
(共110张PPT)
课标考情——知考向 核心素养——提考能
课标
要求 1.简述基因工程的诞生
2.简述基因工程的原理及技术（含PCR技术）
3.举例说明基因工程的应用
4.简述蛋白质工程
5.活动：DNA的粗提取与鉴定
6.讨论生物技术中的伦理问题 生命观念 基因的结构决定其功能
科学思维 能够结合具体实例，归纳与概括转基因的原理和步骤，并构建流程图
科学探究 蛋白质工程的应用，DNA的粗提取与鉴定
社会责任 基因工程在生产实践中的应用，防止基因污染，保护环境
1.基因工程的概念
知识点一 基因工程及基因工程的基本工具
［自主学习］
基因工程的别名 技术
操作环境
操作对象 基因
操作水平 水平
基本过程 剪切→ → →表达
结果 人类需要的新的生物类型或
优点 ①可 生物的遗传性状；
②可克服远缘杂交不亲和的障碍
重组DNA
生物体外
DNA分子
拼接
导入
生物产物
定向改造
2.基因工程的基本操作工具
原核生物
磷酸二酯键
黏性末端
磷酸二酯键
平末端
低
目的基因
质粒
自我复制
1.深挖教材。
（1）限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
［自主检测］
提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经无法识别
（2）切取目的基因与切割载体时只能使用“同一种酶”吗？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
提示：①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性（或平）末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，在切割目的基因和载体时，均使用两种不同的限制酶，使目的基因和载体各具有两个不同的末端
2.热图导析。
限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是
和 。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并说明理由：____________________________________
________________________________________________________________
。
提示：适合的质粒是①。由图可知，
质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有
限制酶的识别位点，使用限制酶后将会导致标记基因遭破坏，故②③④
均不宜选作载体
1.基因工程的基本操作程序
知识点二 基因工程的基本操作程序及应用
［自主学习］
基因文库
PCR
启动子
标记基因
农杆菌转化
显微注射
PCR
抗原—抗体杂交
2.利用PCR获取和扩增目的基因
DNA半保留复制
PCR扩增仪（PCR仪）
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
受热变性
50
引物
72
耐高温的DNA聚合酶
3'
指数
琼脂糖凝胶电泳
1.深挖教材。
（1）利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器的知识，结合基因工程操作程序的基本思路分析，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
［自主检测］
提示：不可以。人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，不可以在大肠杆菌中生产人的糖蛋白
（2）启动子=起始密码子吗？终止子=终止密码子吗？
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
提示：①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止
2.热图导析：抗虫棉的培育过程。
（1）该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？____________________________
。
（2）该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
。
提示：目的基因是Bt基因，
载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的
黏性末端，便于构建基因表达载体
提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
1.概念理解
（1）基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
（2）操作： 或合成基因。
（3）结果：改造了现有蛋白质或制造出 。
（4）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对 进行设计改造。
知识点三 蛋白质工程
［自主学习］
改造
新的蛋白质
蛋白质的结构
2.蛋白质工程的设计流程
功能
蛋白质结构
氨基酸序列
脱氧核苷酸序
列（基因）
蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？
。
［自主检测］
提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传
知识点四 DNA的粗提取与鉴定
［自主学习］
1.实验原理
（1）DNA不溶于 ，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
（2）DNA+二苯胺 色。
酒精
蓝
2.操作流程
新鲜洋葱
酒精
二苯胺
知识点五 生物技术的安全性和伦理问题
［自主学习］
经济发展水平
安全性
生殖
不赞成
不支持
基因检测
基因歧视
致病菌类
不生产
［自主检测］
试管婴儿和“设计试管婴儿”的比较。
（1）不同点
①所用技术手段：“设计试管婴儿”胚胎移植前 （填“需要”或“不需要”）进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿 （填“需要”或“不需要”）进行遗传学诊断或基因诊断。
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，“设计试管婴儿”主要用于白血病、贫血症的治疗。
（2）相同点：
。
需要
不需要
都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过
胚胎移植，都是有性生殖
1.限制性内切核酸酶（限制酶）
（1）识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论碱基数是奇数还是偶数，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GCCG┋GCCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。
基因工程的操作工具
［深度讲解］
（2）切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。
①当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
②当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。
2.限制酶与DNA连接酶的关系
（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
（2）限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3.与DNA分子相关的几种酶的比较
项目 限制酶 DNA
连接酶 DNA
聚合酶 解旋酶
作用
底物 DNA分子 DNA
分子片段 脱氧
核苷酸 DNA
分子
作用
部位 磷酸二酯键 磷酸
二酯键 磷酸
二酯键 碱基对间
的氢键
项目 限制酶 DNA
连接酶 DNA
聚合酶 解旋酶
作用
特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA
两条链
之间的
氢键打开
作用
结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链
DNA分子
4.选择限制酶的注意事项
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点）。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。
③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
④如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
基因工程操作基本工具的八个易错点
（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。
（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
（6）限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
（7）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
（8）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由______________
连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有 种不同长度的DNA片段。
脱氧核糖—
磷酸—脱氧核糖
平
537 bp、790 bp、661 bp
4
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是__________________________________________
。
BamHⅠ
抗生素B
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的
基因D与质粒反向连接
【解析】（1）两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。（2）根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537 bp、790 bp、661 bp。（3）图1DNA片段有两个Sma Ⅰ酶切位点，完全切割后出现三个片段的长度分别为537 bp、790 bp、661 bp，若图1中虚线方框内的碱基被A-T碱基对替换，基因D就突变成基因d，用限制性内切核酸酶Sma Ⅰ完全切割基因d，出现两个片段长度分别是1 327 bp、661 bp。其中1个DNA片段与未替换前完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。
（4）切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。
基因工程的操作过程及蛋白质工程及其与基因工程的关系
［深度讲解］
2.基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的组成及作用。
（2）构建过程。
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
5.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
基因工程中的三个易错点
（1）基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
（2）目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。
（3）启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
［考向预测］
（一）考查基因工程的操作过程（素养目标：科学探究）
1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。
注：普通大肠杆菌菌落为乳白色，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质。
请根据以上信息回答下列问题：
（1）从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足的环境条件有 、
。
（2）利用PCR可以在体外扩增含该目的基因的DNA片段，其扩增循环一般可以分为 、 、 三步。
（3）为了确保目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆和成功表达，可以采用 的方法。
无菌、无毒的环境
适宜的气体环境
变性
复性
延伸
用两种不同的限制酶切割目的基因和载体
（4）在完成第④步操作后，菌液中大肠杆菌分为未转化、导入空白质粒、导入重组质粒三种，它们在图中培养基中培养后观察到的结果分别是
、 、 。
没有菌落
蓝色菌落
乳白色菌落
【解析】（1）结合分析可知，从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足无菌、无毒的环境和适宜的气体环境（95%空气+5%CO2）。（2）PCR可以在体外完成目的基因的DNA片段的扩增，其扩增循环一般可以分为变性、复性、延伸三步，需要的温度条件依次为高温、低温和中温。（3）为了确保目的基因与载体发生定向连接，防止发生自身环化和插入方向错误，导致无法定向克隆和成功表达，可以通过用两种不同的酶切割出具有不同末端的载体和含有目的基因的DNA片段，而后通过DNA连接酶的作用实现目的基因和载体的正向连接。
（4）未转化的大肠杆菌不含AmpR，不能在含有青霉素的培养基中形成菌落，空白质粒含有完整的LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，导致该大肠杆菌菌落呈现为蓝色；目的基因插入到LacZ基因中产生的重组质粒，没有完整的LacZ基因，不能发生颜色变化，大肠杆菌菌落表现为正常的乳白色。
（二）考查蛋白质工程的应用（素养目标：社会责任）
2.1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：
（1）由于密码子的 ，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （填“AB”“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（2）图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶
的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’_________________
3'。
简并
AB和BCA
XhoⅠ和MunⅠ
-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-
（3）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经 （处理方法），大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。
（4）科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→ →推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
Ca2+处理法
白
设计预期的蛋白质结构
DNA的粗提取与鉴定
［深度讲解］
DNA的粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较
试剂 浓度 用途 主要原理
NaCl
溶液 2 mol/L 溶解
DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变
酒精
溶液 95%
（体积
分数） 除去杂
质以提
纯DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质可溶于酒精溶液
二苯胺
试剂 — 鉴定剂 DNA遇二苯胺试剂（沸水浴）会变蓝色
［考向预测］
考查DNA的粗提取与鉴定（素养目标：科学探究）
如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
（1）图中实验材料A可以是 等，研磨前加入的B应该是 。
（2）通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是 。
新鲜洋葱（或菜花）
研磨液
使DNA溶解
（3）在该实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，其中含DNA最少的是滤液 。
1 B液中 搅拌研磨后过滤 滤液E
2 2 mol/L的
NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液F
3 0.14 mol/L的NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液G
4 预冷的95%的酒精溶液中 搅拌后过滤 滤液H
H
（4）DNA鉴定的原理是___________________________________________
。
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被
染成蓝色
【解析】（1）选用新鲜洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入研磨液，进行充分的搅拌和研磨。（2）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。（3）DNA不溶于预冷的酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。
1.（2024年湖北卷）波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是 （ ）
A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D.生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
D
【解析】选择遗传性状优良的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；胚胎移植前，采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；作为受体的杜泊母山羊只需具备健康的体质和正常繁殖能力即可，但山羊和绵羊是不同的物种，具有生殖隔离，不能将山羊的胚胎移植到绵羊子宫发育，即普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。
2.（2024年江西卷）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coli A构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 （ ）
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
D
【解析】不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coli B中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.coli B中含有该酶的基因，因而能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了NcoⅠ和KpnⅠ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR产物也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。
3.（2024年山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 （ ）
A.①② B.②③
C.①④ D.③④
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
D
【解析】分析反应管①~④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；
④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④，故选D。
4.（2024年广东卷）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（如图1）。
回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基的 （答出2点即可）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
碳源、氮源
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图2a，载体的部分结构见图2b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
PT7、PBAD 和PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答出2点即可）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：________________________________________________
。
抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶（或将
酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）
【解析】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。（2）题图2a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图1，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。（4）由（2）分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。（5）由（2）分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶（或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）。
5.（2023年广东卷）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
野生型
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和_____ 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
载体
启动子和终止子
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 ________________________
。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
DAI基因和卡那霉素抗性
基因
75
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
自交
100
【解析】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液
中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求“选出单一位点插入的植株”，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种
于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即为需要选择的植株，阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，图见答案。
6.（2023年山东卷）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________
（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____ （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
RNA聚合酶
限制酶切割位点、标记基因、
复制原点等
F2和R1或F1与R2
a链
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白________ （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
J-V5融合蛋白
不是
【解析】（1）启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是
模板链，而根据启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3'→5'，非模板链（也就是a链）是5'→3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5'→3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'→3'，所以引物结合的单链其方向是3'→5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3'→5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测没有条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
A组 基础巩固练
1.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是 （ ）
A.限制酶、解旋酶、DNA连接酶
B.解旋酶、限制酶、DNA连接酶
C.解旋酶、DNA连接酶、限制酶
D.限制酶、DNA连接酶、解旋酶
（本讲对应学生用书P420~422）
B
【解析】①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。
2.（2024年河北衡水模拟预测）现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是 （ ）
A.在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B.图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C.图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D.图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
D
【解析】动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离 ，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl 和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。
3.（2024年广东韶关二模）科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质）第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA等。下列叙述错误的是 （ ）
A.上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B.在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C.上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D.用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
C
【解析】据图分析，通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确定基因中碱基对的排列顺序，A正确；蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B正确；基因a的基本单位是四种脱氧核苷酸，b是mRNA基本单位是四种核糖核苷酸，因此大分子物质a和b的单体序列均不是唯一的，C错误；基因工程是利用已有的基因生产蛋白质，而蛋白质工程是通过改造基因从而获得原本没有的蛋白质，因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D正确。
4.（2024年广东四校联考一模）“水稻→褐飞虱→拟水狼蛛”表示某农田生态系统的一条食物链。Bt毒蛋白转基因水稻中含有的CrylAb杀虫蛋白可以和目标昆虫肠道上的特异性受体结合发挥杀虫效应，CrylAb杀虫蛋白可通过食物链转移至褐飞虱和拟水狼蛛体内，并产生富集效应，但不会对其存活、行为带来影响。下列有关叙述错误的是 （ ）
A.褐飞虱和拟水狼蛛肠道内缺乏Cry1Ab受体
B.营养级越高，生物体内Cry1Ab的含量就越少
C.富集效应的产生和生物体内不含CrylAb水解酶有关
D.Cry1Ab在褐飞虱体内积累可能带来一定的生态风险
B
【解析】根据题意分析，CrylAb杀虫蛋白可以和目标昆虫肠道上的特异性受体结合发挥杀虫效应，但是对稻飞虱和拟水狼蛛无害，因此说明褐飞虱和拟水狼蛛肠道内缺乏CrylAb受体，A正确；难以分解的物质会随着食物链不断富集，一般来说营养级越高，生物体内的有害物质的浓度就越高，B错误；CrylAb水解酶会水解CrylAb，结合题干“CrylAb杀虫蛋白可通过食物链转移至褐飞虱和拟水狼蛛体内，并产生富集效应”可知，富集效应的产生和生物体内不含CrylAb水解酶有关，C正确；转基因产物转移到其他生物体内可能带来一定的生态风险，D正确。
B组 能力提升练
5.土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种桔粳88中，培育出了耐盐碱水稻新品种。其操作流程及可能用到的限制酶如下图所示，图中Bar为抗除草剂基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因。请分析回答：
限制酶 SacⅠ SmaⅠ BamHⅠ BclⅠ
识别序
列和切
割位点
（1）过程①利用PCR技术扩增并改造OsMYB56基因需要添加引物，为了构建基因表达载体时用相同限制酶切割后的质粒和OsMYB56基因能正确连接，应选用的引物组合为 。
A.5'-CCCGGG…-3'和5'-GGATCC…-3'
B.5'-GAGCTC…-3'和5'-GGATCC…-3'
C.5'-GAGCTC…-3'和5'-TGATCA…-3'
D.5'-CCCGGG…-3'和5'-TGATCA…-3'
B
（2）根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV 53S是 。
（3）为筛选出含重组T-DNA的水稻愈伤组织细胞，应在添加 的选择培养基上培养。诱导水稻愈伤组织再分化发育成植株的培养过程中，
（填“需要”或“不需要”）给予光照。
（4）为确定转基因耐盐碱水稻是否培育成功，可用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐碱性。经检测，科研人员发现部分获得耐盐碱基因OsMYB56的水稻幼菌不具有耐盐碱能力，原因可能是_________
_________________________________________________________________
。
启动子
除草剂
需要
一定浓度的盐水浇灌
虽然获得了
相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常（或耐盐基因OsMYB56
表达异常）
6.（2023年广东高三校联考）In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15~20 bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：
（1）过程①需要用到的酶是 。过程③中，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
（2）为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依据 序列进行设计。
耐高温的DNA聚合酶（或Taq DNA聚合酶）
防止目的基因反向连接，防止线性化质粒（或目的基因自身环化）
目的基因与质粒
（3）若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培养相同时间，然后采用
法进行计数。若结果较真实值偏小，原因是____________
。
（4）与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优势有_________
________________________________________________________________
。（至少答出两点）
稀释涂布平板
当两个或多个
细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落
酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对
不受限制
质粒功能区的破坏
7.（2024年广东江门一模）RDX是某种军用弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，让转基因植物修复因军用炸药RDX污染的土壤。基因XplA和XplB与引物结合位点及模板链分布情况如图1所示。图2为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：
（1）从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精（体积分数为95%）初步分离DNA与蛋白质，原理是 。然后再利用PCR的方法从提取的DNA中获取目的基因，在PCR的反应体系中，引物的作用是 ，DNA聚合酶需要 激活。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
镁离子
（2）若要构建图2中的融合基因，应选择图1的引物组合 ，以便通过PCR检测其中的XplA和XplB基因形成的融合基因是否准确。
（3）将融合基因与农杆菌Ti质粒的T-DNA重组，构建基因表达载体。用Ca2+溶液处理农杆菌后使其处于 的状态，将其与基因表达载体混合一段时间，在添加 的培养基中，经筛选得到含基因表达载体的农杆菌。通过农杆菌的 作用，就可以使融合基因进入植物细胞。
引物1、引物3
能吸收周围环境中DNA分子
潮霉素
转化
（4）用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解RDX物质，原因是________________
。
导入的融合基因
不一定能够成功表达
8.如图为利用PCR技术检测受检人是否携带HIV（属逆转录病毒）的示意图。请回答：
（1）组成HIV的遗传物质的单体是 。HIV携带者T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，原因是____________________________
。
（2）设计图中所示的引物时，应满足以下要求：
①引物自身不能存在互补配对序列，原因是避免引物自身通过折叠形成双链区；
②引物之间不能存在 ，原因是避免两引物结合成双链；
③ 。
核糖核苷酸
HIV的RNA逆转录出的DNA能
整合到T细胞的核DNA中，且能被正常转录和翻译（合理即可）
互补配对序列
引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对
（3）在PCR反应体系中，除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外，还应有 （填序号）。
①Taq酶 ②dNTP（dCTP、dATP、dGTP和dTTP） ③四种碱基 ④ATP ⑤氨基酸
（4）利用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，需使用DNA连接酶来构建基因表达载体。常用DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端且效率更高的是 ，DNA连接酶催化形成的化学键是 。基因表达载体必须有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为 。
①②
T4 DNA连接酶
磷酸二酯键
启动子
C组 压轴培优练
9.下图是利用转基因技术培育抗病小麦的过程。请据图回答问题：
（1）重组质粒T除含有目的基因外，还必须有 、 和
等。
（2）图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是 。
（3）在步骤⑤⑥中都需用 处理。为了确认目的基因通过⑦导入植物细胞后是否转录，通常采用 技术进行检测；验证目的基因导入受体细胞后是否成功表达，通常采用 法从分子水平进行检测。
启动子
终止子
标记基因
获取大量重组质粒（或让目的基因扩增）
Ca2+
PCR
抗原-抗体杂交
（4）假设该抗病基因D，通过基因工程导入小麦后连接到小麦的一条染色体上，则该小麦进行减数分裂的细胞在联会时有 个D基因。
2
课标考情——知考向 核心素养——提考能
课标
要求 1.简述基因工程的诞生
2.简述基因工程的原理及技术（含PCR技术）
3.举例说明基因工程的应用
4.简述蛋白质工程
5.活动：DNA的粗提取与鉴定
6.讨论生物技术中的伦理问题 生命观念 基因的结构决定其功能
科学思维 能够结合具体实例，归纳与概括转基因的原理和步骤，并构建流程图
科学探究 蛋白质工程的应用，DNA的粗提取与鉴定
社会责任 基因工程在生产实践中的应用，防止基因污染，保护环境
1.基因工程的概念
知识点一 基因工程及基因工程的基本工具
［自主学习］
基因工程的别名 技术
操作环境
操作对象 基因
操作水平 水平
基本过程 剪切→ → →表达
结果 人类需要的新的生物类型或
优点 ①可 生物的遗传性状；
②可克服远缘杂交不亲和的障碍
重组DNA
生物体外
DNA分子
拼接
导入
生物产物
定向改造
2.基因工程的基本操作工具
原核生物
磷酸二酯键
黏性末端
磷酸二酯键
平末端
低
目的基因
质粒
自我复制
1.深挖教材。
（1）限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
［自主检测］
提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经无法识别
（2）切取目的基因与切割载体时只能使用“同一种酶”吗？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
提示：①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性（或平）末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，在切割目的基因和载体时，均使用两种不同的限制酶，使目的基因和载体各具有两个不同的末端
2.热图导析。
限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是
和 。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并说明理由：____________________________________
________________________________________________________________
。
提示：适合的质粒是①。由图可知，
质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有
限制酶的识别位点，使用限制酶后将会导致标记基因遭破坏，故②③④
均不宜选作载体
1.基因工程的基本操作程序
知识点二 基因工程的基本操作程序及应用
［自主学习］
基因文库
PCR
启动子
标记基因
农杆菌转化
显微注射
PCR
抗原—抗体杂交
2.利用PCR获取和扩增目的基因
DNA半保留复制
PCR扩增仪（PCR仪）
耐高温的DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
受热变性
50
引物
72
耐高温的DNA聚合酶
3'
指数
琼脂糖凝胶电泳
1.深挖教材。
（1）利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器的知识，结合基因工程操作程序的基本思路分析，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
［自主检测］
提示：不可以。人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，不可以在大肠杆菌中生产人的糖蛋白
（2）启动子=起始密码子吗？终止子=终止密码子吗？
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
提示：①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止
2.热图导析：抗虫棉的培育过程。
（1）该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？____________________________
。
（2）该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
。
提示：目的基因是Bt基因，
载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的
黏性末端，便于构建基因表达载体
提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫
1.概念理解
（1）基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
（2）操作： 或合成基因。
（3）结果：改造了现有蛋白质或制造出 。
（4）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对 进行设计改造。
知识点三 蛋白质工程
［自主学习］
改造
新的蛋白质
蛋白质的结构
2.蛋白质工程的设计流程
功能
蛋白质结构
氨基酸序列
脱氧核苷酸序
列（基因）
蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？
。
［自主检测］
提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传
知识点四 DNA的粗提取与鉴定
［自主学习］
1.实验原理
（1）DNA不溶于 ，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
（2）DNA+二苯胺 色。
酒精
蓝
2.操作流程
新鲜洋葱
酒精
二苯胺
知识点五 生物技术的安全性和伦理问题
［自主学习］
经济发展水平
安全性
生殖
不赞成
不支持
基因检测
基因歧视
致病菌类
不生产
［自主检测］
试管婴儿和“设计试管婴儿”的比较。
（1）不同点
①所用技术手段：“设计试管婴儿”胚胎移植前 （填“需要”或“不需要”）进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿 （填“需要”或“不需要”）进行遗传学诊断或基因诊断。
②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，“设计试管婴儿”主要用于白血病、贫血症的治疗。
（2）相同点：
。
需要
不需要
都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过
胚胎移植，都是有性生殖
1.限制性内切核酸酶（限制酶）
（1）识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论碱基数是奇数还是偶数，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GCCG┋GCCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。
基因工程的操作工具
［深度讲解］
（2）切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。
①当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
②当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。
2.限制酶与DNA连接酶的关系
（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
（2）限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3.与DNA分子相关的几种酶的比较
项目 限制酶 DNA
连接酶 DNA
聚合酶 解旋酶
作用
底物 DNA分子 DNA
分子片段 脱氧
核苷酸 DNA
分子
作用
部位 磷酸二酯键 磷酸
二酯键 磷酸
二酯键 碱基对间
的氢键
项目 限制酶 DNA
连接酶 DNA
聚合酶 解旋酶
作用
特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA
两条链
之间的
氢键打开
作用
结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链
DNA分子
4.选择限制酶的注意事项
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点）。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。
③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。
④如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
基因工程操作基本工具的八个易错点
（1）限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（2）限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
（3）在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
（4）将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。
（5）不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
（6）限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
（7）基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
（8）基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由______________
连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是 末端，其产物长度为 。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有 种不同长度的DNA片段。
脱氧核糖—
磷酸—脱氧核糖
平
537 bp、790 bp、661 bp
4
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是 。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加 的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是__________________________________________
。
BamHⅠ
抗生素B
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的
基因D与质粒反向连接
【解析】（1）两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。（2）根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537 bp、790 bp、661 bp。（3）图1DNA片段有两个Sma Ⅰ酶切位点，完全切割后出现三个片段的长度分别为537 bp、790 bp、661 bp，若图1中虚线方框内的碱基被A-T碱基对替换，基因D就突变成基因d，用限制性内切核酸酶Sma Ⅰ完全切割基因d，出现两个片段长度分别是1 327 bp、661 bp。其中1个DNA片段与未替换前完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。
（4）切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。
基因工程的操作过程及蛋白质工程及其与基因工程的关系
［深度讲解］
2.基因表达载体的构建
（1）基因表达载体的组成及作用。
（2）构建过程。
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
5.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
基因工程中的三个易错点
（1）基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。
（2）目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。
（3）启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
［考向预测］
（一）考查基因工程的操作过程（素养目标：科学探究）
1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存和表达。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如图所示。
注：普通大肠杆菌菌落为乳白色，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质。
请根据以上信息回答下列问题：
（1）从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足的环境条件有 、
。
（2）利用PCR可以在体外扩增含该目的基因的DNA片段，其扩增循环一般可以分为 、 、 三步。
（3）为了确保目的基因与载体的连接发生定向连接重组，以便定向克隆和成功表达，可以采用 的方法。
无菌、无毒的环境
适宜的气体环境
变性
复性
延伸
用两种不同的限制酶切割目的基因和载体
（4）在完成第④步操作后，菌液中大肠杆菌分为未转化、导入空白质粒、导入重组质粒三种，它们在图中培养基中培养后观察到的结果分别是
、 、 。
没有菌落
蓝色菌落
乳白色菌落
【解析】（1）结合分析可知，从动物体内获取细胞进行培养时，除了细胞需要的各种营养物质和适宜的温度、pH和渗透压外，还需要满足无菌、无毒的环境和适宜的气体环境（95%空气+5%CO2）。（2）PCR可以在体外完成目的基因的DNA片段的扩增，其扩增循环一般可以分为变性、复性、延伸三步，需要的温度条件依次为高温、低温和中温。（3）为了确保目的基因与载体发生定向连接，防止发生自身环化和插入方向错误，导致无法定向克隆和成功表达，可以通过用两种不同的酶切割出具有不同末端的载体和含有目的基因的DNA片段，而后通过DNA连接酶的作用实现目的基因和载体的正向连接。
（4）未转化的大肠杆菌不含AmpR，不能在含有青霉素的培养基中形成菌落，空白质粒含有完整的LacZ基因，其编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，导致该大肠杆菌菌落呈现为蓝色；目的基因插入到LacZ基因中产生的重组质粒，没有完整的LacZ基因，不能发生颜色变化，大肠杆菌菌落表现为正常的乳白色。
（二）考查蛋白质工程的应用（素养目标：社会责任）
2.1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：
（1）由于密码子的 ，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （填“AB”“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
（2）图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶
的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’_________________
3'。
简并
AB和BCA
XhoⅠ和MunⅠ
-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-
（3）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经 （处理方法），大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。
（4）科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→ →推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
Ca2+处理法
白
设计预期的蛋白质结构
DNA的粗提取与鉴定
［深度讲解］
DNA的粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较
试剂 浓度 用途 主要原理
NaCl
溶液 2 mol/L 溶解
DNA DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变
酒精
溶液 95%
（体积
分数） 除去杂
质以提
纯DNA DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质可溶于酒精溶液
二苯胺
试剂 — 鉴定剂 DNA遇二苯胺试剂（沸水浴）会变蓝色
［考向预测］
考查DNA的粗提取与鉴定（素养目标：科学探究）
如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
（1）图中实验材料A可以是 等，研磨前加入的B应该是 。
（2）通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是 。
新鲜洋葱（或菜花）
研磨液
使DNA溶解
（3）在该实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，其中含DNA最少的是滤液 。
1 B液中 搅拌研磨后过滤 滤液E
2 2 mol/L的
NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液F
3 0.14 mol/L的NaCl溶液中 搅拌后过滤 滤液G
4 预冷的95%的酒精溶液中 搅拌后过滤 滤液H
H
（4）DNA鉴定的原理是___________________________________________
。
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被
染成蓝色
【解析】（1）选用新鲜洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入研磨液，进行充分的搅拌和研磨。（2）DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。（3）DNA不溶于预冷的酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。
1.（2024年湖北卷）波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉，具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是 （ ）
A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D.生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
D
【解析】选择遗传性状优良的健康波尔母山羊作为供体，进行超数排卵处理，A正确；胚胎移植前，采集部分滋养层细胞进行遗传学检测，B正确；作为受体的杜泊母山羊只需具备健康的体质和正常繁殖能力即可，但山羊和绵羊是不同的物种，具有生殖隔离，不能将山羊的胚胎移植到绵羊子宫发育，即普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体，C正确；生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子，D错误。
2.（2024年江西卷）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coli A构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是 （ ）
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
D
【解析】不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E.coli B中能表达L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因此可用E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.coli B中含有该酶的基因，因而能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了NcoⅠ和KpnⅠ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR产物也未必非要用这两种酶，而是可以用同尾酶替代，D正确。
3.（2024年山东卷）制备荧光标记的DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP）的反应管①~④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有 （ ）
A.①② B.②③
C.①④ D.③④
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3'
3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3'
3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
D
【解析】分析反应管①~④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；
④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3'端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④，故选D。
4.（2024年广东卷）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（如图1）。
回答下列问题：
（1）研究者优化了培养基的 （答出2点即可）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
碳源、氮源
（2）研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图2a，载体的部分结构见图2b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
PT7、PBAD 和PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答出2点即可）。
（4）根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
（5）有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：________________________________________________
。
抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶（或将
酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）
【解析】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。（2）题图2a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图1，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。（4）由（2）分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。（5）由（2）分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶（或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白）。
5.（2023年广东卷）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
野生型
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和_____ 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
载体
启动子和终止子
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图所示），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 ________________________
。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
DAI基因和卡那霉素抗性
基因
75
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
自交
100
【解析】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液
中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求“选出单一位点插入的植株”，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种
于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株，即为需要选择的植株，阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，图见答案。
6.（2023年山东卷）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
（1）与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有______________________________
（答出2个结构即可）。
（2）构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____ （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
RNA聚合酶
限制酶切割位点、标记基因、
复制原点等
F2和R1或F1与R2
a链
（3）重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白________ （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
J-V5融合蛋白
不是
【解析】（1）启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是
模板链，而根据启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3'→5'，非模板链（也就是a链）是5'→3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5'→3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'→3'，所以引物结合的单链其方向是3'→5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3'→5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测没有条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
A组 基础巩固练
1.如图为DNA分子的某一片段，其中①②③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是 （ ）
A.限制酶、解旋酶、DNA连接酶
B.解旋酶、限制酶、DNA连接酶
C.解旋酶、DNA连接酶、限制酶
D.限制酶、DNA连接酶、解旋酶
（本讲对应学生用书P420~422）
B
【解析】①处为氢键，是解旋酶的作用部位；②处为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；③处为两个DNA片段的缺口，是DNA连接酶的作用部位。
2.（2024年河北衡水模拟预测）现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是 （ ）
A.在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B.图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C.图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D.图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
D
【解析】动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离 ，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl 和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。
3.（2024年广东韶关二模）科学家利用蛋白质工程技术将水蛭素（一种可用于预防和治疗血栓的蛋白质）第47位的天冬酰胺替换为赖氨酸，显著提高了它的抗凝血活性，流程图如下。已知天冬酰胺对应的密码子为AAU、AAC，赖氨酸对应的密码子为AAA、GUA等。下列叙述错误的是 （ ）
A.上图的操作流程是从预期的水蛭素功能出发的
B.在这项替换研究中目前可行的直接操作对象是基因
C.上图中大分子物质a和b的单体序列均是唯一的
D.用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质
C
【解析】据图分析，通过分析预期的水蛭素功能推导出蛋白质的结构，进而明确氨基酸序列，最终确定基因中碱基对的排列顺序，A正确；蛋白质的改造工程直接改变的是控制蛋白质合成所对应的基因，B正确；基因a的基本单位是四种脱氧核苷酸，b是mRNA基本单位是四种核糖核苷酸，因此大分子物质a和b的单体序列均不是唯一的，C错误；基因工程是利用已有的基因生产蛋白质，而蛋白质工程是通过改造基因从而获得原本没有的蛋白质，因此用蛋白质工程可生产基因工程所不能生产的蛋白质，D正确。
4.（2024年广东四校联考一模）“水稻→褐飞虱→拟水狼蛛”表示某农田生态系统的一条食物链。Bt毒蛋白转基因水稻中含有的CrylAb杀虫蛋白可以和目标昆虫肠道上的特异性受体结合发挥杀虫效应，CrylAb杀虫蛋白可通过食物链转移至褐飞虱和拟水狼蛛体内，并产生富集效应，但不会对其存活、行为带来影响。下列有关叙述错误的是 （ ）
A.褐飞虱和拟水狼蛛肠道内缺乏Cry1Ab受体
B.营养级越高，生物体内Cry1Ab的含量就越少
C.富集效应的产生和生物体内不含CrylAb水解酶有关
D.Cry1Ab在褐飞虱体内积累可能带来一定的生态风险
B
【解析】根据题意分析，CrylAb杀虫蛋白可以和目标昆虫肠道上的特异性受体结合发挥杀虫效应，但是对稻飞虱和拟水狼蛛无害，因此说明褐飞虱和拟水狼蛛肠道内缺乏CrylAb受体，A正确；难以分解的物质会随着食物链不断富集，一般来说营养级越高，生物体内的有害物质的浓度就越高，B错误；CrylAb水解酶会水解CrylAb，结合题干“CrylAb杀虫蛋白可通过食物链转移至褐飞虱和拟水狼蛛体内，并产生富集效应”可知，富集效应的产生和生物体内不含CrylAb水解酶有关，C正确；转基因产物转移到其他生物体内可能带来一定的生态风险，D正确。
B组 能力提升练
5.土壤盐渍化影响水稻生长发育。科研人员将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种桔粳88中，培育出了耐盐碱水稻新品种。其操作流程及可能用到的限制酶如下图所示，图中Bar为抗除草剂基因，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，Tetr为四环素抗性基因。请分析回答：
限制酶 SacⅠ SmaⅠ BamHⅠ BclⅠ
识别序
列和切
割位点
（1）过程①利用PCR技术扩增并改造OsMYB56基因需要添加引物，为了构建基因表达载体时用相同限制酶切割后的质粒和OsMYB56基因能正确连接，应选用的引物组合为 。
A.5'-CCCGGG…-3'和5'-GGATCC…-3'
B.5'-GAGCTC…-3'和5'-GGATCC…-3'
C.5'-GAGCTC…-3'和5'-TGATCA…-3'
D.5'-CCCGGG…-3'和5'-TGATCA…-3'
B
（2）根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV 53S是 。
（3）为筛选出含重组T-DNA的水稻愈伤组织细胞，应在添加 的选择培养基上培养。诱导水稻愈伤组织再分化发育成植株的培养过程中，
（填“需要”或“不需要”）给予光照。
（4）为确定转基因耐盐碱水稻是否培育成功，可用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐碱性。经检测，科研人员发现部分获得耐盐碱基因OsMYB56的水稻幼菌不具有耐盐碱能力，原因可能是_________
_________________________________________________________________
。
启动子
除草剂
需要
一定浓度的盐水浇灌
虽然获得了
相应的基因，但耐盐基因OsMYB56转录或翻译异常（或耐盐基因OsMYB56
表达异常）
6.（2023年广东高三校联考）In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源序列，通常为15~20 bp），然后用In-Fusion酶处理即可实现无缝连接。它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题：
（1）过程①需要用到的酶是 。过程③中，同源序列1与同源序列2中的碱基序列不同，这样设计的好处是 。
（2）为保证扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因，引物A或引物B要依据 序列进行设计。
耐高温的DNA聚合酶（或Taq DNA聚合酶）
防止目的基因反向连接，防止线性化质粒（或目的基因自身环化）
目的基因与质粒
（3）若目的基因是氨苄青霉素抗性基因，以大肠杆菌作为受体细胞。为检测已转化大肠杆菌的抗性效果，在含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的培养基上分别接种等量的已转化大肠杆菌并培养相同时间，然后采用
法进行计数。若结果较真实值偏小，原因是____________
。
（4）与传统构建重组质粒的方法相比，In-Fusion技术的优势有_________
________________________________________________________________
。（至少答出两点）
稀释涂布平板
当两个或多个
细胞连在一起时，在平板上观察到的是一个菌落
酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对
不受限制
质粒功能区的破坏
7.（2024年广东江门一模）RDX是某种军用弹药使用后残留的危险污染物。研究人员将源于细菌的RDX降解酶基因XplA和XplB插入柳枝稷草染色体中，让转基因植物修复因军用炸药RDX污染的土壤。基因XplA和XplB与引物结合位点及模板链分布情况如图1所示。图2为筛选含融合基因表达载体的农杆菌的示意图。回答下列问题：
（1）从细菌中提取DNA的过程中，使用预冷酒精（体积分数为95%）初步分离DNA与蛋白质，原理是 。然后再利用PCR的方法从提取的DNA中获取目的基因，在PCR的反应体系中，引物的作用是 ，DNA聚合酶需要 激活。
DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
镁离子
（2）若要构建图2中的融合基因，应选择图1的引物组合 ，以便通过PCR检测其中的XplA和XplB基因形成的融合基因是否准确。
（3）将融合基因与农杆菌Ti质粒的T-DNA重组，构建基因表达载体。用Ca2+溶液处理农杆菌后使其处于 的状态，将其与基因表达载体混合一段时间，在添加 的培养基中，经筛选得到含基因表达载体的农杆菌。通过农杆菌的 作用，就可以使融合基因进入植物细胞。
引物1、引物3
能吸收周围环境中DNA分子
潮霉素
转化
（4）用上述农杆菌侵染柳枝稷草愈伤组织，经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解RDX物质，原因是________________
。
导入的融合基因
不一定能够成功表达
8.如图为利用PCR技术检测受检人是否携带HIV（属逆转录病毒）的示意图。请回答：
（1）组成HIV的遗传物质的单体是 。HIV携带者T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质，原因是____________________________
。
（2）设计图中所示的引物时，应满足以下要求：
①引物自身不能存在互补配对序列，原因是避免引物自身通过折叠形成双链区；
②引物之间不能存在 ，原因是避免两引物结合成双链；
③ 。
核糖核苷酸
HIV的RNA逆转录出的DNA能
整合到T细胞的核DNA中，且能被正常转录和翻译（合理即可）
互补配对序列
引物只能和HIV的RNA逆转录出的DNA进行序列互补配对
（3）在PCR反应体系中，除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外，还应有 （填序号）。
①Taq酶 ②dNTP（dCTP、dATP、dGTP和dTTP） ③四种碱基 ④ATP ⑤氨基酸
（4）利用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，需使用DNA连接酶来构建基因表达载体。常用DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端且效率更高的是 ，DNA连接酶催化形成的化学键是 。基因表达载体必须有RNA聚合酶识别和结合的部位，该部位称为 。
①②
T4 DNA连接酶
磷酸二酯键
启动子
C组 压轴培优练
9.下图是利用转基因技术培育抗病小麦的过程。请据图回答问题：
（1）重组质粒T除含有目的基因外，还必须有 、 和
等。
（2）图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是 。
（3）在步骤⑤⑥中都需用 处理。为了确认目的基因通过⑦导入植物细胞后是否转录，通常采用 技术进行检测；验证目的基因导入受体细胞后是否成功表达，通常采用 法从分子水平进行检测。
启动子
终止子
标记基因
获取大量重组质粒（或让目的基因扩增）
Ca2+
PCR
抗原-抗体杂交
（4）假设该抗病基因D，通过基因工程导入小麦后连接到小麦的一条染色体上，则该小麦进行减数分裂的细胞在联会时有 个D基因。
2
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