第59讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
(时间:30分钟 满分:62分)
基础强化练
选择题:1~7题,每题2分。
1.(PCR|2024·北京模拟)下列有关PCR技术的叙述正确的是( )
[A]不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
[B]引物较短以及复性温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
[C]模板DNA与引物能在每次扩增中重复使用
[D]应用PCR技术直接扩增流感病毒的遗传物质进行检测
2.(基因工程的基本工具|2025·成都期末)下列有关基因工程操作所用工具和方法的叙述,正确的是( )
[A] 限制酶可以切割磷酸二酯键形成平末端,也能切割氢键形成黏性末端
[B] T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,因此该酶不具有专一性
[C] 采用花粉管通道法和农杆菌转化法都可以将目的基因导入植物细胞
[D] DNA分子杂交技术可检测进入受体细胞的目的基因是否转录和翻译
3.(PCR的应用|2024·武汉二模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比,黄化叶基因有一个碱基对发生了改变,从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型,提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是( )
[A] 需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
[B] 应在PCR扩增体系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
[C] 可适当降低复性的温度,以减少电泳中非特异性条带的产生
[D] 用限制酶B处理目的基因后进行电泳,若有2条电泳条带可判断为杂合子
4.(基因工程的基本工具|2024·厦门三模)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′G↓GATCC3′、5′↓GATC3′、5′CCC↓GGG3′。如图表示某DNA片段的部分碱基序列,已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是( )
(bp代表碱基对)
[A] 若用SmaⅠ完全切割该DNA,则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
[B] 若虚线方框内的碱基对被TA替换,则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段
[C] 若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA,可形成相同的黏性末端
[D] 用SmaⅠ切割DNA产生的片段,常用E.coli DNA连接酶重新将其连接
5.(PCR的基本操作|2025·揭阳模拟)利用PCR 获得目的基因后,用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
[A] 通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3
[B] 检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1 和引物4进行PCR
[C] 若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高 PCR 复性的温度
[D] DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
6.(基因表达载体的构建|2024·安徽三模)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进TDNA的加工和转移,下列叙述正确的是( )
[A] 构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
[B] 利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
[C] Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
[D] 利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
7.(DNA粗提取及鉴定|2024·无锡模拟)为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA,某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA 的方法,主要操作步骤如图。相关叙述错误的是( )
[A] 将真菌经液氮冷冻后进行研磨,可以获得细胞破碎的真菌粉末
[B] 利用NaOH溶液提取DNA,可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤
[C] NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈振荡,以免造成DNA 损伤断裂
[D] 缓冲液除了中和碱性物质之外,还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能
能力提升练
选择题:8~10题,每题4分。
8.(基因工程综合|2024·河池三模)研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β半乳糖苷酶基因编码产生的β半乳糖苷酶可分解Xgal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述错误的是( )
[A] 将目的基因插入质粒中时,需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶
[B] 需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态
[C] 按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌可正常表达该目的基因
[D] 在含Xgal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,可出现蓝色菌落
9.(构建基因表达载体|2024·眉山模拟)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
[A] 构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ
[B] 在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
[C] 用农杆菌转化植物愈伤组织选择不呈现蓝色的组织进行培养
[D] 为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
10.(新情境·HP疫苗制备|2024·南充模拟)幽门螺杆菌(HP)与胃炎、胃癌等多种疾病有关。利用基因工程技术可将HP的Ipp20基因导入工程菌内以制备HP疫苗。质粒结构及操作步骤如图所示,培养基A中加入潮霉素,培养基B中加入氯霉素。下列相关叙述错误的是( )
[A] 体外扩增目的基因时,反应体系中需添加Ipp20基因、解旋酶、DNA聚合酶和2种
引物
[B] 对Ipp20基因和质粒进行切割时,不能使用限制酶BamHⅠ
[C] 连接切割后的Ipp20基因和质粒时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
[D] 菌落3和菌落5含有目的基因和潮霉素抗性基因,可用于生产HP疫苗
11.(12分)(基因工程综合|2025·内蒙古高考适应性考试)在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列,置于β半乳糖苷酶基因(不含终止编码序列)末端,插入质粒中,并转化大肠杆菌(缺失内源性β半乳糖苷酶基因),经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链,回答下列问题。
(1)使用限制酶 和 对质粒和插入DNA片段进行切割。
(2)在转化大肠杆菌前,一般先用 处理大肠杆菌细胞,使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
(3)重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时,RNA聚合酶首先结合的位点是 。
(4)将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和Xgal的培养基中培养,若观察到
色菌落,可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链,原因是
。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子,在不考虑突变的情况下,这些菌落不含重组DNA分子的原因是
。
(5)溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链,成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是
。
12.(12分)(新情境·温度控制工程菌|2025·福州月考)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种可降解的生物大分子,常用来制备环保塑料包装袋,研究人员通过构建受温度控制的大肠杆菌表达体系来生产PHA。为实现通过温度控制工程菌合成所需的蛋白质,科研人员利用如图方案,构建了相关的基因表达载体,然后将其导入大肠杆菌,获得相应的工程菌。
(1)图1所示的基因表达载体中,RFP基因和GFP基因属于 ;启动子M和启动子R的类型虽然不同,但是二者都能与 结合,启动基因的转录。
(2)大肠杆菌在30 ℃和37 ℃均可生长和繁殖,据图1分析,当培养温度为30 ℃时,C基因编码的C蛋白形成二聚体 , 因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。
(3)PHA的合成过程中,可由单体分子3HB和4HB随机聚合形成随机共聚物;也可以先合成3HB聚合体,再合成4HB聚合体,最后形成分段共聚物(如图2所示),其中分段共聚物形式的PHA品质更佳。请完善以下表格,通过改造上述方案以实现应用工程菌大规模生产优质PHA(不考虑各种酶在不同温度下的活性差异)。
操作 目的
对上述方案表达载体的改造为:① , 并加入持续表达启动子连接的② 基因。将构建好的表达载体导入大肠杆菌,获得工程菌 获得可以合成PHA的工程菌
以③ 为原料配制培养基,灭菌后加入上述工程菌 配制培养基、接种
控制发酵条件:30 ℃发酵12 h,随后切换至37 ℃发酵36 h 发酵48小时,获得3HB比例为④ 的分段共聚物
13.(12分)(超级细菌的培育|2024·天津模拟)塑料制品方便人们生活的同时,也造成了短时期难以降解的“白色污染”。研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解塑料[主要成分为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等],两类细菌主要降解PE,并通过基因工程拼接黄粉虫肠道内菌株WZ的降解PVC的胞外酶基因A,培育降解塑料的“超级菌”。
(1)菌株的筛选。配制固体培养基,接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚度的PE塑料。分组实验结果如表所示:
培养基及 接种菌株 培养基1 培养基2 培养基3
单独培养并接种YT1 单独培养并接种YP1 混合培养YT1和YP1后,选取YP1接种
降解圈 (直径 D/mm) 3.5 1.8 4.2
①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时,应将两类菌株接种到以 为唯一碳源的培养基,从功能上讲,该培养基属于 培养基。
②筛选分解PE塑料能力强的菌株不能直接以降解圈的大小为指标,其原因是
。
培养基3中接种混合培养后的YP1,其降解圈直径明显加大,其原因可能是
。
(2)培育“超级菌”。对菌株WZ的A基因测序可知,如果在其调节功能区增加一个碱基对A/T,则可以大大增强其基因表达能力。通过经典的大引物PCR定点诱变技术在体外改造A基因,操作过程如图1,然后与图2所示的质粒构建表达载体,培育“超级菌”。
①利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2),在PCR中获得的大引物是指 (填“a”或“b”),利用大引物和引物2至少需要 个PCR循环才能获得完整的改良A基因。
②构建改良基因表达载体时,为实现质粒和改良基因的准确连接,应选用的限制酶是
。表达载体导入受体菌株时,有的质粒含有改良的A基因,有的质粒为空白质粒。在含氨苄青霉素和Xgal的平板上培养一段时间后,其中白色菌落含有重组质粒,判断的依据是 。
第59讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.B PCR过程延伸温度主要依据耐高温的DNA聚合酶的最适温度设置,在不同的PCR体系中由于目标DNA片段和引物具有特异性,温度影响复性过程中引物与模板DNA结合的效率和准确性,故不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异;若复性温度低,引物较短时,模板上可能存在多个区域能和引物上的少量碱基匹配,可能形成大量非特异性扩增产物;扩增时,引物参与构成DNA链,不能重复利用;PCR是对DNA双链进行复制,流感病毒遗传物质是单链RNA,因此不能直接进行PCR。
2.C 限制酶可以切割磷酸二酯键,不切割氢键,可以产生平末端也可以产生黏性末端;酶都具有专一性;将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法;目的基因是否翻译的检测方法是抗原—抗体杂交技术。
3.B PCR引物一般是单链DNA;DNA聚合酶都需要Mg2+激活,故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+;复性温度过低会导致引物与模板链非特异性结合,会增加电泳中非特异性条带;若该绿叶油菜为杂合子,则其含绿叶基因和黄化叶基因,绿叶基因不能被限制酶B切割,黄化叶基因被限制酶B酶切后产生2个片段,故应出现3条电泳条带。
4.C 限制酶SmaⅠ的酶切位点是5'CCC↓GGG-3',在图中有两个限制酶SmaⅠ的酶切位点,DNA将被切割成三个片段,结合图解,三个片段的长度分别是637 bp、890 bp、761 bp;发生碱基对替换后,基因中只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点,用Sma Ⅰ完全切割后出现长度不同的两种片段;由题意可知,若用Mbo Ⅰ和BamH Ⅰ切割DNA,都可形成GATC的黏性末端;用Sma Ⅰ切割DNA产生的片段是平末端,E.coli DNA连接酶连接平末端的效率非常低,一般选用T4 DNA连接酶。
5.A 引物结合在模板链的3'端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3;引物结合在模板链的3'端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2 和引物4进行PCR;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低 PCR 复性的温度,以便引物与模板链结合;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸。
6.C Vir区的基因活化能促进TDNA的加工和转移,使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,不能选限制酶Ⅱ;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列,并据此设计引物;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的TDNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进插入到TDNA中的抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上;卡那霉素抗性基因不在TDNA序列中,为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,最好在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞。
7.D 将真菌经液氮冷冻后进行研磨,可以获得细胞破碎的真菌粉末,有利于提取DNA;由题意可知,用NaOH提取DNA,离心后的上清液即可获得DNA纯度较高的溶液,可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤;DNA易断裂,NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈振荡,否则会造成DNA 损伤断裂;DNA酶有分解DNA的作用,杂菌生长也可能破坏真菌DNA,故缓冲液不具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能。
8.C 目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列,将目的基因插入质粒中时,需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起;将目的基因导入大肠杆菌时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态;按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反,大肠杆菌不能正常表达该目的基因;在含Xgal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,β半乳糖苷酶基因编码产生的β半乳糖苷酶可分解Xgal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色。
9.A 由图可知,Ω和polyA之间原本是Bt基因,需要先将Bt基因切除,再将A基因连接到Ω和polyA之间,因此需要限制酶PstⅠ和XhoⅠ,将重组后的“启动子—Ω—A基因—polyA—终止子”(“Ω—A基因—polyA—终止子”)连接到含NptⅡ基因的质粒上时,需要限制酶HindⅢ(或BamHⅠ)和EcoRⅠ,因此构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ、HindⅢ(或BamHⅠ)和EcoRⅠ;由图可知,在构建基因表达载体时,质粒中的NptⅡ基因被保留下来作为标记基因,GUS基因被切除,因此可在培养基中添加卡那霉素来初步筛选导入重组质粒的农杆菌;已知在真核细胞中GUS基因的表达产物可催化底物呈蓝色,由于在构建含目的基因的重组质粒时,GUS基因被切除,因此若用农杆菌转化植物愈伤组织,含目的基因的愈伤组织不会呈现蓝色,所以应选择不呈蓝色的愈伤组织进行培养;A基因为抗除草剂基因,若启动子为除草剂诱导型启动子,即只有在除草剂存在的情况下才诱导基因表达,可减少细胞内物质和能量浪费,有利于品种的改良。
10.A PCR过程不需要添加解旋酶,依靠加热即可使模板DNA的两条链解旋;若使用BamH Ⅰ则会导致终止子序列和两个抗生素抗性基因可能都被切割掉,导致重组质粒的应有功能缺失;E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶都可对题图所示的黏性末端进行连接;在用抗生素筛选的过程中,菌落3和菌落5因为没有氯霉素抗性基因而无法在培养基B中存活,应该是在构建基因表达载体时氯霉素抗性基因被切除,同时也插入了Ipp20基因,故菌落3和菌落5可用于生产HP疫苗。
11.【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)Hind Ⅲ BamHⅠ
(2)Ca2+
(3)启动子
(4)蓝 大肠杆菌缺失内源性β半乳糖苷酶基因,而导入成功后含有β半乳糖苷酶基因,表达出的β半乳糖苷酶分解Xgal产生蓝色物质(4分) 目的基因导入不成功
(5)获得完整的胰岛素A链(2分)
【解析】 (1)据图分析,EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ都会破坏目的基因,故不能选择,Sac Ⅰ酶切位点没有位于启动子与终止子之间,也不能选择,则目的基因左侧只能选择BamH Ⅰ,右侧应选择Hind Ⅲ,质粒的启动子与终止子之间也有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点,故使用限制酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒和插入DNA片段进行切割。
(2)在转化大肠杆菌前,一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
(3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点,可用于驱动基因的转录,故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时,RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。
(4)分析题意,大肠杆菌缺失内源性β半乳糖苷酶基因,而导入成功后含有β半乳糖苷酶基因,表达出的β半乳糖苷酶分解Xgal产生蓝色物质;另一种颜色(白色)的菌落中可能不含重组DNA分子,在不考虑突变的情况下,这些菌落不含重组DNA分子的原因是目的基因导入不成功。
(5)分析题意,溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链,成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是获得完整的胰岛素A链。
12.【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)目的基因 RNA聚合酶
(2)抑制启动子R,F蛋白不表达,解除F蛋白对启动子N的抑制(3分) 绿色
(3)①将GFP基因替换为A酶基因,RFP基因替换为B酶基因 ②X酶 ③葡萄糖 ④25%(第一空若为将RFP基因替换为A基因,GFP基因替换为B基因,则此处为75%)
(3分)
【解析】 (1)由题目中“通过温度控制工程菌合成所需的蛋白质”及图1可知,绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白是不同温度下的目标产物,相应的基因属于目的基因。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。(2)据图1分析可知,当培养温度为30 ℃时,C基因编码的C蛋白形成二聚体,抑制启动子R,使F基因无法表达出F蛋白,进而解除F蛋白对启动子N的抑制,使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。(3)据图2获知,4HB由B酶催化合成,3HB由A酶催化合成,再经X酶催化合成分段共聚物,要想应用工程菌大规模生产优质PHA,则工程菌不应同时产生3HB、4HB,对方案表达载体的改造为:将GFP基因替换为A酶基因,RFP基因替换为B酶基因,加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌,获得工程菌;以葡萄糖为原料配制培养基,灭菌后加入获得的工程菌,将接种后的培养基在30 ℃发酵12 h,随后切换至37 ℃发酵36 h,在30 ℃时,A酶基因表达,产生3HB,所以最终获得3HB比例为25%的分段共聚物,即为所需产物。
13.【答案】 (除标注外,每空1分)
(1)①PE塑料 选择 ②菌体繁殖力不同,形成的菌落大小不同 YP1和YT1混合培养过程中,YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因,发生了转化(3分)
(2)①b 3 ②XmaⅠ和BglⅡ 含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因,受体菌不能分泌分解Xgal而使培养基变蓝的酶(3分)
【解析】 (1)①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时,应将两类菌株接种到以PE塑料为唯一碳源的培养基,不能分解PE塑料的细菌,因为缺少营养物质碳源死亡;该培养基可以筛选出能分解PE塑料类的细菌,所以从功能上讲属于选择培养基。②筛选分解PE塑料能力强的菌株不能直接以降解圈的大小为指标,因为菌体繁殖力不同,形成的菌落大小不同,故应该看菌落直径和降解圈直径的比值来判断菌株对PE塑料的分解能力。原本YP1对PE塑料的分解能力弱于YT1,而培养基3中接种混合培养后的YP1,其降解圈直径明显加大,其原因可能是YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因,发生了转化。(2)①观察图1 PCR1大引物是指以诱变引物延伸得到的DNA链为模板,引物1与之结合延伸得到的DNA子链,即b;经过PCR1得到大引物,再利用大引物和引物2至少3个PCR循环才能获得完整的改良A基因。②改良A基因两端的黏性末端为—GGCC、—CTAG,因此构建改良基因表达载体时,为实现质粒和改良基因的准确连接,应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ。在含氨苄青霉素和Xgal的平板上培养一段时间后,其中白色菌落含有重组质粒,判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因,受体菌不能分泌分解Xgal而使培养基变蓝的酶。第59讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
[课标要求]
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
4.活动:DNA的提取和鉴定。
5.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一 基因工程的基本工具
1.基因工程的概念
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
(2)DNA连接酶。
(3)载体。
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P71正文)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )
(2)(选择性必修3 P72正文)限制性内切核酸酶能识别特定的核苷酸序列,而DNA连接酶不能识别。( )
(3)(选择性必修3 P72正文)常用E.coli DNA连接酶连接平末端或黏性末端。( )
(4)(选择性必修3 P72正文)被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。( )
(5)(选择性必修3 P74~75拓展应用2)限制酶能识别特定的核苷酸序列,不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端。( )
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子
(2)(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能上有何不同
1.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
4.抗生素抗性基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。在受体细胞的培养体系中加入相应抗生素就可以筛选出转入重组载体并稳定表达的受体细胞,原理如图所示。
说明:目的基因要转入的受体细胞不能具有相关抗生素的抗性。
能力1 分析基因工程的基本工具,培养理解能力及获取信息能力
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
[A] 限制酶失活,更换新的限制酶
[B] 酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
[C] 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
[D] 酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.(2024·湖北武汉三模)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中的实践中,某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述,正确的是( )
[A] 可以避免质粒或者目的基因自身环化
[B] 可以避免目的基因与质粒反向连接
[C] 可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
[D] 可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得 等的基因。主要是指 的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理: 。
②条件:
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用 代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
2种引物 使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
③过程:
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了 个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
[思考] 在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),这些dNTP有什么作用
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
②使目的基因能够 和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成。
(3)基因表达载体的构建过程。
3.将目的基因导入受体细胞
提醒 农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P76正文)目的基因均为编码蛋白质的基因。( )
(2)(选择性必修3 P77相关信息)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的双链核酸。( )
(3)(选择性必修3 P78~79图35)PCR通过调节温度来控制DNA双链的解聚及模板与引物的结合。( )
(4)(选择性必修3 P80正文)基因表达载体中目的基因的上游应含有启动子。( )
(5)(选择性必修3 P82正文)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。( )
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P78~79图35拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。请思考:
①PCR技术为什么需要引物
②利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物,原因是什么
③若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗多少个引物 第n轮循环需要消耗多少个引物
(2)(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的TDNA上
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物A (或B)的 DNA 分子数 1 3 7 2n-1
同时含引 物A、B的 DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2
共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2
2.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
3.农杆菌转化法分析
(1)构建基因表达载体需要两种工具酶:限制酶和DNA连接酶。
(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于感受态,有利于重组质粒的导入。
(3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。
能力2 分析具体情境中PCR的条件及过程,培养理解能力和获取信息能力
3.(2024·广西钦州模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基,5′端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是( )
[A] 图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
[B] 图示表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短有关
[C] 用图示引物扩增5次后,可以产生22个目标产物
[D] PCR每次循环都消耗引物和原料,在实验过程中需要及时补充
4.(2024·广西南宁二模)常规PCR只能扩增两引物之间的DNA序列,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是( )
[A] 酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
[B] 环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
[C] 图中引物,应选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对
[D] PCR扩增,将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
PCR技术和体内DNA复制的比较
能力3 特定情境中分析基因工程的基本操作,培养综合运用能力及逻辑推理能力
5.(2024·重庆卷,19)大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是 ;此外,不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ,原因是 。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是 。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ2的种子也变大,但小于YZ1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是
。
考点三 活动:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
(2)操作流程。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
(2)PCR实验操作步骤。
(3)DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为 的紫外灯下被检测出来。
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P74~75探究·实践)提取DNA时,如果没有鸡血材料,可用兔血代替。( )
(2)(选择性必修3 P74~75探究·实践)DNA与蛋白质都溶于酒精。( )
(3)(选择性必修3 P74~75探究·实践)向DNA溶液中加入适量二苯胺,混匀后溶液变蓝。( )
(4)(选择性必修3 P84~85探究·实践)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。( )
(5)(选择性必修3 P84~85探究·实践)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等都要经高压灭菌后使用。( )
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P74~75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是什么
(2)(选择性必修3 P84~85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能是哪些原因造成的
能力4 分析实验基本操作及注意事项,培养实验探究能力
6.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
[A] 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
[B] 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
[C] DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
[D] 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
考向一 从科学思维角度,考查基因工程的基本操作
1.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
[A] 若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
[B] 若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因
[C] 若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
[D] 若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
2.(2024·全国甲卷,38)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在
(答出两点即可);
使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是
;
若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是
。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是
。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
3.(2024·广东卷,21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。回答下列
问题。
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为 ,理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为 (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是
。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路
。
考向二 从科学探究角度,考查有关DNA的两个重要实验
4.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )
[A] 整个提取过程中可以不使用离心机
[B] 研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
[C] 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
[D] 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
5.(2024·黑吉辽卷,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是( )
[A] 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
[B] 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
[C] 在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
[D] 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
热点情境12 融合基因的原理及应用
[情境链接]
1.融合基因的原理
将不同的基因编码区首尾相连构成融合基因,从而进行基因表达。通过这项技术将一个报告系统(基因表达产物发光或者具有特殊的反应等易于筛选检测的性质,并且其中基因的序列已知)与另一个目的基因相融合,置于相同的控制条件下表达,从而通过报告系统来衡量目的基因产物的结构、功能及调控过程。
2.PCR与融合基因
通过设计连接两段基因包括中间接头在内的碱基序列作为引物,从而利用引物重叠互补,通常这两个基因的引物中有一段碱基序列互补。该技术要使用四条引物(如图所示),其中引物2和3的有部分碱基(白色部分)是可以互补配对的。分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到由两个DNA片段融合的基因。
[典型例题]
(2022·山东卷,25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAGP和FLAGP△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ,为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是
。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是
。
(1)模型构建。
(2)逻辑推理。
[迁移应用]
1.(2025·四川成都模拟)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α淀粉酶基因(amy)的dsred2amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互补配对。下列说法错误的是( )
[A] 利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA 双链
[B] 不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
[C] dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
[D] 杂交链延伸得到dsred2amy融合基因的过程不需要加引物
2.(2024·北京模拟)水稻雄性不育系在育种中具有重要的应用价值。研究者试图寻找更多的雄性不育基因。
(1)研究者获得一株雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221不育性为 性状且受核内 对等位基因控制。
(2)对S221的不育基因进行精细定位,发现不育单株8号染色体的S基因上游插入了一段DNA片段(简称M 片段)。
①研究者利用 技术扩增得到M片段和S基因,M片段、S基因分别用限制酶 处理,在 的作用下形成融合片段,构建表达载体(如图1),最终获得转基因株系1,相同方法获得只插入S基因的转基因株系2。
图1
②观察并比较水稻花穗、花药和花粉粒的发育情况,发现与野生型植株相比,株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,株系2无明显差异。本实验的目的是
。
(3)为了研究M片段的功能,研究者将一系列片段分别与Luc基因融合构建表达载体导入水稻原生质体,检测Luc基因的表达水平,操作及结果见图2。
图2结果表明 。
(4)进一步研究发现,不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控。结合本研究,推测突变株S221雄性不育的机理是
。
第59讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
考点一 基因工程的基本工具
必备知识·梳理
1.目的基因 基因重组 分子
2.(1)磷酸二酯键 黏性末端 (2)磷酸二酯键 黏性末端 黏性末端 (3)质粒 限制酶切割位点
深挖教材
1.(1)× 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
(2)√
(3)× E.coli DNA连接酶连接平末端的效率极低,一般不用于连接平末端。
(4)√
(5)× 不同的限制酶切割也可能产生相同的黏性末端。
2.(1)限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰。
(2)DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。
关键能力·提升
能力1
1.B 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶;酶切条件不合适通常会使酶切效果下降,调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。
2.D 两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免质粒或者目的基因自身环化,也不能避免目的基因与质粒反向连接;两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因;若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接,质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切处连接,则正好将目的基因正向连接,这样的重组质粒,既无EcoRⅠ识别位点,又无MfeⅠ识别位点,故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来。
考点二 基因工程的基本操作程序
必备知识·梳理
1.(1)①受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 (2)①DNA半保留复制 ②高温 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 3′ ③两种引物 耐高温的DNA聚合酶④两
[思考] PCR反应体系中加入的dNTP既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
2.(1)②表达 (2)RNA聚合酶 转录 (3)同种 产生相同末端 DNA连接酶
4.PCR 抗原—抗体杂交
深挖教材
1.(1)× 目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子如启动子、终止子等。
(2)× 引物为短单链核酸。
(3)√ (4)√
(5)× 检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。
2.(1)①DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从DNA链的3′端延伸DNA链。
②目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同。
③经过n轮循环需要消耗(2n+1-2)个引物,第n轮循环需要消耗2n个引物。
(2)Ti质粒上的TDNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。
关键能力·提升
能力2
3.D TaqDNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链,所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸;图示表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关,引物长度越长或者GC含量越高,则设置的复性温度越高;经过5次循环后会产生25=32个DNA分子,其中只有2个DNA分子含有原始的模板链,每次复制会产生以原始模板链为模板合成的两条长单链,前4次复制共产生8条,第5次复制时,这8条长单链参与形成的DNA不等长,因此经过5次复制产生等长的目的基因片段为32-10=22个;PCR所需要的引物和原料是一次性添加的,在实验过程中不需要补充。
4.D 在酶切阶段,已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,不然会将已知序列L切断,造成序列识别混乱;T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端,因此环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶;PCR过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合,为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列,应该选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对;PCR扩增中,将温度调至72 ℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将四种脱氧核苷酸,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
能力3
5.【答案】 (1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
(2)EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我环化;不能保证目标片段与载体定向连接(会形成反向连接)
(3)酶切后的空载体片段,启动子D+基因S片段 PCR
(4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大
【解析】 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动DNA的转录,是一段DNA片段,其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
(2)根据图示信息可知,“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列,若使用限制酶EcoRⅠ,会使目的基因序列被破坏。根据题图中限制酶的识别序列可知,酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自我环化,以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。
(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段,因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
(4)再生植株YZ1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D+基因S”序列,再生植株YZ2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T+基因S”序列,结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测:品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。
考点三 活动:DNA的粗提取与鉴定、
DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验基础·整合
1.(1)不溶于 2 mol/L 二苯胺 (2)体积相等的、预冷的体积分数为95% 2 mol/L的NaCl 二苯胺
2.(1)①DNA的热变性 ②相反 ③大小和构象 (2)微量移液器 底部 (3)300 nm
深挖教材
1. (1)× 兔为哺乳动物,其成熟红细胞中没有细胞核。
(2)× DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。
(3)× 用二苯胺鉴定DNA时,需要沸水浴加热5 min,冷却后观察颜色变化。
(4)× 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(5)√
2.(1)DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量。
(2)未出现扩增条带可能的原因有模板DNA含有蛋白质杂质或Taq DNA聚合酶的抑制剂;Taq DNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性温度低,变性时间短等。
关键能力·提升
能力4
6.D 研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低;DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可初步分离DNA;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,二苯胺试剂用于鉴定DNA。
研练真题·感悟高考
考向一
1.D 若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段,目的基因有正向连接和反向连接两种连接形式,因此转录的产物可能不同;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因;DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落。
2.【答案】 (1)变性 氢键
(2)避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶
(3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
利用DNA分子杂交技术,即将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸脯氨酸丝氨酸
【解析】 (1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性,引物与模板DNA链碱基之间互补配对形成的化学键是氢键。
(2)构建重组质粒时,与单一酶切相比,采用的双酶切方法,可以形成不同的黏性末端,双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端,需用T4DNA连接酶连接。
(3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法:首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,可利用DNA分子杂交技术,即将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码链与模板链互补,模板链与mRNA互补,因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,若第一个核苷酸G缺失,则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA,肽链序列是甘氨酸脯氨酸丝氨酸。
3.【答案】 (1)碳源、氮源
(2)PT7、PBAD和PBAD 基因2和基因3正常表达无活性产物,被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)抑制杂菌;去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制其他色素合成的基因)
【解析】 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等,研究者培养的驹形杆菌可合成细菌纤维素(主要是C、H、O)并将其分泌到胞外组装成膜(膜主要成分有蛋白质,主要元素是C、H、O、N),所以需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件。
(2)基因2和基因3在通用型启动子PBAD的激活下正常表达,使T7RNAP被激活,此时基因1表达后形成黑色素,从而实现光控染色。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养容易出现杂菌污染,抗生素具有抑制杂菌的作用;工程菌繁殖过程中质粒复制不同步可能出现丢失的问题,加入大观霉素后有去除丢失质粒的菌株的作用。
(4)由(2)分析可知,细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素,故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
(5)由(2)分析可知,题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色,希望生产其他颜色图案的BC膜,则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制其他色素合成的基因)。
考向二
4.A 在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变;仅设置一个对照组即可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰。
5.A 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子, 指示剂条带接近凝胶边缘时,停止电泳;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子需在波长为300 nm的紫外灯下检测。
热点情境12 融合基因的原理及应用
[典型例题]
【答案】 (1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸 5′端
(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基
【解析】 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,因此设计扩增P基因的引物,需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA聚合酶延伸时,是将脱氧核苷酸加到引物的3′端,为了不破坏目的基因,该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因翻译时出错。由图可看出,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取,翻译出的氨基酸序列改变,可通过在引物的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基,这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变,能够正常翻译。
[迁移应用]
1.C 利用PCR技术扩增基因时,高温变性使DNA双链解旋,不需要解旋酶来打开DNA 双链;引物②与③之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增;dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链(分别是3′端互补和5′端互补);杂交链延伸得到dsred2amy融合基因的过程中,不需要加入引物,DNA聚合酶可以两条母链作为子链合成的引物在其3′端添加脱氧核苷酸。
2.【答案】 (1)显性 1
(2)①PCR BamHⅠ、Bgl Ⅱ DNA连接酶 ②探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致
(3)M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达
(4)在雄性不育突变株中,M片段插入到S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育
【解析】 (1)雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221为杂合子,表示出的不育性为显性性状且受核内1对等位基因控制。(2)①研究者利用PCR技术扩增得到M片段和S基因,据图1分析,M片段、S基因分别用BamHⅠ、Bgl Ⅱ限制酶处理(若S基因也用BamHⅠ处理,则融合片段中间存在Bgl Ⅱ识别序列,融合片段插入质粒载体前用Bgl Ⅱ和SacⅠ切割,会破坏融合片段),在DNA连接酶的作用下形成融合片段。②与野生型植株相比,人为转入M片段+S基因的株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒(雄性不育),只转入S基因的株系2无明显差异,可判断本实验的目的是探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致。(3)据图2分析,第2组有M片段但无启动子的情况下,Luc基因仍有较高表达,第3组Luc基因表达水平最高,说明M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达。(4)由于不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控,推测突变株S221雄性不育的机理为在雄性不育突变株中,M片段插入到S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育。(共145张PPT)
第59讲
基因工程的基本工具和基本操作程序
[课标要求]
1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
4.活动:DNA的提取和鉴定。
5.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。
基因工程的基本工具
考点一
1.基因工程的概念
目的基因
基因重组
分子
磷酸二酯键
黏性末端
2.基因工程的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。
磷酸二酯键
(2)DNA连接酶。
黏性末端
黏性末端
(3)载体。
质粒
限制酶切割位点
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P71正文)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别
6个核苷酸序列。( )
【提示】 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
×
(2)(选择性必修3 P72正文)限制性内切核酸酶能识别特定的核苷酸序列,而DNA连接酶不能识别。( )
(3)(选择性必修3 P72正文)常用E.coli DNA连接酶连接平末端或黏性末端。
( )
√
×
【提示】 E.coli DNA连接酶连接平末端的效率极低,一般不用于连接平末端。
(4)(选择性必修3 P72正文)被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。( )
(5)(选择性必修3 P74～75拓展应用2)限制酶能识别特定的核苷酸序列,不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端。( )
√
【提示】 不同的限制酶切割也可能产生相同的黏性末端。
×
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子
【提示】 限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰。
(2)(选择性必修3 P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能上有何不同
【提示】 DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。
1.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则:质粒作为载体必须具备标记基因,所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。若载体上有两个及以上的标记基因,则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏,从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率,防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因,造成无效筛选)。
(3)善用“双酶切”,注意方向性:目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时,一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶,对目的基因所在序列和载体进行剪切,即“双酶切法”。其优点和作用是:①防止目的基因环化;②避免目的基因与载体反向连接,即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上,目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的,否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
(4)巧用“同尾酶”:同尾酶指来源不同,但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时,可用其同尾酶替换,以获得相同的黏性末端。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据限制酶的切割位点选择Ti质粒
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ),分析如下:
4.抗生素抗性基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。在受体细胞的培养体系中加入相应抗生素就可以筛选出转入重组载体并稳定表达的受体细胞,原理如图所示。
说明:目的基因要转入的受体细胞不能具有相关抗生素的抗性。
能力1 分析基因工程的基本工具,培养理解能力及获取信息能力
1.(2024·湖南卷,5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
[A] 限制酶失活,更换新的限制酶
[B] 酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
[C] 质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
[D] 酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B
【解析】 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶;酶切条件不合适通常会使酶切效果下降,调整反应条件如温度和pH等,调整酶的用量没有作用;质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶。
2.(2024·湖北武汉三模)含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)的质粒、含有目的基因的DNA片段及相关限制酶酶切位点如图所示。在构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中的实践中,某同学选用EcoRⅠ和MfeⅠ分别对质粒和含目的基因的DNA片段进行双酶切。下列对这种操作的优点的叙述,正确的是( )
[A] 可以避免质粒或者目的基因自身环化
[B] 可以避免目的基因与质粒反向连接
[C] 可以避免一个质粒中连续接入多个目的基因
[D] 可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来
D
【解析】 两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免质粒或者目的基因自身环化,也不能避免目的基因与质粒反向连接;两种限制酶切割后得到的黏性末端一致,不能避免一个质粒中连续接入多个目的基因;若质粒EcoRⅠ酶切位点处与目的基因MfeⅠ酶切处连接,质粒MfeⅠ酶切位点处与目的基因EcoRⅠ酶切处连接,则正好将目的基因正向连接,这样的重组质粒,既无EcoRⅠ识别位点,又无MfeⅠ识别位点,故可以避免受体菌的EcoRⅠ和MfeⅠ将所需重组质粒中的目的基因切割下来。
考点二
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得
等的基因。主要是指 的基因。
②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。
①原理: 。
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
DNA半保留复制
②条件:
高温
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶(体外用 代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
2种引物 使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸
4种脱氧核苷酸
耐高温的DNA聚合酶
3′
③过程:
两种引物
耐高温的DNA聚合酶
④结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了 个DNA分子,随着循环次数的增多,DNA分子以指数形式增加。
[思考] 在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),
这些dNTP有什么作用
【提示】 PCR反应体系中加入的dNTP既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
两
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)构建基因表达载体的目的。
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。②使目的基因能够 和发挥作用。
表达
(2)基因表达载体的组成。
RNA聚合酶
转录
(3)基因表达载体的构建过程。
同种
产生
DNA连接酶
相同末端
3.将目的基因导入受体细胞
提醒 农杆菌转化法中涉及的基因的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
PCR
抗原—抗体杂交
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P76正文)目的基因均为编码蛋白质的基因。( )
【提示】 目的基因主要是指编码蛋白质的基因,也可以是一些具有调控作用的因子如启动子、终止子等。
×
(2)(选择性必修3 P77相关信息)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的双链核酸。( )
【提示】 引物为短单链核酸。
×
(3)(选择性必修3 P78～79图3-5)PCR通过调节温度来控制DNA双链的解聚及模板与引物的结合。( )
(4)(选择性必修3 P80正文)基因表达载体中目的基因的上游应含有启动子。
( )
(5)(选择性必修3 P82正文)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。( )
√
【提示】 检测目的基因是否导入受体细胞的方法是PCR等技术。
√
×
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P78～79图3-5拓展)PCR反应过程中,引物非常关键。请思考:
①PCR技术为什么需要引物
【提示】 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从DNA链的3′端延伸DNA链。
②利用PCR技术扩增目的基因时需要两种引物,原因是什么
【提示】 目的基因的两条反向平行的链都作为模板,其碱基序列不同。
③若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环,理论上需要消耗多少个引物 第n轮循环需要消耗多少个引物
【提示】 经过n轮循环需要消耗(2n+1-2)个引物,第n轮循环需要消耗2n个
引物。
(2)(选择性必修3 P81资料卡拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上
【提示】 Ti质粒上的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引物A、B的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2
共消耗的 引物数量 2=21+1-2 6=22+1-2 14=23+1-2 2n+1-2
2.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据:目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列,又要考虑载体序列,原因:为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因):
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对,原因:防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,原因:防止引物之间配对,导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端;脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
3.农杆菌转化法分析
(1)构建基因表达载体需要两种工具酶:限制酶和DNA连接酶。
(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时,要用Ca2+处理农杆菌细胞,使其处于感受态,有利于重组质粒的导入。
(3)将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。
能力2 分析具体情境中PCR的条件及过程,培养理解能力和获取信息能力
3.(2024·广西钦州模拟)PCR引物的3′端有结合模板DNA的关键碱基,5′端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列。下列相关叙述错误的是( )
[A] 图中两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸
[B] 图示表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短有关
[C] 用图示引物扩增5次后,可以产生22个目标产物
[D] PCR每次循环都消耗引物和原料,在实验过程中需要及时补充
D
【解析】 TaqDNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA子链,所以两条子链合成一定都是从5′端向3′端延伸;图示表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关,引物长度越长或者GC含量越高,则设置的复性温度越高;经过5次循环后会产生25=32个DNA分子,其中只有2个DNA分子含有原始的模板链,每次复制会产生以原始模板链为模板合成的两条长单链,前4次复制共产生8条,第5次复制时,这8条长单链参与形成的DNA不等长,因此经过5次复制产生等长的目的基因片段为32-10=22个;PCR所需要的引物和原料是一次性添加的,在实验过程中不需要补充。
4.(2024·广西南宁二模)常规PCR只能扩增两引物之间的DNA序列,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是( )
[A] 酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
[B] 环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
[C] 图中引物,应选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对
[D] PCR扩增,将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链结合
D
【解析】 在酶切阶段,已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列,不然会将已知序列L切断,造成序列识别混乱;T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端,因此环化阶段,可选用E.coli DNA连接酶或
T4 DNA连接酶;PCR过程需要两种引物,能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合,为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列,应该选择引物1和引物4,且二者间不能互补配对;PCR扩增中,将温度调至72 ℃的目的是耐高温的DNA聚合酶将四种脱氧核苷酸,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
归纳总结
PCR技术和体内DNA复制的比较
能力3 特定情境中分析基因工程的基本操作,培养综合运用能力及逻辑推理能力
5.(2024·重庆卷,19)大豆是重要的粮油作物,提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现,基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小),然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列,并开展相关研究。
(1)基因S启动子的基本组成单位是 。
脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
【解析】 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,用于启动DNA的转录,是一段DNA片段,其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。
(2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时,为保证目标序列的完整性,不宜使用的限制酶是 ;此外,不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ,原因是
。
EcoRⅠ
酶切后形成的片段黏性末端相同,易自我环化;不能保证目标片段与载体定向连接(会形成反向连接)
【解析】 (2)根据图示信息可知,“启动子D+基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列,若使用限制酶EcoRⅠ,会使目的基因序列被破坏。根据题图中限制酶的识别序列可知,酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同,若用这两种限制酶切割,形成的DNA片段在构建基因表达载体时,容易出现自我环化,以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接,影响目的基因在受体细胞中的表达。
(3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上,可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有 。
经验证的重组表达载体需转入农杆菌,检测转入是否成功的技术是 。
酶切后的空载体片段,启动子D+基因S片段
PCR
【解析】 (3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段,用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段,还有酶切后的空载体片段,因此电泳时,对照样品除指示分子大小的标准参照物外,还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段。在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ,所得再生植株YZ-2的种子也变大,但小于YZ-1。综合分析,大豆品种DN较TL种子大的原因是
。
品种DN的基因S上游启动子效应比TL强,使得基因S表达量更高,种子更大
【解析】 (4)再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D+基因S”序列,再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T+基因S”序列,结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测:品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T,启动子D使基因S表达量更高,因而种子更大。
考点三
活动:DNA的粗提取与
鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理。
不溶于
2 mol/L
二苯胺
(2)操作流程。
体积相等的、预冷的体积分数
2 mol/L的NaCl
二苯胺
为95%
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础。
①PCR原理:利用了 原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动,这个过程就是电泳。
③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤。
微量移液器
底部
(3)DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为 的紫外灯下被检测出来。
300 nm
深挖教材
1.判断正误
(1)(选择性必修3 P74～75探究·实践)提取DNA时,如果没有鸡血材料,可用兔血代替。( )
【提示】 兔为哺乳动物,其成熟红细胞中没有细胞核。
×
(2)(选择性必修3 P74～75探究·实践)DNA与蛋白质都溶于酒精。( )
【提示】 DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精。
×
(3)(选择性必修3 P74～75探究·实践)向DNA溶液中加入适量二苯胺,混匀后溶液变蓝。( )
【提示】 用二苯胺鉴定DNA时,需要沸水浴加热5 min,冷却后观察颜色变化。
×
(4)(选择性必修3 P84～85探究·实践)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。( )
【提示】 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
×
(5)(选择性必修3 P84～85探究·实践)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等都要经高压灭菌后使用。( )
√
2.规范表达
(1)(选择性必修3 P74～75探究·实践拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是什么
【提示】 DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量。
(2)(选择性必修3 P84～85探究·实践拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能是哪些原因造成的
【提示】 未出现扩增条带可能的原因有模板DNA含有蛋白质杂质或
Taq DNA聚合酶的抑制剂;Taq DNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性温度低,变性时间短等。
能力4 分析实验基本操作及注意事项,培养实验探究能力
6.(2024·安徽卷,14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
[A] 实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
[B] 利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
[C] DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
[D] 将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质
杂质
D
【解析】 研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低;
DNA不溶于酒精溶液,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理可初步分离DNA;DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变,因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取;在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,二苯胺试剂用于鉴定DNA。
考向一 从科学思维角度,考查基因工程的基本操作
1.(2023·湖北卷,4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
[A] 若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
[B] 若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因
[C] 若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
[D] 若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
研练真题·感悟高考
D
【解析】 若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段,目的基因有正向连接和反向连接两种连接形式,因此转录的产物可能不同;若用PvuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),因此在含Tet(四环素)培养基中生长的菌落,不一定含有目的基因;DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否;
SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落。
2.(2024·全国甲卷,38)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是 ,引物与模板DNA链碱基之间的化学键是 。
变性
氢键
【解析】 (1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段,其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性,引物与模板DNA链碱基之间互补配对形成的化学键是氢键。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点,限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时,与用酶a单酶切相比,用酶a和酶b双酶切的优点体现在
(答出两点即可); 使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是 。
避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化
T4DNA连接酶
【解析】 (2)构建重组质粒时,与单一酶切相比,采用的双酶切方法,可以形成不同的黏性末端,双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端,需用T4DNA连接酶连接。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前,通常先将受体细胞处理成感受态,感受态细胞的特点是 ;
若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,简要的实验思路和预期结果是
。
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
利用DNA分子杂交技术,即将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒
【解析】 (3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法:首先用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒,可利用DNA分子杂交技术,即将大肠杆菌的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,表明大肠杆菌中含有重组质粒。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA,编码从GGG开始,部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失,则突变后相应肽链的序列是
。
甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
【解析】 (4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA,
编码链与模板链互补,模板链与mRNA互补,因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA,若第一个核苷酸G缺失,则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA,肽链序列是甘氨酸-脯氨酸-丝氨酸。
3.(2024·广东卷,21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料,BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体,将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株,为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。回答下列问题。
(1)研究者优化了培养基的 (答两点)等营养条件,并控制环境条件,大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
碳源、氮源
【解析】 (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等,研究者培养的驹形杆菌可合成细菌纤维素(主要是C、H、O)并将其分泌到胞外组装成膜(膜主要成分有蛋白质,主要元素是C、H、O、N),所以需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件,并控制环境条件。
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签,构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a,载体的部分结构见图二b)。构建载体时,选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识
别)。为实现蓝光控制染色,启动子①②及③依次为 ,理由是
。
PT7、PBAD和PBAD
基因2和基因3正常表达无活性产物,被蓝光激活后再启动基因1表达
【解析】(2)基因2和基因3在通用型启动子PBAD的激活下正常表达,使T7RNAP被激活,此时基因1表达后形成黑色素,从而实现光控染色。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素,其作用为 (答两点)。
抑制杂菌;去除丢失质粒的菌株
【解析】(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养容易出现杂菌污染,抗生素具有抑制杂菌的作用;工程菌繁殖过程中质粒复制不同步可能出现丢失的问题,加入大观霉素后有去除丢失质粒的菌株的作用。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色,其原因是
。
该处细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素
【解析】 (4)由(2)分析可知,细胞中T7RNAP激活,酪氨酸酶表达并合成黑色素,故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间,随后将其转至染色池处理,发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路
。
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制其他色素合成的基因)
【解析】 (5)由(2)分析可知,题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色,希望生产其他颜色图案的BC膜,则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或把基因1换成控制其他色素合成的基因)。
考向二 从科学探究角度,考查有关DNA的两个重要实验
4.(2024·山东卷,13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )
[A] 整个提取过程中可以不使用离心机
[B] 研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,应充分摇匀再倒入烧杯中
[C] 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
[D] 仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
A
【解析】 在DNA的粗提取与鉴定实验中,可将获得的研磨液用纱布过滤后,在4 ℃的冰箱中放置几分钟,再取上清液,也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液;研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后,DNA在上清液中,应取上清液倒入烧杯中;鉴定过程中用沸水浴加热,DNA双螺旋结构会发生改变;仅设置一个对照组即可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰。
5.(2024·黑吉辽卷,7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是( )
[A] 琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
[B] 凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
[C] 在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
[D] 琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
A
【解析】 琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率,琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段,比如基因组DNA或质粒DNA,通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶,因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段,比如PCR产物或酶切片段,则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶,以提供更好的分辨率和分离效果; 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料,可以作为电泳进度的指示分子, 指示剂条带接近凝胶边缘时,停止电泳;在琼脂糖凝胶电泳中,当电场作用时,DNA片段实际上是向正极迁移的,而不是向负极迁移。同时,DNA片段的迁移速率与其大小成反比,即DNA片段越长,迁移速率越慢;琼脂糖凝胶中的DNA分子需在波长为300 nm的紫外灯下检测。
热点情境12
融合基因的原理及应用
[情境链接]
1.融合基因的原理
将不同的基因编码区首尾相连构成融合基因,从而进行基因表达。通过这项技术将一个报告系统(基因表达产物发光或者具有特殊的反应等易于筛选检测的性质,并且其中基因的序列已知)与另一个目的基因相融合,置于相同的控制条件下表达,从而通过报告系统来衡量目的基因产物的结构、功能及调控过程。
2.PCR与融合基因
通过设计连接两段基因包括中间接头在内的碱基序列作为引物,从而利用引物重叠互补,通常这两个基因的引物中有一段碱基序列互补。该技术要使用四条引物(如图所示),其中引物2和3的有部分碱基(白色部分)是可以互补配对的。分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到由两个DNA片段融合的基因。
[典型例题]
(2022·山东卷,25节选)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 ,为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3′端”或“5′端”)。
能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
5′端
【解析】 (1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,因此设计扩增P基因的引物,需要满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA聚合酶延伸时,是将脱氧核苷酸加到引物的3′端,为了不破坏目的基因,该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是
。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是
。
P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取
在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基
【解析】 (2)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因翻译时出错。由图可看出,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取,翻译出的氨基酸序列改变,可通过在引物的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基,这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变,能够正常翻译。
思维建模
(1)模型构建。
(2)逻辑推理。
[迁移应用]
1.(2025·四川成都模拟)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的dsred2-amy融合基因,其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(灰色区域)可互补配对。下列说法错误的是( )
[A] 利用PCR技术扩增基因时不需要解旋酶来打开DNA 双链
[B] 不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
[C] dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
[D] 杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
C
【解析】 利用PCR技术扩增基因时,高温变性使DNA双链解旋,不需要解旋酶来打开DNA 双链;引物②与③之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增;dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链(分别是3′端互补和5′端互补);杂交链延伸得到dsred2-amy融合基因的过程中,不需要加入引物,DNA聚合酶可以两条母链作为子链合成的引物在其3′端添加脱氧核苷酸。
2.(2024·北京模拟)水稻雄性不育系在育种中具有重要的应用价值。研究者试图寻找更多的雄性不育基因。
(1)研究者获得一株雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221不育性为 性状且受核内
对等位基因控制。
显性
1
【解析】 (1)雄性不育突变株 S221,与纯合可育植株杂交,后代表型及分离比为不育株∶可育株=1∶1,表明S221为杂合子,表示出的不育性为显性性状且受核内1对等位基因控制。
(2)对S221的不育基因进行精细定位,发现不育单株8号染色体的S基因上游插入了一段DNA片段(简称M 片段)。
①研究者利用 技术扩增得到M片段和S基因,M片段、S基因分别用限制酶
处理,在 的作用下形成融合片段,构建表达载体(如图1),最终获得转基因株系1,相同方法获得只插入S基因的转基因株系2。
PCR
图1
BamHⅠ、Bgl Ⅱ
DNA连接酶
【解析】 (2)①研究者利用PCR技术扩增得到M片段和S基因,据图1分析,M片段、S基因分别用BamHⅠ、Bgl Ⅱ限制酶处理(若S基因也用BamHⅠ处理,则融合片段中间存在Bgl Ⅱ识别序列,融合片段插入质粒载体前用Bgl Ⅱ和SacⅠ切割,会破坏融合片段),在DNA连接酶的作用下形成融合片段。
②观察并比较水稻花穗、花药和花粉粒的发育情况,发现与野生型植株相比,株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,株系2无明显差异。本实验的目的是 。
探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致
【解析】 ②与野生型植株相比,人为转入M片段+S基因的株系1的花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒(雄性不育),只转入S基因的株系2无明显差异,可判断本实验的目的是探究水稻雄性不育是否由M片段插入S基因上游导致。
(3)为了研究M片段的功能,研究者将一系列片段分别与Luc基因融合构建表达载体导入水稻原生质体,检测Luc基因的表达水平,操作及结果见图2。
图2结果表明 。
M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达
【解析】 (3)据图2分析,第2组有M片段但无启动子的情况下,Luc基因仍有较高表达,第3组Luc基因表达水平最高,说明M片段可以启动并且与S 基因启动子共同促进Luc基因表达。
(4)进一步研究发现,不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控。结合本研究,推测突变株S221雄性不育的机理是
。
在雄性不育突变株中,M片段插入到S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育
【解析】 (4)由于不育株中S基因编码的蛋白参与花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因的表达调控,推测突变株S221雄性不育的机理为在雄性不育突变株中,M片段插入到S基因的上游,启动并增强S基因表达,从而导致花药绒毡层细胞中凋亡抑制基因表达下调,凋亡细胞数量增加,花穗变小、花药变短、无成熟花粉粒,进而导致雄性不育。
(时间:30分钟 满分:62分)
基础强化练
选择题:1～7题,每题2分。
1.(PCR|2024·北京模拟)下列有关PCR技术的叙述正确的是( )
[A]不同反应体系PCR的温度差别主要表现为延伸温度的差异
[B]引物较短以及复性温度较低均可能形成大量非特异性扩增产物
[C]模板DNA与引物能在每次扩增中重复使用
[D]应用PCR技术直接扩增流感病毒的遗传物质进行检测
B
【解析】 PCR过程延伸温度主要依据耐高温的DNA聚合酶的最适温度设置,在不同的PCR体系中由于目标DNA片段和引物具有特异性,温度影响复性过程中引物与模板DNA结合的效率和准确性,故不同反应体系PCR的温度差别主要表现为复性温度的差异;若复性温度低,引物较短时,模板上可能存在多个区域能和引物上的少量碱基匹配,可能形成大量非特异性扩增产
物;扩增时,引物参与构成DNA链,不能重复利用;PCR是对DNA双链进行复制,流感病毒遗传物质是单链RNA,因此不能直接进行PCR。
2.(基因工程的基本工具|2025·成都期末)下列有关基因工程操作所用工具和方法的叙述,正确的是( )
[A] 限制酶可以切割磷酸二酯键形成平末端,也能切割氢键形成黏性末端
[B] T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,因此该酶不具有专一性
[C] 采用花粉管通道法和农杆菌转化法都可以将目的基因导入植物细胞
[D] DNA分子杂交技术可检测进入受体细胞的目的基因是否转录和翻译
C
【解析】 限制酶可以切割磷酸二酯键,不切割氢键,可以产生平末端也可以产生黏性末端;酶都具有专一性;将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法;目的基因是否翻译的检测方法是抗原—抗体杂交技术。
3.(PCR的应用|2024·武汉二模)油菜的绿叶对黄化叶为显性。与绿叶基因相比,黄化叶基因有一个碱基对发生了改变,从而出现一个限制酶B的酶切位点。为鉴定某绿叶油菜的基因型,提取其DNA进行了PCR和电泳。下列叙述正确的是( )
[A] 需设计能与目的基因结合的双链DNA作为PCR引物
[B] 应在PCR扩增体系中添加Mg2+,以激活DNA聚合酶
[C] 可适当降低复性的温度,以减少电泳中非特异性条带的产生
[D] 用限制酶B处理目的基因后进行电泳,若有2条电泳条带可判断为杂合子
B
【解析】 PCR引物一般是单链DNA;DNA聚合酶都需要Mg2+激活,故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+;复性温度过低会导致引物与模板链非特异性结合,会增加电泳中非特异性条带;若该绿叶油菜为杂合子,则其含绿叶基因和黄化叶基因,绿叶基因不能被限制酶B切割,黄化叶基因被限制酶B酶切后产生2个片段,故应出现3条电泳条带。
4.(基因工程的基本工具|2024·厦门三模)BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为5′-G↓GATCC-3′、5′-↓GATC-3′、5′-CCC↓GGG-3′。如图表示某DNA片段的部分碱基序列,已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是( )
(bp代表碱基对)
[A] 若用SmaⅠ完全切割该DNA,则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
[B] 若虚线方框内的碱基对被T-A替换,则用SmaⅠ完全切割该DNA可产生3种片段
[C] 若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA,可形成相同的黏性末端
[D] 用SmaⅠ切割DNA产生的片段,常用E.coli DNA连接酶重新将其连接
C
【解析】 限制酶SmaⅠ的酶切位点是5′-CCC↓GGG-3′,在图中有两个限制酶SmaⅠ的酶切位点,DNA将被切割成三个片段,结合图解,三个片段的长度分别是637 bp、890 bp、761 bp;发生碱基对替换后,基因中只有一个限制酶SmaⅠ酶切位点,用SmaⅠ完全切割后出现长度不同的两种片段;由题意可
知,若用MboⅠ和BamHⅠ切割DNA,都可形成GATC的黏性末端;用SmaⅠ切割DNA产生的片段是平末端,E.coli DNA连接酶连接平末端的效率非常低,一般选用T4 DNA连接酶。
5.(PCR的基本操作|2025·揭阳模拟)利用PCR 获得目的基因后,用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
[A] 通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3
[B] 检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1 和引物4进行PCR
[C] 若设计的引物与模板不完全配对,可适当提高 PCR 复性的温度
[D] DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5′端连接脱氧核苷酸
A
【解析】 引物结合在模板链的3′端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3;引物结合在模板链的3′端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2 和引物4进行PCR;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低 PCR 复性的温度,以便引物与模板链结合;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
6.(基因表达载体的构建|2024·安徽三模)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,下列叙述正确的是( )
[A] 构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
[B] 利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
[C] Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
[D] 利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
C
【解析】 Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因,不能选限制酶Ⅱ;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列,并据此设计引物;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进插入到T-DNA中的抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上;卡那霉素抗性基因不在T-DNA序列中,为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,最好在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞。
7.(DNA粗提取及鉴定|2024·无锡模拟)为了在实验室条件下更加快速高效提取真菌DNA,某团队研究出了一种利用NaOH裂解细胞并快速提取DNA 的方法,主要操作步骤如图。相关叙述错误的是( )
[A] 将真菌经液氮冷冻后进行研磨,可以获得细胞破碎的真菌粉末
[B] 利用NaOH溶液提取DNA,可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤
[C] NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈振荡,以免造成DNA 损伤断裂
[D] 缓冲液除了中和碱性物质之外,还具有维持DNA 酶活性、促进微生物生长等功能
D
【解析】 将真菌经液氮冷冻后进行研磨,可以获得细胞破碎的真菌粉末,有利于提取DNA;由题意可知,用NaOH提取DNA,离心后的上清液即可获得DNA纯度较高的溶液,可省去低温下冷藏静置和用冷却酒精析出等步骤;
DNA易断裂,NaOH溶液提取DNA 的时间不宜过长且不能剧烈振荡,否则会造成DNA 损伤断裂;DNA酶有分解DNA的作用,杂菌生长也可能破坏真菌DNA,故缓冲液不具有维持DNA酶活性、促进微生物生长等功能。
选择题:8～10题,每题4分。
8.(基因工程综合|2024·河池三模)研究人员将目的基因插入质粒,构建重组质粒的过程如图所示,再将该重组质粒导入大肠杆菌中。由β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色,否则菌落为白色。下列叙述错误的是( )
[A] 将目的基因插入质粒中时,需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA连接酶
[B] 需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态
[C] 按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,大肠杆菌可正常表达该目的基因
[D] 在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,可出现蓝色菌落
C
能力提升练
【解析】 目的基因两侧含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的识别序列,将目的基因插入质粒中时,需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接在一起;将目的基因导入大肠杆菌时,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态;按图示构建的重组质粒导入大肠杆菌后,由于目的基因的转录方向和启动子的方向相反,大肠杆菌不能正常表达该目的基因;在含X-gal的培养基上培养导入了重组质粒的大肠杆菌,β-半乳糖苷酶基因编码产生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal产生蓝色物质,使菌落呈蓝色。
9.(构建基因表达载体|2024·眉山模拟)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程,其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因,GUS基因仅在真核细胞中表达,表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是( )
[A] 构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ
[B] 在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
[C] 用农杆菌转化植物愈伤组织选择不呈现蓝色的组织进行培养
[D] 为进一步改良品种,可将启动子替换为除草剂诱导型启动子
A
【解析】 由图可知,Ω和polyA之间原本是Bt基因,需要先将Bt基因切除,再将A基因连接到Ω和polyA之间,因此需要限制酶PstⅠ和XhoⅠ,将重组后的“启动子—Ω—A基因—polyA—终止子”
(“Ω—A基因—polyA—终止子”)连接到含NptⅡ基因的质粒上时,需要限制酶HindⅢ(或BamHⅠ)和EcoRⅠ,因此构建重组质粒时需要的限制酶有PstⅠ、XhoⅠ、HindⅢ(或BamHⅠ)和EcoRⅠ;由图可知,在构建基因表达载体时,质粒中的NptⅡ基因被保留下来作为标记基因,GUS基因被切除,因此可在培养基中添加卡那霉素来初步筛选导入重组质粒的农杆菌;已知在真核细胞中GUS基因的表达产物可催化底物呈蓝色,由于在构建含目的基因的重组质粒时,GUS基因被切除,因此若用农杆菌转化植物愈伤组织,含目的基因的愈伤组织不会呈现蓝色,所以应选择不呈蓝色的愈伤组织进行培养;A基因为抗除草剂基因,若启动子为除草剂诱导型启动子,即只有在除草剂存在的情况下才诱导基因表达,可减少细胞内物质和能量浪费,有利于品种的改良。
10.(新情境·HP疫苗制备|2024·南充模拟)幽门螺杆菌(HP)与胃炎、胃癌等多种疾病有关。利用基因工程技术可将HP的Ipp20基因导入工程菌内以制备HP疫苗。质粒结构及操作步骤如图所示,培养基A中加入潮霉素,培养基B中加入氯霉素。下列相关叙述错误的是
( )
[A] 体外扩增目的基因时,反应体系中需添加Ipp20基因、解旋酶、DNA聚合酶和2种引物
[B] 对Ipp20基因和质粒进行切割时,不能使用限制酶BamHⅠ
[C] 连接切割后的Ipp20基因和质粒时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
[D] 菌落3和菌落5含有目的基因和潮霉素抗性基因,可用于生产HP疫苗
A
【解析】 PCR过程不需要添加解旋酶,依靠加热即可使模板DNA的两条链解旋;若使用BamH Ⅰ则会导致终止子序列和两个抗生素抗性基因可能都被切割掉,导致重组质粒的应有功能缺失;E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶都可对题图所示的黏性末端进行连接;在用抗生素筛选的过程中,菌落3和菌落5因为没有氯霉素抗性基因而无法在培养基B中存活,应该是在构建基因表达载体时氯霉素抗性基因被切除,同时也插入了Ipp20基因,故菌落3和菌落5可用于生产HP疫苗。
11.(12分)(基因工程综合|2025·内蒙古高考适应性考试)在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列,置于β-半乳糖苷酶基因(不含终止编码序列)末端,插入质粒中,并转化大肠杆菌(缺失内源性β-半乳糖苷酶基因),经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链,回答下列问题。
(1)使用限制酶 和 对质粒和插入DNA片段进行切割。
Hind Ⅲ
BamHⅠ
【解析】 (1)据图分析,EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ都会破坏目的基因,故不能选择,
Sac Ⅰ酶切位点没有位于启动子与终止子之间,也不能选择,则目的基因左侧只能选择BamH Ⅰ,右侧应选择Hind Ⅲ,质粒的启动子与终止子之间也有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点,故使用限制酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒和插入DNA片段进行切割。
Ca2+
(2)在转化大肠杆菌前,一般先用 处理大肠杆菌细胞,使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
【解析】 (2)在转化大肠杆菌前,一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。
(3)重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时,RNA聚合酶首先结合的位点是
。
【解析】 (3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点,可用于驱动基因的转录,故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时,RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。
启动子
(4)将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X-gal的培养基中培养,若观察到 色菌落,可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链,原因是
。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子,在不考虑突变的情况下,这些菌落不含重组DNA分子的原因是 。
蓝
大肠杆菌缺失内源性β-半乳糖苷酶基因,而导入成功后含有β-半乳糖苷酶基因,表达出的β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色物质
目的基因导入不成功
【解析】 (4)分析题意,大肠杆菌缺失内源性β-半乳糖苷酶基因,而导入成功后含有β-半乳糖苷酶基因,表达出的β-半乳糖苷酶分解X-gal产生蓝色物质;另一种颜色(白色)的菌落中可能不含重组DNA分子,在不考虑突变的情况下,这些菌落不含重组DNA分子的原因是目的基因导入不成功。
(5)溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链,成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是 。
获得完整的胰岛素A链
【解析】 (5)分析题意,溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链,成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是获得完整的胰岛素A链。
12.(12分)(新情境·温度控制工程菌|2025·福州月考)聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一种可降解的生物大分子,常用来制备环保塑料包装袋,研究人员通过构建受温度控制的大肠杆菌表达体系来生产PHA。为实现通过温度控制工程菌合成所需的蛋白质,科研人员利用如图方案,构建了相关的基因表达载体,然后将其导入大肠杆菌,获得相应的工程菌。
(1)图1所示的基因表达载体中,RFP基因和GFP基因属于 ;启动子M和启动子R的类型虽然不同,但是二者都能与 结合,启动基因的转录。
目的基因
RNA聚合酶
【解析】 (1)由题目中“通过温度控制工程菌合成所需的蛋白质”及图1可知,绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白是不同温度下的目标产物,相应的基因属于目的基因。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,紧挨转录的起始位点,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。
(2)大肠杆菌在30 ℃和37 ℃均可生长和繁殖,据图1分析,当培养温度为30 ℃时,C基因编码的C蛋白形成二聚体
,因而大肠杆菌表达 荧光蛋白。
【解析】 (2)据图1分析可知,当培养温度为30 ℃时,C基因编码的C蛋白形成二聚体,抑制启动子R,使F基因无法表达出F蛋白,进而解除F蛋白对启动子N的抑制,使其发生转录促进GFP基因编码绿色荧光蛋白。
抑制启动子R,F蛋白不表达,解除F蛋白对启动子N的抑制
绿色
操作 目的
对上述方案表达载体的改造为:① ,并加入持续表达启动子连接的② 基因。将构建好的表达载体导入大肠杆菌,获得工程菌 获得可以合成PHA的工程菌
以③ 为原料配制培养基,灭菌后加入上述工程菌 配制培养基、接种
控制发酵条件:30 ℃发酵12 h,随后切换至37 ℃发酵36 h 发酵48小时,获得3HB比例为④
的分段共聚物
(3)PHA的合成过程中,可由单体分子3HB和4HB随机聚合形成随机共聚物;也可以先合成3HB聚合体,再合成4HB聚合体,最后形成分段共聚物(如图2所示),其中分段共聚物形式的PHA品质更佳。请完善以下表格,通过改造上述方案以实现应用工程菌大规模生产优质PHA(不考虑各种酶在不同温度下的活性差异)。
将GFP基因
替换为A酶基因,RFP基因替换为B酶基因
X酶
葡萄糖
25%
(第一空若为将RFP基因替换为A基因,GFP基因替换为B基因,则此处为75%)
【解析】 (3)据图2获知,4HB由B酶催化合成,3HB由A酶催化合成,再经X酶催化合成分段共聚物,要想应用工程菌大规模生产优质PHA,则工程菌不应同时产生3HB、4HB,对方案表达载体的改造为:将GFP基因替换为A酶基因,
RFP基因替换为B酶基因,加入持续表达启动子连接的X酶基因构建表达载体并导入大肠杆菌,获得工程菌;以葡萄糖为原料配制培养基,灭菌后加入获得的工程菌,将接种后的培养基在30 ℃发酵12 h,随后切换至37 ℃发酵36 h,在30 ℃时,A酶基因表达,产生3HB,所以最终获得3HB比例为25%的分段共聚物,即为所需产物。
13.(12分)(超级细菌的培育|2024·天津模拟)塑料制品方便人们生活的同时,也造成了短时期难以降解的“白色污染”。研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解塑料[主要成分为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等],两类细菌主要降解PE,并通过基因工程拼接黄粉虫肠道内菌株WZ的降解PVC的胞外酶基因A,培育降解塑料的“超级菌”。
(1)菌株的筛选。配制固体培养基,接种菌株后表层覆盖0.1 mm厚度的PE塑料。分组实验结果如表所示:
PE塑料
培养基及 接种菌株 培养基1 培养基2 培养基3
单独培养并接种YT1 单独培养并接种YP1 混合培养YT1和YP1后,选取YP1接种
降解圈(直径D/mm) 3.5 1.8 4.2
①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时,应将两类菌株接种到以 为唯一碳源的培养基,从功能上讲,该培养基属于 培养基。
选择
【解析】 (1)①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时,应将两类菌株接种到以PE塑料为唯一碳源的培养基,不能分解PE塑料的细菌,因为缺少营养物质碳源死亡;该培养基可以筛选出能分解PE塑料类的细菌,所以从功能上讲属于选择培养基。
②筛选分解PE塑料能力强的菌株不能直接以降解圈的大小为指标,其原因是 。
培养基3中接种混合培养后的YP1,其降解圈直径明显加大,其原因可能是
。
菌体繁殖力不同,形成的菌落大小不同
YP1和YT1混合培养过程中,YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因,发生了转化
【解析】 ②筛选分解PE塑料能力强的菌株不能直接以降解圈的大小为指
标,因为菌体繁殖力不同,形成的菌落大小不同,故应该看菌落直径和降解圈直径的比值来判断菌株对PE塑料的分解能力。原本YP1对PE塑料的分解能力弱于YT1,而培养基3中接种混合培养后的YP1,其降解圈直径明显加大,其原因可能是YP1菌株整合了YT1的对PE塑料高分解力的基因,发生了转化。
(2)培育“超级菌”。对菌株WZ的A基因测序可知,如果在其调节功能区增加一个碱基对A/T,则可以大大增强其基因表达能力。通过经典的大引物PCR定点诱变技术在体外改造A基
因,操作过程如图1,然后与图2所示的质粒构建表达载体,培育“超级菌”。
①利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2),在PCR中获得的大引物是指 (填“a”或“b”),利用大引物和引物2至少需要 个PCR循环才能获得完整的改良A基因。
b
3
【解析】 (2)①观察图1 PCR1大引物是指以诱变引物延伸得到的DNA链为模板,引物1与之结合延伸得到的DNA子链,即b;经过PCR1得到大引物,再利用大引物和引物2至少3个PCR循环才能获得完整的改良A基因。
②构建改良基因表达载体时,为实现质粒和改良基因的准确连接,应选用的限制酶是 。表达载体导入受体菌株时,有的质粒含有改良的A基因,有的质粒为空白质粒。在含氨苄青霉素和X-gal的平板上培养一段时间后,其中白色菌落含有重组质粒,判断的依据是
。
XmaⅠ和BglⅡ
含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因,受体菌不能分泌分解X-gal而使培养基变蓝的酶
【解析】 ②改良A基因两端的黏性末端为—GGCC、—CTAG,因此构建改良基因表达载体时,为实现质粒和改良基因的准确连接,应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ。在含氨苄青霉素和X-gal的平板上培养一段时间后,其中白色菌落含有重组质粒,判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因,受体菌不能分泌分解X-gal而使培养基变蓝的酶。
