专题研究10 PCR技术
类型一 PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、 B的DNA分子数 0 2 6 2n－2
共消耗的引物数量 2 6 14 2n＋1－2
[应用1](2022·辽宁卷)抗虫和耐除草剂玉米双抗12－5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是( B )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
解析：预变性是使模板DNA充分变性，A错误；后延伸过程是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需引物参与，C错误；转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测目的基因是否表达，以及安全性等问题，D错误。
解题方法
PCR技术和细胞内DNA复制的比较
类型二 引物的特点及选择
(1)引物的特点
①是一段短单链核酸，且能与DNA母链的一段序列碱基互补配对。
②引物的5‘端可以被修饰，而3’端需与DNA模板链严格互补配对，故不可被修饰。5'端常见的修饰：加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等。
③PCR过程中，引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对。
(2)判断引物的方向
①判断引物的3‘端、5’端：引物与DNA模板链的3'端互补，方向相反。
②DNA复制从引物的3'端继续延伸。
③由此可知，甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向如图1所示。
(3)根据扩增目的选择引物
①若扩增目的基因序列，则应选择图1中的引物乙、丙；
②若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点，应设计一个引物与目的基因外部序列(即质粒序列)碱基互补配对，另一个引物与目的基因内部序列碱基互补配对，如图2所示的引物1、2。
[应用2](2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
图甲 图乙
(1)与图甲中启动子结合的酶是 RNA聚合酶 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (答出2个结构即可)。
解析：(1)基因表达载体中的启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合启动子。作为基因工程载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 F1、R2(或F2、R1) 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 a链 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
解析：(2)在确定J基因连接方向时，如果选用J基因上的引物对，无论其正向连接还是反向连接，都能够扩增出条带，无法区分连接方向，所以选择F1、R2(或F2、R1)。由于转录时新合成链的方向是5‘到3’端，而J基因以b链为模板，所以b链的方向是3‘到5’端(从左向右)，引物F1与b链序列互补，与a链序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 J－V5融合蛋白 ，条带2所检出的蛋白 不是 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(3)图乙中用抗J蛋白抗体和抗V5抗体都能够检测出条带1，因此出现条带1表明细胞内表达了J－V5融合蛋白。终止子能够使转录停止，重组质粒在受体细胞内正确表达时，融合基因不会在J基因的末尾提前停止转录，所以表达出的条带2不是由重组质粒上的J基因表达的，可能是受体细胞中能与抗J蛋白抗体结合的少量非目的蛋白。
类型三 PCR中的引物设计
PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。因此，引物的设计需要把握以下原则：
(1)引物长度要适宜。过长会导致其延伸温度大于72 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，过短则特异性差。
(2)引物GC含量要适宜。
(3)引物自身及引物之间不应存在互补序列：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。
(4)引物5‘端可以修饰，3’端不可修饰
①引物的5‘端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、缺失突变序列，引入启动子序列等。
②引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
③在引物的5'端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
(5)退火温度要适宜：退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。
[应用3](2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是( B )
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
解析：图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确，A、C、D错误。
[应用4](2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 模板(片段F1、片段F2)、引物 ，扩增程序中最主要的不同是 退火温度 。
解析：(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的，扩增程序中依据不同引物设置不同的退火(复性)温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。
(2)有关基因序列如图2，引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用 CD 。
A.ATGGTG——————CAACCA
B.TGGTTG——————CACCAT
C.GACGAG——————CTGCAG
D.CTGCAG——————CTCGTC
解析：(2)由图1可知，引物F2－F用于扩增F2片段，引物F1－R用于扩增F1片段，C项中GACGAG与EGFP基因中的右侧部分序列的互补序列配对，因此引物F1－R选用C；D项中CTGCAG能与AnB1基因中的左侧部分序列的互补序列配对，因此引物F2－F选用D。
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶 。
解析：(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 ABC 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
解析：(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 P3、P4 。
解析：(5)EGFP基因为720 bp，AnB1基因为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 。
解析：(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
类型四 PCR技术的类型及应用
1.PCR技术的常规应用：利用获取目的基因
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
2.PCR技术的常规应用：鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
3.重叠延伸PCR：鉴定基因定点突变
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
(1)重叠延伸PCR图解
(2)四种引物：引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。
(3)流程
①分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到两种DNA片段，由于引物2和引物3有互补序列，这两种DNA片段存在部分互补区域。
②以得到的两种DNA片段为模板，用引物1和4再进行一次PCR，扩增得到含有突变位点的DNA片段。
③通过测序可以检验定点突变是否成功。
4.反向PCR：扩增未知基因序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。
5.逆转录PCR(RT－PCR)、实时荧光PCR：快速检测病原体
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
(1)逆转录PCR(RT－PCR)：逆转录PCR也称反转录PCR，实验原理为：提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，首先利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量，例如新型冠状病毒的检测。
(2)实时荧光PCR
①方法：目前采用RT－PCR技术(逆转录荧光PCR技术)。
②原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针(一段特异性寡核苷酸序列)，其两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。
a.探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。
b.若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。
c.荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)，其中Ct值与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。
③优点：早期诊断，灵敏度和特异性高。
[应用5](2025·河北保定期中)荧光定量PCR技术是在常规PCR的基础上，加入与模板DNA某条链互补的荧光探针(一类两端经过特殊基团修饰的单链DNA片段)，当子链延伸至探针处时DNA聚合酶会水解掉探针一端并生成荧光分子，使荧光监测系统接收到荧光信号，即DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，原理如图所示。下列有关叙述正确的是( D )
A.1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
B.1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物
C.该反应循环5次，消耗引物31个
D.若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入63个荧光探针
解析：荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分子，一共会生成1＋2＋4＝7个荧光分子，A错误；1个双链DNA分子经过5轮循环一共会形成 32个 DNA分子，即形成64条链，其中62条链都是新合成的，一共需要消耗31对引物，B、C错误；若某次PCR反应共产生52个等长DNA，说明至少扩增了6次，DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，就需要一个荧光探针，因此需加入63个荧光探针，D正确。
[应用6](2025·八省联考河南卷)由mRNA逆转录产生的单链DNA称为第一链cDNA，以第一链cDNA为模板合成的单链DNA称为第二链cDNA。下列叙述正确的是( A )
A.第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板
B.第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相同
C.第二链cDNA不能与转录该mRNA的DNA进行杂交
D.第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列和组成均相同
解析：第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板，进行PCR扩增，A正确；第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相反，B错误；第二链cDNA能与转录该mRNA的DNA碱基互补配对，能进行杂交，C错误；第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列互补，碱基组成不一定相同，D错误。故选A。
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第九单元 生物技术与工程
专题研究10 PCR技术
类型一 PCR技术的相关计算
1. PCR扩增过程中的循环图示与规律
2. PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物A(或B)的
DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物A、
B的DNA分子数 0 2 6 2n－2
共消耗的引物数量 2 6 14 2n＋1－2
A. 预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B. 后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C. 延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D. 转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
B
解析：预变性是使模板DNA充分变性，A错误；后延伸过程是为了让引物延伸完全并 让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过 程需引物参与，C错误；转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测目的 基因是否表达，以及安全性等问题，D错误。
解题方法
PCR技术和细胞内DNA复制的比较
类型二 引物的特点及选择
(1)引物的特点
①是一段短单链核酸，且能与DNA母链的一段序列碱基互补配对。
②引物的5‘端可以被修饰，而3’端需与DNA模板链严格互补配对，故不可被修饰。 5'端常见的修饰：加酶切位点、加荧光标记、引入突变位点等。
③PCR过程中，引物一般成对存在且成对的引物不能碱基互补配对。
(2)判断引物的方向
①判断引物的3‘端、5’端：引物与DNA模板链的3'端互补，方向相反。
②DNA复制从引物的3'端继续延伸。
③由此可知，甲、乙、丙、丁四个引物的扩增方向如图1所示。
(3)根据扩增目的选择引物
①若扩增目的基因序列，则应选择图1中的引物乙、丙；
②若要检验目的基因是否以正确方向插入质粒相应位点，应设计一个引物与目的基因 外部序列(即质粒序列)碱基互补配对，另一个引物与目的基因内部序列碱基互补配 对，如图2所示的引物1、2。
[应用2](2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检 测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
图甲 图乙
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体， 质粒还需具备的结构有 (答出2个结构即 可)。
解析：(1)基因表达载体中的启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转 录，因此RNA聚合酶识别和结合启动子。作为基因工程载体必须具备的条件：①要具 有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组后重组子的筛选； ③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体 细胞分离出来。图甲中有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切 割位点、标记基因、复制原点等。
RNA聚合酶
限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检 测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录 的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相 应部分的序列相同。
解析：(2)在确定J基因连接方向时，如果选用J基因上的引物对，无论其正向连接还是 反向连接，都能够扩增出条带，无法区分连接方向，所以选择F1、R2(或F2、R1)。由 于转录时新合成链的方向是5‘到3’端，而J基因以b链为模板，所以b链的方向是 3‘到5’端(从左向右)，引物F1与b链序列互补，与a链序列相同。
F1、R2(或F2、R1)
a链
解析：(3)图乙中用抗J蛋白抗体和抗V5抗体都能够检测出条带1，因此出现条带1表明 细胞内表达了J－V5融合蛋白。终止子能够使转录停止，重组质粒在受体细胞内正确 表达时，融合基因不会在J基因的末尾提前停止转录，所以表达出的条带2不是由重组 质粒上的J基因表达的，可能是受体细胞中能与抗J蛋白抗体结合的少量非目的蛋白。
J－
V5融合蛋白
不是
类型三 PCR中的引物设计
PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响PCR的结果。成功的PCR 反应既要高效，又要特异性扩增产物。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩 增特异性和高效性。因此，引物的设计需要把握以下原则：
(1)引物长度要适宜。过长会导致其延伸温度大于72 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反 应，过短则特异性差。
(2)引物GC含量要适宜。
(3)引物自身及引物之间不应存在互补序列：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间 不能有连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物 与模板的复性结合。
(4)引物5‘端可以修饰，3’端不可修饰
①引物的5‘端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰 而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突 变、缺失突变序列，引入启动子序列等。
②引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
③在引物的5'端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。
(5)退火温度要适宜：退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。
[应用3](2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆 的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。
A. ①＋③ B. ①＋②
C. ③＋② D. ③＋④
B
解析：图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基 因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子， 需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B 正确，A、C、D错误。
[应用4](2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技 术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
解析：(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。 分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段 F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱 基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的，扩增程序中依据不 同引物设置不同的退火(复性)温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免 引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。
模板(片
段F1、片段F2)、引物
退火温度
(2)有关基因序列如图2，引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用 。
A. ATGGTG——————CAACCA
B. TGGTTG——————CACCAT
C. GACGAG——————CTGCAG
D. CTGCAG——————CTCGTC
解析：(2)由图1可知，引物F2－F用于扩增F2片段，引物F1－R用于扩增F1片段，C项 中GACGAG与EGFP基因中的右侧部分序列的互补序列配对，因此引物F1－R选用 C；D项中CTGCAG能与AnB1基因中的左侧部分序列的互补序列配对，因此引物F2－ F选用D。
CD
解析：(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具 有与目的基因相同的末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质 粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体 具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶(限制 酶)和DNA连接酶。
限制性
内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 。
A. 稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B. 抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C. 抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D. 抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
ABC
解析：(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选 时，菌落数可能低于30，A错误；培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落， 一般不是培养基温度太高所致，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养 基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的 菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布 平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1 －F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果 判断，可以舍弃的质粒有 。
P3、P4
解析：(5)EGFP基因为720 bp，AnB1基因为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp ＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结 果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
解析：(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测 DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通 过基因测序确认。
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA
分子的碱基序列
类型四 PCR技术的类型及应用
1. PCR技术的常规应用：利用获取目的基因
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR 特异性地快速扩增目的基因。
2. PCR技术的常规应用：鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体 上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的 基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还 可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
3. 重叠延伸PCR：鉴定基因定点突变
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物 形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该 技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有 着独特的应用。
(1)重叠延伸PCR图解
(2)四种引物：引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有 部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。
(3)流程
①分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后，得到两种DNA片段，由于引物2和引物3 有互补序列，这两种DNA片段存在部分互补区域。
②以得到的两种DNA片段为模板，用引物1和4再进行一次PCR，扩增得到含有突变位 点的DNA片段。
③通过测序可以检验定点突变是否成功。
4. 反向PCR：扩增未知基因序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技 术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物 环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为 模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相 向的，从而得以扩增出未知序列。
5. 逆转录PCR(RT－PCR)、实时荧光PCR：快速检测病原体
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种 类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测 方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和 敏感性。
(1)逆转录PCR(RT－PCR)：逆转录PCR也称反转录PCR，实验原理为：提取组织或细 胞中的总RNA，以RNA为模板，首先利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模 板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了 几个数量级，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量，例 如新型冠状病毒的检测。
(2)实时荧光PCR
①方法：目前采用RT－PCR技术(逆转录荧光PCR技术)。
②原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针(一段特异性 寡核苷酸序列)，其两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。
a.探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。
b.若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的 外切酶活性将探针降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，发出荧光。每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子产生。
c.荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)，其中Ct值与病 毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。
③优点：早期诊断，灵敏度和特异性高。
D
A. 1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
B. 1个双链DNA分子经过5轮循环一共需要消耗15对引物
C. 该反应循环5次，消耗引物31个
D. 若某次PCR反应共产生52个等长DNA，则需加入63个荧光探针
解析：荧光探针只能跟模板DNA的某条链互补配对，DNA分子每扩增一次，就 有一个荧光分子生成，3轮循环后得到8个DNA分子，即扩增形成了7个新DNA分 子，一共会生成1＋2＋4＝7个荧光分子，A错误；1个双链DNA分子经过5轮循环 一共会形成 32个 DNA分子，即形成64条链，其中62条链都是新合成的，一共需 要消耗31对引物，B、C错误；若某次PCR反应共产生52个等长DNA，说明至少 扩增了6次，DNA每扩增一次，就有一个荧光分子生成，就需要一个荧光探针， 因此需加入63个荧光探针，D正确。
A. 第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板
B. 第一链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相同
C. 第二链cDNA不能与转录该mRNA的DNA进行杂交
D. 第二链cDNA与其模板mRNA的碱基序列和组成均相同
A
解析：第一链cDNA可以单独作为PCR反应体系的模板，进行PCR扩增，A正确；第一 链cDNA与其模板mRNA序列互补、方向相反，B错误；第二链cDNA能与转录该 mRNA的DNA碱基互补配对，能进行杂交，C错误；第二链cDNA与其模板mRNA的碱 基序列互补，碱基组成不一定相同，D错误。故选A。
