第49讲 微生物的培养技术及应用
复习目标 1.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术； 2.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物； 3.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法； 4.概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。
@考点1 微生物的基本培养技术
考点1 微生物的基本培养技术
A基础知识重点疑难
1.培养基的配制
(1)培养基的概念：人们按照微生物对 营养物质 的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)培养基的营养构成：各种培养基一般都含有 水、碳源、氮源 和无机盐等营养物质。另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
笔记：一般指生长因子，是一类调节微生物正常生长代谢所必需的但不能利用碳源、氮源自行合成的有机物(如维生素等)
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加 维生素
霉菌 一般将培养基调至 酸 性
细菌 一般将培养基调至 中性或弱碱 性
厌氧微生物 提供 无氧 条件
提醒 (1)常见选择培养基举例
①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
(2)几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 N、N等 光能
硝化 细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
(3)培养基的种类及用途
划分 标准 培养基的种类 特点或原理 用途
物理 性质 液体培养基 不加 凝固剂 工业生产
加凝固剂，如 琼脂
半固体培养基 观察微生物的运动、鉴定
固体培养基 微生物的分离与鉴定、活菌计数、菌种保藏
化学 成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 分类、鉴定
功能 选择培养基 培养基中加入某种化学物质，以 抑制 不需要的微生物的生长，或促进所需要的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如在培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素；在培养金黄色葡萄球菌时，可在培养基中加入高浓度的食盐等)
鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入 某种指示剂或化学药品 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基检测饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)
2.无菌技术
(1)目的：获得 纯净的培养物 。
(2)常用的消毒和灭菌方法
笔记：实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性失活
项目 概念 常用方法 应用范围
消毒 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物① 煮沸消毒法：在100 ℃下煮沸5～6 min 可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
巴氏消毒法：在63～65 ℃消毒30 min或72～76 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s 一些不耐高温的液体，如 牛奶 。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分
化学药物消毒法② 如用酒精③擦拭双手、用氯气消毒水源等
紫外线消毒法：紫外线照射30 min，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果 接种室、接种箱或超净工作台。可以杀死物体表面或空气中的微生物
灭菌 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 接种工具④的灭菌和试管口、瓶口等的灭菌
干热灭菌：在160～170 ℃下灭菌 1～2 h 耐高温的和需要保持干燥的物品，如 玻璃器皿 、金属用具等的灭菌
湿热灭菌 ：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌(在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min)的效果最好 培养基及容器的灭菌
笔记：①部分微生物依然存活 ②作用原理：使菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭芽孢和孢子 ③体积分数为70％～75％的酒精消毒效果最好 ④如涂布器、接种环、接种针等
3.微生物的纯培养
(1)概念：由 单一个体 繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是 纯培养 。
(2)方法：平板划线法和 稀释涂布平板法 。
(3)菌落的概念：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成 肉眼 可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
(4)酵母菌纯培养的操作步骤
制备培 养基 ①配制培养基：目的明确、营养 协调 、pH适宜 ②灭菌：培养基用 高压蒸汽灭菌法 灭菌，培养皿用 干热灭菌法 灭菌 ③倒平板：培养基冷却至 50 ℃ 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
接种和 分离 通过平板划线法操作纯化、分离微生物
培养 酵母菌 ①对照组：未接种平板倒置培养 ②实验组：接种平板倒置培养
结果分析与评价 ①未接种培养基表面是否有菌落生长(若有菌落，则说明培养基被杂菌污染) ②接种的培养基表面是否出现单菌落，菌落大小、形状、颜色是否一致，是否符合微生物特征 ③若培养基表面出现了其他菌落，可能是由哪些原因引起的
提醒 概念辨析
培养物 接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体
纯培养 获得纯培养物的过程
4.倒平板的操作步骤
拔出锥形瓶的棉塞
将瓶口迅速通过火焰
用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基(10～20 mL)倒入培养皿，立即盖上皿盖
等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置
笔记：火焰附近没有杂菌
提醒 (1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时，要用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
5.平板划线法操作步骤
(1)实验成功关键点
第一次 划线 第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环① 灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种
第二次 划线 在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落
要求 划线时最后一区域不要与第一区域相连②；划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破
笔记：①灼烧接种环的次数＝划线次数＋1 ②若连接，则基本无法获得单菌落，实验失败
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
第一次划 线前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
每次划线 前灼烧 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自上次划线的末端
最后一次划 线结束灼烧 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
B拆解真题情境推理
[判断正误]
1.(2022·湖北卷)为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌。( × )
2.(2023·辽宁卷)细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置。( √ )
3.(2023·河北卷)平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境。( × )
4.(2024·江苏卷)从试管取菌种前，先在火焰旁拔棉塞，再将试管口迅速通过火焰以灭菌。( √ )
[情境推理]
1.(选择性必修3 P12“探究·实践”)(1)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 。
提示：(1)通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则这个平板不能用来培养微生物，为什么？ 。
提示：(2)空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，造成污染
(3)平板划线法划线过程中，不能将最后一次的划线与第一次的划线相连，为什么？ 。
提示：(3)平板划线法通过依次在上一次划线末端再次划线达到菌种稀释，获得单菌落的目的。若将最后一次的划线与第一次的划线相连则无法达到这一目的
2.(2023·新课标卷节选)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养物，此实验中的纯培养物是 。
提示：由一个根瘤菌繁殖所获得的根瘤菌群体
3.(2021·广东卷节选)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是 (答出两点即可)。
提示：培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环境是碱性的，杂菌会因酶失活而死亡
4.(2022·全国乙卷节选)用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路： 。
提示：分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基、培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较含不同浓度制糖废液的培养基中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度
5.(2023·湖南卷节选)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营养物质包括水和 。
提示：无机盐、淀粉
C升华思维实战演练
培养基的配制和无菌技术
1.(2025·湖北襄阳四校联考)微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是( B )
A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子
B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌
C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
解析：煮沸消毒法可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一切微生物，包括芽孢和孢子，A错误；指示剂和染料中可能混有微生物，因此加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。
解题方法
常见物品的消毒或灭菌方法
（1）消毒方法及适用对象
①煮沸消毒法：日常食品、维装食品等;
②巴氏消毒法：牛奶等不耐高温的液体等;
③化学药剂消毒法：操作者双手、动植物表面等;
④紫外线消毒法：接种室、接种箱或超净工作台等。
（2）灭菌方法及适用对象
①灼烧灭菌：接种工具、其他金属用具等;
②干热灭菌：玻璃器皿、金属用具等;
③湿热灭菌：培养基等，其中高压蒸汽灭菌效果最好。
2.(2025·湖南名校联盟改编)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防细菌、病毒感染的有效措施之一。某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目，请回答下列问题：
(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供 碳源、氮源和维生素
等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入 琼脂 。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量 水 的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30 min。
(2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的 接种 ，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是 避免周围环境中的微生物污染培养基 。
(3)统计甲、乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲组少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应 用酒精棉球擦拭、戴消毒手套
等方法处理(答出1种即可)。
(4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确，并预期结果和结论。 再加一个不接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，说明培养过程中被杂菌污染，猜想正确 。
微生物的纯培养
3.(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是( D )
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
解析：由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
@考点2 微生物的选择培养和计数
考点2 微生物的选择培养和计数
A基础知识重点疑难
1.区分选择培养基与鉴别培养基
种类 特点 用途 举例
选择 培养基 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长 从众多微生物中分离所需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基分离得到尿素分解菌
鉴别 培养基 根据微生物的代谢特点在培养基中加入某种指示剂或化学药品，进而产生特定的颜色或其他变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌
提醒 常见选择培养基举例：缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。含青霉素的培养基可淘汰大部分细菌，筛选出真菌。无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作：取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板操作
取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
将涂布器浸在盛有 酒精 的烧杯中
将涂布器放在 火焰上灼烧 ，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
用涂布器将菌液均匀地涂布在 培养基表面 。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
3.微生物的数量测定
方法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原理 样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×10 000×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
误差 比实际值偏 小 比实际值偏 大
细菌的数目还可以通过滤膜法来测定
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
项目 详细内容
实验原理 ①某些细菌能分解尿素是因为它们能合成 脲酶 ，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源 ②配制以 尿素 为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就是能分解尿素的细菌
数量统计 ①显微镜直接计数法 ②稀释涂布平板法
实验流程 土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察→菌落计数
鉴定方法 在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则说明该细菌能分解尿素
实验结果与评价 有无杂菌污染的判断 对照的培养皿无菌落生长→未被杂菌污染 对照的培养皿有菌落生长→被杂菌污染
培养基是否具筛选作用 选择培养基上的菌落数目远少于牛肉膏培养基上的菌落数目→选择培养基具筛选作用
样品稀释评价 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板→操作成功
重复组的结果 比较各重复组→若选取同一种土样，统计结果应接近
笔记：同一稀释倍数的三个重复组的菌落数不能相差悬殊，若相差较大，表示实验不精确，需重新进行实验
提醒 微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落 挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择 培养法 利用选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长，然后筛选目的微生物
鉴定 培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征 鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法 如在尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色 鉴别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
B拆解真题情境推理
[判断正误]
1.(2024·贵州卷)稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数。( √ )
2.(2024·浙江6月选考)(题干信息：脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。)
(1)产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖。( √ )
(2)以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌。( √ )
3.(2023·江苏卷)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。( × )
4.(2022·江苏卷改编)某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。( √ )
5.(2021·浙江6月选考)涂布平板法和划线分离法均能得到单菌落，都可用于细菌计数。( × )
6.(2024·河北卷)从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物。( √ )
7.(2023·辽宁卷)同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值。( √ )
[情境推理]
1.为什么只有能分解尿素的微生物才能在尿素固体培养基上生长？ 。
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源
2.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是 。
提示：生物与环境具有相互依存的关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境
3.(2022·河北卷节选)培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用 (填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是 。
提示：稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落基本都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法不能直接区分死菌和活菌
4.(2019·全国卷Ⅲ节选)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是 。
提示：在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
C升华思维实战演练
微生物的选择培养
1.(2023·山东卷)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( D )
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
解析：不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
溯源教材 找答案：某些微生物体内能合成脲酶，脲酶能催化 尿素 分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的 氮 源，由以上可以推断D 正确 。
2.(多选)(2024·黑吉辽卷)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是( CD )
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B.将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D.判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
解析：由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；由题图可知，将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法可分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
解题方法
微生物的筛选和鉴别方法
（1）微生物的筛选方法
①单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法将微生物接种到固体培养基的表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
②选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物，如在以尿素为唯一氮源的培养基中，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
③鉴别培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物，如用伊红一美蓝培养基鉴别大肠杆菌（菌落呈紫黑色并带金属光泽）。
（2）微生物的鉴别方法
①菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
②指示剂鉴别法
如在能分解尿素的微生物的培养基（尿素是唯一氮源）中加入酚红指示剂后，若培养基变红，则说明这种微生物能分解尿素。
③染色鉴别法
如在能分解纤维素的微生物的培养基（纤维素是唯一碳源）中加入刚果红，若培养基中出现以菌落为中心的透明图，则说明该微生物能分解纤维素。
微生物的分离和计数
3.(2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 显微镜直接计数法将活菌和死菌一起计数，菌落计数法存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌 。
解析：(1)显微镜直接计数法一般是把死菌和活菌一起计数；菌落计数法只计数活菌，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故测得的细菌数量前者大于后者。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 5 000 个/mL。
解析：(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，再从稀释菌液中取200 μL(0.2 mL)涂布平板，菌落计数的结果为100，则细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100÷0.2)×10＝5 000个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 杀死涂布器上可能存在的微生物，防止微生物污染 ，
冷却的目的是 防止温度过高杀死菌种 。
解析：(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 A ，判断依据是 A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高 (答出两点即可)。
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 深紫 色。
解析：(4)A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。
解析：(5)大肠杆菌在伊红美蓝(伊红—亚甲蓝)培养基上生长的菌落呈深紫色。
提醒 完成限时跟踪检测(四十九)
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第九单元 生物技术与工程
第49讲 微生物的培养技术及应用
复习目标 1.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术； 2.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物； 3.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法； 4.概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点1 微生物的基本培养技术
A基础知识重点疑难
1. 培养基的配制
(1)培养基的概念：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其生长繁殖 的营养基质。
(2)培养基的营养构成：各种培养基一般都含有 和无机盐等营养物 质。另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。
笔记：一般指生长因子，是一类调节微生物正常生长代谢所必需的但不能利用碳源、 氮源自行合成的有机物(如维生素等)
营养物质
水、碳源、氮源
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加
霉菌 一般将培养基调至 性
细菌 一般将培养基调至 性
厌氧微生物 提供 条件
维生素
酸
中性或弱碱
无氧
①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
提醒 (1)常见选择培养基举例
(2)几种微生物的营养和能量来源
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌 CO2 光能
硝化
细菌 CO2 NH3 NH3的氧化
根瘤菌 糖类等有机物 N2 有机物
酵母菌 糖类、蛋白质等有机物 蛋白质等 有机物
(3)培养基的种类及用途
划分标准 培养基的种类 特点或原理 用途
物理
性质 液体培养基 不加 工业生产
加凝固剂，如
半固体培养基 观察微生物的运动、鉴定
固体培养基 微生物的分离与鉴定、活菌计数、菌种保藏
化学
成分 天然培养基 含化学成分不明确的天然物质 工业生产
合成培养基 培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质配成) 分类、鉴定
凝固剂
琼脂
划分标准 培养基的种类 特点或原理 用途
功 能 选择培养基 培养基中加入某种化学物 质，以 不需要的微 生物的生长，或促进所需要 的微生物的生长 培养、分离出特定微生物(如在培 养酵母菌和霉菌时，可在培养基 中加入青霉素；在培养金黄色葡 萄球菌时，可在培养基中加入高 浓度的食盐等)
抑制
划分标准 培养基的种类 特点或原理 用途
功 能 鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在 培养基中加入 鉴别不同种类的微生物，如可用 伊红—亚甲蓝琼脂培养基检测饮 用水或乳制品中是否有大肠杆菌 (若有，菌落呈深紫色，并带有金 属光泽)
某种指示剂
或化学药品
2. 无菌技术
(1)目的：获得 。
(2)常用的消毒和灭菌方法
笔记：实质都是使微生物的蛋白质或核酸变性失活
纯净的培养物
项 目 概念 常用方法 应用范围
消 毒 使用较为温和的物理、化学或生 物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物① 煮沸消毒法：在100 ℃下煮沸5～6 min 可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢
消 毒 巴氏消毒法：在63～65 ℃消毒30 min或72～76 ℃处理15 s或80～85 ℃处理10～15 s 一些不耐高温的液体，如 。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分
化学药物消毒法② 如用酒精③擦拭双手、用氯气消毒水源等
牛奶
项 目 概念 常用方法 应用范围
消 毒 使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物① 紫外线消毒法：紫外线照射30 min，在照 射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒 液，可以加强消毒效果 接种室、接种箱或超净工作台。可以杀死物体表 面或空气中的微生物
项 目 概念 常用方法 应用范围
灭 菌 使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧 接种工具④的灭菌和试管口、瓶口等的灭菌
干热灭菌：在160～170 ℃下灭菌 1～2 h 耐高温的和需要保持干燥的物品，如 、金属用具等的灭菌
：利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌(在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min)的效果最好 培养基及容器的灭菌
玻璃器
皿
湿热灭菌
笔记：①部分微生物依然存活 ②作用原理：使菌体内蛋白质变性，但是化学物质很 难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭芽孢和孢子 ③体 积分数为70％～75％的酒精消毒效果最好 ④如涂布器、接种环、接种针等
3. 微生物的纯培养
(1)概念：由 繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过 程就是 。
(2)方法：平板划线法和 。
(3)菌落的概念：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成 可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
单一个体
纯培养
稀释涂布平板法
肉眼
(4)酵母菌纯培养的操作步骤
制备培
养基 ①配制培养基：目的明确、营养 、pH适宜
②灭菌：培养基用 灭菌，培养皿用 灭菌
③倒平板：培养基冷却至 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板
接种和
分离 通过平板划线法操作纯化、分离微生物
培养
酵母菌 ①对照组：未接种平板倒置培养
②实验组：接种平板倒置培养
结果分 析与评 价 ①未接种培养基表面是否有菌落生长(若有菌落，则说明培养基被杂菌污染)
②接种的培养基表面是否出现单菌落，菌落大小、形状、颜色是否一致，是 否符合微生物特征
③若培养基表面出现了其他菌落，可能是由哪些原因引起的
协调
高压蒸汽灭菌法
干热灭菌法
50 ℃
提醒 概念辨析
培养物 接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物 由单一个体繁殖所获得的微生物群体
纯培养 获得纯培养物的过程
4. 倒平板的操作步骤
拔出锥形瓶的棉塞
将瓶口迅速通过火焰
用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基(10～20 mL)倒入培养皿，立即盖上皿盖
等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置
笔记：火焰附近没有杂菌
提醒 (1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会 凝固。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培 养基。
(3)倒平板时，要用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开， 以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置 后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染。
5. 平板划线法操作步骤
(1)实验成功关键点
第一次
划线 第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接 种环①
灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种
第二次
划线 在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这 样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌 繁殖而来的菌落
要求 划线时最后一区域不要与第一区域相连②；划线用力大小要适当，防止用力 过大将培养基划破
笔记：①灼烧接种环的次数＝划线次数＋1 ②若连接，则基本无法获得单菌落，实验 失败
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
第一次划
线前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
每次划线
前灼烧 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种均来自 上次划线的末端
最后一次划
线结束灼烧 杀死接种环上残留的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
×
√
×
√
[情境推理]
1. (选择性必修3 P12“探究·实践”)(1)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷 凝后，为什么要将平板倒置？ 。
提示：(1)通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，皿盖上会凝结 水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水 分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，则这个平板 不能用来培养微生物，为什么？ 。
提示：(2)空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，造成污染
(3)平板划线法划线过程中，不能将最后一次的划线与第一次的划线相连，为什 么？ 。
提示：(3)平板划线法通过依次在上一次划线末端再次划线达到菌种稀释，获得单菌落 的目的。若将最后一次的划线与第一次的划线相连则无法达到这一目的
2. (2023·新课标卷节选)从豆科植物的根瘤中分离根瘤菌进行培养，可以获得纯培养 物，此实验中的纯培养物是 。
提示：由一个根瘤菌繁殖所获得的根瘤菌群体
3. (2021·广东卷节选)基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种 不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发 酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是 (答出两点即可)。
提示：培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环 境是碱性的，杂菌会因酶失活而死亡
4. (2022·全国乙卷节选)用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密 切。若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关 实验。请简要写出实验思路： 。
提示：分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基、培养菌株 C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较含不同浓度制糖废液的培养基中 的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度
5. (2023·湖南卷节选)若从植物根际土壤中筛选分解淀粉的固氮细菌，培养基的主要营 养物质包括水和 。
提示：无机盐、淀粉
A. 煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子
B. 将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌
C. 加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
D. 家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
解析：煮沸消毒法可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一 切微生物，包括芽孢和孢子，A错误；指示剂和染料中可能混有微生物，因此加入培 养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌 或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。
B
解题方法
常见物品的消毒或灭菌方法
（1）消毒方法及适用对象
①煮沸消毒法：日常食品、维装食品等;
②巴氏消毒法：牛奶等不耐高温的液体等;
③化学药剂消毒法：操作者双手、动植物表面等;
④紫外线消毒法：接种室、接种箱或超净工作台等。
（2）灭菌方法及适用对象
①灼烧灭菌：接种工具、其他金属用具等;
②干热灭菌：玻璃器皿、金属用具等;
③湿热灭菌：培养基等，其中高压蒸汽灭菌效果最好。
2. (2025·湖南名校联盟改编)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓， 拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生 物，是预防细菌、病毒感染的有效措施之一。某生物实验小组设计了“比较洗手前后 手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一 下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这 两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落 数目，请回答下列问题：
(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物 的生长提供
等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入 。为了防止外来杂 菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量 的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30 min。
碳源、氮源和维生素
琼脂
水
接种
避免周围环境中的微生物污染培养基
用酒精棉球擦拭、戴消毒手套
再加一个不
接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生
长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，说明培养
过程中被杂菌污染，猜想正确
微生物的纯培养
D
A. ①②⑤⑥ B. ③④⑥⑦
C. ①②⑦⑧ D. ①③④⑤
解析：由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖 完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧ 中平板应倒置培养。①③④⑤正确，故选D。
考点2 微生物的选择培养和计数
A基础知识重点疑难
1. 区分选择培养基与鉴别培养基
种 类 特点 用途 举例
选 择
培 养 基 允许特定种类的微生物 生长，同时抑制或阻止 其他微生物生长 从众多微生物中分离所 需的微生物 以尿素为唯一氮源的培养基 分离得到尿素分解菌
种 类 特点 用途 举例
鉴 别
培 养 基 根据微生物的代谢特点 在培养基中加入某种指 示剂或化学药品，进而 产生特定的颜色或其他 变化 鉴别不同种类的微生物 用伊红—亚甲蓝培养基鉴别 大肠杆菌
提醒 常见选择培养基举例：缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。 含青霉素的培养基可淘汰大部分细菌，筛选出真菌。无有机碳源的培养基可筛选出自 养微生物。
2. 稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作：取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板操作
取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
将涂布器浸在盛有 的烧杯中
将涂布器放在 ，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进 行涂布
酒精
火焰上灼烧
用涂布器将菌液均匀地涂布在 。涂布时可转动培养 皿，使涂布均匀
培养基表面
3. 微生物的数量测定
方 法 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微镜直接计数法)
原 理 样品的稀释度足够高时，培养基表面 生长的一个单菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在 显微镜下计算一定体积的样品中微生物的 数量
公 式 每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落 数；V：涂布平板时所用的稀释液的 体积(mL)；M：稀释倍数 每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细 菌数×400×10 000×稀释倍数
缺 点 当两个或多个细胞连在一起时，平板 上观察到的只是一个菌落 不能区分细胞死活
误 差 比实际值偏 比实际值偏
细菌的数目还可以通过滤膜法来测定
小
大
4. 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
项目 详细内容
实验原理 ①某些细菌能分解尿素是因为它们能合成 ，脲酶催化尿素分解产 生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源
②配制以 为唯一氮源的培养基，能够在该培养基中生长的细菌就 是能分解尿素的细菌
数量统计 ①显微镜直接计数法
②稀释涂布平板法
实验流程 土壤取样→制备培养基→样品的稀释与涂布平板→微生物的培养与观察→ 菌落计数
鉴定方法 在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，则说明该细菌能分解尿素
脲酶
尿素
项目 详细内容
实 验 结 果 与 评 价 有无杂 菌污染 的判断 对照的培养皿无菌落生长→未被杂菌污染
对照的培养皿有菌落生长→被杂菌污染
培养基 是否具 筛选作 用 选择培养基上的菌落数目远少于牛肉膏培养基上的菌落数目→选择培养基 具筛选作用
样品稀 释评价 得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板→操作成功
重复组 的结果 比较各重复组→若选取同一种土样，统计结果应接近
笔记：同一稀释倍数的三个重复组的菌落数不能相差悬殊，若相差较大，表示实验不 精确，需重新进行实验
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法 利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法 利用选择培养基允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长，然后筛选目的微生物
鉴定培养法 利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物
提醒 微生物的筛选与鉴别方法
(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法 根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法 如在尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴
别法 如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来鉴别分解纤维素的微生物
B拆解真题情境推理
[判断正误]
2. (2024·浙江6月选考)(题干信息：脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。 脲酶被去除镍后失去活性。)
√
√
√
×
√
×
√
√
[情境推理]
1. 为什么只有能分解尿素的微生物才能在尿素固体培养基上生长？ 。
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供 氮源
2. 在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是 。
提示：生物与环境具有相互依存的关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含 量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境
3. (2022·河北卷节选)培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用 (填“稀释涂布平板 法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是 。
提示：稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落基本都来自 一个活细胞，而显微镜直接计数法不能直接区分死菌和活菌
4. (2019·全国卷Ⅲ节选)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形 状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是 。
提示：在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
A. 不含氮源的平板不能用于微生物培养
B. 平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C. 接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D. 利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
D
解析：不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前 必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B 错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢 弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平 板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合 成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出 合成脲酶的微生物，D正确。
溯源教材 找答案：某些微生物体内能合成脲酶，脲酶能催化 分解产生NH3， NH3可作为微生物生长的 源，由以上可以推断D 。
尿素
氮
正确
A. 在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B. 将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C. 将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D. 判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
CD
解析：由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，在 大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；获得纯净 的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗， 收集冲洗液进行无菌检测，B错误；由题图可知，将无菌检测合格的样品研磨，经稀 释涂布平板法可分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图抗性检测可知，判断内生 菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组 接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌 斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
解题方法
微生物的筛选和鉴别方法
（1）微生物的筛选方法
①单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法将微生物接种到固体培养基的表面，直接根据微生 物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
②选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物，如在以尿素为唯一氮 源的培养基中，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。
③鉴别培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物，如用伊红 一美蓝培养基鉴别大肠杆菌（菌落呈紫黑色并带金属光泽）。
（2）微生物的鉴别方法
①菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征 进行鉴别。
②指示剂鉴别法
如在能分解尿素的微生物的培养基（尿素是唯一氮源）中加入酚红指示剂后，若培养 基变红，则说明这种微生物能分解尿素。
③染色鉴别法
如在能分解纤维素的微生物的培养基（纤维素是唯一碳源）中加入刚果红，若培养基 中出现以菌落为中心的透明图，则说明该微生物能分解纤维素。
微生物的分离和计数
3. (2024·全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒 液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
显微镜直接计数法将活菌和死菌一起计数，
菌落计数法存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌
解析：(1)显微镜直接计数法一般是把死菌和活菌一起计数；菌落计数法只计数活菌， 还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故测得的细菌数量前者大于后者。
解析：(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀 释了10倍，再从稀释菌液中取200 μL(0.2 mL)涂布平板，菌落计数的结果为100，则细 菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100÷0.2)×10＝5 000个/mL。
5
000
解析：(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的 是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目 的是防止温度过高杀死菌种。
杀
死涂布器上可能存在的微生物，防止微生物污染
防止温度过高杀死菌种
A
A消毒液活菌数减少量最
多，且杀菌时间较短，效率最高
深紫
解析：(4)A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌 效果最好。
解析：(5)大肠杆菌在伊红美蓝(伊红—亚甲蓝)培养基上生长的菌落呈深紫色。
