提升点1 PCR技术及应用
1．PCR循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物1(或2)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物1、2的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
3．利用RT-PCR技术进行RNA病毒的核酸检测
(1)RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)
①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。
②先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为某病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止检测的物质在检测过程中降解，把它转换为更稳定的DNA。
③检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。这些扩增出的供检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中目标RNA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。
(2)荧光探针法(TaqMan技术)是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，Q)。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被Taq酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。如图所示：
荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct>40或无Ct值判定为阴性。
通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是( )
A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、Taq酶等
B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
C [PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。]
提升点2 电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率取决于核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同切割点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果是个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同切割点每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
图1、图2表示甲、乙两种遗传方式不同的单基因遗传病，其中一种病的致病基因位于X染色体，甲病相关基因用A(a)表示、乙病相关基因用B(b)表示；图3表示A(a)、B(b)四种基因经过电泳所形成的条带分布情况。下列叙述正确的是( )
A．Ⅱ5的甲病基因和Ⅱ7的乙病的致病基因均来自Ⅰ1和Ⅰ2
B．图3中条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、B、b
C．Ⅱ7、Ⅱ9、Ⅱ10的基因型分别是AAXbY、aaXBY、AAXBXB
D．Ⅱ 6与Ⅱ 9婚配生出两病兼患男孩的概率是1/24
D [Ⅱ5的甲病基因(a)来自Ⅰ1和Ⅰ2，Ⅱ7的乙病致病基因(b)来自Ⅰ1，A错误。Ⅱ5和Ⅱ9都患甲病，其基因型为aa，因此Ⅰ3、Ⅰ4的基因型都为Aa；在图3中由Ⅰ3、Ⅰ4、Ⅱ5的条带1和条带2特点，可以推测条带1、条带2分别表示A、a基因，分析条带3和条带4的特点，Ⅰ4不患乙病，其基因型为XBY，推知条带3、条带4分别表示b、B基因，因此，图3中的条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、b、B，B错误。Ⅱ7两病都患，其基因型为aaXbY；Ⅱ9只患甲病，其基因型为aaXBY，图3中的条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、b、B，故Ⅱ10的基因型是AAXBXB，C错误。Ⅱ6的基因型为(2/3)Aa(1/2)XBXb，Ⅱ9的基因型为aaXbY，两者婚配生出两病兼患男孩的概率是2/3×1/2×1/2×1/4＝1/24，D正确。]
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选择性必修3 生物技术与工程
素养加强课10 PCR技术与电泳相关问题
提升点1 PCR技术及应用
1．PCR循环图示及规律
2．PCR中的数量关系
循环次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物1(或2)的DNA分子数 1 3 7 2n－1
同时含引物1、2的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2
共消耗的引物数量 2＝21＋1－2 6＝22＋1－2 14＝23＋1－2 2n＋1－2
3．利用RT-PCR技术进行RNA病毒的核酸检测
(1)RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)
①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。
②先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为某病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止检测的物质在检测过程中降解，把它转换为更稳定的DNA。
③检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。这些扩增出的供检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中目标RNA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。
(2)荧光探针法(TaqMan技术)是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，Q)。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测到荧光信号；而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被Taq酶的5′→3′外切酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，荧光信号累积的越多，荧光强度越大。如图所示：
荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct>40或无Ct值判定为阴性。
通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。右图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是( )
A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、Taq酶等
B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
√
C [PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。]
提升点2 电泳技术及应用
1．核酸凝胶电泳
一般用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移速率也就越快，反之则较慢。在一定的电场强度下，电泳分子的迁移速率取决于核酸分子的大小和构象以及凝胶的浓度等。
在生理条件下，核酸分子的糖—磷酸骨架呈离子状态，即DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖—磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移，从而分离出相应的DNA片段。
2．电泳在遗传中的应用
遗传病、基因与电泳结果之间的关系如图。限制酶切割基因时，有n个识别点，切割后可以得到n＋1个片段。基因在人体中是成对存在的，如果个体中两个基因相同，用限制酶处理，基因有相同切割点，电泳结果显示条带数量之和构成该基因；如果是个体中存在等位基因，用限制酶处理，两个基因可能存在不同切割点每个基因形成不同片段，电泳结果显示不同条带，每个基因片段需要结合相同基因进一步判断基因片段。
图1、图2表示甲、乙两种遗传方式不同的单基因遗传病，其中一种病的致病基因位于X染色体，甲病相关基因用A(a)表示、乙病相关基因用B(b)表示；图3表示A(a)、B(b)四种基因经过电泳所形成的条带分布情况。下列叙述正确的是( )
A．Ⅱ5的甲病基因和Ⅱ7的乙病的致病基因均来自Ⅰ1和Ⅰ2
B．图3中条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、B、b
C．Ⅱ7、Ⅱ9、Ⅱ10的基因型分别是AAXbY、aaXBY、AAXBXB
D．Ⅱ 6与Ⅱ 9婚配生出两病兼患男孩的概率是1/24
√
D [Ⅱ5的甲病基因(a)来自Ⅰ1和Ⅰ2，Ⅱ7的乙病致病基因(b)来自Ⅰ1，A错误。Ⅱ5和Ⅱ9都患甲病，其基因型为aa，因此Ⅰ3、Ⅰ4的基因型都为Aa；在图3中由Ⅰ3、Ⅰ4、Ⅱ5的条带1和条带2特点，可以推测条带1、条带2分别表示A、a基因，分析条带3和条带4的特点，Ⅰ4不患乙病，其基因型为XBY，推知条带3、条带4分别表示b、B基因，因此，图3中的条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、b、B，B错误。Ⅱ7两病都患，其基因型为aaXbY；Ⅱ9只患甲病，其基因型为aaXBY，图3中的条带1、2、3、4对应的基因分别是A、a、b、B，故Ⅱ10的基因型是AAXBXB，C错误。Ⅱ6的基因型为(2/3)Aa(1/2)XBXb，Ⅱ9的基因型为aaXbY，两者婚配生出两病兼患男孩的概率是2/3×1/2×1/2×1/4＝1/24，D正确。]
