第50讲 微生物的培养技术及应用
课标要求 1.阐明在发酵工程中防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的前提。2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。5.概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。
考情分析 1.微生物的基本培养技术 2024·湖南卷，6；2024·黑吉辽卷，19；2024·浙江6月选考，10；2023·全国乙卷，37；2023·河北卷，12；2023·重庆卷，9；2022·天津卷，3
2.微生物的选择培养和计数 2024·贵州卷，21；2024·江西卷，17；2024·重庆卷，13；2024·广东卷，21；2024·浙江6月选考，11；2024·浙江6月选考，14；2023·山东卷，15；2023·广东卷，10；2023·北京卷，16；2023·河北卷，3；2023·辽宁卷，9；2022·全国甲卷，37；2022·全国乙卷，37；2022·广东卷，21
考点一 微生物的基本培养技术
INCLUDEPICTURE"核心要点再研.tif" INCLUDEPICTURE "../../核心要点再研.tif" \* MERGEFORMAT
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、类型和用途
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(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、 、氮源、 。
②其他条件：pH、 和氧气。如下表：
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加_____ pH调至_____ pH调至______ ______
2.无菌技术
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无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)
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3.微生物的纯培养
(1)概念辨析
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(2)酵母菌纯培养的操作步骤
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(3)倒平板的操作步骤
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①培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4.平板划线法操作步骤
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(1)实验成功关键点
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(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
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考向1 结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维
1.(2024·湖南卷，6)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是( )
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A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
2.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( )
A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
考向2 围绕微生物的纯培养，考查科学探究
3.(2020·江苏卷，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
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A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
4.(2025·广东佛山调研)如图为实验室中酵母菌纯培养过程的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
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A.微生物的纯培养物就是指不含代谢废物的微生物培养物
B.步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至室温后开始倒平板
C.步骤①使用的培养基制备过程是先调pH再灭菌
D.③到④过程中，每次划线后都需要灼烧接种环并蘸取菌液
考点二 微生物的选择培养和计数
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1.选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
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常见选择培养基举例
①筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源的培养基。
②将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物。
③缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
④含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
⑤无有机碳源的培养基可筛选出自养型微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
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(2)涂布平板操作
序号 名称 图示 操作
1 取菌液 INCLUDEPICTURE"SW664.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW664.tif" \* MERGEFORMAT 取0.1 mL菌液，滴加到
2 涂布器消毒 INCLUDEPICTURE"SW665.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW665.tif" \* MERGEFORMAT 将涂布器浸在盛有 的烧杯中
3 涂布器灭菌 INCLUDEPICTURE"SW666.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW666.tif" \* MERGEFORMAT 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4 涂布平板 INCLUDEPICTURE"SW667.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW667.tif" \* MERGEFORMAT 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使
3.微生物的数量测定方法
(1)显微镜直接计数法
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提醒 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
(2)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计数原则：为了保证结果准确，一般选择菌落数为 的平板进行计数。
③误差分析：用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目 (填“高”或“低”)，因为 。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
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(2)实验流程
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(3)实验结果分析与评价
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5.分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
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(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
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INCLUDEPICTURE"考点速览.tif" INCLUDEPICTURE "../../考点速览.tif" \* MERGEFORMAT
(1)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷，7D)( )
(2)某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(2022·江苏卷，3B)( )
(3)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数。(2021·浙江6月选考，17C)( )
(4)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。(2020·浙江7月选考，19A)( )
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考向1 围绕微生物的选择培育，考查科学探究
1.(2023·广东卷，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )
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A.A点时取样、尿素氮源培养基
B.B点时取样、角蛋白氮源培养基
C.B点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.C点时取样、角蛋白氮源培养基
2.(2025·江苏徐州调研)研究人员筛选和分离纤维素分解菌，在刚果红培养基平板上，筛选到有透明降解圈的菌落，所形成的菌落如图所示。相关说法错误的是( )
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A.纤维素的基本单位是葡萄糖
B.透明圈的形成是由于纤维素被分解后刚果红不能与纤维素结合形成红色复合物
C.透明圈可能是分解刚果红的菌种形成的，为确定得到的是纤维素分解菌还需进行发酵产纤维素酶实验
D.菌落②的中心区域最大，纤维素分解菌含量多，是需要筛选和分离的目标菌株
考向2 围绕微生物的分离与计数，考查科学探究
3.(2024·重庆卷，13)养殖场粪便是农家肥的重要来源，其中某些微生物可使氨氮化合物转化为尿素进而产生NH3，影响畜禽健康。为筛选粪便中能利用氨氮化合物且减少NH3产生的微生物。兴趣小组按图进行实验获得目的菌株，正确的是( )
INCLUDEPICTURE"24GT181.tif" INCLUDEPICTURE "../../24GT181.tif" \* MERGEFORMAT
A.①通常在等比稀释后用平板划线法获取单个菌落
B.②挑取在2种培养基上均能生长的用于后续的实验
C.③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙
D.粪便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的减少
4.(2024·浙江6月选考，14)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是( )
A.镍是组成脲酶的重要元素
B.镍能提高尿素水解反应的活化能
C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
INCLUDEPICTURE"跳出题海.tif" INCLUDEPICTURE "../../跳出题海.tif" \* MERGEFORMAT
两种纯化方法的比较
INCLUDEPICTURE"+22.tif" INCLUDEPICTURE "../../+22.tif" \* MERGEFORMAT INCLUDEPICTURE"关键真题必刷.tif" INCLUDEPICTURE "../../关键真题必刷.tif" \* MERGEFORMAT 1.(2023·辽宁卷，9)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的
浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是( )
A.采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B.细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C.同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D.稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
2.(2024·江苏卷，9)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是( )
A.酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌
B.酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养
C.可用稀释涂布平板法对酵母菌计数
D.该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰
3.(2023·浙江1月选考，19)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是( )
A.培养基pH需偏碱性
B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C.需在无氧条件下培养
D.分离得到的微生物均为乳酸菌
4.(2024·江西卷，17)聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇胺(一种磷脂类物质)为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。
(2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基(在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂)平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是
_________________________________________________________________。
INCLUDEPICTURE"情境·探究·长句.tif" INCLUDEPICTURE "../../情境·探究·长句.tif" \* MERGEFORMAT
随着经济时代的发展，方便快捷的各种外卖越来越受年轻人的青睐，但是随之而来，“外卖是否卫生、是否环保”成了人们讨论的焦点话题。
INCLUDEPICTURE"SW675.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW675.tif" \* MERGEFORMAT
外卖餐盒常用材料淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE)是一种聚乙烯类塑料替代材料，科研人员开展相关研究，从垃圾堆埋场中筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株，试图解决外卖餐盒的环境污染问题。
(1)在进行该菌株的分离筛选时，需要将一定量的适宜稀释倍数的土壤悬液接种在以
为唯一碳源的液体培养基上，重复多次进行富集培养，然后将富集培养的菌液接种到固体培养基上。此种分离纯化微生物的接种方法称为 。
研究未知的微生物一定要注意进行规范的无菌操作，以防 ，实验后，一定要洗手。
(2)科研人员将富集得到的菌株分别接入以聚乙烯蜡(PE－WAX，一种低分子聚乙烯)为唯一碳源的基本培养基中，挑选能在该培养基中生长的菌株，结果如图1所示。同时，将富集得到的菌株转接至淀粉固体培养基，观察透明圈(出现透明部分说明该菌株能分泌胞外 酶)，结果如图2所示。综上分析，菌株 (从图1、图2中选择序号)为所选菌株，原因是_____________________________。
第50讲 微生物的培养技术及应用
考点一
核心要点·再研
1.(1)营养物质 生长繁殖 液体 积累其代谢物 (2)①碳源 无机盐 ②特殊营养物质 维生素 酸性 中性或弱碱性 无氧
2.纯净的微生物培养物 防止杂菌污染 消毒 灭菌
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3.(1)固体培养基 一定形态结构 (2)15～20 g琼脂 湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法 干热灭菌 酒精灯火焰 灼烧灭菌 平板划线法 恒温培养箱 28 菌落 形态
4.灼烧 火焰旁 火焰 棉塞 平行线 第一次 第一次 倒置
典型例题·深研
1.D [由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养，D正确。]
2.D [动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养基中一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。]
3.B [倒平板后无需间歇晃动，A错误；图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量均太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖等形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。]
4.C [由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A错误；步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至50 ℃左右时，开始倒平板，B错误；③到④过程中，每次划线后对接种环进行灼烧处理，是为了杀死接种环上残留的菌种，使下次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，不需要重新蘸取菌液，D错误。]
考点二
核心要点·再研
1.抑制或阻止
2.(2)培养基表面 酒精 涂布均匀
3.(2)①单菌落 一个活菌 ②30～300 ③低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
4.(1)脲酶 尿素 (2)30～300 温度 时间 (3)少于 30～300
5.(2)纤维素 刚果红 红色复合物
考点速览
(1)× 提示 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
(2)√
(3)× 提示 平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数。
(4)× 提示 尿素固体培养基属于选择培养基，以尿素为唯一氮源，不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存，故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物。
典型例题·深研
1.D [研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌具有既耐高温，又能够高效降解角蛋白的功能，所以在C点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D符合题意。]
2.D [刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，而当平板上纤维素被纤维素分解菌分解后，则无法形成红色复合物，从而出现透明圈，B正确；使用刚果红筛选和分离纤维素分解菌存在假阳性反应，即透明圈可能是由其他微生物降解刚果红而形成的，因此为确保是否得到目的菌，需要进行发酵产纤维素酶实验，C正确；菌落①的透明圈范围大，而且菌落小，说明菌落①降解纤维素的能力强，因此菌落①是需要筛选和分离的目标菌株，D错误。]
3.C [平板划线法无需稀释，A错误；由图可知，②筛选不能在尿素唯一氮源培养基上生长，而能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株用于后续的实验，B错误；所筛选出的菌株之所以不能利用尿素，可能是由于不产生脲酶或分泌脲酶抑制剂，所以③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙，C正确；由图可知，甲不产生脲酶而乙可以产生脲酶，且乙同时分泌脲酶抑制剂，粪便中可能还含有其他能产生脲酶的菌株，所以粪便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的减少，D错误。]
4.B [根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。]
关键·真题必刷
1.D [为防止杂菌污染，采样前需要对空气微生物采样器进行灭菌，A正确；细菌气溶胶样品恒温培养时，为防止冷凝水滴落造成污染，应将平板倒置，B正确；对微生物计数时，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值，C正确；使用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计的数值往往比实际值低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，D错误。]
2.C [酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌，A错误；将含有酵母菌的培养基放置在28 ℃左右恒温培养箱中进行培养，B错误；稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。由此可知，可用稀释涂布平板法对酵母菌计数，C正确；酵母菌是真核细胞，具有内质网和高尔基体，可以对合成的蛋白质进行加工和修饰，D错误。]
3.C [因为乳酸菌经过无氧呼吸会产生乳酸，故其生活的环境是酸性的，培养基pH需偏酸性，A错误；多次划线能起到稀释的作用，泡菜汁无需多次稀释，B错误；乳酸菌是厌氧型微生物，只能在无氧条件下培养，C正确；泡菜汁中还有酵母菌等其他杂菌，因此分离得到的微生物除了乳酸菌，还有其他微生物，D错误。]
4.(1)选择 氮源 水 无机盐 (2)转基因(或重组DNA或基因工程) 限制酶 DNA连接酶 载体 (3)诱变育种 (4)培养基的卵黄磷脂的含量、pH和灭菌是否彻底等都会影响水解圈的大小
解析 (1)以磷脂酰乙醇胺为唯一碳源的培养基可筛选产磷脂酶的微生物，这样的培养基为选择培养基。微生物培养基所含的营养物质有碳源、氮源、水和无机盐等。(2)定向改造现有微生物的方法为转基因技术(或重组DNA技术或基因工程)，转基因操作使用的工具有限制酶、DNA连接酶和载体。(3)利用物理因素(如紫外线、X射线等)或化学因素(如亚硝酸盐等)处理生物，可使现有微生物发生基因突变，创造出人类需要的新品种，由于基因突变具有不定向性，因此诱变育种技术为非定向改造生物的技术。(4)培养基的卵黄磷脂的含量、培养基pH的大小、培养基灭菌不彻底导致其他杂菌产生的代谢产物等均有可能影响水解圈的大小。
情境·探究·长句
(1)淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE) 稀释涂布平板法 被致病的微生物感染 (2)淀粉 11 既能利用聚乙烯作为碳源生长，又能利用淀粉生长，因此能够更高效降解淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE)
解析 (1)由题干信息可知，本实验是为了筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株，故培养基中的唯一碳源是淀粉—PE。此种分离纯化微生物的接种方法称为稀释涂布平板法。研究未知的微生物一定要注意进行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感染，实验后，一定要洗手、消毒。(2)观察透明圈，在淀粉固体平板上出现透明部分说明该菌株能分泌胞外淀粉酶。观察图1可知，菌株7和菌株11在以PE－WAX为唯一碳源的基本培养基中生长较好，观察图2可知，菌株11的透明圈比菌株6的大，这说明菌株11既能利用聚乙烯作为碳源生长，又能利用淀粉生长，因此能够更高效降解淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉－PE)。(共61张PPT)
微生物的培养技术及应用
第 50 讲
课标要求 1.阐明在发酵工程中防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的前提。 2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。 3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。 4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。 5.概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。
考情分析 1.微生物的基本培养技术 2024·湖南卷，6；2024·黑吉辽卷，19；2024·浙江6月选考，10；2023·全国乙卷，37；2023·河北卷，12；2023·重庆卷，9；2022·天津卷，3
2.微生物的选择培养和计数 2024·贵州卷，21；2024·江西卷，17；2024·重庆卷，13；2024·广东卷，21；2024·浙江6月选考，11；2024·浙江6月选考，14；2023·山东卷，15；2023·广东卷，10；2023·北京卷，16；2023·河北卷，3；2023·辽宁卷，9；2022·全国甲卷，37；2022·全国乙卷，37；2022·广东卷，21
1
目 录
微生物的基本培养技术
2
4
微生物的选择培养和计数
关键 · 真题必刷
3
情境 · 探究 · 长句
考点一
微生物的基本培养技术
核心要点·再研
典型例题·深研
1.培养基的配制
(1)培养基的概念、类型和用途
营养物质
生长繁殖
液体
积累其
代谢物
(2)培养基的配方
①主要营养物质：水、______、氮源、________。
②其他条件：pH、______________和氧气。如下表：
碳源
无机盐
特殊营养物质
微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物
特殊需求 添加________ pH调至______ pH调至 ______________ ______
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧
2.无菌技术
纯净的微生物培养物
防止杂菌污染
消毒
灭菌
无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)
3.微生物的纯培养
(1)概念辨析
固体培养基
一定形态结构
(2)酵母菌纯培养的操作步骤
15～20 g琼脂
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法
干热灭菌
酒精灯
火焰
灼烧灭菌
平板划线法
恒温培养箱
28
菌落
形态
(3)倒平板的操作步骤
①培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
4.平板划线法操作步骤
灼烧
火焰
旁
火焰
棉塞
平行线
第一次
第一次
倒置
(1)实验成功关键点
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
考向1 结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维
1.(2024·湖南卷，6)微生物平板划线和培养的
具体操作如图所示，下列操作正确的是( )
D
A.①②⑤⑥ B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧ D.①③④⑤
解析 由图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养，D正确。
2.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( )
A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
D
解析 动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；
动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养基中一般不能加入抗生素，B错误；
一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；
可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
考向2 围绕微生物的纯培养，考查科学探究
3.(2020·江苏卷，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( )
B
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
解析 倒平板后无需间歇晃动，A错误；
图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量均太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；
Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；
刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖等形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
4.(2025·广东佛山调研)如图为实验室中酵母菌纯培养过程的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
C
A.微生物的纯培养物就是指不含代谢废物的微生物培养物
B.步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至室温后开始倒平板
C.步骤①使用的培养基制备过程是先调pH再灭菌
D.③到④过程中，每次划线后都需要灼烧接种环并蘸取菌液
解析 由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A错误；
步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至50 ℃左右时，开始倒平板，B错误；
③到④过程中，每次划线后对接种环进行灼烧处理，是为了杀死接种环上残留的菌种，使下次划线时接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，不需要重新蘸取菌液，D错误。
A.微生物的纯培养物就是指不含代谢废物的微生物培养物
B.步骤①中，用手触摸估计培养基冷却至室温后开始倒平板
C.步骤①使用的培养基制备过程是先调pH再灭菌
D.③到④过程中，每次划线后都需要灼烧接种环并蘸取菌液
考点二
微生物的选择培养和计数
核心要点·再研
典型例题·深研
1.选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
抑制或阻止
常见选择培养基举例
①筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源的培养基。
②将培养基放在高温环境中培养，可分离出耐高温的微生物。
③缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。
④含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。
⑤无有机碳源的培养基可筛选出自养型微生物。
2.稀释涂布平板法
(1)系列稀释操作
取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(2)涂布平板操作
序号 名称 图示 操作
1 取菌液 取0.1 mL菌液，滴加到____________
2 涂布器消毒 将涂布器浸在盛有______的烧杯中
3 涂布器灭菌 将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4 涂布平板 用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使__________
培养基表面
酒精
涂布均匀
3.微生物的数量测定方法
(1)显微镜直接计数法
提醒 显微镜直接计数法本身不能区分细菌的死活，但是通过一定的辅助处理，可以实现活菌计数，如在计数前用台盼蓝染液进行染色，可以通过统计无色细胞的个数来对活菌进行计数。
(2)间接计数法——活菌计数法(即稀释涂布平板法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个________，来源于样品稀释液中的__________。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计数原则：为了保证结果准确，一般选择菌落数为_____________的平板进行计数。
③误差分析：用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目____ (填“高”或“低”)，因为______________________________________________________。
单菌落
一个活菌
30～300
低
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作
(1)实验原理
脲酶
尿素
(2)实验流程
30～300
温度
时间
(3)实验结果分析与评价
少于
30～300
5.分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
纤维素
刚果红
红色复合物
(1)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷，7D)( )
提示 血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。
(2)某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(2022·江苏卷，3B)( )
(3)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数。(2021·浙江6月选考，17C)( )
提示 平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数。
×
√
×
(4)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。(2020·浙江7月选考，19A)( )
提示 尿素固体培养基属于选择培养基，以尿素为唯一氮源，不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存，故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死其他微生物。
×
考向1 围绕微生物的选择培育，考查科学探究
1.(2023·广东卷，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )
D
A.A点时取样、尿素氮源培养基
B.B点时取样、角蛋白氮源培养基
C.B点时取样、蛋白胨氮源培养基
D.C点时取样、角蛋白氮源培养基
解析 研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌具有既耐高温，又能够高效降解角蛋白的功能，所以在C点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D符合题意。
2.(2025·江苏徐州调研)研究人员筛选和分离纤维素分解菌，在刚果红培养基平板上，筛选到有透明降解圈的菌落，所形成的菌落如图所示。相关说法错误的是( )
D
A.纤维素的基本单位是葡萄糖
B.透明圈的形成是由于纤维素被分解后刚果红不能与
纤维素结合形成红色复合物
C.透明圈可能是分解刚果红的菌种形成的，为确定得到的是纤维素分解菌还需进行发酵产纤维素酶实验
D.菌落②的中心区域最大，纤维素分解菌含量多，是需要筛选和分离的目标菌株
解析 刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，而当平板上纤维素被纤维素分解菌分解后，则无法形成红色复合物，从而出现透明圈，B正确；
使用刚果红筛选和分离纤维素分解菌存在假阳性反应，即透明圈可能是由其他微生物降解刚果红而形成的，因此为确保是否得到目的菌，需要进行发酵产纤维素酶实验，C正确；
菌落①的透明圈范围大，而且菌落小，说明菌落①降解纤维素的能力强，因此菌落①是需要筛选和分离的目标菌株，D错误。
A.纤维素的基本单位是葡萄糖
B.透明圈的形成是由于纤维素被分解后刚果红不能与纤维素结合形成红色复合物
C.透明圈可能是分解刚果红的菌种形成的，为确定得到的是纤维素分解菌还需进行发酵产纤维素酶实验
D.菌落②的中心区域最大，纤维素分解菌含量多，是需要筛选和分离的目标菌株
考向2 围绕微生物的分离与计数，考查科学探究
3.(2024·重庆卷，13)养殖场粪便是农家肥的重要来源，其中某些微生物可使氨氮化合物转化为尿素进而产生NH3，影响畜禽健康。为筛选粪便中能利用氨氮化合物且减少NH3产生的微生物。兴趣小组按图进行实验获得目的菌株，正确的是( )
C
A.①通常在等比稀释后用平板划线
法获取单个菌落
B.②挑取在2种培养基上均能生长的
用于后续的实验
C.③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙
D.粪便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的减少
解析 平板划线法无需稀释，A错误；
由图可知，②筛选不能在尿素唯一氮源培养基上生长，而能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株用于后续的实验，B错误；
所筛选出的菌株之所以不能利用尿素，可能是由于不产生脲酶或分泌脲酶抑制剂，所以③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙，C正确；
由图可知，甲不产生脲酶而乙可以产生脲酶，且乙同时分泌脲酶抑制剂，粪便中可能还含有其他能产生脲酶的菌株，所以粪便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的减少，D错误。
A.①通常在等比稀释后用平板划线法获取单个菌落
B.②挑取在2种培养基上均能生长的用于后续的实验
C.③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙
D.粪便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的减少
4.(2024·浙江6月选考，14)脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是( )
A.镍是组成脲酶的重要元素
B.镍能提高尿素水解反应的活化能
C.产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D.以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
B
解析 根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；
脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；
产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；
产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。
两种纯化方法的比较
关键 · 真题必刷
1.(2023·辽宁卷，9)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是( )
A.采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B.细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C.同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D.稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
D
解析 为防止杂菌污染，采样前需要对空气微生物采样器进行灭菌，A正确；
细菌气溶胶样品恒温培养时，为防止冷凝水滴落造成污染，应将平板倒置，B正确；
对微生物计数时，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值，C正确；
使用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，统计的数值往往比实际值低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，D错误。
2.(2024·江苏卷，9)酵母菌是基因工程中常用的表达系统。下列相关叙述正确的是( )
A.酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌，但不能灭活真菌
B.酵母菌是真核细胞，需放置在CO2培养箱中进行培养
C.可用稀释涂布平板法对酵母菌计数
D.该表达系统不能对合成的蛋白质进行加工和修饰
C
解析 酵母菌培养液使用前要灭活所有细菌和真菌，A错误；
将含有酵母菌的培养基放置在28 ℃左右恒温培养箱中进行培养，B错误；
稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。由此可知，可用稀释涂布平板法对酵母菌计数，C正确；
酵母菌是真核细胞，具有内质网和高尔基体，可以对合成的蛋白质进行加工和修饰，D错误。
3.(2023·浙江1月选考，19)某同学想从泡菜汁中筛选耐高盐乳酸菌，进行了如下实验：取泡菜汁样品，划线接种于一定NaCl浓度梯度的培养基，经培养得到了单菌落。下列叙述正确的是( )
A.培养基pH需偏碱性
B.泡菜汁需多次稀释后才能划线接种
C.需在无氧条件下培养
D.分离得到的微生物均为乳酸菌
C
解析 因为乳酸菌经过无氧呼吸会产生乳酸，故其生活的环境是酸性的，培养基pH需偏酸性，A错误；
多次划线能起到稀释的作用，泡菜汁无需多次稀释，B错误；
乳酸菌是厌氧型微生物，只能在无氧条件下培养，C正确；
泡菜汁中还有酵母菌等其他杂菌，因此分离得到的微生物除了乳酸菌，还有其他微生物，D错误。
4.(2024·江西卷，17)聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇胺(一种磷脂类物质)为唯一碳源制备________培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有________、________、________等营养物质。
选择
氮源
水
无机盐
(2)方法2采用________________________________技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要________、____________、________等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过________技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。
转基因(或重组DNA或基因工程)
限制酶
DNA连接酶
载体
诱变育种
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基(在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂)平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是____________________________________________________________________。
培养基的卵黄磷脂的含量、pH和灭菌是否彻底等都会影响水解圈的大小
解析 (1)以磷脂酰乙醇胺为唯一碳源的培养基可筛选产磷脂酶的微生物，这样的培养基为选择培养基。微生物培养基所含的营养物质有碳源、氮源、水和无机盐等。
(2)定向改造现有微生物的方法为转基因技术(或重组DNA技术或基因工程)，转基因操作使用的工具有限制酶、DNA连接酶和载体。
(3)利用物理因素(如紫外线、X射线等)或化学因素(如亚硝酸盐等)处理生物，可使现有微生物发生基因突变，创造出人类需要的新品种，由于基因突变具有不定向性，因此诱变育种技术为非定向改造生物的技术。
(4)培养基的卵黄磷脂的含量、培养基pH的大小、培养基灭菌不彻底导致其他杂菌产生的代谢产物等均有可能影响水解圈的大小。
情境 · 探究 · 长句
随着经济时代的发展，方便快捷的各种外卖越来越受年轻人的青睐，但是随之而来，“外卖是否卫生、是否环保”成了人们讨论的焦点话题。
外卖餐盒常用材料淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE)是一种聚乙烯类塑料替代材料，科研人员开展相关研究，从垃圾堆埋场中筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株，试图解决外卖餐盒的环境污染问题。
(1)在进行该菌株的分离筛选时，需要将一定量的适宜稀释倍数的土壤悬液接种在以_______________________________为唯一碳源的液体培养基上，重复多次进行富集培养，然后将富集培养的菌液接种到固体培养基上。此种分离纯化微生物的接种方法称为_____________________。
研究未知的微生物一定要注意进行规范的无菌操作，以防______________________________，实验后，一定要洗手。
淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE)
稀释涂布平板法
被致病的微生物感染
(2)科研人员将富集得到的菌株分别接入以聚乙烯蜡(PE－WAX，一种低分子聚乙烯)为唯一碳源的基本培养基中，挑选能在该培养基中生长的菌株，结果如图1所示。同时，将富集得到的菌株转接至淀粉固体培养基，观察透明圈(出现透明部分说明该菌株能分泌胞外________酶)，结果如图2所示。综上分析，菌株______(从图1、图2中选择序号)为所选菌株，原因是_________________________________________
_________________________________________________________________。
淀粉
11
既能利用聚乙烯作为碳源生长，又能利用淀粉生长，因此能够更高效降解淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉—PE)
解析 (1)由题干信息可知，本实验是为了筛选到能够更高效降解淀粉—PE的菌株，故培养基中的唯一碳源是淀粉—PE。此种分离纯化微生物的接种方法称为稀释涂布平板法。研究未知的微生物一定要注意进行规范的无菌操作，以防被致病的微生物感染，实验后，一定要洗手、消毒。
(2)观察透明圈，在淀粉固体平板上出现透明部分说明该菌株能分泌胞外淀粉酶。观察图1可知，菌株7和菌株11在以PE－WAX为唯一碳源的基本培养基中生长较好，观察图2可知，菌株11的透明圈比菌株6的大，这说明菌株11既能利用聚乙烯作为碳源生长，又能利用淀粉生长，因此能够更高效降解淀粉填充聚乙烯类塑料(淀粉－PE)。限时练50 微生物的培养技术及应用
(时间：25分钟 分值：35分)
选择题1～11小题，每小题2分，共22分。
【对点强化】
考点一 微生物的基本培养技术
1.(2025·长春质检)如表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( )
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊红 亚甲基蓝 蒸馏水
含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A.从物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基
B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供无机盐的物质
D.该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
2.(2025·辽宁大连测试)下列关于灭菌或消毒的相关叙述，正确的是( )
A.巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的全部微生物
B.在接种过程中，试管口、瓶口等都可以通过火焰灼烧进行灭菌
C.培养基、接种环、涂布器、外植体可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D.可用紫外线照射接种室，以杀死空气中的所有微生物及芽孢和孢子
3.(2025·安徽合肥质检)如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW676.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW676.tif" \* MERGEFORMAT
A.此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B.图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C.每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D.培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
4.(2025·江苏镇江考试)防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键。下列叙述错误的是( )
A.利用微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，可实现生物消毒
B.利用紫外线对超净工作台进行消毒前，喷洒消毒液可加强消毒效果
C.利用干热灭菌箱对培养基进行灭菌时，应在160 ℃的热空气中维持1～2 h
D.利用酒精灯对金属用具进行灼烧灭菌时，应在酒精灯火焰充分燃烧层进行
5.(2025·山东潍坊统考)为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW677.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW677.tif" \* MERGEFORMAT
A.为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B.图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C.图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
考点二 微生物的选择培养和计数
6.(2023·山东卷，15)平板接种常用在微生物培养中，下列说法正确的是( )
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
7.(2022·江苏卷，3)下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是( )
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株
8.(2025·江苏盐城联考)某生物兴趣小组试图从土壤中分离分解尿素的细菌，流程如图所示。下列说法错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW678.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW678.tif" \* MERGEFORMAT
A.该实验配制的培养基中不含蛋白胨
B.图中菌液稀释10倍时所加的无菌水的量都为9 mL
C.实验的合理程序为“计算→称量→溶解→灭菌→倒平板→接种土壤样本→菌落计数”
D.三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌5×107个
【综合提升】
9.(2025·河北邢台一中调研)屠宰场废弃血污不经过处理直接排放，会对环境造成污染。传统的处理方法有填埋法和焚烧法等。填埋法易造成地表环境、地下水资源污染。焚烧法处理会造成大气污染，且废弃物中所含的蛋白质资源不能得到有效利用。研究人员以屠宰场血污堆积土壤为分离基质，利用血平板培养基(添加了动物血液)，分离出了高效降解血红蛋白的菌株，并初步用于降解废弃血液，生产氨基酸液态肥料。下列相关叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW679.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW679.tif" \* MERGEFORMAT
A.题述菌株分离纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法
B.菌株培养后进行计数，只能采用稀释涂布平板法
C.血平板培养基上透明水解圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高
D.利用该菌株降解废弃血液可在保护环境的同时实现资源的可持续利用
10.(2025·河南信阳高中质检)如图所示，自来水经滤膜过滤后，转移到牛肉膏蛋白胨培养基上，适宜条件下培养48 h，染色后统计变色菌落数目为165。下列说法正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW680.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW680.tif" \* MERGEFORMAT
A.若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈蓝绿色
B.自来水中大肠杆菌浓度是33个·L－1，比真实值大
C.为了提高准确度，需设重复实验，但不用空白对照
D.若培养基菌落数目大于300，可适当减少自来水量
11.(2025·四川成都七中诊断)如图是研究人员从落叶地的土壤中筛选高效分解纤维素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW679A.tif" INCLUDEPICTURE "../../SW679A.tif" \* MERGEFORMAT
A.在配制步骤②③的培养基时，高压蒸汽灭菌后将pH调至中性或弱碱性
B.步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源
D.步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落
12.(13分)(2023·北京卷，16)自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)(2分)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供________和维生素等。
(2)(3分)A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明___________________________________________________________。
(3)(4分)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样________后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现________。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
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(4)(4分)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。__________________________________________________________。
限时练50 微生物的培养技术及应用
1.B [题述培养基成分中不含琼脂，不属于固体培养基，A错误；培养基成分中的K2HPO4可提供无机盐，C错误；培养基调节合适的pH后需要经过灭菌才能接种使用，D错误。]
2.B [巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的大部分微生物，但不是所有微生物，A错误；培养基可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，涂布器、接种环采用灼烧灭菌法进行灭菌，外植体进行消毒，不能灭菌，C错误；可用紫外线照射接种室进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，不包括芽孢和孢子，D错误。]
3.A [根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，从而保证下一次划线时菌落来自上一次划线的末端，C错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。]
4.C [有的微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，因此可以使用这些微生物进行生物消毒，如净化污水、污泥，A正确；用紫外线照射30 min，可以杀死物体表面或空气中的微生物，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果，B正确；常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，C错误；接种环等金属用具一般用灼烧灭菌，即直接在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧灭菌，D正确。]
5.D [为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法进行接种，该方法需要使用图1中①酒精灯(操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌)、④涂布器和③培养基，②为接种环(接种工具)，是平板划线法接种时需要使用的接种工具，用平板划线法不能获得长满测试菌的平板，A错误；图2中Ⅱ处抑菌圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误。]
6.D [不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。]
7.D [农田或公园土壤中含有较多的能产脲酶的微生物，故可选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株，A正确；为了分离产脲酶菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。]
8.C [本实验的目的是从土壤中分离分解尿素的细菌，该实验配制的培养基应以尿素为唯一氮源，而蛋白胨能提供氮源，所以蛋白胨不能作为配制本培养基的原料，A正确；题图中菌液稀释10倍时需要加入1 mL菌液和9 mL无菌水，B正确；实验设计时，需要在溶解之后，灭菌之前调节pH，C错误；根据题图可知，对菌液进行稀释时共稀释了106倍，分别接种了3个培养皿，一段时间后，三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌(54＋46＋50)÷3÷1×106＝5×107(个)，D正确。]
9.B [菌株培养后进行计数，除了采用稀释涂布平板法外，还可以采用显微镜直接计数法，B错误。]
10.D [若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽，A错误；自来水中大肠杆菌浓度是165÷5＝33(个·L－1)，由于两个或多个大肠杆菌可能长成一个菌落，因此比真实值小，B错误；为了提高准确度，需设重复实验，同时需要设置空白对照，C错误；若培养基菌落数目大于300，说明细菌数目较多，可适当减少自来水量，D正确。]
11.A [配制培养基时，调节培养基的pH应在灭菌之前进行，A错误。]
12.(1)氮源 (2)A菌能在培养平板中生长繁殖 (3)梯度稀释 溶菌圈 (4)假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
解析 (1)蛋白胨主要为细菌提供氮源和维生素等。(2)将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。(3)将含菌量较高的湖泊水样梯度稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。(4)根据实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌物，为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。(共25张PPT)
微生物的培养技术及应用
限时练50
(时间：25分钟 分值：35分)
考点一 微生物的基本培养技术
1.(2025·长春质检)如表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( )
B
成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊红 亚甲基蓝 蒸馏水
含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000 mL
A.从物理性质看该培养基属于固体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基
B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供无机盐的物质
D.该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
解析 题述培养基成分中不含琼脂，不属于固体培养基，A错误；
培养基成分中的K2HPO4可提供无机盐，C错误；
培养基调节合适的pH后需要经过灭菌才能接种使用，D错误。
2.(2025·辽宁大连测试)下列关于灭菌或消毒的相关叙述，正确的是( )
A.巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的全部微生物
B.在接种过程中，试管口、瓶口等都可以通过火焰灼烧进行灭菌
C.培养基、接种环、涂布器、外植体可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D.可用紫外线照射接种室，以杀死空气中的所有微生物及芽孢和孢子
B
解析 巴氏消毒法常用于消毒牛奶，可以杀死牛奶中的大部分微生物，但不是所有微生物，A错误；
培养基可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，涂布器、接种环采用灼烧灭菌法进行灭菌，外植体进行消毒，不能灭菌，C错误；
可用紫外线照射接种室进行消毒，以杀死物体表面或空气中的微生物，不包括芽孢和孢子，D错误。
3.(2025·安徽合肥质检)如图为用固体培养基培养某细菌的结果，对此下列有关叙述正确的是( )
A
A.此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B.图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C.每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D.培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
解析 根据菌落的生长状态可知，此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②，②处可见单菌落，A正确，B错误；
除第一次划线外，每次划线前灼烧接种环的目的都是杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，从而保证下一次划线时菌落来自上一次划线的末端，C错误；
培养基中的琼脂是凝固剂，不能为细菌提供碳源，D错误。
A.此结果是利用平板划线法得到的，划线的顺序是①→③→②
B.图示显示的接种方法为稀释涂布平板法，②处可见单菌落
C.每次划线前均需灼烧接种环，其目的都是防止杂菌污染
D.培养基中的糖类、琼脂等含碳物质，可为该细菌提供碳源
4.(2025·江苏镇江考试)防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键。下列叙述错误的是( )
A.利用微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，可实现生物消毒
B.利用紫外线对超净工作台进行消毒前，喷洒消毒液可加强消毒效果
C.利用干热灭菌箱对培养基进行灭菌时，应在160 ℃的热空气中维持1～2 h
D.利用酒精灯对金属用具进行灼烧灭菌时，应在酒精灯火焰充分燃烧层进行
C
解析 有的微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，因此可以使用这些微生物进行生物消毒，如净化污水、污泥，A正确；
用紫外线照射30 min，可以杀死物体表面或空气中的微生物，在照射前，适量喷洒苯酚或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果，B正确；
常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，C错误；
接种环等金属用具一般用灼烧灭菌，即直接在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧灭菌，D正确。
5.(2025·山东潍坊统考)为了解病原微生物对四种抗生素的敏感程度，某研究小组进行了相关药敏实验，图1为部分实验器材。将含有相同浓度的抗生素Ⅰ～Ⅳ四个大小相同的纸片分别贴在长满测试菌的平板上，实验结果如图2。下列相关叙述正确的是( )
D
A.为获得长满测试菌的平板，需要
使用图1中器材①②③
B.图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C.图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
解析 为获得长满测试菌的琼脂平板，需要采用稀释涂布平板法进行接种，该方法需要使用图1中①酒精灯(操作需要在酒精灯火焰旁进行，酒精灯对涂布器进行灼烧灭菌)、④涂布器和③培养基，②为接种环(接种工具)，是平板划线法接种时需要使用的接种工具，用平板划线法不能获得长满测试菌的平板，A错误；
图2中Ⅱ处抑菌圈最小，说明此处微生物对该药物敏感度最低，B错误；
突变株的出现不是在抗生素的作用下产生的，抗生素只能起选择作用，C错误。
A.为获得长满测试菌的平板，需要使用图1中器材①②③
B.图2中Ⅱ形成的抑菌圈较小，可能是病原微生物对药物较敏感
C.图2抑菌圈中的菌落可能是在抗生素Ⅳ作用下产生了突变株
D.不同抗生素在平板上的扩散速度不同会影响实验结果
考点二 微生物的选择培养和计数
6.(2023·山东卷，15)平板接种常用在微生物培养中，下列说法正确的是( )
A.不含氮源的平板不能用于微生物培养
B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
D
解析 不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；
平板涂布时涂布器使用前必须进行灭菌，B错误；
使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；
脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。
7.(2022·江苏卷，3)下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是( )
A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株
D
解析 农田或公园土壤中含有较多的能产脲酶的微生物，故可选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株，A正确；
为了分离产脲酶菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
8.(2025·江苏盐城联考)某生物兴趣小组试图从土壤中分离分解尿素的细菌，流程如图所示。下列说法错误的是( )
C
A.该实验配制的培养基中不含蛋白胨
B.图中菌液稀释10倍时所加的无菌水的
量都为9 mL
C.实验的合理程序为“计算→称量→溶解
→灭菌→倒平板→接种土壤样本→菌落计数”
D.三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌5×107个
解析 本实验的目的是从土壤中分离分解尿素的细菌，该实验配制的培养基应以尿素为唯一氮源，而蛋白胨能提供氮源，所以蛋白胨不能作为配制本培养基的原料，A正确；
题图中菌液稀释10倍时需要加入1 mL菌液和9 mL无菌水，B正确；
实验设计时，需要在溶解之后，灭菌之前调节pH，C错误；
根据题图可知，对菌液进行稀释时共稀释了106倍，分别接种了3个培养皿，一段时间后，三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌(54＋46＋50)÷3÷1×106＝5×107(个)，D正确。
A.该实验配制的培养基中不含蛋白胨
B.图中菌液稀释10倍时所加的无菌水的量都为9 mL
C.实验的合理程序为“计算→称量→溶解→灭菌→倒平板→接种土壤样本→菌落计数”
D.三个培养皿中分别形成了54个、46个、50个菌落，则1 g土壤样本中约有分解尿素的细菌5×107个
9.(2025·河北邢台一中调研)屠宰场废弃血污不经过处理直接排放，会对环境造成污染。传统的处理方法有填埋法和焚烧法等。填埋法易造成地表环境、地下水资源污染。焚烧法处理会造成大气污染，且废弃物中所含的蛋白质资源不能得到有效利用。研究人员以屠宰场血污堆积土壤为分离基质，利用血平板培养基(添加了动物血液)，分离出了高效降解血红蛋白的菌株，并初步用于降解废弃血液，生产氨基酸液态肥料。下列相关叙述错误的是( )
B
A.题述菌株分离纯化过程中用到了稀释涂布平板法和平板划线法
B.菌株培养后进行计数，只能采用稀释涂布平板法
C.血平板培养基上透明水解圈大的菌落分泌的蛋白酶的活性往往较高
D.利用该菌株降解废弃血液可在保护环境的同时实现资源的可持续利用
解析 菌株培养后进行计数，除了采用稀释涂布平板法外，还可以采用显微镜直接计数法，B错误。
10.(2025·河南信阳高中质检)如图所示，自来水经滤膜过滤后，转移到牛肉膏蛋白胨培养基上，适宜条件下培养48 h，染色后统计变色菌落数目为165。下列说法正确的是( )
D
A.若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈蓝绿色
B.自来水中大肠杆菌浓度是33个·L－1，比真实值大
C.为了提高准确度，需设重复实验，但不用空白对照
D.若培养基菌落数目大于300，可适当减少自来水量
解析 若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈深紫色，并有金属光泽，A错误；
自来水中大肠杆菌浓度是165÷5＝33(个·L－1)，由于两个或多个大肠杆菌可能长成一个菌落，因此比真实值小，B错误；
为了提高准确度，需设重复实验，同时需要设置空白对照，C错误；
若培养基菌落数目大于300，说明细菌数目较多，可适当减少自来水量，D正确。
A.若培养基含伊红—亚甲蓝，大肠杆菌菌落呈蓝绿色
B.自来水中大肠杆菌浓度是33个·L－1，比真实值大
C.为了提高准确度，需设重复实验，但不用空白对照
D.若培养基菌落数目大于300，可适当减少自来水量
11.(2025·四川成都七中诊断)如图是研究人员从落叶地的土壤中筛选高效分解纤维素的细菌的过程示意图。下列有关叙述错误的是( )
A
A.在配制步骤②③的培养基时，高压蒸汽
灭菌后将pH调至中性或弱碱性
B.步骤③筛选、纯化的原理是将聚集的细
菌分散，可以获得单细胞菌落
C.步骤③采用稀释涂布平板法进行接种，并需要加入纤维素作为唯一的碳源
D.步骤④加入的是刚果红染液，可根据菌落与透明圈的直径比来挑选优质菌落
解析 配制培养基时，调节培养基的pH应在灭菌之前进行，A错误。
12.(2023·北京卷，16)自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。
(1)用于分离细菌的固体培养基包含水、葡萄糖、蛋白胨和琼脂等成分，其中蛋白胨主要为细菌提供________和维生素等。
(2)A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明___________________________________________________________________。
氮源
A菌能在培养平板中生长繁殖
(3)为分离出具有溶菌作用的细菌，需要合适的菌落密度，因此应将含菌量较高的湖泊水样________后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现________。采用这种方法，研究者分离、培养并鉴定出P菌。
(4)为探究P菌溶解破坏A菌的方式，请提出一个假设，该假设能用以下材料和设备加以验证。
主要实验材料和设备：P菌、A菌、培养基、圆形滤纸小片、离心机和细菌培养箱。
梯度稀释
溶菌圈
假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂
解析 (1)蛋白胨主要为细菌提供氮源和维生素等。
(2)将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊，表明A菌能在培养平板中生长繁殖。
(3)将含菌量较高的湖泊水样梯度稀释后，依次分别涂布于不同的浑浊薄层上。培养一段时间后，能溶解A菌的菌落周围会出现溶菌圈。
(4)根据实验材料和设备，圆形滤纸小片可用于吸收某种物质，离心机可用于分离菌体和细菌分泌物，为探究P菌溶解破坏A菌的方式，可假设P菌通过分泌某种化学物质使A菌溶解破裂。
