第54讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
考情分析 1.重组DNA技术的基本工具 2024·江西卷，12；2024·山东卷，5；2023·新课标卷，6
2.基因工程的基本操作程序 2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2024·新课标卷，35；2024·黑吉辽卷，25；2023·全国乙卷，38；2023·全国甲卷，38；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，20
考点一 重组DNA技术的基本工具
INCLUDEPICTURE"核心要点再研.tif"
1.基因工程的概念
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2.基因工程的工具
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
INCLUDEPICTURE"SW724-.tif"
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①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
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INCLUDEPICTURE"名师解读.tif"
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
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INCLUDEPICTURE"典型例题深研.tif"
考向1 分析基因工程的三种工具，考查科学思维
1.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"24GT152.tif"
A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
2.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
INCLUDEPICTURE"13kts7.TIF"
INCLUDEPICTURE"13kts7a.TIF"
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
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1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类
INCLUDEPICTURE"SW726.tif"
(1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
INCLUDEPICTURE"SW727.tif"
3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
INCLUDEPICTURE"SW728.tif"
考向2 结合载体的作用及特点，考查科学思维
3.(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
4.(2025·湖北襄阳四中联考)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW729.tif"
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌
C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
INCLUDEPICTURE"跳出题海.tif"
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：
INCLUDEPICTURE"SW730.tif"
考点二 基因工程的基本操作程序
INCLUDEPICTURE"核心要点再研.tif"
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
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(2)利用PCR获取和扩增目的基因
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①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
INCLUDEPICTURE"Q125A-.TIF"
3.将目的基因导入受体细胞
INCLUDEPICTURE"SW732-.tif"
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(1)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
INCLUDEPICTURE"Q129-.TIF"
[深度思考]
1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
INCLUDEPICTURE"Q130.TIF"
①第1组：_____________________________________________________；
②第2组：_____________________________________________________。
2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？
________________________________________________________________________________________________________________________________
INCLUDEPICTURE"典型例题深研.tif"
1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"13kts41.TIF"
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
INCLUDEPICTURE"跳出题海.tif"
1.目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
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(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
INCLUDEPICTURE"SW733.tif"
(2)被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
INCLUDEPICTURE"24GT8.tif"
(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是____________________________________________________________
_________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和
____________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是
______________________________________________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是
_______________________________________________________________________________________________________________________(答出2点即可)。
INCLUDEPICTURE"跳出题海.tif" INCLUDEPICTURE "../../../../../2026版%20创新设计%20高考总复习%20生物学（配人教版）（琼鄂津……）/跳出题海.tif" \* MERGEFORMAT
1.体内DNA复制与PCR技术的比较
PCR技术 体内DNA复制
相同点 原则 碱基互补配对
条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料
延伸方向 新链都是从5′端向3′端延伸
不同点 解旋方式 90 ℃以上高温解旋 解旋酶催化
场所 PCR扩增仪 主要在细胞核
延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶
温度 控制温度、需要在不同温度下进行 细胞内温和
条件过程 INCLUDEPICTURE"SW735.tif" INCLUDEPICTURE "../../../../../2026版%20创新设计%20高考总复习%20生物学（配人教版）（琼鄂津……）/SW735.tif" \* MERGEFORMAT INCLUDEPICTURE"SW736.tif" INCLUDEPICTURE "../../../../../2026版%20创新设计%20高考总复习%20生物学（配人教版）（琼鄂津……）/SW736.tif" \* MERGEFORMAT
结果 大量的DNA片段(或目的基因) 形成完整的子代DNA
2.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同，因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端；脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
INCLUDEPICTURE"关键真题必刷.tif"1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"13KTS148.TIF"
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或T4连接酶
2.(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
INCLUDEPICTURE"24GT33.tif"
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是
________________________________________________________。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是
_______________________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________和________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是________________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是
_________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1～1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1～1 362合成基因序列和1 363～1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
3.(2024·重庆卷，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
①表达载体
限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ)
INCLUDEPICTURE"24GT188.tif"
②启动子D＋基因S
5′C……TAGAATTCCA……3′
3′……ATCTTAAGGT……5′
③四种限制酶识别序列及切割位点
INCLUDEPICTURE"24GT187.tif"
注：箭头表示酶的切割位置。
(1)基因S启动子的基本组成单位是________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是
______________________________________________________。
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有____________________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是____________________________________________________。
第54讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
考点一
核心要点·再研
1.转基因 生物产品 DNA分子 遗传性状
2.(1)磷酸二酯键 黏性末端 (2)限制酶 (3)质粒 限制酶切割位点
典型例题·深研
1.A [分析题意，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB，然后利用PCR扩增目的基因，A正确；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产
γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D错误。]
2.C [酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。]
3.D [在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；细菌没有染色体，质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。]
4.B [分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则lacZ基因没有被破坏，即导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。]
考点二
核心要点·再研
1.(1)编码蛋白质 结构 功能 (2)引物 脱氧核苷酸 耐高温 温度 两种引物 耐高温的DNA聚合酶 指数形式 琼脂糖凝胶电泳
2.受体细胞 RNA聚合酶 受体细胞中是否含有目的基因 标记基因 限制酶
3.目的基因 子房 T－DNA 染色体 显微注射 受精卵
4.PCR 抗原—抗体杂交
[深度思考]
1.提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
典型例题·深研
1.D [若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
2.(1)磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达 (2)C—G、U—A、A—T (3)菌株B2的基因组DNA 无PCR产物 (4)无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等
解析 (1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。(2)根据所给信息，向导RNA需要与对应DNA进行结合，结合期间，RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对，根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要验证是否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2的基因组DNA，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)中，没有引物P4的结合位置，因此使用引物P3、P4进行PCR时，无法获得PCR产物。(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
关键·真题必刷
1.B [根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli连接酶或T4连接酶连接，D正确。]
2.(1)水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离 溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA (2)PCR技术扩增 人工合成 (3)RNA聚合酶识别并结合的部位 提高目的基因的转录效率 (4)HygBR (5)F3 R2 (6)D
解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
3.(1)脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸) (2)EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接(或反向连接) (3)酶切后的空载体片段、“启动子D＋基因S”片段 PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动基因的转录，是一段有特殊结构序列的DNA片段，其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。(4)根据题目(4)信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。(共70张PPT)
基因工程的基本工具和基本操作程序
第 54 讲
课标要求 1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。 考情分析 1.重组DNA技术的基本工具 2024·江西卷，12；2024·山东卷，5；2023·新课标卷，6
2.基因工程的基本操作程序 2024·重庆卷，19；2024·湖南卷，21；2024·甘肃卷，24；2024·安徽卷，20；2024·河北卷，22；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2024·新课标卷，35；2024·黑吉辽卷，25；2023·全国乙卷，38；2023·全国甲卷，38；2023·湖北卷，4；2023·广东卷，20
1
目 录
重组DNA技术的基本工具
2
基因工程的基本操作程序
关键 · 真题必刷
3
考点一
重组DNA技术的基本工具
核心要点·再研
典型例题·深研
1.基因工程的概念
转基因
生
物产品
DNA分子
遗传性状
2.基因工程的工具
(1)限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
磷酸二酯键
黏性末端
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
限制酶
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
质粒
限制酶切割位点
考向1 分析基因工程的三种工具，考查科学思维
1.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是( )
A
A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
解析 分析题意，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB，然后利用PCR扩增目的基因，A正确；
由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；
将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；
根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D错误。
2.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
C
解析 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；
质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；
质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案合理且高效，C正确；
若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
1.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类
(1)应选择切割位点位于目的基因两端
的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择切割位点位于目的基因
和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
3.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下：
考向2 结合载体的作用及特点，考查科学思维
3.(2025·广东广州模拟)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是( )
A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
D
解析 在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；
具有一至多个限制酶切割位点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；
细菌没有染色体，质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；
作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
4.(2025·湖北襄阳四中联考)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是( )
B
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌
C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
解析 分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；
试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；
能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；
若大肠杆菌的菌落为蓝色，则lacZ基因没有被破坏，即导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌
C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：
考点二
基因工程的基本操作程序
核心要点·再研
典型例题·深研
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
编码蛋白质
结构
功能
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
引物
脱氧核苷酸
耐高温
温度
两种引物
耐高温的DNA
聚合酶
指数形式
琼脂糖凝胶电泳
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
受体细胞
RNA聚合酶
受体细胞中是否含有目的基因
标记基因
限制酶
3.将目的基因导入受体细胞
目的基因
子房
T-DNA
染色体
显微注
射
受精卵
(1)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
PCR
抗原—抗体
杂交
[深度思考]
1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：___________________________________________________________；
②第2组：___________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？
提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
D
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，
不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；
若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；
DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；
SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
1.目的基因的获取方法
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因
(3)从基因文库中获取目的基因
根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
2.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含质粒的细菌。
(3)筛选方法：将细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含质粒的细菌，如图中1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即含有重组质粒的菌落，如图中1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________________________
___________________________________________________________________。
磷酸二酯键
保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是______________________。
C—G、U—A、A—T
菌株B2的基因组DNA
无PCR产物
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_____________________________________________________________________ (答出2点即可)。
无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等
解析 (1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。
(2)根据所给信息，向导RNA需要与对应DNA进行结合，结合期间，RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对，根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。
(3)需要验证是否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2的基因组DNA，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)中，没有引物P4的结合位置，因此使用引物P3、P4进行PCR时，无法获得PCR产物。
(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
1.体内DNA复制与PCR技术的比较
2.引物设计应注意的问题
(1)设计引物的依据：目的基因两端的核苷酸序列。
(2)引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制酶的酶切位点。
(3)使用的一对引物的序列不相同,因为目的基因两端具有不同的核苷酸序列。
(4)引物设计的要求(或引物失效的原因)：每种引物内部不能发生局部碱基互补配对；两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。
①每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。
②两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。
(5)两种引物都结合在DNA模板链的3′端；脱氧核苷酸连接在引物的3′端进行延伸。
关键 · 真题必刷
1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
B
A.实验所用引物，其中一个序列为
5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切
至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或T4连接酶
解析 根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；
根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；
步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；
目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli连接酶或T4连接酶连接，D正确。
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′
B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli连接酶或T4连接酶
2.(2024·黑吉辽卷，25)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是________________________
____________________________________。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是________________________
____________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是______________和_________________。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
水解蛋白质，使得DNA与
蛋白质分离
溶解蛋白质等物质，析出
不溶于酒精的DNA
PCR技术扩增
人工合成
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是___________________________________,驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是________________________。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
RNA聚合酶识别并结合的部位
提高目的基因的转录效率
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
HygBR
F3
R2
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________(单选)。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1～1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1～1 362合成基因序列和1 363～1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
D
解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是水解蛋白质，使得DNA与蛋白质分离。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA。
(2)本操作中获取目的基因的方法是人工合成和PCR技术扩增。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是RNA聚合酶识别并结合的部位，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是提高目的基因的转录效率。
(4)结合基因表达载体的示意图，根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是F3和R2。
(6)D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
3.(2024·重庆卷，19)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。
①表达载体
限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ)
②启动子D＋基因S
5′C……TAGAATTCCA……3′
3′……ATCTTAAGGT……5′
③四种限制酶识别序列及切割位点
注：箭头表示酶的切割位置。
(1)基因S启动子的基本组成单位是_____________________________。
(2)通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是________；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是________________________________________
____________________________________________________________________。
脱氧核糖核苷酸(脱氧核苷酸)
EcoRⅠ
酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向连接(或反向连接)
(3)为验证“启动子D＋基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有________________________________________。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是________。
(4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ－1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T＋基因S”序列成功导入YZ，所得再生植
株YZ－2的种子也变大，但小于YZ－1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是_____________________________________________________________
____________________________________________________________________。
酶切后的空载体片段、“启动子D＋基因S”片段
PCR
品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动基因的转录，是一段有特殊结构序列的DNA片段，其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸。
(2)根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。
(3)DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D＋基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D＋基因S”片段；在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。
(4)根据题目(4)信息可知，再生植株YZ－1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。限时练54 基因工程的基本工具和基本操作程序
(时间：30分钟 分值：40分)
选择题1～5小题，每小题2分，共10分。
【对点强化】
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.(2025·湖北荆州市联考)下列有关基因工程的理论基础和技术发展的叙述，错误的是( )
A.遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
B.基因载体的发现为基因跨物种转移找到了运载工具
C.限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造了条件
D.PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因的碱基序列
2.(2025·西工大附中调研)基因工程操作过程中需要特殊工具和合适的受体细胞。下列有关叙述错误的是( )
A.DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同
B.质粒作为载体必须具有特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选
C.原核生物中限制酶不切割自身的DNA一定与其DNA中不存在该酶识别序列有关
D.培育转基因高产抗病植物时的受体细胞可以为受精卵或体细胞
3.(2025·福建厦门模拟)下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是( )
限制酶种类 序列及切点 限制酶种类 序列及切点
①EcoRⅠ INCLUDEPICTURE"SW737.tif" ③BglⅡ INCLUDEPICTURE"SW738.tif"
②BamHⅠ INCLUDEPICTURE"SW739.tif" ④NotⅠ INCLUDEPICTURE"SW740.tif"
A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B.①切出的DNA片段，只有用E.coli DNA连接酶才能连接起来
C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D.构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
考点二 基因工程的基本操作程序
4.(2025·武汉二中模拟)中国农业科学院棉花研究所棉花分子遗传改良创新团队成功将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，如图是利用基因工程培育粉红色棉花的示意图，下列有关该研究的说法错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW741.tif"
A.通过基因工程创制出彩色纤维棉可有效减少化学染料使用量
B.过程①→②完成需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与
C.在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，就代表粉红色棉花培育成功
D.过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理
5.(2025·河北冀州中学质检)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW742.tif"
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，②是c，③是b
C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
【综合提升】
6.(14分)(2024·甘肃卷，21)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图)，研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
INCLUDEPICTURE"24GT112.tif"
(1)(4分)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是_______________________________________________
__________________________________________________________________。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了_________________________________________________________________。
INCLUDEPICTURE"4分.tif"
(2)(2分)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是____________________。INCLUDEPICTURE"2分.tif"
(3)(2分)过程⑤在基因工程中称为________________，该过程需要的主要酶有________________。INCLUDEPICTURE"2分.tif"
(4)(4分)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。
该过程用Ca2＋处理细胞，使其处于一种____________________________的生理状态。INCLUDEPICTURE"4分.tif"
(5)(2分)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是
____________________________________________________(答出两点)。
INCLUDEPICTURE"2分.tif"
生物质原料 降解率/% 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物。
7.(16分)(2024·河北卷，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)(4分)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________启动子。Nos为终止子，其作用为________________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
INCLUDEPICTURE"24GT63.tif"
(2)(3分)利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________________，通过________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)(4分)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________________________________________
______________________________________________________________。
(4)(2分)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
INCLUDEPICTURE"24GT64.tif"
(5)(3分)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是
_____________________________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。
限时练54 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.D [细菌的质粒有自我复制能力，并可以在细胞间转移，质粒作为基因工程的常用载体，为基因跨物种转移的运载工具，B正确；基因工程诞生的过程中，限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造了条件，C正确；在基因工程中，利用PCR技术扩增目的基因的前提需要有一段目的基因的已知碱基序列，便于合成引物，并不是已知目的基因的全部碱基序列，D错误。]
2.C [DNA连接酶使DNA片段间形成磷酸二酯键，DNA聚合酶在DNA复制时发挥作用，使单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键，两种酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同，A正确；作为载体必须具备的条件之一是具有某些特殊的标记基因，以便重组DNA分子的筛选，B正确；限制酶不切割自身DNA的原因可能是自身的识别序列已经被修饰，C错误；可以用受精卵作为受体细胞，也可以用体细胞作为受体细胞，再采用植物组织培养技术将受体细胞培育成转基因植株，D正确。]
3.C [①②③④均为限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂，不能催化氢键的断裂，且均形成黏性末端，A错误；①切出的DNA片段带有黏性末端，用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来，B错误；②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为—GGATCT—，因而不能再被②或③识别切割，C正确；构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。]
4.C [通过基因工程将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，可有效减少化学染料使用量，A正确；过程①→②为基因表达载体的构建，完成该过程需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B正确；在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，但该基因不一定能进行转录和翻译，故检测到甜菜红素合成相关的基因，不代表该粉红色棉花一定能培育成功，C错误；过程④→⑤为植物组织培养，植物组织培养的原理是植物体细胞具有全能性，D正确。]
5.C [质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。]
6.(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3)基因表达载体的构建 限制酶和DNA连接酶 (4)繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 易于吸收周围环境中DNA分子 (5)降解时的温度不同、降解时的pH不同
解析 (1)选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长、繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力。透明圈越大，说明高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力越强，即该菌产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点有繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。过程⑥用Ca2＋ 处理细胞，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响，故表中协同系数存在差异的原因是降解时的温度不同、降解时的pH不同。
7.(1)在胚乳中特异性表达的基因 使转录在所需要的地方停下来 HindⅢ EcoRⅠ (2)农杆菌转化 是否转录出mRNA 抗原—抗体杂交 (3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离 (4)体液 细胞 (5)水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗(合理即可)
解析 (1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列，而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN和载体进行酶切。(2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达，可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白质。(3)设r2HN为基因N，则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn＝1∶2∶1，r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。(4)抗体参与体液免疫，CD8＋T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析题图，实验组的抗体水平及CD8＋T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中获得大量疫苗。(共27张PPT)
基因工程的基本工具和基本操作程序
限时练54
(时间：30分钟 分值：40分)
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.(2025·湖北荆州市联考)下列有关基因工程的理论基础和技术发展的叙述，错误的是( )
A.遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
B.基因载体的发现为基因跨物种转移找到了运载工具
C.限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造了条件
D.PCR技术扩增目的基因的前提是已知目的基因的碱基序列
D
解析 细菌的质粒有自我复制能力，并可以在细胞间转移，质粒作为基因工程的常用载体，为基因跨物种转移的运载工具，B正确；
基因工程诞生的过程中，限制酶和DNA连接酶的发现为DNA的切割和连接创造了条件，C正确；
在基因工程中，利用PCR技术扩增目的基因的前提需要有一段目的基因的已知碱基序列，便于合成引物，并不是已知目的基因的全部碱基序列，D错误。
2.(2025·西工大附中调研)基因工程操作过程中需要特殊工具和合适的受体细胞。下列有关叙述错误的是( )
A.DNA连接酶与DNA聚合酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同
B.质粒作为载体必须具有特殊的标记基因，以便于重组DNA分子的筛选
C.原核生物中限制酶不切割自身的DNA一定与其DNA中不存在该酶识别序列有关
D.培育转基因高产抗病植物时的受体细胞可以为受精卵或体细胞
C
解析 DNA连接酶使DNA片段间形成磷酸二酯键，DNA聚合酶在DNA复制时发挥作用，使单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键，两种酶催化合成的化学键相同，但催化反应的底物不同，A正确；
作为载体必须具备的条件之一是具有某些特殊的标记基因，以便重组DNA分子的筛选，B正确；
限制酶不切割自身DNA的原因可能是自身的识别序列已经被修饰，C错误；
可以用受精卵作为受体细胞，也可以用体细胞作为受体细胞，再采用植物组织培养技术将受体细胞培育成转基因植株，D正确。
3.(2025·福建厦门模拟)下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是( )
C
制酶种类 序列及切点 限制酶种类 序列及切点
①EcoRⅠ ③BglⅡ
②BamHⅠ ④NotⅠ
A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B.①切出的DNA片段，只有用E.coli DNA连接酶才能连接起来
C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D.构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载体的反向连接
解析 ①②③④均为限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂，不能催化氢键的断裂，且均形成黏性末端，A错误；
①切出的DNA片段带有黏性末端，用E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来，B错误；
②③切出的黏性末端相同，用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为—GGATCT—，因而不能再被②或③识别切割，C正确；
构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。
考点二 基因工程的基本操作程序
4.(2025·武汉二中模拟)中国农业科学院棉花研究所棉花分子遗传改良创新团队成功将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，如图是利用基因工程培育粉红色棉花的示意图，下列有关该研究的说法错误的是( )
C
A.通过基因工程创制出彩色纤维棉
可有效减少化学染料使用量
B.过程①→②完成需要限制性内切
核酸酶和DNA连接酶的参与
C.在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，就代表粉红色棉花培育成功
D.过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理
解析 通过基因工程将甜菜红素在棉花纤维中富集，创制出纤维呈粉红色的棉花，可有效减少化学染料使用量，A正确；
过程①→②为基因表达载体的构建，完成该过程需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B正确；
在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，但该基因不一定能进行转录和翻译，故检测到甜菜红素合成相关的基因，不代表该粉红色棉花一定能培育成功，C错误；
过程④→⑤为植物组织培养，植物组织培养的原理是植物体细胞具有全能性，D正确。
A.通过基因工程创制出彩色纤维棉可有效减少化学染料使用量
B.过程①→②完成需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与
C.在⑤的植株中检测到甜菜红素合成相关的基因，就代表粉红色棉花培育成功
D.过程④→⑤依据了植物体细胞全能性的原理
5.(2025·河北冀州中学质检)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是( )
C
项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况
① 能生长 不能生长
② 能生长 能生长
③ 不能生长 能生长
A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点
B.①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是a，
②是c，③是b
C.质粒被一种限制酶切开时，被水解的磷酸二酯键有2个
D.将外源基因与质粒连接时需用DNA聚合酶
解析 质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；
①②③三种重组后细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；
将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D错误。
6.(2024·甘肃卷，21)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图)，研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是_______________________________________________________。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了____________________________________________________________________。
只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖
菌落产生的纤维素酶的活性和量
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是____________________。
(3)过程⑤在基因工程中称为____________________，该过程需要的主要酶有________________________。
耐高温的DNA聚合酶
基因表达载体的构建
限制酶和DNA连接酶
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有_______________________________
____________________________________________________________________。
该过程用Ca2＋处理细胞，使其处于一种____________________________的生理状态。
繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等
易于吸收周围环境中DNA分子
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是________________________________________
(答出两点)。
生物质 原料 降解率/% 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物。
降解时的温度不同、降解时的pH不同
解析 (1)选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长、繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力。透明圈越大，说明高产纤维素酶菌株分解纤维素的能力越强，即该菌产生的纤维素酶的活性强、量多。
(2)扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。
(3)根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。
(4)大肠杆菌作为受体细胞的优点有繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。过程⑥用Ca2＋ 处理细胞，使其处于一种易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(5)不同酶的最适温度、最适pH不同，当温度和pH改变时，酶促反应速率也会受到影响，故表中协同系数存在差异的原因是降解时的温度不同、降解时的pH不同。
7.(2024·河北卷，22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________________________启动子。Nos为终止子，其作用为___________________________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶___________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
在胚乳中特异性表达的基因
使转录在所需要的地方停下来
HindⅢ
EcoRⅠ
(2)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________________，通过________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________________________________________________。
农杆菌转化
是否转录出mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合体自交后代不发生性状分离
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_____________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。
体液
细胞
水稻易于种植，容易获得疫苗；水稻的产量较高，能够获得大量的疫苗(合理即可)
解析 (1)若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一端有特殊序列结构的DNA片段，使转录在所需要的地方停下来。r2HN应插入启动子GtP和终止子Nos之间，由于GtP中有限制酶KpnⅠ的识别序列，而SacⅠ的一个识别序列位于终止子之后，因此不能选择这两种限制酶切割，应选择HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN和载体进行酶切。
(2)通常采用农杆菌转化法将目的基因导入水稻的愈伤组织。检测r2HN是否表达，可以采用PCR技术检测该基因是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交技术检测是否翻译出相关蛋白质。
(3)设r2HN为基因N，则单一位点插入目的基因的植株的基因型为Nn，其自交后代的基因型及比例为NN∶Nn∶nn＝1∶2∶1，r2HN纯合体植株的比例为1/4。纯合体自交后代不会发生性状分离，因此选择纯合体进行后续研究。
(4)抗体参与体液免疫，CD8＋T细胞为细胞毒性T细胞，参与细胞免疫。分析题图，实验组的抗体水平及CD8＋T细胞水平的相对值都高于对照组，说明获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
(5)水稻属于常见的农作物，易于种植，其作为生物反应器容易获得疫苗；水稻的产量高，作为生物反应器容易从胚乳中获得大量疫苗。
