微专题11 PCR技术和基因编辑技术
考情速览
课标要求 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。
考情分析 1.基因编辑技术 2024·北京卷，25；2023·海南卷，20
2.PCR技术的应用 2024·河北卷，22；2024·重庆卷，19；2021·黑吉辽卷，25；2024·安徽卷，20；2024·新课标卷，35；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2023·重庆卷，12；2023·山东卷，25；2023·江西卷，22；2022·江苏卷，24；2022·山东卷，25
热点1 基因编辑技术
INCLUDEPICTURE"思维建模.TIF"
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
INCLUDEPICTURE"L312.tif"
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
INCLUDEPICTURE"解题觉醒.TIF"
1.(2025·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"L313.tif"
A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
2.(2025·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"L314.tif"
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
热点2 PCR技术的应用
题型一 PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
INCLUDEPICTURE"Q150.TIF"
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1
同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2
共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2
[例1] (2025·湖北襄阳四中联考)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW743.tif"
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
题型二 PCR定点突变技术
1.重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
INCLUDEPICTURE"L320.tif"
[例2] (2025·江苏无锡模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW744.tif"
A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C.过程②的产物都可以完成延伸过程
D.若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个通用引物RP2
2.反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
INCLUDEPICTURE"L322.tif"
[例3] (2025·湖南长郡中学联考)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW745.tif"
A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶
D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置
3.融合PCR技术与融合蛋白
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。
INCLUDEPICTURE"SW746.tif"
[例4] (2025·河北衡水金卷)融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。图1表示融合PCR技术的过程示意图(P1～P4表示引物)，图2表示融合后产物的电泳图。
INCLUDEPICTURE"SW747.tif"
(1)从化学本质上来说，引物是________________________，其作用是
______________________________________________________________。
(2)图1过程设计的P2与P3引物的添加序列必须能够发生____________。融合PCR步骤1中，至少进行________次循环才能获得基因A的PCR产物。
(3)融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是
___________________________________________________________。
若要对A、B融合基因继续进行PCR扩增，则图1中的M、N处位置所需要的引物分别是________________________________。
(4)图2中电泳图中________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是______________________________________
___________________________________________(至少两点)。
微专题11 PCR技术和基因编辑技术
热点1
解题觉醒·融会贯通
1.D [Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对目的基因序列的编辑，A、B正确；复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会定点插入、删除或替换部分碱基对，C正确；通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。]
2.B [培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。]
热点2
[例1] C [据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。]
[例2] D [两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。]
[例3] C [过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。]
[例4] (1)一小段单链DNA或RNA 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)碱基互补配对 2 (3)引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在Taq DNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因A、B完成融合 P1、P4 (4)4 复性温度太高；引物设计不合理，无法与目的基因结合
解析 (1)引物是一小段单链DNA或RNA，能与目的基因碱基互补配对，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)由于A、B基因需要融合，融合依据的原理是碱基互补配对，因此在引物设计是P2与P3引物对应的序列就要求能碱基互补配对。PCR经过两次循环才能获得纯的目的基因片段。(3)由图可知，引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在Taq DNA聚合酶的作用下向两边延伸，使基因A、B完成融合。根据引物延伸的方向，N处添加的引物是P4，M处添加的引物是P1。(4)融合后的片段长度更长，很有可能是4号条带。PCR技术没有扩增出目的基因的原因包括：复性温度太高；引物设计不合理，无法与目的基因结合。(共28张PPT)
pcr技术和基因编辑技术
微专题11
考情速览
课标要求 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。 考情分析 1.基因编辑技术 2024·北京卷，25；2023·海南卷，20
2.PCR技术的应用 2024·河北卷，22；2024·重庆卷，19；2021·黑吉辽卷，25；2024·安徽卷，20；2024·新课标卷，35；2024·全国甲卷，38；2024·山东卷，25；2023·重庆卷，12；2023·山东卷，25；2023·江西卷，22；2022·江苏卷，24；2022·山东卷，25
1
目 录
基因编辑技术
2
PCR技术的应用
热点1
基因编辑技术
思维建模·触类旁通
解题觉醒·融会贯通
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
1.(2025·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是( )
D
A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
解析 Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体，复合体中的sgRNA与目的基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白相当于限制酶，Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对目的基因序列的编辑，A、B正确；
复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会定点插入、删除或替换部分碱基对，C正确；
通过基因编辑技术引起的变异属于基因突变，D错误。
A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因
B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构
C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对
D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组
2.(2025·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是( )
B
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
解析 培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；
根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；
改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。
A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
热点2
PCR技术的应用
题型一 PCR技术的相关计算
1.PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的数量 1 3 7 2n－1
同时含两种引物的数量 0 2 6 2n－2
共消耗引物的数量 2 6 14 2n＋1－2
[例1] (2025·湖北襄阳四中联考)“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是( )
C
A.第一轮复制得到2个DNA分子，
即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，
即①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
解析 据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；
第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；
第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；
经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因
D.经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子
题型二 PCR定点突变技术
1.重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
[例2] (2025·江苏无锡模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
A.过程①需要把两对引物同时加入
一个扩增体系以提高扩增效率
B.过程①需要2轮PCR才能得到图
中所示PCR产物
C.过程②的产物都可以完成延伸过程
D.若过程④得到16个突变基因则需要
消耗15个通用引物RP2
D
解析 两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；
过程①至少需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；
过程②获得的产物不都可以完成延伸过程，因为子链只能从引物的3′端开始延伸，C错误；
若过程④得到16个突变基因，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30(个)通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15(个)，D正确。
2.反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
[例3] (2025·湖南长郡中学联考)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割
B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键
C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶和解旋酶
D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA的位置
解析 过程③即PCR扩增，PCR技术中DNA解旋是在高温下实现的，不需要加入解旋酶，C错误。
C
3.融合PCR技术与融合蛋白
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。
[例4] (2025·河北衡水金卷)融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。图1表示融合PCR技术的过程示意图(P1～P4表示引物)，图2表示融合后产物的电泳图。
(1)从化学本质上来说，引物是___________________________，其作用是___________________________________________________。
(2)图1过程设计的P2与P3引物的添加序列必须能够发生____________。融合PCR步骤1中，至少进行________次循环才能获得基因A的PCR产物。
一小段单链DNA或RNA
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
碱基互补配对
2
(3)融合PCR步骤2中基因A、B融合形成一个基因的机制是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
若要对A、B融合基因继续进行PCR扩增，则图1中的M、N处位置所需要的引物分别是________。
引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在Taq DNA聚合酶的作用下向两边延伸，基因A、B完成融合
P1、P4
(4)图2中电泳图中________号条带最可能表示融合后片段，若PCR反应没有扩增出任何产物，则可能的原因是__________________________________________
__________________________________________________________(至少两点)。
4
复性温度太高；引物设计不合理，无法与
目的基因结合
解析 (1)引物是一小段单链DNA或RNA，能与目的基因碱基互补配对，其作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(2)由于A、B基因需要融合，融合依据的原理是碱基互补配对，因此在引物设计是P2与P3引物对应的序列就要求能碱基互补配对。PCR经过两次循环才能获得纯的目的基因片段。
(3)由图可知，引物P2与P3添加序列的互补链发生碱基互补配对，然后在Taq DNA聚合酶的作用下向两边延伸，使基因A、B完成融合。根据引物延伸的方向，N处添加的引物是P4，M处添加的引物是P1。
(4)融合后的片段长度更长，很有可能是4号条带。PCR技术没有扩增出目的基因的原因包括：复性温度太高；引物设计不合理，无法与目的基因结合。专题练11 PCR技术和基因编辑技术(A组)
(时间：25分钟 分值：30分)
选择题1～5小题，每小题3分，共15分。
【精准强化】
1.(2025·安徽安庆模拟)反转录PCR又称逆转录PCR(RT－PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW749.tif"
A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物
B.RT－PCR技术中，不需已知mRNA的全部序列
C.过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸
D.RT－PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测
2.(2025·山东泰安模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是( )
INCLUDEPICTURE"SW750.tif"
A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等
B.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D.第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
3.(2025·四川成都七中诊断)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW751.tif"
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
4.(2025·西安五校联考)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是( )
INCLUDEPICTURE"SW752.tif"
INCLUDEPICTURE"SW753.tif"
A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链
C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物
D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适当升高复性温度
【综合提升】
5.(2025·广东佛山质检)PCR定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工合成的引物，使目标DNA序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。PCR定点突变技术的过程如图所示(图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的位点)。下列叙述错误的是( )
INCLUDEPICTURE"V741.TIF"
A.获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1
B.获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循环即得片段2
C.图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对
D.图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对
6.(15分)(2024·山东卷，25)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲：载体信息
INCLUDEPICTURE"24GT50.tif"
LB/RB：T－DNA的边界序列；KanR：卡那霉素抗性基因；AmpR：氨苄青霉素抗性基因
图乙：目标基因L部分序列
INCLUDEPICTURE"24GT51.tif"
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
INCLUDEPICTURE"24GT53.tif"
INCLUDEPICTURE"24GT52.tif"
(1)(7分)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′—________—3′和5′—________—3′。
(2)(5分)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
(3)(3分)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
专题练11 PCR技术和基因编辑技术(A组)
1.C [图示过程需要控制温度，如变性解旋时温度需要控制在90 ℃以上，A正确；PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列，只需一段已知mRNA的部分序列即可，B正确；过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，C错误；RT－PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术，可应用于是否被RNA病毒感染的检测，D正确。]
2.C [PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；第2轮PCR，引物1能与图中①结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。]
3.C [不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物能与乙链碱基互补配对，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。]
4.C [在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。]
5.B [根据图示过程可知，获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1，A正确；获得片段2所需要的引物为R和F_m，且2次循环即得片段2，B错误；结合题图分析，引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对，C正确；图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对，以防引物发生碱基互补配对，从而不能与模板结合，D正确。]
6.(1)低 44(或256) GTTT CAAT (2)卡那霉素 SacⅠ ④
(3)1/4
解析 (1)引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导致非特异性产物的形成，影响PCR的特异性和准确性。
INCLUDEPICTURE"24GT69.tif" INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "F:\\陈红\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\【配套学生Word版文档】\\答案解析\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\生物\\答案解析\\24GT69.tif" \* MERGEFORMATINET
图甲：载体信息
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(2)分析载体信息可知，卡那霉素抗性基因位于T－DNA上，故重组载体中含有卡那霉素抗性基因，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素卡那霉素可筛选到具有该抗生素抗性的植株。
图乙：目标基因L部分序列
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图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
INCLUDEPICTURE"24GT71.tif" INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "F:\\陈红\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "D:\\2025\\课件\\一轮完\\2026版 创新设计 高考总复习 生物学（配人教版）（琼鄂津……）\\学生WORD文档\\答案解析\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\【配套学生Word版文档】\\答案解析\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "C:\\Users\\Administrator\\Desktop\\生物\\答案解析\\24GT71.tif" \* MERGEFORMATINET
(3)设基因L突变为基因L′，则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L′L′，由题中信息可知，一条染色体插入了T－DNA，若其插入了L′所在染色体，其所在染色体记为L′1，则其自交子代的基因型及比例为L′1L′1∶L′1L′∶L′L′＝1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代，筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L′L′)所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体，所得结果相同。(共23张PPT)
PCR技术和基因编辑技术(A组)
专题练11
(时间：25分钟 分值：30分)
1.(2025·安徽安庆模拟)反转录PCR又称逆转录PCR(RT－PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是( )
C
A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物
B.RT－PCR技术中，不需已知mRNA的全部序列
C.过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸
D.RT－PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测
解析 图示过程需要控制温度，如变性解旋时温度需要控制在90 ℃以上，A正确；
PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列，只需一段已知mRNA的部分序列即可，B正确；
过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，C错误；
RT－PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术，可应用于是否被RNA病毒感染的检测，D正确。
A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物
B.RT－PCR技术中，不需已知mRNA的全部序列
C.过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸
D.RT－PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测
2.(2025·山东泰安模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是( )
C
A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、
解旋酶、Taq DNA聚合酶等
B.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等
长的DNA占1/2
C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的
基因定向插入载体
D.第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成
两条链等长的突变基因
解析 PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；
第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；
引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；
第2轮PCR，引物1能与图中①结合并且形成两条链不等长的突变基因，其中②较长，D错误。
A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq DNA聚合酶等
B.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D.第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
3.(2025·四川成都七中诊断)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是( )
C
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道
基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
解析 不对称PCR中加入的一对引物中含量较多的被称为非限制性引物，非限制性引物能与乙链碱基互补配对，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列一致，C错误。
A.用不对称PCR方法扩增目的基因时，不需要知道基因的全部序列
B.进行最初若干次循环的目的是增加模板DNA的量
C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链的碱基序列一致
D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
4.(2025·西安五校联考)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是( )
C
A.PCR1中使用的引物有引物A、引物C
B.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链
C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物
D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生可适当升高复性温度
解析 在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，在基因的左侧需要用限制酶HindⅢ来切割，在基因的右侧用限制酶SacⅠ切割，因此在PCR1中结合到基因右端的引物选择引物C，从题图中看，另一个引物应含有突变碱基C，所以选择引物A，A正确；
在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，应含有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′端到3′端的序列中开始部位应含有SacⅠ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链，B正确；
PCR1过程主要是为了获得大引物，则扩增2轮即可获得目标产物，C错误；
由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目的基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高温度，便于引物与模板链的结合，D正确。
5.(2025·广东佛山质检)PCR定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工合成的引物，使目标DNA序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。PCR定点突变技术的过程如图所示(图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的位点)。下列叙述错误的是( )
B
A.获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1
B.获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循环即得片段2
C.图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对
D.图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对
解析 根据图示过程可知，获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1，A正确；
获得片段2所需要的引物为R和F_m，且2次循环即得片段2，B错误；
结合题图分析，引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对，C正确；
图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对，以防引物发生碱基互补配对，从而不能与模板结合，D正确。
A.获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1
B.获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循环即得片段2
C.图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对
D.图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对
6.(2024·山东卷，25)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲：载体信息
LB/RB：T－DNA的边界序列；KanR：卡那霉素抗性基因；AmpR：氨苄青霉素抗性基因
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′—________—3′和5′—________—3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
低
44(或256)
GTTT
CAAT
卡那霉素
SacⅠ
④
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
解析 (1)引物的长短会影响其在目标DNA序列上的结合能力和特异性。引物过短可能导致非特异性扩增，即引物可能会结合到与目标序列不完全匹配或无关的DNA上，进而导致非特异性产物的形成，影响PCR的特异性和准确性。
图甲：载体信息
(2)分析载体信息可知，卡那霉素抗性基因位于T－DNA上，故重组载体中含有卡那霉素抗性基因，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素卡那霉素可筛选到具有该抗生素抗性的植株。
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(3)设基因L突变为基因L′，则该株基因L成功突变的纯合植株的基因型为L′L′，由题中信息可知，一条染色体插入了T－DNA，若其插入了L′所在染色体，其所在染色体记为L′1，则其自交子代的基因型及比例为L′1L′1∶L′1L′∶L′L′＝1∶2∶1。若用抗生素筛选这个植株的自交子代，筛选出来的子代中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株(L′L′)所占的比例为1/4。若其插入了其他染色体，所得结果相同。专题练11 PCR技术和基因编辑技术(B组)
(时间：30分钟 分值：40分)
【综合提升】
1.(11分)(2025·江苏南京调研)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题。
(1)(4分)图1是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。在设计PCR引物时最好添加限制酶________________的识别序列，选择依据是____________________________________________________________
________________________________________________________________。
INCLUDEPICTURE"SW754.tif"
(2)(3分)目前，科学家已通过将肽链中B链的第28位氨基酸——脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU)，有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。在改造用BCA法获得的胰岛素基因时，可运用大引物PCR进行定点突变，相关原理如图2所示。
INCLUDEPICTURE"SW755.tif"
为保证有效抑制胰岛素的聚合，进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是________________________________。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR，要获得带有突变位点的、适于与上图中质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)；至少进行________次循环才能获得双链等长的改良基因。
(3)(4分)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了________等成分的培养基上，呈现________色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
2.(15分)(2024·九省联考黑、吉卷，25)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于质膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)(2分)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是_________________________________________________________________。
(2)(8分)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为________%。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用__________________两种限制酶对载体酶切。
INCLUDEPICTURE"13kts227.TIF"
INCLUDEPICTURE"13kts228.TIF"
(3)(2分)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是________________________________________________
__________________________________________________。
(4)(3分)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是_________________________________________
_____________________________________________。
3.(14分)(2025·山东青岛模拟)将草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。回答下列问题：
INCLUDEPICTURE"V742A.TIF"
INCLUDEPICTURE"V742.TIF"
(1)(2分)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如图1所示，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因时应选用的2种引物序列是
______________________________________________________________(标出5′端和3′端)。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经4次PCR循环需要消耗引物数量为________个。
(2)(5分)图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加________以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。添加此抗生素而不选用添加另一种抗生素筛选的原因是
_____________________________________________________________。
(3)(2分)若要获得抗除草剂能力更强的转基因甘蓝植株，可以用草甘膦抗性基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到________工程。检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，所用的方法是________________。
(4)(5分)为确定步骤③中T－DNA(碱基序列已知)的插入位置，往往需要用反向PCR技术测定插入部位的碱基序列，其原理如图3：
INCLUDEPICTURE"V743.TIF"
①不直接在图3 a中的DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_________________________________________________________________。
②PCR测序与反向PCR________(填“可以”或“不可以”)选用相同的一对引物，原因是_________________________________________________________
_________________________________________________________________。
专题练11 PCR技术和基因编辑技术(B组)
1.(1)EcoRⅠ和XhoⅠ 胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种限制酶切割会破坏目的基因；LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，选用该种限制酶切割会破坏标记基因，导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接 (2)将CCT改为GAT ② 3 (3)氨苄青霉素、X－gal 白
解析 (1)根据题图质粒与目的基因上的相关酶切位点分析，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因中，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选择添加这两种限制酶的识别位点，只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中选择；由于LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，若选择MunⅠ，会导致标记基因都被破坏，而无法筛选；而质粒上EcoRⅠ和XhoⅠ的作用位点只在一种标记基因(即LacZ基因)上，选择这两种酶只会破坏一种标记基因，仍然保留了另一个标记基因以供筛选，同时可避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接。若要目的基因两侧带有EcoRⅠ和XhoⅠ这两种限制酶切割的黏性末端，则需要在(扩增目的基因)设计PCR引物时，添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列。
(2)根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸——脯氨酸替换为天冬氨酸，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。从大引物和目的基因的结合位点分析，若选择①链，由于其是与目的基因中间部位结合，导致其延伸的片段并不是完整的目的基因片段，只有选择②链才能与目的基因的3′端结合，然后从②链的3′端添加核苷酸才能获得完整的目的基因片段，因此要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链不等长或不含改良基因，第三次循环产生的DNA分子存在等长的含改良基因的序列。(3)已知β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β－半乳糖苷酶，底物X－gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上，筛选出的白色菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
2.(1)需要能量、需要载体蛋白 (2)①逆转录 ②47 ③SpeⅠ、EcoRⅠ XbaⅠ、EcoRⅠ (3)将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况 (4)过量表达SOS1基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路将胞质内的Na＋过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na＋的利用
解析 (1)由题干信息“在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na＋结合并将其排出细胞外”可知，植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外是逆浓度梯度的运输，因此运输方式为主动运输，特点是需要载体蛋白，需要能量。(2)①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。②SOS1基因编码序列中A＋T含量占53%，则G＋C含量为47%。③由图可知，荧光蛋白基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶酶切序列，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，并且不能选择限制酶SmaⅠ，否则会导致载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能正确表达，故选择XbaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对载体酶切，由于SOSⅠ基因内部有XbaⅠ的识别序列，故不能选择限制酶XbaⅠ对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在SOS1基因两端分别添加SpeⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列。(3)鉴定水稻抗盐能力是否增强，采取的操作是将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况。(4)过量表达SOS1基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路将胞质内的Na＋过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na＋的利用。
3.(1)5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′ 30 (2)潮霉素 由图可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段，所以潮霉素抗性基因可随T－DNA转移到被侵染的细胞中，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株 (3)蛋白质 抗原—抗体杂交 (4)①T－DNA两端序列未知，无法设计引物 ②可以 PCR测序与反向PCR扩增的片段相同，可选用相同的一对引物
解析 (1)图1所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别从基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列可推知选用的2种引物序列是5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经4次PCR循环可形成16个DNA分子，其中原有2条母链的没有引物，其余子链都有引物，故需要消耗引物数量为15×2＝30(个)。(2)图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加潮霉素以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。由图可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可随T－DNA转移到被侵染的细胞，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株。(3)对草甘膦抗性基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到蛋白质工程。检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，可以用抗原—抗体杂交的方法。(4)①不直接在图3 a中的DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是T－DNA两端序列未知，无法设计引物。②由于PCR测序与反向PCR扩增的片段相同，所以PCR测序与反向PCR可选用相同的一对引物。(共24张PPT)
PCR技术和基因编辑技术(B组)
专题练11
(时间：30分钟 分值：40分)
1.(2025·江苏南京调研)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，利用工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题。
(1)图1是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。在设计PCR引物时最好添加限制酶________________的识别序列，选择依据是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
EcoRⅠ和XhoⅠ
胰岛素基因中有SalⅠ和NheⅠ的识别序列，选用这两种限制酶切割会破坏目的基因；LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，选用该种限制酶切割会破坏标记基因，导致无法筛选；选EcoRⅠ和XhoⅠ能避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接
(2)目前，科学家已通过将肽链中B链的第28位氨基酸——脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU)，有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素类似物产品。在改造用BCA法获得的胰岛素基因时，可运用大引物PCR进行定点突变，相关原理如图2所示。
为保证有效抑制胰岛素的聚合，进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是_________________________。利用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR，要获得带有突变位点的、适于与上图中质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)；至少进行________次循环才能获得双链等长的改良基因。
将CCT改为GAT
②
3
(3)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。将转化后的大肠杆菌接种到添加了____________________等成分的培养基上，呈现________色的菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
氨苄青霉素、X－gal
白
解析 (1)根据题图质粒与目的基因上的相关酶切位点分析，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因中，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选择添加这两种限制酶的识别位点，只能在XhoⅠ、MunⅠ和EcoRⅠ中选择；由于LacZ基因和AmpR基因中均有MunⅠ的识别序列，若选择MunⅠ，会导致标记基因都被破坏，而无法筛选；而质粒上EcoRⅠ和XhoⅠ的作用位点只在一种标记基因(即LacZ基因)上，选择这两种酶只会破坏一种标记基因，仍然保留了另一个标记基因以供筛选，同时可避免目的基因、质粒的自身环化，保证目的基因与质粒不会进行反向连接。若要目的基因两侧带有EcoRⅠ和XhoⅠ这两种限制酶切割的黏性末端，则需要在(扩增目的基因)设计PCR引物时，添加限制酶EcoRⅠ和XhoⅠ的识别序列。
(2)根据碱基互补配对原则，B链的第28位氨基酸——脯氨酸替换为天冬氨酸，则需要将转录模板链相应位置GGA改为CTA，那么与之结合的相应引物的序列应由CCT改为GAT。从大引物和目的基因的结合位点分析，若选择①链，由于其是与目的基因中间部位结合，导致其延伸的片段并不是完整的目的基因片段，只有选择②链才能与目的基因的3′端结合，然后从②链的3′端添加核苷酸才能获得完整的目的基因片段，因此要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。利用大引物②链作为下游引物和常规上游引物共同进行PCR时，根据PCR过程和DNA分子半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链不等长或不含改良基因，第三次循环产生的DNA分子存在等长的含改良基因的序列。
(3)已知β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。而结合题图，目的基因的插入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达，无法产生β－半乳糖苷酶，底物X－gal不会被分解，则菌落呈现白色。故应将转化后的大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上，筛选出的白色菌落即为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。
2.(2024·九省联考黑、吉卷，25)植物在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS3和SOS2激活位于质膜上的转运蛋白SOS1，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na＋结合并将其排出细胞外，维持其正常生命活动。回答下列问题：
(1)植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外，这种运输方式的特点是___________________________________________________________________。
(2)通过基因工程在水稻中过量表达SOS1蛋白，以期增强水稻抗盐能力。
①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过__________获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。
需要能量、需要载体蛋白
逆转录
②测序表明，SOS1基因编码序列含有3 444个核苷酸，其中A＋T含量占53%，模板链中C含量为26%，那么SOS1基因双链序列中G＋C的含量为________%。
③构建表达载体时，在下图所示载体含有的限制酶识别位点插入SOS1基因。序列分析发现SOS1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在SOS1基因两端分别添加____________________两种限制酶的识别序列，将SOS1基因插入载体前，应选用____________________两种限制酶对载体酶切。
47
SpeⅠ、EcoRⅠ
XbaⅠ、EcoRⅠ
(3)重组质粒转化水稻后，选取可发绿色荧光的植株，鉴定其抗盐能力是否增强，采取的操作是________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(4)若发现水稻中过量表达SOS1基因并不能明显提高其抗盐能力，从信号通路角度分析，可能的原因是________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________。
将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况
过量表达SOS1基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路将胞质内的Na＋过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na＋的利用
解析 (1)由题干信息“在高于胞内Na＋浓度的环境下，SOS1通过SOS信号通路与胞质内Na＋结合并将其排出细胞外”可知，植物利用SOS信号通路将Na＋排出细胞外是逆浓度梯度的运输，因此运输方式为主动运输，特点是需要载体蛋白，需要能量。
(2)①为获得编码SOS1蛋白的基因，可提取野生型水稻总RNA，通过逆转录获得模板DNA，再经PCR获得SOS1基因片段。②SOS1基因编码序列中A＋T含量占53%，则G＋C含量为47%。③由图可知，荧光蛋白基因内部存在SpeⅠ和BamHⅠ两种限制酶酶切序列，因此对载体酶切时不能选择这两种酶，并且不能选择限制酶SmaⅠ，否则会导致载体中SOS1基因和绿色荧光蛋白基因不能正确表达，故选择XbaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶对载体酶切，由于SOSⅠ基因内部有XbaⅠ的识别序列，故不能选择限制酶XbaⅠ对目的基因酶切，但需要目的基因有与载体相同的黏性末端，故可在SOS1基因两端分别添加SpeⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列。
(3)鉴定水稻抗盐能力是否增强，采取的操作是将转基因水稻和普通水稻种植于高于胞内Na＋浓度的环境下，观察两种水稻的生长状况。
(4)过量表达SOS1基因使转运蛋白SOS1含量增多，SOS1通过SOS信号通路将胞质内的Na＋过多地排出细胞外，影响细胞本身对Na＋的利用。
3.(2025·山东青岛模拟)将草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。回答下列问题：
(1)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如图1所示，采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因时应选用的2种引物序列是____________________________________
________________________________ (标出5′端和3′端)。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经4次PCR循环需要消耗引物数量为________个。
(2)图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加________以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。添加此抗生素而不选用添加另一种抗生素筛选的原因是________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
5′－CTTGGATGAT－3′和
5′－TCTGTTGAAT－3′
30
潮霉素
由图可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段，所以潮霉素抗性基因可随T－DNA转移到被侵染的细胞中，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株
(3)若要获得抗除草剂能力更强的转基因甘蓝植株，可以用草甘膦抗性基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到________工程。检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，所用的方法是________________。
(4)为确定步骤③中T－DNA(碱基序列已知)的插入位置，往往需要用反向PCR技术测定插入部位的碱基序列，其原理如图3：
蛋白质
抗原—抗体杂交
①不直接在图3 a中的DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是___________________________________________________________________。
②PCR测序与反向PCR________(填“可以”或“不可以”)选用相同的一对引物，原因是_____________________________________________________________。
T－DNA两端序列未知，无法设计引物
可以
PCR测序与反向PCR扩增的片段相同，可选用相同的一对引物
解析 (1)图1所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别从基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列可推知选用的2种引物序列是5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′。若初始加入1个草甘膦抗性基因，则历经4次PCR循环可形成16个DNA分子，其中原有2条母链的没有引物，其余子链都有引物，故需要消耗引物数量为15×2＝30(个)。
(2)图2中步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤④的培养基中添加潮霉素以便筛选出含目的基因的甘蓝植株。由图可知，潮霉素抗性基因在T－DNA片段中，卡那霉素抗性基因不在T－DNA片段中，所以潮霉素抗性基因可随T－DNA转移到被侵染的细胞，并且随其整合到该细胞的染色体DNA上，从而使含目的基因的甘蓝植株有抗潮霉素的抗性，所以能在含潮霉素的培养基上筛选含目的基因的甘蓝植株。
(3)对草甘膦抗性基因进行改造，最终得到相应的蛋白质，该过程需用到蛋白质工程。检测转基因甘蓝植株是否产生抗除草剂蛋白，可以用抗原—抗体杂交的方法。
(4)①不直接在图3 a中的DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是T－DNA两端序列未知，无法设计引物。②由于PCR测序与反向PCR扩增的片段相同，所以PCR测序与反向PCR可选用相同的一对引物。
