高考生物一轮复习选择性必修3热点拓展6PCR和基因编辑技术课件(共26张PPT)

(共26张PPT)
选择性必修3　生物技术与工程
热点拓展六　PCR和基因编辑技术
热点一　PCR技术及其应用
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1．PCR技术与病毒检测
新冠病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测新冠病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。
2．基因定点突变与基因改造
重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
3．融合PCR技术与融合蛋白
融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来，进而可以用于生产融合蛋白。
突|破|训|练
1．(2024·山东六校学情联考)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述错误的是(　　)
A．在PCR体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、耐高温的DNA聚合酶等
B．第3轮PCR中，引物1能与图中的②结合并且形成突变基因
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入基因表达载体
D．在第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA占1/4
答案：A
解析：在PCR体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等，但不需要加入解旋酶，A错误；物质②是引物2以引物1扩增得到的DNA链为模板进行复制得到的，故在第3轮PCR中，引物1能与图中的②结合并且形成两条链的突变基因，B正确；引物中设计两种限制酶识别位点，可以配合载体的限制酶识别位点，帮助目的基因定向定点插入基因表达载体，避免发生自身环化，C正确；在第3轮PCR结束后，含突变碱基对的DNA有2个，总DNA分子共8个，所以其比例为1/4，D正确。
2．(2025·山东淄博模拟)定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA 分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物 PCR 定点诱变技术成为基于PCR 的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(1)利用大引物 PCR 进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1 和 PCR2)，在PCR1 中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是_______________________________________。为将改良基因构建在质粒上，还需要________________等酶。
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述组件的溶液加入大肠杆菌菌液中，适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和____________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是____________________________________ ____________________________________________________________。
答案：(1)2　②　(2)SmaⅠ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接　BglⅡ、DNA连接酶　(3)β－半乳糖苷　构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β－半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色
解析：(1)由图可知，大引物的两条链均带有突变位点，进行第一轮循环，得到的DNA有一个不含突变位点，另一个DNA有一条链含有突变位点，进行第二轮循环，即可得到DNA有一个不含突变位点、两个含一个突变位点和一个两条链均含突变位点的DNA，即大引物，所以至少需要经过两个循环才能获得相应的大引物模板；在PCR2中，由于DNA聚合酶只能从子链的3′端连接单个脱氧核苷酸，因此从大引物和目的基因的结合位点分析，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的②链。
(2)根据SmaⅠ的酶切位点，如果选择SmaⅠ，则获得的是平末端，无法与改良基因上的黏性末端连接；从各种限制酶的酶切位点分析，除使用XmaⅠ外，还需使用BglⅡ切出相应黏性末端与改良基因CTAG一侧进行连接，同时需要用DNA连接酶构建基因表达载体。
(3)因LacZ基因编码的酶能分解β－半乳糖苷，产生蓝色物质，如果没有分解，则菌落为白色，因此可以将菌液涂布在含氨苄青霉素和β－半乳糖苷的平板上，由于重组质粒的LacZ基因在重组过程中被切断，不能编码相应的酶分解β－半乳糖苷，呈现白色，因此白色菌落含有重组质粒。
热点二　基因编辑技术及其应用
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CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
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3．CRISPR/Cas9系统由单链的向导RNA(SgRNA)和内切核酸酶Cas9构成，为高效获得特定基因敲除的斑马鱼系，科研人员利用基因编辑技术(原理如图所示)，用化学方法合成特定的SgRNA，与Cas9 mRNA一起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列说法正确的是(　　)
A．两种RNA可通过显微注射法导入斑马鱼的肌肉细胞
B．图中SgRNA通过碱基互补配对实现其引导功能
C．Cas9 mRNA能对斑马鱼特定基因位点进行切割
D．基因敲除后的斑马鱼的发育一定会发生异常
答案：B
解析：用化学方法合成特定的SgRNA，与Cas9 mRNA一起注射到斑马鱼细胞，两种RNA通过显微注射法导入斑马鱼的受精卵，不是肌肉细胞，A错误；SgRNA通过与DNA的碱基互补配对完成对目标DNA的识别，从而实现Cas9蛋白对DNA分子的定位，引导Cas9蛋白到DNA的特定基因位点进行切割，B正确；Cas9蛋白能对基因位点进行切割，Cas9 mRNA不能切割基因，C错误；如果敲除的基因是内含子，则不会导致斑马鱼发育异常，D错误。
4．(2021·海南高考改编)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是______________。
(3)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________________。随后，Cas9蛋白可切割__________________ ________序列。
(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
答案：(1)DNA连接酶　(2)Ca2＋处理法　(3)碱基互补配对原则　目标DNA特定的核苷酸
(4)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中
解析：(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之前需要用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9蛋白切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9蛋白能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则，实现SgRNA与目标DNA特定序列的特异识别，进而定位；由此可见，Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，从而插入到基因组DNA中。