17 第一部分 模块五 专题(十三) 基因工程 课件-2026版高考二轮专题复习与策略生物
文档属性
| 名称 | 17 第一部分 模块五 专题(十三) 基因工程 课件-2026版高考二轮专题复习与策略生物 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 21.7MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-07-25 16:54:47 | ||
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文档简介
(共205张PPT)
第一部分 专题素能提升
模块五 生物技术与工程
专题(十三) 基因工程
核心整合篇
01
核心整合练A卷
02
核心整合练B卷
03
热点拓展篇
04
热点拓展练
05
核心整合篇
1．基因工程的基本工具
提醒：两种不同的限制酶切割不同的DNA片段，产生相同的黏性末端，这两种限制酶称为同尾酶。
磷酸二酯键
T4 DNA连接酶
2．基因工程的基本操作程序
PCR
RNA聚合酶识别和结
合的部位
农杆菌转化法
显微注射技术
提醒：①目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入在启动子与终止子之间。当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要利用特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。②鉴定目的基因的插入与转录，可使用PCR技术或分子杂交技术。
3．蛋白质工程
基因合成
新的
蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
4．DNA的粗提取与鉴定
5．PCR技术
6．DNA片段的电泳鉴定
提醒：DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
①电泳缓冲液维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率。②凝胶载样缓冲液(内含指示剂)主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置，有助于判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。③核酸染料是用来染色DNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带。
1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
√
B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
2．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是( )
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
A [题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E．coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E．coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB，E．coliA和E．coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；据题中信息无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。]
3．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
A [在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]
命题延伸 判断与表达
(1)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生。(2021·湖北卷T16) ( )
(2)基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。(2021·辽宁卷T3) ( )
√
提示：基因工程中常用农杆菌转化植物细胞。
(3)利用蛋白质工程技术在N0(腈水合酶)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现。(2021·辽宁卷T14) ( )
×
√
(4)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物。(2021·山东卷T13) ( )
提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。
×
(5)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(2023·江苏卷T9) ( )
×
提示：粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色。
(6)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________
_______________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山东卷T25)
能与P基因母链的一段碱基序
列互补配对、短单链核酸
5′端
(7)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________。(2019·江苏卷T33)
乙、丙
目的基因反向连接
(8)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是农杆菌细胞内含有Ti质粒，_____________________________________________________
_____________________________。(2023·海南卷T20)
Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
题组1 基因工程及其应用
1．(2024·湖北八市联考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
2
4
1
3
题号
5
√
B [图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；目的基因两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；PCR技术扩增目的基因时，若复性温度偏低，则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目标序列，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
2．(2024·安徽合肥三模)AK、DHDPS是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。下列有关分析错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关
B．要替换AK、DHDPS中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现
C．改造后的AK和DHDPS与赖氨酸的结合能力增强
D．改造后的AK和DHDPS的空间结构发生改变
2
4
1
3
题号
5
√
C [由题可知，赖氨酸与AK、DHDPS结合，抑制它们的活性，属于负反馈调节，A正确；根据题意“将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸”可知，该操作为蛋白质工程，蛋白质工程的实质是改造相应基因来实现的，B正确；由题分析可知，将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，会导致改造后的AK和DHDPS的空间结构发生改变，与赖氨酸的结合能力降低，C错误，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
3．(2024·湖南长沙一模)研究人员从分解纤维素的细菌(A菌)中提取出一种纤维素酶基因(CBHⅡ)并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒(图1)连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌(B菌)。请回答下列问题：
2
4
1
3
题号
5
2
4
1
3
题号
5
限制酶 识别序列及酶切位点
BglⅡ
BstEⅡ
SacⅠ
MspⅠ
BamHⅠ
几种限制酶识别序列及酶切位点
(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶________________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段(X和Y)，X两端的黏性末端分别为-CTAG和-CAATG，则Y两端的黏性末端分别为-CTAG和________。
(2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，因此在扩增CBHⅡ基因时，需要在两种引物的______ (填“5′”或“3′”)端分别添加相应限制酶的识别序列。
2
4
1
3
题号
5
BglⅡ、BstEⅡ
-CATTG
5′
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素____(填“M”或“N”)的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示(片段过小时检测不到条带)。据图分析，菌落__________中成功导入了重组质粒。
2
4
1
3
题号
5
N
2、3
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基内纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种______________，说明___________________________________。
2
4
1
3
题号
5
A菌
B菌分解纤维素能力比A菌更强
[解析] (1)需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstEⅡ对质粒进行酶切。根据表格中BstEⅡ识别序列和切割位点，X一端的黏性末端为-CAATG，则Y一端与之互补的为-CATTG。(2)引物是从子链的5′端往3′端方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与载体正确连接，则需要在引物的5′端分别添加相应限制酶的识别序列。(3)BstEⅡ和BglⅡ破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素N的培养基上培养，图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。(4)对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由柱状图长短可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。
2
4
1
3
题号
5
4．(2024·河北衡水模拟)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
2
4
1
3
题号
5
√
D [动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
5．(2023·山东潍坊三模)下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的说法，错误的是( )
A．放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部
B．配置琼脂糖溶液时，需要根据DNA片段的大小调节琼脂糖浓度
C．电泳时需要的两种缓冲液分别含有核酸染料和指示剂
D．电泳时，需要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压
√
2
4
1
3
题号
5
C [使用PCR技术的具体操作顺序：按配方准备好各组分→用微量移液器将各组分依次加入微量离心管中→离心使反应液集中在离心管底部→设计好PCR仪的循环程序→进行PCR反应，因此放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部，A正确；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段的大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子，B正确；凝胶载样缓冲液内含指示剂，琼脂糖溶液加入核酸染料，电泳缓冲液不含有核酸染料，C错误；接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
1．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
核心整合练(十三) 基因工程[A卷]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
D [若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
2．(2024·安徽合肥三模)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，下列叙述正确的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B．利用PCR技术扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C．Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D．利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
题号
1
3
5
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8
7
9
√
C [使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，是T-DNA转移整合到受体细胞的染色体DNA上必不可少的，不能选择限制酶Ⅱ，A错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可，B错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，最好在培养基中添加四环素，可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，D错误。]
题号
1
3
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2
4
6
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7
9
3．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．表达质粒pGEX-4T-2可以用限制酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ进行双酶切
B．dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
题号
1
3
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2
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6
8
7
9
√
D [dTCTP基因经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，因此一般需要相同的限制酶切割载体，产生相同的黏性末端，A正确；由题意知，从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，最终获得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是该项研究中的目的基因，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，C正确；利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，构建基因表达载体，D错误。]
题号
1
3
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2
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6
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7
9
4．(2024·辽宁丹东二模)利用AI(人工智能)破解蛋白质结构和功能之谜，建立蛋白质数据库，并在此基础上进行蛋白质结构设计和优化，会给未来蛋白质工程的发展带来翻天覆地的变化。关于该技术的实施下列说法错误的是( )
A．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理
B．可以通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质
C．根据设计的某种蛋白质的氨基酸序列推理的基因序列中包含启动子和终止子
D．用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，原因是密码子的简并
√
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
C [用AI预测新型蛋白质的基因结构依据的原理是中心法则，从蛋白质结构反推出氨基酸序列，再反推出相应的基因序列，A正确；对蛋白质的改造是通过改造或合成基因来完成的，B正确；启动子和终止子为非编码区，故由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，C错误；因为一种氨基酸可能对应多种密码子(密码子的简并)，故用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，D正确。]
题号
1
3
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7
9
5．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
√
题号
1
3
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4
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8
7
9
D [研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。]
题号
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9
6．(2024·辽宁沈阳模拟)某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是( )
A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长
B．提取DNA时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液
C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补
D．为满足PCR反应的需求，需控制复性温度及添加 Mg2+以保证DNA的稳定增长
√
题号
1
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9
B [培养基预增菌，目的是增加待测菌的数量，可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长，A正确；提取DNA时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中进行离心，将上清液去除后对菌体进行采集，B错误；两种引物分别和目的基因的两端的序列互补，两引物的序列不互补，C正确；为满足PCR反应的需求，需控制复性温度及添加Mg2+以保证DNA的稳定增长，D正确。]
题号
1
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9
7．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
题号
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9
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的_______________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
题号
1
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碳源、氮源
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为__________________，理由是_________
_____________________________________________________________。
题号
1
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PT7、PBAD和PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为____________________________ (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________________________________________
_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：_____________________________________。
[解析] (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
题号
1
3
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9
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶
(2)据题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与pMag-T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。
题号
1
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9
(4)由(2)分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。
题号
1
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9
8．(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为___________
__________启动子。Nos为终止子，其作用________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
在胚乳中特
异性表达的
终止转录
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
(2)利用________________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测______________，通过______________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为____。选择纯合体进行后续研究的原因是____________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
农杆菌转化
r2HN的mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合体自交后代不发生性状分离
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和_____免疫。
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
体液
细胞
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_____________
__________________________________________。(答出两点即可)
[解析] (1)若使r2HN仅在水稻胚乳表达，则Gtp应为在胚乳中特异性表达的启动子。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnⅠ破坏了启动子序列不能选用，SacⅠ位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测r2HN的mRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
题号
1
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9
(4)据图可知，实验组的抗体水平和CD8＋T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
(5)通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
题号
1
3
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7
9
9．(2024·湖北荆州三模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态
变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一
的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白
(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化
的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。
无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建
荧光探针表达载体的过如下图。请回答下列
问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿______(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向水解DNA，形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是___________________
_________________________________________________________。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”，因此过程③所需的酶有_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
5′→3′
降低酶活性，防止过
DNA聚合酶和DNA连接酶
度水解DNA
(3)PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是__________________
_________________________________________________________，有时需要在引物的一端增加限制酶的酶切位点，目的通常是_________________________________________________________。PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的基因片段时，所用的引物F1和R2可对应下表中的_________(填序号)。
题号
1
3
5
2
4
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8
7
9
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
便于目的基因与载体连接
①④
① 5′ -TCCGGACTCAGATCTCGAGC 3-′
② 5′ -AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTA -
ACTAGTCTTAGTGGCGTC -3′
③ 5′ -TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATG -
GTGAGCAAGGGCGA- 3′
④ 5′- GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTG TACAGCTCGTCCA -3′
题号
1
3
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2
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6
8
7
9
(4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含________________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植，可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__________________，了解PA的分布和含量。
题号
1
3
5
2
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8
7
9
草胺膦
绿色荧光点的分布
[解析] (1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。
(2)过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。
题号
1
3
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7
9
(3) PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，有时需要在引物的一端增加限制酶的酶切位点，目的通常是便于目的基因与载体连接。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的基因片段的引物F1对应于表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的④。
题号
1
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9
(4)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的分布和含量。
题号
1
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9
(教师用书独具)
(2024·湖北武汉二模)水中物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
A．根据题意可知斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
√
B [将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，推测斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体，A正确；结合题图，ERE诱导Gal4转录，其翻译产物Gal4蛋白与UAS结合驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B错误；用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D正确。]
√
1．(2023·广东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
核心整合练(十三) 基因工程[B卷]
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
D [裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；粗提取的DNA通过分离，可以去除混合物中的多糖、蛋白质等，B正确；根据DNA和蛋白质等杂质的溶解度差异，可以反复多次沉淀来提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。]
题号
1
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9
2．(2024·浙江杭州模拟)某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因A1、A2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A3的基因频率是( )
A．52% B．27%
C．32% D．2%
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
B [据图可知，该动物种群中基因型为A3A3的有2个，A2A2的有8个，A1A1的有9个，A1A3的有15个，A1A2的有31个，A2A3的有35个，A3的基因数为2×2＋15＋35＝54，则种群中A3的基因频率为54÷200×100%＝27%，B正确，A、C、D错误。]
题号
1
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6
8
7
9
3．(2024·湖北武汉一模)人乳铁蛋白(hLF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白(hLF)基因转入到山羊体内，从山羊的乳汁中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是( )
A．可用PCR直接扩增人乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是山羊乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A [不可以直接用PCR扩增mRNA，需将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，A错误；为保证在供体山羊的乳汁中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C正确；为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因已翻译形成蛋白质，D正确。]
题号
1
3
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7
9
4．(2024·广东广州模拟)紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因(S)的cDNA(某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA)和Ti质粒图。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
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2
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7
9
A．由图可知，最好选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒
B．在用农杆菌侵染时，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞
C．用于扩增 S基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链 3′端的碱基序列互补配对
D．若检测出标记基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
题号
1
3
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2
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6
8
7
9
√
D [由图可知，最好选用XbaⅠ、 Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒，既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因，A正确；在用农杆菌侵染时，既要让农杆菌Ti质粒上的T-DNA整合到植物细胞的染色体DNA上，又要避免农杆菌的大量繁殖，因此培养基中通常加入抗生素，B正确；用于扩增S基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对，以保证子链从5′端向3′端延伸，C正确；若检测出目的基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞，D错误。]
题号
1
3
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8
7
9
5．(2024·湖北黄石一模)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
B．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因
D．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
B [根据GNA-ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A正确；由于重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B错误；雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，C正确；图中质粒与GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
6．(2024·北京昌平期末)科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，检测原理(a、b)及结果(c)如下图。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针
B．图中b是PCR反应的复性过程
C．多重PCR同时完成对4种病原体的检测
D．由结果推测该检测样品中有A病原体的核酸
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
B [不同的病原体的碱基序列是不同的，因此需要根据病原体的碱基序列设计不同的特异性引物和荧光探针，A正确；图中b是PCR反应的延伸过程，该过程中发生合成子链的过程，B错误；科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，由图c可知，多重PCR同时完成对(A、B、C、D)4种病原体的检测，实验组中B、C、D的剩余探针荧光强度与阴性对照组相似，说明该检测样品中没有B、C、D病原体的核酸，实验组中A的剩余探针荧光强度与阴性对照组不同，说明该检测样品中有A病原体的核酸，C、D正确。]
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
7．(2023·辽宁卷)天然β-淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于_________工程。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
蛋白质
(2)PCR中使用的聚合酶属于________________(填写编号)。
①以DNA为模板的RNA聚合酶
②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶
④以RNA为模板的DNA聚合酶
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
③
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是________(填写编号)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
②
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
标记基因
(5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位点)全长为1.5 kb，将其插入BamHⅠ位点。用EcoRⅠ酶切来自不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是__________________________。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为__________kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过________________反应获得PCR的模板。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
筛选导入目的基因的大肠杆菌
5.7
逆转录
[解析] (1)根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
(2)PCR的原理是DNA双链复制，使用的聚合酶是以DNA为模板的热稳定的DNA聚合酶。
(3)根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(4)作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知，应还要包括目的基因和标记基因。
(5)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoRⅠ酶切位点，则切割后的长度为4.2＋1.5＝5.7 kb。
(6)转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出cDNA作为PCR反应的模板。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
8．(2024·广东佛山二模)瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白(GFP)基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。回答下列问题。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的________________(填“5′”或“3′”)端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、__________________________，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
题号
1
3
5
2
4
6
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7
9
3′
Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位点
(2)已知Hind Ⅲ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用Hind Ⅲ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是____________________________
_________________________________________________________。
本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加______________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是______________________________________(答出2种)。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行______________。
题号
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Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同)
新霉素
抗原—抗体杂交技术、检测绿色荧光强弱
动物细胞培养
[解析] (1)引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，因此引物1左侧为5′端，DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，因此与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的3′端。构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位点，以便于酶切后的瘦素基因正确连接。
题号
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(2)由于Hind Ⅲ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近，因此用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ对P载体进行切割后，会形成一个大片段，接近4 700 bp，一个超小片段可忽略，即对P载体酶切产物电泳后，只出现接近4 700 bp的条带，若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用Hind Ⅲ、BamHⅠ对重组质粒切割后，会出现两个片段，一个是瘦素基因，一个是接近4 700 bp的片段，则电泳结果会出现两个条带，如图所示：
题号
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(3)Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子或转录后的加工不同或翻译后的加工不同，因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。本实验中受体细胞为小鼠成纤维细胞，为真核细胞，则Kanr/Neor在真核细胞中表达具有新霉素抗性，为筛选转化的细胞，应在培养基中添加新霉素，能存活的细胞为导入重组质粒的受体细胞。
题号
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(4)瘦素基因表达产物为蛋白质，因此可以用抗原—抗体杂交技术检测瘦素基因是否成功表达，同时目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况，即可以检测绿色荧光的强弱。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行动物细胞培养。
题号
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9．(2024·湖北宜昌一模)科研人员构建了可表达WRK10-MYC 融合蛋白的重组农杆菌Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，该质粒的部分结构如图1所示，其中Kan为卡那霉素抗性基因，Hyg为潮霉素抗性基因，MYC标签序列编码标签短肽MYC，WRK10蛋白为转录因子，可与图2中PIF4基因启动子某区段结合并激活该基因的转录。
题号
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(1)将重组农杆菌Ti质粒导入农杆菌时，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是_____________________________________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的植物愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入______________(填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素和卡那霉素”)进行筛选。
题号
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使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
潮霉素
(3)已知利用LP和RP扩增结果为大带，BP和RP扩增结果为小带。可用图中三种引物进行两次PCR扩增和________________方法鉴定转基因植物后代中的纯合转基因植株，PCR扩增时加入dNTP的目的是________________，其中BP引物和_____链对应碱基序列相似。T- DNA插入植物染色体DNA 分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，则纯合转基因植株PCR产物的检测结果为____(填“大带”“小带”或“大带和小带”)。
题号
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琼脂糖凝胶电泳
提供原料和能量
a
小带
(4)为了探究WRK10蛋白与PIF4基因启动子结合的具体区段(如图2所示)，科研工作者利用短肽MYC抗体处理了对应的基因表达产物，后经一系列过程，得到图3所示的结果，由此推测转基因植株体内WRK10蛋白激活PIF4基因的表达的机制是_________________
_________________________________________________________。
题号
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9
红光条件下WRK10
蛋白能够结合PIF4基因启动子的W12区段
MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是___________________
_________________________________________________________。
[解析] (1)Ca2+处理农杆菌的目的是使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以便后续将基因表达载体导入受体细胞。
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与 MYC抗体结合，便于检测、示踪WRK10基因有无表达
(2)卡那霉素抗性基因在启动子与终止子以外，无法表达，因此将农杆菌浸泡过的植物愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选。
(3)PCR扩增结果需要用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，加入dNTP的目的是提供原料和能量，BP和RP扩增结果为小带，BP引物和b 链结合，因此BP引物和a链对应碱基序列相似。如图， BP位点在T DNA片段上，又因为T- DNA插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，故纯合转基因植株PCR检测结果为BP和RP扩增的小带。
题号
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(4)由实验结果分析，红光下处理时， MYC抗体阳性组PIF4基因表达量很高，推测转基因植株体内WRK10蛋白激活PIF4基因的表达的机制是红光条件下WRK10蛋白(转录因子)与PIF4基因启动子的W12区段结合，从而激活该基因的表达。 MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是与MYC抗体结合，便于对WRK10蛋白表达的检测、示踪。
题号
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(教师用书独具)
(2023·浙江6月卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3 -GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
√
B [分析图甲可知，启动子在左侧，Gata3-GFP基因在右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向为从左向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，不能区分杂合子和纯合子，D错误。]
热点拓展一 同尾酶
1．同尾酶定义
同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶，一般是指能产生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。在构建基因表达载体的过程中，若选择的某种限制酶会破坏目的基因或质粒的重要片段时，可尝试使用该酶的同尾酶进行切割。
热点拓展篇
这样用同尾酶进行体外重组时，在限制酶切割反应之后不必将原有的限制酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中原有的限制酶的存在，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷酸反应而得到最高的连接效率，即不需要将5′端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。
拓展应用
(2024·湖南雅礼中学模拟)像Bcl Ⅰ MboⅠ
这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是( )
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
√
B [切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确。切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用MboⅠ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误。切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列可能发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用，C正确。切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，产生的均为黏性末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。]
热点拓展二 启动子与转录调控
1．启动子的类型
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
启动子对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。
参照转录调控模式，启动子又可以分：
(1)组成型启动子，该类启动子能够调控结构基因的表达基本恒定在一定程度上，在不同部位或组织表达水平差异不明显。
(2)组织特异型启动子，该类启动子的调控作用使得基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器使用的即为乳腺细胞中特异表达基因的启动子。
(3)诱导型启动子，即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类型启动子调控下大幅度地提升。目前已经分离了众多启动子如热诱导表达基因、光诱导表达基因、创伤诱导表达基因、真菌诱导表达基因和共生细菌诱导表达基因启动子等。
2．启动子位置及转录模板链的判断
基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链？答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须要明确以下三个要素：
(1)链方向
(2)链性质(编码链或模板链)
(3)功能区域(启动子或终止子)
确定其中2个要素即可确定第3个要素。
举例分析如下：
①基于图2中模板链①及其方向，判断启动子的位置。
由于转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，转录过程的发生是从启动子到终止子，则推导出非编码区2为启动子。
②基于图3中启动子位置及DNA链的方向，判断模板链位置。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，且与模板链反向平行，推导出②为该基因的模板链。
③基于图4中的模板链(①)及启动子位置，判断DNA链的方向。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录出来的mRNA的5′端位于左侧，3′端位于右侧，由于①为模板链，其与转录产生的mRNA互补，且反向平行，所以①的方向从左至右为3′→5′，②的方向从左至右为5′→3′。
拓展应用
(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________
_________________ (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
RNA聚合酶
限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等
F2和R1(或F1和R2)
a链
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
[解析] (1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
J-V5融合蛋白
不是
(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2和R1(或F1和R2)，若选用引物F1和R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。
(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J-V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
热点拓展三 Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的放射性同位素标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交实验可以帮助研究人员检测特定DNA序列的存在和数量，可应用于基因表达研究、基因组学、医学诊断等领域。
实验操作步骤如下：
一、DNA样品准备：从组织或细胞中提取基因组DNA，使用一种或多种限制酶对基因组DNA进行切割，将其消化成大小不同的片段。
二、DNA电泳分离：制备琼脂糖凝胶，在恒定电压下，将切割后的DNA片段上样至琼脂糖凝胶中，进行电泳分离。电泳时间根据DNA片段的大小和凝胶浓度而定，以确保DNA片段按分子量大小在凝胶中形成清晰的条带。
三、DNA变性和转膜：将电泳后的凝胶浸泡在变性溶液中(如0.25 mol/L HCl和碱性溶液)，使DNA变性并断裂成单链片段。将变性后的凝胶上的DNA片段转移到固相支持物上，如硝酸纤维素膜或尼龙膜。在转膜过程中，需要保持DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一致。
四、DNA固定：将载有DNA片段的膜进行固定处理，以防止DNA在后续步骤中脱落。常用的固定方法有紫外线照射或干烤等。
五、探针标记与杂交：使用同位素(如放射性同位素)或非同位素(如地高辛)标记方法制备特异性探针。将固定好的膜置于预杂交液中，将标记好的探针加入预杂交液中，与膜上的DNA片段进行杂交反应。
六、洗膜与检测：洗去未与DNA片段结合的游离探针。根据探针的标记方法选择合适的检测方法。对于放射性同位素标记的探针，通常采用放射自显影进行检测；对于非同位素标记的探针，则可以使用相应的显色系统(如地高辛特异抗体检测系统)进行检测。
拓展应用
(2024·湖南常德模拟)Southern印迹
杂交是进行基因组DNA特定序列定位
的通用方法。其基本方法是利用琼脂
糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA
片段，将凝胶上的DNA变性并在原位
将单链DNA片段转移至硝酸纤维素膜
上并固定，再与放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子。根据信息判断，下列说法中错误的是( )
A．限制酶消化DNA片段时破坏了相邻两个核苷酸分子之间的磷酸二酯键
B．转移至硝酸纤维素膜上的DNA片段中有2个游离的磷酸基团
C．标记探针与硝酸纤维素膜上的DNA分子部分碱基序列互补
D．可用Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因
√
B [限制酶切割DNA分子内部核苷酸分子之间的磷酸二酯键，A正确；转移至硝酸纤维素膜上的 DNA片段是单链DNA分子，其中有1 个游离的磷酸基团，B错误；核酸探针通过氢键与待检测基因片段进行连接，进行碱基互补配对，C正确；放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子，可用 Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因，D正确。]
热点拓展四 PCR技术拓展
1．实时荧光定量RT-PCR技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
3．PCR定点突变——大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，
这三条引物分别是突变上游引物、常规上游
引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变
上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不
完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮
PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作
为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增
得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5．巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。
拓展应用
1．(2024·黑龙江大庆模拟)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是( )
A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选E．coli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者之间不能互补配对
D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
√
A [在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E．coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者之间不能互补配对，C错误；PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。]
2．(2024·广东湛江二模)研究发现，若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“ ”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合为( )
A．引物1和引物4
B．引物2和引物6
C．引物2和引物4
D．引物3和引物5
√
B [题图可知，利用重叠延伸PCR技术对DNA分子进行定点突变的过程中，通过PCR2获得产物CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3′端结合，因此引物d的序列为5′GTCACGTG，引物2符合该序列。现要利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将mRNA上的第154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c的碱基序列为5′CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意。]
热点拓展五 基因组编辑技术
1．寡核苷酸介导的定点突变
寡核苷酸是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称，利用寡核苷酸可以实现不依赖PCR的定点突变。
(1)首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段(除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对)。
(2)然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体(通常由M13噬菌体衍生而来，内有一个环状单链DNA分子)进行杂交。
(3)继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体。
(4)最后将双链载体引入宿主细胞复制，并进行筛选和鉴定。
2．CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的一种免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，为它们提供获得性免疫。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具。其中最常见的是CRISPR/Cas9基因编辑技术。
(1)系统构成：向导RNA＋限制性内切核酸酶Cas9。由具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白和一条人为重组的一段目的基因的单链向导RNA(SgRNA)组成，向导RNA可以指导Cas9蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。
(2)编辑原理：向导RNA能与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对结合在一起，引导Cas9到特定的基因位点进行切割；通过设计向导RNA中的20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。根据CRISPR/Cas9精准攻击外源DNA的工作原理，就可以实现基因敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，就可以实现基因的定点突变。
3．重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术(见热点拓展四)
拓展应用
1．定点突变技术是按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。其中一种方法是利用寡核苷酸链介导的定点突变，过程如图所示。下列关于利用寡核苷酸链介导的定点突变技术的叙述，错误的是( )
A．该技术的原理是基因发生碱基对的替换
B．过程①需要模板、原料、能量、酶等基本条件
C．过程②以寡核苷酸链延伸后的单链为模板
D．过程①②均遵循碱基互补配对原则
√
A [定点突变改变特定位点的核苷酸，先是诱变寡核苷酸引物上的碱基对发生替换、增添或缺失，随后经过延伸和复制，产生新的突变基因，A错误；该延伸过程属于DNA复制过程，需要模板、原料、能量、酶等基本条件，B正确；题图显示过程②为以寡核苷酸链延伸后的单链为模板合成互补DNA链的过程，C正确；延伸过程遵循碱基互补配对的原则，需要DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸，D正确。]
2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________。
DNA连接酶
Ca2+处理法
(3)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是_________________，基因敲除成功的判断依据是_______________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________。
碱基互补配对
目标(目的)DNA(基因)
DNA分子杂交技术
经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：____________________________________________________________________________________________________________________。
表达的Cas9蛋白和SgRNA，两者形成复合体，SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
[解析] (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。
(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功。
(5)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
1．(2024·山东烟台期中)同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是( )
热点拓展练(十三) 基因工程
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大
C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，可以防止目的基因自身的环化
D．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被二者重新切开
题号
1
3
5
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6
8
7
9
√
B [BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A错误；使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大，不同的酶也能切割出相同的黏性末端，B正确；图中BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，故选用两种不同的限制酶切割目的基因，不一定可以防止目的基因自身的环化，C错误；用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，不可被二者重新切开，D错误。]
题号
1
3
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9
2．(2024·浙江杭州二模)某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
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8
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9
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达
B．仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确
C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同
D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子
题号
1
3
5
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6
8
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9
√
C [据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确；仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确，B正确；ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，因此引物F1与b链的部分序列相同，C错误；若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子，D正确。]
题号
1
3
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9
3．(2024·江苏盐城模拟)常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列相关叙述错误的是( )
A．细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关
B．膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游
C．真核生物细胞中，一般一个启动子只能启动一个基因的转录
D．强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性
√
题号
1
3
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9
B [根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达”可知，细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关，A正确；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，因此膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在组织特异型启动子的下游，导入细胞中，保证基因在膀胱细胞中表达，B错误；一般情况下，真核生物细胞中，一个启动子只能启动一个基因的转录，C正确；强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性，从而启动基因的转录，D正确。]
题号
1
3
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9
4．(2024·四川绵阳期中)研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经植物组织培养、筛选最终获得了一株水稻突变体，现欲检测该突变体是否由T-DNA插入所致。如图是利用不同的限制酶处理突变体的总DNA，经电泳、核酸分子杂交的放射性自显影结果，并与野生型和Ti质粒做对比(注：T-DNA上没有所用限制酶的酶切位点)，对该实验的分析错误的是( )
题号
1
3
5
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8
7
9
A．检测结果时使用了放射性标记的T-DNA片段做探针
B．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明T-DNA有不同的插入位置
C．实验结果证明该突变体核DNA中插入了T-DNA
D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确
题号
1
3
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8
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9
√
B [图示结果突变体中出现放射性，说明使用了放射性标记的T-DNA片段做探针对目的基因进行检测，A正确；不同酶切杂交带位置不同，说明不同酶切后带有T-DNA的片段长度不同(即不同的酶切位点距离T-DNA的远近不同)，B错误；该突变体产生的根本原因是T-DNA携带目的基因插入水稻细胞的染色体DNA上，C正确；由图所示放射性检测结果可知，野生型无放射性杂交带，若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确，D正确。]
题号
1
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9
5．(2024·四川绵阳期中)巢式PCR是指先后用外、内引物扩增获得目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
题号
1
3
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2
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9
√
D [两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。]
题号
1
3
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9
6．(2024·福建漳州一模)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个
或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来
研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核
苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可
获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一
轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程
如图所示。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
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7
9
A．第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度
B．PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
C．第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物
D．将某蛋白第21位的组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程
题号
1
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9
√
C [为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；据图分析可知，除第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某蛋白质第21位的组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)的过程属于蛋白质工程，D正确。]
题号
1
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9
7．(2024·山东德州二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了SgRNA1和SgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法错误的是( )
题号
1
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7
9
A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与SgRNA序列的特异性相关
B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱
C．两种SgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达
D．据图2可知，用SgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好
题号
1
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√
D [CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与SgRNA编码序列有关，即主要与SgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高器官移植的成功率，B正确；两种SgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；据图2可知，与对照组相比，用SgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用SgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。]
题号
1
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9
8．(2024·山东济宁模拟)干扰素是在病毒感染后机体免疫细胞产生的一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤等作用。科研人员利用大肠杆菌构建干扰素工程菌，下图是部分单链DNA序列，回答下列问题：
(1)从相应细胞中提取mRNA后，在________________酶的作用下获得cDNA。也可以直接从细胞中粗提取DNA，DNA不溶于酒精，但溶于___mol/L的NaCl溶液。
题号
1
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7
9
逆转录
2
(2)通过PCR技术扩增干扰素基因时，所需引物序列的前9个核苷酸为____________________________和_________________________，所需的酶为________________________________。
(3)构建基因表达载体时，需要选择合适的启动子，其作用是_________________________________________________________。若目的基因以图中单链为转录模板链，启动子应该与目的基因的_______(填“左侧”或“右侧”)连接。
题号
1
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9
5′-GGTCAACAA-3′
5′-TAAACTTCA-3′
耐高温的DNA聚合酶
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
右侧
(4)使用一种限制酶切割目的基因和载体后，会存在目的基因的正向或反向两种连接产物，________________(填“可以”或“不可以”)通过电泳来区分两种产物，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________________________________________ (列举两点)等有关。
题号
1
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9
不可以
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
[解析] (1)mRNA在逆转录酶的作用下获得cDNA；DNA溶于
2 mol/L的NaCl溶液。
(2)由于子链合成的方向是由子链的5′端向3′端延伸，引物选择如箭头所示
根据碱基互补配对原则，引物为5′-GGTCAACAA-3′和5′-TAAACTTCA-3′。PCR需要耐高温的DNA聚合酶。
题号
1
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7
9
(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录。若目的基因以图中单链为转录模板链，且转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，故启动子应该与目的基因的右侧连接。
(4)琼脂糖凝胶电泳可对DNA分子大小进行鉴定，凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，目的基因的正向或反向两种连接产物分子大小一致，无法通过电泳区分。
题号
1
3
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2
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6
8
7
9
9．(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有___________________________，扩增程序中最主要的不同是_________。
(2)有关基因序列如图2。引物F2 -F、F1 -R应在下列选项中选用___。
A．ATGGTG……CAACCA
B．TGGTTG……CACCAT
C．GACGAG……CTGCAG
D．CTGCAG……CTCGTC
题号
1
3
5
2
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8
7
9
模板(片段F1、片段F2)、引物
复性温度
CD
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
题号
1
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9
限制酶和DNA连接酶
ABC
(5)为了验证平
第一部分 专题素能提升
模块五 生物技术与工程
专题(十三) 基因工程
核心整合篇
01
核心整合练A卷
02
核心整合练B卷
03
热点拓展篇
04
热点拓展练
05
核心整合篇
1．基因工程的基本工具
提醒：两种不同的限制酶切割不同的DNA片段，产生相同的黏性末端，这两种限制酶称为同尾酶。
磷酸二酯键
T4 DNA连接酶
2．基因工程的基本操作程序
PCR
RNA聚合酶识别和结
合的部位
农杆菌转化法
显微注射技术
提醒：①目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入在启动子与终止子之间。当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要利用特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。②鉴定目的基因的插入与转录，可使用PCR技术或分子杂交技术。
3．蛋白质工程
基因合成
新的
蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
4．DNA的粗提取与鉴定
5．PCR技术
6．DNA片段的电泳鉴定
提醒：DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
①电泳缓冲液维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率。②凝胶载样缓冲液(内含指示剂)主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置，有助于判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。③核酸染料是用来染色DNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带。
1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
√
B [限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。]
2．(2024·江西卷)γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E．coliA，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB。下列叙述正确的是( )
A．上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B．E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ-氨基丁酸
D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
A [题意显示，研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E．coliA，说明可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，A正确；题意显示，用L-谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一，E．coliB中能表达L-谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E．coliB发酵生产γ-氨基丁酸，该过程中L-谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E．coliA构建高效生产γ-氨基丁酸的菌株E．coliB，E．coliA和E．coliB均不能高效降解γ-氨基丁酸，C错误；据题中信息无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒，D错误。]
3．(2024·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
√
A [在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。]
命题延伸 判断与表达
(1)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生。(2021·湖北卷T16) ( )
(2)基因工程中常用噬菌体转化植物细胞。(2021·辽宁卷T3) ( )
√
提示：基因工程中常用农杆菌转化植物细胞。
(3)利用蛋白质工程技术在N0(腈水合酶)的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现。(2021·辽宁卷T14) ( )
×
√
(4)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物。(2021·山东卷T13) ( )
提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。
×
(5)粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(2023·江苏卷T9) ( )
×
提示：粗提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色。
(6)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_________________________
_______________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。(2022·山东卷T25)
能与P基因母链的一段碱基序
列互补配对、短单链核酸
5′端
(7)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是________________。(2019·江苏卷T33)
乙、丙
目的基因反向连接
(8)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是农杆菌细胞内含有Ti质粒，_____________________________________________________
_____________________________。(2023·海南卷T20)
Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
题组1 基因工程及其应用
1．(2024·湖北八市联考)HA蛋白是禽流感病毒的重要抗原。鸡卵清蛋白是由输卵管上皮细胞中卵清蛋白基因特异性表达后分泌至输卵管内，参与构成鸡蛋清的蛋白质。下图是利用基因工程技术制备HA蛋白鸡输卵管生物反应器的过程。几种可供选择的限制酶识别序列如下，下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．①为逆转录过程，该过程需要逆转录酶、4种游离的脱氧核苷酸等组分
B．目的基因与鸡卵清蛋白基因启动子拼接前应先在目的基因两端分别引入HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列
C．利用PCR技术扩增目的基因时，复性温度偏低、引物特异性差均可导致产物中出现部分非目标序列
D．基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法
2
4
1
3
题号
5
√
B [图中①以禽流感病毒RNA形成目的基因DNA过程，为逆转录过程，需要的酶是逆转录酶，逆转录合成的是DNA，需要4种脱氧核苷酸作为原料，A正确；目的基因两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列，进而使目的基因能够与鸡卵清蛋白基因启动子、载体正确连接，构建基因表达载体，B错误；PCR技术扩增目的基因时，若复性温度偏低，则可能导致引物与非目的基因序列部分配对，进而扩增出非目标序列，引物特异性差也会导致和非目的基因序列部分配对，导致产物中出现部分非目标序列，C正确；受体细胞为动物细胞时通常采用显微注射法，因此基因表达载体导入受精鸡胚的胚盘可以使用显微注射法，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
2．(2024·安徽合肥三模)AK、DHDPS是玉米中合成赖氨酸的两种关键酶，赖氨酸达到一定浓度就会与两种酶结合抑制它们的活性，如图所示，因此玉米中赖氨酸含量比较低。将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，该变化影响了其与赖氨酸的结合，使玉米叶片和种子内游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。下列有关分析错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．玉米中赖氨酸含量比较低与负反馈调节密切相关
B．要替换AK、DHDPS中的氨基酸需要通过改造相应基因来实现
C．改造后的AK和DHDPS与赖氨酸的结合能力增强
D．改造后的AK和DHDPS的空间结构发生改变
2
4
1
3
题号
5
√
C [由题可知，赖氨酸与AK、DHDPS结合，抑制它们的活性，属于负反馈调节，A正确；根据题意“将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸”可知，该操作为蛋白质工程，蛋白质工程的实质是改造相应基因来实现的，B正确；由题分析可知，将AK中第352位苏氨酸变成异亮氨酸，DHDPS中第104位天冬酰胺变成异亮氨酸，会导致改造后的AK和DHDPS的空间结构发生改变，与赖氨酸的结合能力降低，C错误，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
3．(2024·湖南长沙一模)研究人员从分解纤维素的细菌(A菌)中提取出一种纤维素酶基因(CBHⅡ)并进行PCR扩增，然后与高效表达载体pUT质粒(图1)连接构建成重组质粒并导入A菌，从而获得分解纤维素能力更强的工程菌(B菌)。请回答下列问题：
2
4
1
3
题号
5
2
4
1
3
题号
5
限制酶 识别序列及酶切位点
BglⅡ
BstEⅡ
SacⅠ
MspⅠ
BamHⅠ
几种限制酶识别序列及酶切位点
(1)构建成重组质粒时，应选择限制酶________________对pUT质粒进行酶切，经酶切后形成了两个DNA片段(X和Y)，X两端的黏性末端分别为-CTAG和-CAATG，则Y两端的黏性末端分别为-CTAG和________。
(2)CBHⅡ基因中无上述限制酶的酶切位点，两端需添加相关酶切位点才能在酶切后与pUT质粒连接，因此在扩增CBHⅡ基因时，需要在两种引物的______ (填“5′”或“3′”)端分别添加相应限制酶的识别序列。
2
4
1
3
题号
5
BglⅡ、BstEⅡ
-CATTG
5′
(3)为鉴定重组质粒是否构建成功以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素____(填“M”或“N”)的培养基上培养，将3个不同菌落扩大培养后提取质粒分别进行双酶切并进行电泳，结果如图3所示(片段过小时检测不到条带)。据图分析，菌落__________中成功导入了重组质粒。
2
4
1
3
题号
5
N
2、3
(4)为检测B菌的纤维素分解能力，将含有20%纤维素的培养基分为三组，进行不同处理后，在相同条件下培养一段时间，测定培养基内纤维素含量，结果如图4所示，对照组2的处理为接种______________，说明___________________________________。
2
4
1
3
题号
5
A菌
B菌分解纤维素能力比A菌更强
[解析] (1)需要将目的基因插入高效启动子之后，至少保留一个标记基因M或N，故选择BglⅡ、BstEⅡ对质粒进行酶切。根据表格中BstEⅡ识别序列和切割位点，X一端的黏性末端为-CAATG，则Y一端与之互补的为-CATTG。(2)引物是从子链的5′端往3′端方向延伸，为了能让扩增出的目的基因与载体正确连接，则需要在引物的5′端分别添加相应限制酶的识别序列。(3)BstEⅡ和BglⅡ破坏了抗生素M抗性基因，但保留了抗生素N抗性基因，因此为鉴定重组质粒是否构建成功，以及是否成功导入A菌，将其接种在含抗生素N的培养基上培养，图3为琼脂糖凝胶电泳图谱，由CBHⅡ基因大小可知，菌落2和3扩增出了目的基因，说明成功导入了重组质粒。(4)对照组1为空白对照，对照组2应为接种A菌，由柱状图长短可知，B菌分解纤维素能力比A菌更强。
2
4
1
3
题号
5
4．(2024·河北衡水模拟)现用新鲜的加入抗凝剂的鸡血来进行DNA的粗提取和鉴定实验，其过程如图所示。下列说法错误的是( )
2
4
1
3
题号
5
A．在实验材料的选择上，鸡血细胞比菜花细胞更容易吸水涨破
B．图①和图③中均用到了搅拌，但搅拌的力度和速度均不同
C．图③利用DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精的原理粗提取DNA
D．图④甲试管中加入的是清水和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化
2
4
1
3
题号
5
√
D [动物细胞没有细胞壁，因此鸡血细胞相对于菜花细胞更容易吸水涨破，A正确；图①搅拌的目的是加速吸水后的细胞破碎，因此力度和速度较大，图③搅拌的目的是使析出的DNA缠绕在玻璃棒上，搅拌时力度小、速度缓，B正确；DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离，C正确；图④甲试管中加入的是2 mol/L NaCl溶液和二苯胺试剂，沸水浴后不会出现颜色变化，D错误。]
2
4
1
3
题号
5
5．(2023·山东潍坊三模)下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验的说法，错误的是( )
A．放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部
B．配置琼脂糖溶液时，需要根据DNA片段的大小调节琼脂糖浓度
C．电泳时需要的两种缓冲液分别含有核酸染料和指示剂
D．电泳时，需要根据电泳槽阳极至阴极之间的距离设定电压
√
2
4
1
3
题号
5
C [使用PCR技术的具体操作顺序：按配方准备好各组分→用微量移液器将各组分依次加入微量离心管中→离心使反应液集中在离心管底部→设计好PCR仪的循环程序→进行PCR反应，因此放入PCR仪前，需要对离心管进行离心，使反应液集中在底部，A正确；PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段的大小配制一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子，B正确；凝胶载样缓冲液内含指示剂，琼脂糖溶液加入核酸染料，电泳缓冲液不含有核酸染料，C错误；接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5 V/cm，D正确。]
2
4
1
3
题号
5
1．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
核心整合练(十三) 基因工程[A卷]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
D [若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
2．(2024·安徽合肥三模)科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图，其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，下列叙述正确的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．构建基因表达载体时，最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B．利用PCR技术扩增抗冻基因，需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C．Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D．利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
C [使用限制酶Ⅱ会破坏Vir区的基因，Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移，是T-DNA转移整合到受体细胞的染色体DNA上必不可少的，不能选择限制酶Ⅱ，A错误；使用PCR技术扩增抗冻基因，只需要知道抗冻基因两端碱基序列设计引物即可，B错误；农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞并整合到该细胞的染色体DNA上，所以Vir区的基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上，C正确；为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，最好在培养基中添加四环素，可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
3．(2024·河北衡水模拟)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，是一个高度保守且和细胞生长、死亡等功能有关的蛋白。现从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，插入表达质粒pGEX-4T-2上构建基因表达载体，最终表达有活性的dTCTP融合蛋白。关于该基因表达载体的构建，下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．表达质粒pGEX-4T-2可以用限制酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ进行双酶切
B．dTCTP基因是该项研究中的目的基因
C．除了目的基因和标记基因外，该基因表达载体还必须有启动子和终止子
D．将dTCTP基因插入表达质粒pGEX-4T-2上时，需要用到DNA聚合酶
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
D [dTCTP基因经限制酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，因此一般需要相同的限制酶切割载体，产生相同的黏性末端，A正确；由题意知，从果蝇基因组DNA中扩增果蝇dTCTP基因，最终获得dTCTP融合蛋白，故dTCTP基因是该项研究中的目的基因，B正确；基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，C正确；利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体切口处，构建基因表达载体，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
4．(2024·辽宁丹东二模)利用AI(人工智能)破解蛋白质结构和功能之谜，建立蛋白质数据库，并在此基础上进行蛋白质结构设计和优化，会给未来蛋白质工程的发展带来翻天覆地的变化。关于该技术的实施下列说法错误的是( )
A．用AI预测新型蛋白质的基因结构应依据中心法则原理
B．可以通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质
C．根据设计的某种蛋白质的氨基酸序列推理的基因序列中包含启动子和终止子
D．用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，原因是密码子的简并
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
C [用AI预测新型蛋白质的基因结构依据的原理是中心法则，从蛋白质结构反推出氨基酸序列，再反推出相应的基因序列，A正确；对蛋白质的改造是通过改造或合成基因来完成的，B正确；启动子和终止子为非编码区，故由氨基酸序列推理的基因序列中不包含启动子和终止子，C错误；因为一种氨基酸可能对应多种密码子(密码子的简并)，故用蛋白质的氨基酸序列推测的RNA编码序列有多种可能，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
5．(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
D [研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可初步分离DNA，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
6．(2024·辽宁沈阳模拟)某实验小组设计了快速检测餐饮食品中金黄色葡萄球菌的方法，主要包括无菌采样、培养基预增菌、煮沸法提取DNA 和实时荧光 PCR技术特异性检测四个步骤。下列叙述错误的是( )
A．培养基预增菌可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长
B．提取DNA时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中离心后采集上清液
C．可根据金黄色葡萄球菌基因组的保守序列设计两种引物，两引物的序列不互补
D．为满足PCR反应的需求，需控制复性温度及添加 Mg2+以保证DNA的稳定增长
√
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
B [培养基预增菌，目的是增加待测菌的数量，可以通过保持营养的稳定供给使所提取的菌株均能正常生长，A正确；提取DNA时需将金黄色葡萄球菌的培养液放入离心机中进行离心，将上清液去除后对菌体进行采集，B错误；两种引物分别和目的基因的两端的序列互补，两引物的序列不互补，C正确；为满足PCR反应的需求，需控制复性温度及添加Mg2+以保证DNA的稳定增长，D正确。]
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
7．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的_______________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
碳源、氮源
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为__________________，理由是_________
_____________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
PT7、PBAD和PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为____________________________ (答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________________________________________
_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：_____________________________________。
[解析] (1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶
(2)据题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与pMag-T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(4)由(2)分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)由(2)分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
8．(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。
回答下列问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为___________
__________启动子。Nos为终止子，其作用________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
在胚乳中特
异性表达的
终止转录
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
(2)利用________________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测______________，通过______________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为____。选择纯合体进行后续研究的原因是____________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
农杆菌转化
r2HN的mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合体自交后代不发生性状分离
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和_____免疫。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
体液
细胞
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_____________
__________________________________________。(答出两点即可)
[解析] (1)若使r2HN仅在水稻胚乳表达，则Gtp应为在胚乳中特异性表达的启动子。Nos为终止子，终止子可以终止转录。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。KpnⅠ破坏了启动子序列不能选用，SacⅠ位于终止子序列之外不能选用，则为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测r2HN的mRNA，可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。单一位点插入目的基因的植株相当于杂合子，杂合子自交，后代含有r2HN基因的纯合子为1/4。由于纯合体自交后代不发生性状分离，具有遗传的稳定性，所以选择纯合体进行后续研究。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(4)据图可知，实验组的抗体水平和CD8＋T细胞水平都比对照组高，说明通过体液免疫产生了抗体，通过细胞免疫产生了细胞毒性T细胞，即r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
(5)通过水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗具有不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高等优点。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
9．(2024·湖北荆州三模)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态
变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一
的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白
(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化
的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。
无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建
荧光探针表达载体的过如下图。请回答下列
问题：
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
注：bar为草胺膦抗性基因；Kanr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿______(填“5′→3′”或“3′→5′”)的方向水解DNA，形成黏性末端。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是___________________
_________________________________________________________。
(2)过程②两个片段复性后存在“缺口”，因此过程③所需的酶有_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
5′→3′
降低酶活性，防止过
DNA聚合酶和DNA连接酶
度水解DNA
(3)PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是__________________
_________________________________________________________，有时需要在引物的一端增加限制酶的酶切位点，目的通常是_________________________________________________________。PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。据图分析扩增目的基因片段时，所用的引物F1和R2可对应下表中的_________(填序号)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
便于目的基因与载体连接
①④
① 5′ -TCCGGACTCAGATCTCGAGC 3-′
② 5′ -AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTA -
ACTAGTCTTAGTGGCGTC -3′
③ 5′ -TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATG -
GTGAGCAAGGGCGA- 3′
④ 5′- GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTG TACAGCTCGTCCA -3′
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(4)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含________________的MS培养基上进行筛选和鉴定，将筛选得到的种子种植，可得到转基因拟南芥，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__________________，了解PA的分布和含量。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
草胺膦
绿色荧光点的分布
[解析] (1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。
(2)过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端大于互补配对的区段(同源序列)，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将游离的单个脱氧核苷酸加到子链3′末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。
题号
1
3
5
2
4
6
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9
(3) PCR技术中通常要设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，有时需要在引物的一端增加限制酶的酶切位点，目的通常是便于目的基因与载体连接。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的基因片段的引物F1对应于表中的①。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的④。
题号
1
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9
(4)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子进行表面消毒，均匀铺在含草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的分布和含量。
题号
1
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9
(教师用书独具)
(2024·湖北武汉二模)水中物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，下图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
A．根据题意可知斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B．用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C．用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D．基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
√
B [将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，推测斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体，A正确；结合题图，ERE诱导Gal4转录，其翻译产物Gal4蛋白与UAS结合驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B错误；用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D正确。]
√
1．(2023·广东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
核心整合练(十三) 基因工程[B卷]
题号
1
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D [裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；粗提取的DNA通过分离，可以去除混合物中的多糖、蛋白质等，B正确；根据DNA和蛋白质等杂质的溶解度差异，可以反复多次沉淀来提高DNA的纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl溶液，加入二苯胺试剂，混合均匀后，沸水中加热五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。]
题号
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2．(2024·浙江杭州模拟)某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因A1、A2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A3的基因频率是( )
A．52% B．27%
C．32% D．2%
√
题号
1
3
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9
B [据图可知，该动物种群中基因型为A3A3的有2个，A2A2的有8个，A1A1的有9个，A1A3的有15个，A1A2的有31个，A2A3的有35个，A3的基因数为2×2＋15＋35＝54，则种群中A3的基因频率为54÷200×100%＝27%，B正确，A、C、D错误。]
题号
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9
3．(2024·湖北武汉一模)人乳铁蛋白(hLF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白(hLF)基因转入到山羊体内，从山羊的乳汁中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是( )
A．可用PCR直接扩增人乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是山羊乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
√
题号
1
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9
A [不可以直接用PCR扩增mRNA，需将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，A错误；为保证在供体山羊的乳汁中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C正确；为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因已翻译形成蛋白质，D正确。]
题号
1
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4．(2024·广东广州模拟)紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)。紫色花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素基因(S)的cDNA(某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA)和Ti质粒图。下列叙述错误的是( )
题号
1
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9
A．由图可知，最好选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒
B．在用农杆菌侵染时，常要使用一些抗生素，其目的一是抑制农杆菌生长，二是筛选转化细胞
C．用于扩增 S基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链 3′端的碱基序列互补配对
D．若检测出标记基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞
题号
1
3
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9
√
D [由图可知，最好选用XbaⅠ、 Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒，既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因，A正确；在用农杆菌侵染时，既要让农杆菌Ti质粒上的T-DNA整合到植物细胞的染色体DNA上，又要避免农杆菌的大量繁殖，因此培养基中通常加入抗生素，B正确；用于扩增S基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对，以保证子链从5′端向3′端延伸，C正确；若检测出目的基因所表达的性状，则说明重组质粒已经成功导入西红柿细胞，D错误。]
题号
1
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9
5．(2024·湖北黄石一模)如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的是( )
题号
1
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9
A．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
B．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因
D．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
题号
1
3
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9
√
B [根据GNA-ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A正确；由于重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B错误；雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因，C正确；图中质粒与GNA-ACA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D正确。]
题号
1
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9
6．(2024·北京昌平期末)科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，检测原理(a、b)及结果(c)如下图。下列叙述错误的是( )
题号
1
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9
A．需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针
B．图中b是PCR反应的复性过程
C．多重PCR同时完成对4种病原体的检测
D．由结果推测该检测样品中有A病原体的核酸
题号
1
3
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√
B [不同的病原体的碱基序列是不同的，因此需要根据病原体的碱基序列设计不同的特异性引物和荧光探针，A正确；图中b是PCR反应的延伸过程，该过程中发生合成子链的过程，B错误；科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术，由图c可知，多重PCR同时完成对(A、B、C、D)4种病原体的检测，实验组中B、C、D的剩余探针荧光强度与阴性对照组相似，说明该检测样品中没有B、C、D病原体的核酸，实验组中A的剩余探针荧光强度与阴性对照组不同，说明该检测样品中有A病原体的核酸，C、D正确。]
题号
1
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9
7．(2023·辽宁卷)天然β-淀粉酶大多耐热性差，不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造β-淀粉酶基因，并将改造的基因与pLN23质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的β-淀粉酶。回答下列问题：
(1)上述过程属于_________工程。
题号
1
3
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2
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9
蛋白质
(2)PCR中使用的聚合酶属于________________(填写编号)。
①以DNA为模板的RNA聚合酶
②以RNA为模板的RNA聚合酶
③以DNA为模板的DNA聚合酶
④以RNA为模板的DNA聚合酶
题号
1
3
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9
③
(3)某天然β-淀粉酶由484个氨基酸构成，研究发现，将该酶第476位天冬氨酸替换为天冬酰胺，耐热性明显提升。在图1所示的β-淀粉酶基因改造方案中，含已替换碱基的引物是________(填写编号)。
题号
1
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8
7
9
②
(4)为了使上述改造后的基因能在大肠杆菌中高效表达，由图2所示的pLN23质粒构建得到基因表达载体。除图示信息外，基因表达载体中还应该有目的基因(即改造后的基因)和________________。
题号
1
3
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2
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8
7
9
标记基因
(5)目的基因(不含EcoRⅠ酶切位点)全长为1.5 kb，将其插入BamHⅠ位点。用EcoRⅠ酶切来自不同大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是__________________________。正确连接的基因表达载体被EcoRⅠ酶切后长度为__________kb。
(6)采用PCR还能在分子水平上确定目的基因是否转录，根据中心法则，可通过________________反应获得PCR的模板。
题号
1
3
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7
9
筛选导入目的基因的大肠杆菌
5.7
逆转录
[解析] (1)根据蛋白质的功能改变基因的结构，最终获得耐高温的β-淀粉酶，这属于蛋白质工程。
(2)PCR的原理是DNA双链复制，使用的聚合酶是以DNA为模板的热稳定的DNA聚合酶。
(3)根据β-淀粉酶的编码序列，替换的碱基在编码序列中，则利用的引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②③。含已替换碱基的引物是②。
题号
1
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9
(4)作为基因工程载体的质粒应该包含：复制原点、限制酶的切割位点、标记基因、启动子和终止子，根据图示的表达载体可知，应还要包括目的基因和标记基因。
(5)目的基因通过表达载体导入大肠杆菌中，大肠杆菌菌落的质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定DNA片段长度，这一操作的目的是筛选出导入目的基因的大肠杆菌。正确连接的基因表达载体只有一个EcoRⅠ酶切位点，则切割后的长度为4.2＋1.5＝5.7 kb。
(6)转录是以DNA为模板合成RNA的过程，通过PCR在分子水平上确定目的基因是否转录，则需要以RNA为模板逆转录出cDNA作为PCR反应的模板。
题号
1
3
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9
8．(2024·广东佛山二模)瘦素是一种由脂肪组织合成和分泌的肽类激素。P载体含有的绿色荧光蛋白(GFP)基因能在真核细胞中表达GFP。将目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况。为研究瘦素的功能，科学家构建了瘦素基因真核表达载体，检测瘦素基因在小鼠成纤维细胞中的表达情况。瘦素基因及P载体的结构如图所示。回答下列问题。
题号
1
3
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2
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7
9
(1)PCR扩增瘦素基因时，与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的________________(填“5′”或“3′”)端。据图推测，构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、__________________________，以便与酶切后的瘦素基因正确连接。
题号
1
3
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2
4
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7
9
3′
Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位点
(2)已知Hind Ⅲ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近。为确定重组质粒是否构建成功，用Hind Ⅲ、BamHⅠ分别对瘦素基因PCR产物、P载体和重组质粒双酶切，再进行电泳，结果如图所示。若重组质粒构建成功，请在图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
题号
1
3
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6
8
7
9
(3)Kanr/Neor是一种抗性基因，在真核细胞中表达具有新霉素抗性，而在原核细胞中表达具有卡那霉素抗性。同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同，可能的原因是____________________________
_________________________________________________________。
本实验中为筛选转化的细胞，应在培养基中添加______________。
(4)为检测瘦素基因是否成功表达，可用的鉴定方法是______________________________________(答出2种)。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行______________。
题号
1
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9
Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子(或转录后的加工不同或翻译后的加工不同)
新霉素
抗原—抗体杂交技术、检测绿色荧光强弱
动物细胞培养
[解析] (1)引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，因此引物1左侧为5′端，DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链组成，因此与引物1互补的a链左侧是脱氧核苷酸链的3′端。构建该基因表达载体时，P载体上应有启动子、终止子、标记基因、复制原点、Hind Ⅲ和BamHⅠ切割位点，以便于酶切后的瘦素基因正确连接。
题号
1
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8
7
9
(2)由于Hind Ⅲ和BamHⅠ在P载体上的切割位点非常接近，因此用Hind Ⅲ、BamH Ⅰ对P载体进行切割后，会形成一个大片段，接近4 700 bp，一个超小片段可忽略，即对P载体酶切产物电泳后，只出现接近4 700 bp的条带，若重组质粒构建成功，重组载体上会携带瘦素基因，用Hind Ⅲ、BamHⅠ对重组质粒切割后，会出现两个片段，一个是瘦素基因，一个是接近4 700 bp的片段，则电泳结果会出现两个条带，如图所示：
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
(3)Kanr/Neor抗性基因在真核与原核细胞中有不同的启动子或转录后的加工不同或翻译后的加工不同，因此同种基因在真核、原核细胞中表达结果不同。本实验中受体细胞为小鼠成纤维细胞，为真核细胞，则Kanr/Neor在真核细胞中表达具有新霉素抗性，为筛选转化的细胞，应在培养基中添加新霉素，能存活的细胞为导入重组质粒的受体细胞。
题号
1
3
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6
8
7
9
(4)瘦素基因表达产物为蛋白质，因此可以用抗原—抗体杂交技术检测瘦素基因是否成功表达，同时目的基因插入GFP基因后，能表达出目的蛋白和GFP的融合蛋白，根据荧光的强弱，可确定目的基因在细胞内的表达情况，即可以检测绿色荧光的强弱。为进一步获得更多能表达融合蛋白的细胞，还需要进行动物细胞培养。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
9．(2024·湖北宜昌一模)科研人员构建了可表达WRK10-MYC 融合蛋白的重组农杆菌Ti质粒并成功转化植物细胞得到转基因植株，该质粒的部分结构如图1所示，其中Kan为卡那霉素抗性基因，Hyg为潮霉素抗性基因，MYC标签序列编码标签短肽MYC，WRK10蛋白为转录因子，可与图2中PIF4基因启动子某区段结合并激活该基因的转录。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(1)将重组农杆菌Ti质粒导入农杆菌时，需用Ca2+处理农杆菌，其目的是_____________________________________________________。
(2)将农杆菌浸泡过的植物愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入______________(填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素和卡那霉素”)进行筛选。
题号
1
3
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2
4
6
8
7
9
使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
潮霉素
(3)已知利用LP和RP扩增结果为大带，BP和RP扩增结果为小带。可用图中三种引物进行两次PCR扩增和________________方法鉴定转基因植物后代中的纯合转基因植株，PCR扩增时加入dNTP的目的是________________，其中BP引物和_____链对应碱基序列相似。T- DNA插入植物染色体DNA 分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，则纯合转基因植株PCR产物的检测结果为____(填“大带”“小带”或“大带和小带”)。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
琼脂糖凝胶电泳
提供原料和能量
a
小带
(4)为了探究WRK10蛋白与PIF4基因启动子结合的具体区段(如图2所示)，科研工作者利用短肽MYC抗体处理了对应的基因表达产物，后经一系列过程，得到图3所示的结果，由此推测转基因植株体内WRK10蛋白激活PIF4基因的表达的机制是_________________
_________________________________________________________。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
红光条件下WRK10
蛋白能够结合PIF4基因启动子的W12区段
MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是___________________
_________________________________________________________。
[解析] (1)Ca2+处理农杆菌的目的是使农杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以便后续将基因表达载体导入受体细胞。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
与 MYC抗体结合，便于检测、示踪WRK10基因有无表达
(2)卡那霉素抗性基因在启动子与终止子以外，无法表达，因此将农杆菌浸泡过的植物愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入潮霉素进行筛选。
(3)PCR扩增结果需要用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，加入dNTP的目的是提供原料和能量，BP和RP扩增结果为小带，BP引物和b 链结合，因此BP引物和a链对应碱基序列相似。如图， BP位点在T DNA片段上，又因为T- DNA插入植物染色体DNA分子后会抑制原插入位点两侧引物的扩增产物的出现，故纯合转基因植株PCR检测结果为BP和RP扩增的小带。
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
(4)由实验结果分析，红光下处理时， MYC抗体阳性组PIF4基因表达量很高，推测转基因植株体内WRK10蛋白激活PIF4基因的表达的机制是红光条件下WRK10蛋白(转录因子)与PIF4基因启动子的W12区段结合，从而激活该基因的表达。 MYC标签序列编码的标签短肽MYC的作用是与MYC抗体结合，便于对WRK10蛋白表达的检测、示踪。
题号
1
3
5
2
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6
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9
(教师用书独具)
(2023·浙江6月卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3 -GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
√
B [分析图甲可知，启动子在左侧，Gata3-GFP基因在右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向为从左向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，不能区分杂合子和纯合子，D错误。]
热点拓展一 同尾酶
1．同尾酶定义
同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶，一般是指能产生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。在构建基因表达载体的过程中，若选择的某种限制酶会破坏目的基因或质粒的重要片段时，可尝试使用该酶的同尾酶进行切割。
热点拓展篇
这样用同尾酶进行体外重组时，在限制酶切割反应之后不必将原有的限制酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中原有的限制酶的存在，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷酸反应而得到最高的连接效率，即不需要将5′端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。
拓展应用
(2024·湖南雅礼中学模拟)像Bcl Ⅰ MboⅠ
这样，识别序列不同，但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割，并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是( )
选项 切割质粒 切割目的基因 结果分析
A BclⅠ和BglⅡ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B BclⅠ和BglⅡ MboⅠ 切割后的质粒不可自我环化，切割后的目的基因可以自我环化
C MboⅠ BclⅠ和BglⅡ 形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开，但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D MboⅠ MboⅠ 切割后的质粒可以自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化
√
B [切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ，由于两种酶切割后产生的黏性末端相同，形成重组质粒时目的基因可能反向连接，形成的碱基排列顺序不一定相同，A正确。切割质粒用BclⅠ和BglⅡ，切割后产生的黏性末端相同，切割后的质粒可能自我环化；切割目的基因用MboⅠ，切割后产生黏性末端，切割后的目的基因可以自我环化，B错误。切割质粒用MboⅠ，产生黏性末端，切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ，产生黏性末端，形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列可能发生改变，不能再被这两种酶切割，但不影响MboⅠ的作用，C正确。切割质粒用MboⅠ，切割目的基因用MboⅠ，产生的均为黏性末端，切割后的质粒可自我环化，切割后的目的基因也可以自我环化，D正确。]
热点拓展二 启动子与转录调控
1．启动子的类型
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
启动子对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。
参照转录调控模式，启动子又可以分：
(1)组成型启动子，该类启动子能够调控结构基因的表达基本恒定在一定程度上，在不同部位或组织表达水平差异不明显。
(2)组织特异型启动子，该类启动子的调控作用使得基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器使用的即为乳腺细胞中特异表达基因的启动子。
(3)诱导型启动子，即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类型启动子调控下大幅度地提升。目前已经分离了众多启动子如热诱导表达基因、光诱导表达基因、创伤诱导表达基因、真菌诱导表达基因和共生细菌诱导表达基因启动子等。
2．启动子位置及转录模板链的判断
基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链？答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须要明确以下三个要素：
(1)链方向
(2)链性质(编码链或模板链)
(3)功能区域(启动子或终止子)
确定其中2个要素即可确定第3个要素。
举例分析如下：
①基于图2中模板链①及其方向，判断启动子的位置。
由于转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，转录过程的发生是从启动子到终止子，则推导出非编码区2为启动子。
②基于图3中启动子位置及DNA链的方向，判断模板链位置。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录产生的RNA新链的合成方向为5′→3′，且与模板链反向平行，推导出②为该基因的模板链。
③基于图4中的模板链(①)及启动子位置，判断DNA链的方向。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录出来的mRNA的5′端位于左侧，3′端位于右侧，由于①为模板链，其与转录产生的mRNA互补，且反向平行，所以①的方向从左至右为3′→5′，②的方向从左至右为5′→3′。
拓展应用
(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________________
_________________ (答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的______(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
RNA聚合酶
限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等
F2和R1(或F1和R2)
a链
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
[解析] (1)基因表达载体的构建中启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
J-V5融合蛋白
不是
(2)用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时，常设计一对引物，一个引物与目的基因序列互补，另一个引物与质粒序列互补，两引物延伸方向相反，以扩增出两引物间的序列，若插入方向正确，则可扩增出相应序列，反之，则不能扩增出相应序列，故选用的引物应为F2和R1(或F1和R2)，若选用引物F1和R1，不论目的基因插入方向是否正确，都可扩增出目的基因序列。因为J基因的b链为转录的模板链，启动子在左侧，所以转录方向为从左到右，由于转录沿模板链3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b链左侧为3′端，引物要与DNA的3′端互补配对，所以F1与b链互补，a链也与b链互补，由此推知引物F1与a链相应部分序列相同。
(3)抗J蛋白抗体和抗V5抗体均能检测到条带1，说明条带1为J-V5融合蛋白，条带2仅能由抗J蛋白抗体检测到，说明该蛋白仅含J蛋白，不含V5标签，故条带2检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
热点拓展三 Southern印迹杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。其原理为利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链 DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的放射性同位素标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Southern印迹杂交实验可以帮助研究人员检测特定DNA序列的存在和数量，可应用于基因表达研究、基因组学、医学诊断等领域。
实验操作步骤如下：
一、DNA样品准备：从组织或细胞中提取基因组DNA，使用一种或多种限制酶对基因组DNA进行切割，将其消化成大小不同的片段。
二、DNA电泳分离：制备琼脂糖凝胶，在恒定电压下，将切割后的DNA片段上样至琼脂糖凝胶中，进行电泳分离。电泳时间根据DNA片段的大小和凝胶浓度而定，以确保DNA片段按分子量大小在凝胶中形成清晰的条带。
三、DNA变性和转膜：将电泳后的凝胶浸泡在变性溶液中(如0.25 mol/L HCl和碱性溶液)，使DNA变性并断裂成单链片段。将变性后的凝胶上的DNA片段转移到固相支持物上，如硝酸纤维素膜或尼龙膜。在转膜过程中，需要保持DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一致。
四、DNA固定：将载有DNA片段的膜进行固定处理，以防止DNA在后续步骤中脱落。常用的固定方法有紫外线照射或干烤等。
五、探针标记与杂交：使用同位素(如放射性同位素)或非同位素(如地高辛)标记方法制备特异性探针。将固定好的膜置于预杂交液中，将标记好的探针加入预杂交液中，与膜上的DNA片段进行杂交反应。
六、洗膜与检测：洗去未与DNA片段结合的游离探针。根据探针的标记方法选择合适的检测方法。对于放射性同位素标记的探针，通常采用放射自显影进行检测；对于非同位素标记的探针，则可以使用相应的显色系统(如地高辛特异抗体检测系统)进行检测。
拓展应用
(2024·湖南常德模拟)Southern印迹
杂交是进行基因组DNA特定序列定位
的通用方法。其基本方法是利用琼脂
糖凝胶电泳分离经限制酶消化的DNA
片段，将凝胶上的DNA变性并在原位
将单链DNA片段转移至硝酸纤维素膜
上并固定，再与放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子。根据信息判断，下列说法中错误的是( )
A．限制酶消化DNA片段时破坏了相邻两个核苷酸分子之间的磷酸二酯键
B．转移至硝酸纤维素膜上的DNA片段中有2个游离的磷酸基团
C．标记探针与硝酸纤维素膜上的DNA分子部分碱基序列互补
D．可用Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因
√
B [限制酶切割DNA分子内部核苷酸分子之间的磷酸二酯键，A正确；转移至硝酸纤维素膜上的 DNA片段是单链DNA分子，其中有1 个游离的磷酸基团，B错误；核酸探针通过氢键与待检测基因片段进行连接，进行碱基互补配对，C正确；放射性标记的探针进行杂交，利用放射自显影检测特定DNA分子，可用 Southern印迹杂交法从基因组文库中获取目的基因，D正确。]
热点拓展四 PCR技术拓展
1．实时荧光定量RT-PCR技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
3．PCR定点突变——大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，
这三条引物分别是突变上游引物、常规上游
引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变
上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不
完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮
PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作
为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增
得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5．巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。
拓展应用
1．(2024·黑龙江大庆模拟)常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是( )
A．酶切阶段，L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列
B．环化阶段，可选E．coli DNA连接酶而不能选T4 DNA连接酶
C．应选择引物2和引物3进行PCR，且二者之间不能互补配对
D．PCR扩增，每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状
√
A [在酶切阶段，已知序列L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列，不然会将已知序列L切断，造成序列识别混乱，A正确；T4 DNA连接酶或E．coli DNA连接酶都可以用来连接黏性末端，因此环化阶段，可选用E．coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶，B错误；PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者之间不能互补配对，C错误；PCR的扩增只需要第一次循环前加入足够的限制酶，并不需要每轮都加入，D错误。]
2．(2024·广东湛江二模)研究发现，若将第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)，则可增强抗菌肽的抑菌性。抗菌肽基因的部分碱基序列及可供选择的引物如图1所示，箭头下方的数字代表碱基序号。现利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，过程如图2所示，其中Ⅰ为转录模板链，引物上的“ ”代表突变位点。改造过程中PCR2所使用的引物组合为( )
A．引物1和引物4
B．引物2和引物6
C．引物2和引物4
D．引物3和引物5
√
B [题图可知，利用重叠延伸PCR技术对DNA分子进行定点突变的过程中，通过PCR2获得产物CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3′端结合，因此引物d的序列为5′GTCACGTG，引物2符合该序列。现要利用重叠延伸PCR技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将mRNA上的第154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为A。因此引物c的碱基序列为5′CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B符合题意，A、C、D不符合题意。]
热点拓展五 基因组编辑技术
1．寡核苷酸介导的定点突变
寡核苷酸是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称，利用寡核苷酸可以实现不依赖PCR的定点突变。
(1)首先人工合成一段含有特定突变位点的单链寡核苷酸片段(除突变位点外，该片段的其他部分可以与目的基因互补配对)。
(2)然后将该寡核苷酸片段与带有目的基因的单链载体(通常由M13噬菌体衍生而来，内有一个环状单链DNA分子)进行杂交。
(3)继而在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下分别进行DNA链的合成和连接反应，得到含有突变位点的双链载体。
(4)最后将双链载体引入宿主细胞复制，并进行筛选和鉴定。
2．CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的一种免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，为它们提供获得性免疫。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具。其中最常见的是CRISPR/Cas9基因编辑技术。
(1)系统构成：向导RNA＋限制性内切核酸酶Cas9。由具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白和一条人为重组的一段目的基因的单链向导RNA(SgRNA)组成，向导RNA可以指导Cas9蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。
(2)编辑原理：向导RNA能与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对结合在一起，引导Cas9到特定的基因位点进行切割；通过设计向导RNA中的20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。根据CRISPR/Cas9精准攻击外源DNA的工作原理，就可以实现基因敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，就可以实现基因的定点突变。
3．重叠延伸PCR技术、大引物PCR技术(见热点拓展四)
拓展应用
1．定点突变技术是按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。其中一种方法是利用寡核苷酸链介导的定点突变，过程如图所示。下列关于利用寡核苷酸链介导的定点突变技术的叙述，错误的是( )
A．该技术的原理是基因发生碱基对的替换
B．过程①需要模板、原料、能量、酶等基本条件
C．过程②以寡核苷酸链延伸后的单链为模板
D．过程①②均遵循碱基互补配对原则
√
A [定点突变改变特定位点的核苷酸，先是诱变寡核苷酸引物上的碱基对发生替换、增添或缺失，随后经过延伸和复制，产生新的突变基因，A错误；该延伸过程属于DNA复制过程，需要模板、原料、能量、酶等基本条件，B正确；题图显示过程②为以寡核苷酸链延伸后的单链为模板合成互补DNA链的过程，C正确；延伸过程遵循碱基互补配对的原则，需要DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸，D正确。]
2．(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________。
DNA连接酶
Ca2+处理法
(3)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________________序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是_________________，基因敲除成功的判断依据是_______________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________。
碱基互补配对
目标(目的)DNA(基因)
DNA分子杂交技术
经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：____________________________________________________________________________________________________________________。
表达的Cas9蛋白和SgRNA，两者形成复合体，SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
[解析] (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法。
(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功。
(5)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
1．(2024·山东烟台期中)同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅠ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是( )
热点拓展练(十三) 基因工程
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大
C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，可以防止目的基因自身的环化
D．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被二者重新切开
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
B [BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A错误；使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大，不同的酶也能切割出相同的黏性末端，B正确；图中BamHⅠ、BglⅠ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，故选用两种不同的限制酶切割目的基因，不一定可以防止目的基因自身的环化，C错误；用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，不可被二者重新切开，D错误。]
题号
1
3
5
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9
2．(2024·浙江杭州二模)某研究小组构建了能表达ACTA1-GFP融合蛋白的重组质粒，该重组质粒的部分结构如下图所示。下列叙述错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
注：F1和F2表示上游引物，R1和R2表示下游引物。
A．RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达
B．仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确
C．ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与a链的部分序列相同
D．若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子
题号
1
3
5
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6
8
7
9
√
C [据图可知，ACTA1基因和GFP基因位于启动子和终止子之间，故RNA聚合酶与启动子结合，调控ACTA1基因和GFP基因的表达，A正确；仅用F2和R1一对引物，即可确定ACTA1基因插入方向是否正确，B正确；ACTA1基因转录的模板链是a链，引物F1与b链均可以和a链互补配对，因此引物F1与b链的部分序列相同，C错误；若用引物F2和R2进行PCR，能更好地区分ACTA1-GFP基因纯合子和杂合子，D正确。]
题号
1
3
5
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6
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9
3．(2024·江苏盐城模拟)常见的启动子可分为三类：组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达；诱导型启动子，通常在光、盐等信号作用下，使目的基因的转录水平有所提高。下列相关叙述错误的是( )
A．细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关
B．膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在诱导型启动子的下游
C．真核生物细胞中，一般一个启动子只能启动一个基因的转录
D．强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性
√
题号
1
3
5
2
4
6
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9
B [根据题干信息“组成型启动子，驱动基因在所有细胞、组织和器官中持续表达；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达”可知，细胞分化与组织特异型启动子的调控和组成型启动子均有关，A正确；组织特异型启动子，调控基因只在某些特定的部位中表达，因此膀胱生物反应器的构建需要将目的基因连接在组织特异型启动子的下游，导入细胞中，保证基因在膀胱细胞中表达，B错误；一般情况下，真核生物细胞中，一个启动子只能启动一个基因的转录，C正确；强启动子可使基因高水平表达，启动子的强弱主要取决于其与RNA聚合酶的亲和性，从而启动基因的转录，D正确。]
题号
1
3
5
2
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8
7
9
4．(2024·四川绵阳期中)研究人员利用农杆菌侵染水稻叶片，经植物组织培养、筛选最终获得了一株水稻突变体，现欲检测该突变体是否由T-DNA插入所致。如图是利用不同的限制酶处理突变体的总DNA，经电泳、核酸分子杂交的放射性自显影结果，并与野生型和Ti质粒做对比(注：T-DNA上没有所用限制酶的酶切位点)，对该实验的分析错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．检测结果时使用了放射性标记的T-DNA片段做探针
B．不同酶切显示的杂交带位置不同，说明T-DNA有不同的插入位置
C．实验结果证明该突变体核DNA中插入了T-DNA
D．若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
B [图示结果突变体中出现放射性，说明使用了放射性标记的T-DNA片段做探针对目的基因进行检测，A正确；不同酶切杂交带位置不同，说明不同酶切后带有T-DNA的片段长度不同(即不同的酶切位点距离T-DNA的远近不同)，B错误；该突变体产生的根本原因是T-DNA携带目的基因插入水稻细胞的染色体DNA上，C正确；由图所示放射性检测结果可知，野生型无放射性杂交带，若野生型也出现杂交带，则实验样本可能被污染，检测结果不准确，D正确。]
题号
1
3
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6
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9
5．(2024·四川绵阳期中)巢式PCR是指先后用外、内引物扩增获得目的基因的方法。其原理为先以比目的基因大的DNA片段为模板，用外引物(F1，R1)进行扩增，获得大量含目的基因的中间产物，再以扩增后的中间产物为模板，用内引物(F2，R2)扩增目的基因，如图所示。下列说法错误的是( )
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B．第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定
C．由于和两套引物都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性
D．如果两套引物一起加入反应体系中，外引物的复性温度应显著低于内引物
题号
1
3
5
2
4
6
8
7
9
√
D [两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；第二轮PCR使内侧引物以第一轮PCR产物为模板进行再次扩增，第二轮PCR反应能否进行，是对第一轮PCR反应正确性的鉴定，B正确；由于和两套引物同时都互补的靶序列较少，该技术可大大提高扩增的特异性 ，将需要的目的基因扩增出来，C正确；如果两套引物一起加入反应体系中，外引物复性温度要明显高于内引物，使外引物先进行反应，D错误。]
题号
1
3
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4
6
8
7
9
6．(2024·福建漳州一模)基因定点突变的目的是通过定向改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个
或几个氨基酸。大引物PCR定点突变常用来
研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核
苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可
获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一
轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物，过程
如图所示。下列叙述错误的是( )
题号
1
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9
A．第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度
B．PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
C．第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物
D．将某蛋白第21位的组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，属于蛋白质工程
题号
1
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9
√
C [为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；据图分析可知，除第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某蛋白质第21位的组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)的过程属于蛋白质工程，D正确。]
题号
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9
7．(2024·山东德州二模)CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理如图1所示。科研人员根据猪的细胞表面抗原基因RAG1的启动子设计了SgRNA1和SgRNA2，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了两种基因敲除猪，检测基因敲除猪体内的RAG1基因表达情况如图2所示。下列说法错误的是( )
题号
1
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9
A．CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与SgRNA序列的特异性相关
B．基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱
C．两种SgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达
D．据图2可知，用SgRNA2制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好
题号
1
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9
√
D [CRISPR/Cas9识别目标DNA序列主要与SgRNA编码序列有关，即主要与SgRNA序列的特异性相关，A正确；猪的细胞表面抗原会导致器官移植时发生免疫排斥，基因敲除猪的细胞表面抗原减少，器官移植过程中免疫排斥作用减弱，提高器官移植的成功率，B正确；两种SgRNA都可引导Cas9在转录水平上减弱RAG1基因的表达，C正确；据图2可知，与对照组相比，用SgRNA1制备的基因敲除猪RAG1基因表达量更低，说明用SgRNA1制备的基因敲除猪用于器官移植效果更好，D错误。]
题号
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8．(2024·山东济宁模拟)干扰素是在病毒感染后机体免疫细胞产生的一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤等作用。科研人员利用大肠杆菌构建干扰素工程菌，下图是部分单链DNA序列，回答下列问题：
(1)从相应细胞中提取mRNA后，在________________酶的作用下获得cDNA。也可以直接从细胞中粗提取DNA，DNA不溶于酒精，但溶于___mol/L的NaCl溶液。
题号
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逆转录
2
(2)通过PCR技术扩增干扰素基因时，所需引物序列的前9个核苷酸为____________________________和_________________________，所需的酶为________________________________。
(3)构建基因表达载体时，需要选择合适的启动子，其作用是_________________________________________________________。若目的基因以图中单链为转录模板链，启动子应该与目的基因的_______(填“左侧”或“右侧”)连接。
题号
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5′-GGTCAACAA-3′
5′-TAAACTTCA-3′
耐高温的DNA聚合酶
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录
右侧
(4)使用一种限制酶切割目的基因和载体后，会存在目的基因的正向或反向两种连接产物，________________(填“可以”或“不可以”)通过电泳来区分两种产物，在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________________________________________ (列举两点)等有关。
题号
1
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9
不可以
凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
[解析] (1)mRNA在逆转录酶的作用下获得cDNA；DNA溶于
2 mol/L的NaCl溶液。
(2)由于子链合成的方向是由子链的5′端向3′端延伸，引物选择如箭头所示
根据碱基互补配对原则，引物为5′-GGTCAACAA-3′和5′-TAAACTTCA-3′。PCR需要耐高温的DNA聚合酶。
题号
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(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录。若目的基因以图中单链为转录模板链，且转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，故启动子应该与目的基因的右侧连接。
(4)琼脂糖凝胶电泳可对DNA分子大小进行鉴定，凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，目的基因的正向或反向两种连接产物分子大小一致，无法通过电泳区分。
题号
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9．(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
题号
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(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有___________________________，扩增程序中最主要的不同是_________。
(2)有关基因序列如图2。引物F2 -F、F1 -R应在下列选项中选用___。
A．ATGGTG……CAACCA
B．TGGTTG……CACCAT
C．GACGAG……CTGCAG
D．CTGCAG……CTCGTC
题号
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模板(片段F1、片段F2)、引物
复性温度
CD
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有________________________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
题号
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限制酶和DNA连接酶
ABC
(5)为了验证平
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