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微专题12
利用PCR技术获取目的基因的过程图解
(1)目的基因位于获得的DNA片段中。
(2)第一轮循环,引物与模板互补(非对齐),但因为模板很长,子链沿模板延伸至其末端才终止,所以第一个循环扩增出来的新片段较长(Ⅰ链)。
(3)第二轮循环中以Ⅰ链为模板扩增时,子链(Ⅱ链)长度为“引物”到“引物”的长度,是需要的长度,但只是一条链,所以还不能分离出目的基因。
(4)第三轮循环,当以Ⅱ链为模板时,因为这个单链的长度就是需要扩增的长度,所以当第三轮循环完成时,获得的双链DNA片段(Ⅲ链所在的DNA片段),就是所需的目的基因。所以至少要3个循环才能分离出目的基因。
1.(经典高考节选)利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(见下图)。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。
(1)理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
(2)在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
15/16
三
【解析】 由图可知,由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中,只含有引物A或引物B,而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时,两种引物都含有,故第四轮循环共产生16个DNA分子,其中含有引物A的DNA分子是15个(只有第四轮循环中,引物B以母链为模板合成的DNA片段不含引物A),占 15/16。
2.X基因是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝X基因,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示,经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,下列叙述错误的是( )
[A] 第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
[B] 第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各一个
[C] 第三轮复制得到8个DNA分子,其中有2个等长的
[D] 第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
D
【解析】 据图分析可知,第一轮复制形成2个DNA分子,即①②各一个;第二轮复制得到22=4个DNA分子,第一轮的①复制得①和③、第一轮的②复制得②和④,即得到①②③④各一个;第三轮复制得到23=8个DNA分子,第二轮的③复制得③和⑤、第二轮的④复制得④和⑤,即得到2个⑤(等长);第四轮复制得到24=16个DNA分子,第三轮的2个⑤复制得4个⑤,此外第三轮产生的③和④复制都可以得到⑤,故得到的X基因多于4个。
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。设计PCR的一对引物时,一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
3.(经典高考节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是
。
乙、丙
目的基因反向连接
【解析】 分析题图可知,理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物,则无论目的基因是否正确插入,扩增的片段都是50+300+100=450(bp),不符合要求;如果选择乙和丙这对引物,正向连接和反向连接后所得结果不同,所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接,则引物乙会出现在重组质粒靠近丙结合位点的一端,此时若加入引物甲和乙,则可以扩增出300+100=400(bp)的片段。
1.重叠延伸PCR
重叠延伸PCR需要设计两对引物:上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基,且具有重叠区域,如图所示,引物中突变碱基处用“·”表示。第一、第二轮PCR时(即图中PCR1和PCR2)分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段AB和下游片段CD。此时,AB和CD都携带突变碱基,但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域,将其置于一起时能局部配对并延伸,再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA,即AD。
2.大引物PCR
需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段,再以此片段为模板,以常规上游引物进行扩增即得到一条双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图所示:
4.(2024·山东滨州质检)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变,其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
[A] 过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
[B] 过程①需要3次循环才能得到图中所示PCR产物
[C] 过程②的产物都可以完成延伸过程
[D] 若将1个突变基因经过程④扩增为16个,则需要消耗15个通用引物RP2
D
【解析】 两种突变引物能互补配对,因此过程①必须分两个反应系统进行;由于通用引物与模板链平齐,过程①需要2次循环即能得到图中所示PCR产物;过程②获得的杂交DNA有2种,一种3′端为单链,一种5′端为单链,只有5′端为单链的杂交DNA(题图中右侧)可以完成延伸过程,因为子链只能从引物的3′端开始延伸;1个基因片段经PCR扩增为16个,得到32条单链,其中两条单链为母链,因此共需要消耗16×2-2=30(个)引物,故需要通用引物RP2的数量为30÷2=15(个)。
5.(2024·福建漳州一模)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物,过程如图所示。下列叙述错误的是( )
[A] 第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度
[B] PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
[C] 第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物
[D] 将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC),属于蛋白质工程
C
【解析】 第一轮PCR所用引物短,第二轮PCR所用引物长,故第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度;启动子是RNA聚合酶识别和结合部位,能驱动基因转录,终止子能使转录停止,若要使得目的基因可以表达出蛋白质,则需要加入启动子和终止子等结构,诱导基因转录和翻译;第一轮产物中只有一条链能作第二轮PCR扩增的大引物,第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物,以便进行另一条链的延伸;通过对基因定点诱变实现蛋白质中氨基酸序列的改变属于蛋白质工程技术范畴。
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。原理如图。
6.(2024·山东日照二模)反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图。下列叙述错误的是( )
[A] 过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
[B] 过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
[C] 过程③需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链
[D] 过程③中将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
D
【解析】 由图可知,过程①即酶切后,已知序列能环化,说明两端的黏性末端相同,故过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割;过程②即环化,将DNA片段连接起来,该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键;过程③为扩增,需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从其3′端以未知序列为模板延伸子链;过程③中将温度调至72 ℃的目的是提高耐高温的DNA聚合酶的活性。
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光定量PCR技术鉴定。实时荧光定量PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结
合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图甲)。若待检测样品中存在相应病毒时,检测到的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小,说明病毒核酸浓度越高。
7.(2024·安徽池州二模)甲流病毒是我国冬季流感的常见病毒,甲流病毒核酸检测方便快捷,可以为临床诊断提供可靠依据。病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR(qPCR)检测
法,技术流程如图所示,在PCR扩增时加入能与目的基因(甲流病毒的N基因)结合的荧光探针,相关步骤如图所示。回答下列问题。
催化病毒蛋白质
(1)图中步骤1提取RNA过程中加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂的作用是
。
水解,抑制RNA的降解
【解析】 (1)根据图中信息推测RNA提取裂解液中的蛋白酶K能够催化病毒蛋白质水解(促进病毒RNA的释放),RNA酶抑制剂能够抑制RNA的降解。
(2)qPCR过程前,需先以RNA为模板,经过 过程合成cDNA,设计一对引物。为确保甲流病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据甲流病毒cDNA两条链中的 (填“3′”或“5′”)端来进行。
逆转录
3′
【解析】 (2)以RNA为模板合成cDNA的过程是逆转录的过程。根据DNA子链合成方向及DNA双链反向平行的特点,PCR的引物应根据模板链的3′端设计。
(3)在配制PCR扩增缓冲液时,加入的荧光探针序列为5′-ACCGA……AATGC-3′,如果模板中存在N基因序列,与探针结合的序列应该是5′- -3′。在扩增过程中,若探针完整时,不产生荧光,当探针被酶X(TaqDNA聚合酶)水解时,R与Q分离,即可检测出R发出荧光。由此可推测,探针的水解发生在PCR 阶段。
GCATT……TCGGT
【解析】 (3)根据碱基互补配对原则可确定探针序列是5′-GCATT……TCGGT-3′。
根据图中探针的发光原理可推测探针的水解发生在PCR延伸阶段(此时TaqDNA聚合酶与结合在DNA单链上的探针相遇)。
延伸
(4)在qPCR中Ct值含义是“每个反应管内积累的荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数”,根据某试剂盒说明书显示Ct≤40则为阳性,若每分子探针水解释放的荧光强度为a,加入模板数为b,则设定的荧光强度阈值应为 。
ab(240-1)
【解析】 (4)根据图中信息得知,以F为引物合成子链时会发出荧光,即引物F数=探针数,荧光强度阈值为ab(2Ct-1),由于Ct≤40为阳性,故阈值为ab(240-1)。微专题12 PCR相关问题归纳
题型一 利用PCR技术获取和扩增目的基因
【知识·方法】
利用PCR技术获取目的基因的过程图解
(1)目的基因位于获得的DNA片段中。
(2)第一轮循环,引物与模板互补(非对齐),但因为模板很长,子链沿模板延伸至其末端才终止,所以第一个循环扩增出来的新片段较长(Ⅰ链)。
(3)第二轮循环中以Ⅰ链为模板扩增时,子链(Ⅱ链)长度为“引物”到“引物”的长度,是需要的长度,但只是一条链,所以还不能分离出目的基因。
(4)第三轮循环,当以Ⅱ链为模板时,因为这个单链的长度就是需要扩增的长度,所以当第三轮循环完成时,获得的双链DNA片段(Ⅲ链所在的DNA片段),就是所需的目的基因。所以至少要3个循环才能分离出目的基因。
【类题·精练】
1.
(经典高考节选)利用PCR技术扩增目的基因,其原理与细胞内DNA复制类似(见下图)。图中引物为单链DNA片段,它是子链合成延伸的基础。
(1)理论上推测,第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
(2)在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
【答案】 (1)15/16 (2)三
【解析】 由图可知,由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中,只含有引物A或引物B,而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时,两种引物都含有,故第四轮循环共产生16个DNA分子,其中含有引物A的DNA分子是15个(只有第四轮循环中,引物B以母链为模板合成的DNA片段不含引物A),占 15/16。
2.X基因是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝X基因,需在PCR反应中加入两种引物,两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示,经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,下列叙述错误的是( )
[A] 第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
[B] 第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各一个
[C] 第三轮复制得到8个DNA分子,其中有2个等长的
[D] 第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
【答案】 D
【解析】 据图分析可知,第一轮复制形成2个DNA分子,即①②各一个;第二轮复制得到22=4个DNA分子,第一轮的①复制得①和③、第一轮的②复制得②和④,即得到①②③④各一个;第三轮复制得到23=8个DNA分子,第二轮的③复制得③和⑤、第二轮的④复制得④和⑤,即得到2个⑤(等长);第四轮复制得到24=16个DNA分子,第三轮的2个⑤复制得4个⑤,此外第三轮产生的③和④复制都可以得到⑤,故得到的X基因多于4个。
题型二 利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
【知识·方法】
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤,可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中,PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因,还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。设计PCR的一对引物时,一个引物与质粒DNA互补结合,另一个引物与目的基因DNA互补结合,这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
【类题·精练】
3.(经典高考节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是 。
【答案】 乙、丙 目的基因反向连接
【解析】 分析题图可知,理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物,则无论目的基因是否正确插入,扩增的片段都是50+300+100=450(bp),不符合要求;如果选择乙和丙这对引物,正向连接和反向连接后所得结果不同,所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接,则引物乙会出现在重组质粒靠近丙结合位点的一端,此时若加入引物甲和乙,则可以扩增出300+100=400(bp)的片段。
题型三 利用PCR技术引导基因定点突变
【知识·方法】
1.重叠延伸PCR
重叠延伸PCR需要设计两对引物:上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基,且具有重叠区域,如图所示,引物中突变碱基处用“·”表示。第一、第二轮PCR时(即图中PCR1和PCR2)分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段AB和下游片段CD。此时,AB和CD都携带突变碱基,但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域,将其置于一起时能局部配对并延伸,再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA,即AD。
2.大引物PCR
需要用到三条引物进行两轮PCR,这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段,再以此片段为模板,以常规上游引物进行扩增即得到一条双链都含有突变位点的DNA。该技术的流程如图
所示:
【类题·精练】
4.(2024·山东滨州质检)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变,其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
[A] 过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
[B] 过程①需要3次循环才能得到图中所示PCR产物
[C] 过程②的产物都可以完成延伸过程
[D] 若将1个突变基因经过程④扩增为16个,则需要消耗15个通用引物RP2
【答案】 D
【解析】 两种突变引物能互补配对,因此过程①必须分两个反应系统进行;由于通用引物与模板链平齐,过程①需要2次循环即能得到图中所示PCR产物;过程②获得的杂交DNA有2种,一种3′端为单链,一种5′端为单链,只有5′端为单链的杂交DNA(题图中右侧)可以完成延伸过程,因为子链只能从引物的3′端开始延伸;1个基因片段经PCR扩增为16个,得到32条单链,其中两条单链为母链,因此共需要消耗16×2-2=30(个)引物,故需要通用引物RP2的数量为30÷2=15(个)。
5.(2024·福建漳州一模)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作为第二轮PCR扩增的大引物,过程如图所示。下列叙述错误的是( )
[A] 第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度
[B] PCR扩增的定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
[C] 第一轮PCR的产物的两条DNA链作为第二轮PCR所用的引物
[D] 将某蛋白质的第21位组氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC),属于蛋白质工程
【答案】 C
【解析】 第一轮PCR所用引物短,第二轮PCR所用引物长,故第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度;启动子是RNA聚合酶识别和结合部位,能驱动基因转录,终止子能使转录停止,若要使得目的基因可以表达出蛋白质,则需要加入启动子和终止子等结构,诱导基因转录和翻译;第一轮产物中只有一条链能作第二轮PCR扩增的大引物,第二轮PCR仍需加入另一种侧翼引物,以便进行另一条链的延伸;通过对基因定点诱变实现蛋白质中氨基酸序列的改变属于蛋白质工程技术范畴。
题型四 利用PCR扩增未知基因序列
【知识·方法】
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。原理如图。
【类题·精练】
6.(2024·山东日照二模)反向PCR是利用已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如图。下列叙述错误的是( )
[A] 过程①可用同种限制酶切割磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键
[B] 过程②需用DNA连接酶将酶切片段环化以实现对未知序列的扩增
[C] 过程③需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从其3′端延伸子链
[D] 过程③中将温度调至72 ℃的目的是使引物与模板链通过碱基互补配对结合
【答案】 D
【解析】 由图可知,过程①即酶切后,已知序列能环化,说明两端的黏性末端相同,故过程①可用同一种限制酶对未知序列两端进行切割;过程②即环化,将DNA片段连接起来,该过程中使用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键;过程③为扩增,需添加引物1和引物3以便DNA聚合酶从其3′端以未知序列为模板延伸子链;过程③中将温度调至72 ℃的目的是提高耐高温的DNA聚合酶的活性。
题型五 利用PCR技术检测病毒核酸
【知识·方法】
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光定量PCR技术鉴定。实时荧光定量PCR扩增目的基因,需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA,可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时,不产生荧光。在PCR过程中,与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解,R与Q分离后,R发出的荧光可被检测到(如图甲)。若待检测样品中存在相应病毒时,检测到的荧光强度变化如图乙,荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小,说明病毒核酸浓度越高。
【类题·精练】
7.(2024·安徽池州二模)甲流病毒是我国冬季流感的常见病毒,甲流病毒核酸检测方便快捷,可以为临床诊断提供可靠依据。病毒核酸检测的方法为实时荧光定量PCR(qPCR)检测法,技术流程如图所示,在PCR扩增时加入能与目的基因(甲流病毒的N基因)结合的荧光探针,相关步骤如图所示。回答下列问题。
(1)图中步骤1提取RNA过程中加入蛋白酶K和RNA酶抑制剂的作用是
。
(2)qPCR过程前,需先以RNA为模板,经过 过程合成cDNA,设计一对引物。为确保甲流病毒核酸检测的准确性,在设计PCR引物时必须依据甲流病毒cDNA两条链中的
(填“3′”或“5′”)端来进行。
(3)在配制PCR扩增缓冲液时,加入的荧光探针序列为5′-ACCGA……AATGC-3′,如果模板中存在N基因序列,与探针结合的序列应该是5′- -3′。在扩增过程中,若探针完整时,不产生荧光,当探针被酶X(TaqDNA聚合酶)水解时,R与Q分离,即可检测出R发出荧光。由此可推测,探针的水解发生在PCR 阶段。
(4)在qPCR中Ct值含义是“每个反应管内积累的荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数”,根据某试剂盒说明书显示Ct≤40则为阳性,若每分子探针水解释放的荧光强度为a,加入模板数为b,则设定的荧光强度阈值应为 。
【答案】 (1)催化病毒蛋白质水解,抑制RNA的降解
(2)逆转录 3′
(3)GCATT……TCGGT 延伸
(4)ab(240-1)
【解析】 (1)根据图中信息推测RNA提取裂解液中的蛋白酶K能够催化病毒蛋白质水解(促进病毒RNA的释放),RNA酶抑制剂能够抑制RNA的降解。
(2)以RNA为模板合成cDNA的过程是逆转录的过程。根据DNA子链合成方向及DNA双链反向平行的特点,PCR的引物应根据模板链的3′端设计。
(3)根据碱基互补配对原则可确定探针序列是5′-GCATT……TCGGT-3′。根据图中探针的发光原理可推测探针的水解发生在PCR延伸阶段(此时TaqDNA聚合酶与结合在DNA单链上的探针相遇)。
(4)根据图中信息得知,以F为引物合成子链时会发出荧光,即引物F数=探针数,荧光强度阈值为ab(2Ct-1),由于Ct≤40为阳性,故阈值为ab(240-1)。
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